PLoS One. 2010; 5(10): e15401.
Minimalizem
Dokončanje vzorca, sposobnost priklica popolnih spominov, ki jih sprožijo delne naloge, je bistvena značilnost procesa pomnjenja. O molekularnih in celičnih mehanizmih, na katerih temelji ta postopek, je malo znanega. Za preučevanje vloge dopamina pri odpoklicu spomina smo analizirali hepatrozne miši s prenašalcem dopamina (DAT)+/−), in ugotovili, da imajo te miši normalno učenje, konsolidacijo in priklic spomina pod pogoji, ki so v celoti pripravljeni, vendar pa kažejo specifične primanjkljaje v zaključku vzorca pod pogojem delne iztočnice. To obliko spomina na spomin pri heteroroznih miših s transporterji dopamina lahko odpravimo z majhnim odmerkom haloperidola antagonista dopamina, kar še dodatno potrdi, da je nezmožnost priklica spominskih vzorcev posledica neravnotežja dopamina. Zato naši rezultati razkrivajo, da je občutljiv nadzor možganske ravni dopamina kritičen za dokončanje vzorca med asociativnim priklicem spomina.
Predstavitev
Priklic spomina vključuje rekapitulacijo prej pridobljenih informacij [1], [2]. Odvisno od stanja priklica lahko pride do priklica spomina z večino ali vse prej naštete naloge, povezane z učenjem (npr. Videnje človeka in slišanje njegovega glasu hkrati ali obisk njegovega rodnega mesta, ki se ni veliko spremenil itd.). Po drugi strani pa se v mnogih primerih spominsko iskanje ponavadi, če so prisotne samo podvrsti začetnih znakov (npr. Rekonstrukcija starih zemljevidov uličnega mesta, ko je le nekaj starih mejnikov ostalo nespremenjenih). To je znano kot dokončanje vzorca, v katerem možgani rekonstruirajo in pridobivajo celotne spominske vzorce iz delnih zunanjih napak ali samoiniciativnih notranjih procesov. Trenutno je malo znanega o dejanskih molekulskih in celičnih mehanizmih, na katerih temelji vzorec dokončanja priklica spomina. Vendar pa nove študije kažejo, da lahko monoaminsko signaliziranje igra pomembno vlogo pri iskanju spomina [3].
V tej študiji smo želeli preučiti, kako modulacijski nevrotransmiter dopamin igra vlogo pri uravnavanju dokončanja spominskega vzorca med delnim priklicem izvlečka. Dopamin je ključni nevrotransmiter, ki lahko vpliva na kognicijo, čustva in gibanje. Nenormalni dopaminergični prenos je bil vpleten v številne psihiatrične in nevrološke motnje, vključno s pomanjkanjem pozornosti in hiperaktivnostjo (ADHD), shizofrenijo in Parkinsonovo boleznijo [4]-[8]. Čeprav dopaminergični nevroni izvirajo le iz ventralnega tegmentalnega območja in substantia nigra compacta, njihovi izhodi štrlijo skoraj povsod v možgane, vključno s predfrontalno skorjo, medialnim časovnim režnjam in hipokampusom, regijami, za katere je znano, da se aktivirajo med spominsko retrievol [3], [9]-[14].
Prav tako je treba opozoriti, da se je dopamin smatral za funkcionalno ključnega pomena za pozornost in delovni spomin, ki ga posredujejo zgoraj možganske regije [15]-[18], ki sta se obetala pri iskanju pomnilnika pod delnimi pogoji [19]. Kot primarni celični mehanizem za prekinitev signala dopamina dopaminski transporter (DAT), ki se nahaja na preskusnih terminalih nevronov, ponovno prevzame dopamin iz sinaptične razcepke nazaj v dopaminergične nevrone. Kot taka je DAT kritična molekula pri uravnavanju sinaptičnih nivojev dopamina in posledično določanju časovnega trajanja dopaminskih akcij na lokalnih nevronskih vezjih. Dejansko genetski izpad gena za prenašalce dopamina povzroči resne okvare. Homozigotne miši DAT-KO trpijo zaradi očitnih nepravilnosti, vključno z upočasnitvijo rasti, robustno lokomotorno hiperaktivnostjo in številnimi drugimi okvarami, vključno s primanjkljaji pri habituaciji in socialni interakciji, pa tudi z zmanjšano gibljivostjo črevesja, dihalnim nadzorom itd. [6], [20], [21]. Splošne napake v homozigotih miših DAT-KO so bile manj primerne za preverjanje vloge dopamina pri uravnavanju procesov spomina.
Zanimivo je, da so heterozigozne knockout miši (DAT)+/− miši), ki imajo še vedno alel funkcionalnega gena DAT, se zdijo povsem običajni v njihovem splošnem vedenju [6], [20], [21]. Tako je DAT+/− miši lahko nudijo dragocen model za preučevanje nekaterih občutljivih, a pomembnih fenotipov, kot so asociativni pomnilniški procesi in sorodni mehanizmi, ki jih ureja dopaminergično vezje. Tu smo uporabili nabor vedenjskih paradigem, da smo ocenili funkcionalne posledice neravnovesja dopamina na dokončanje vzorca med asociativnim spominom spomina.
Rezultati
Za raziskovanje vloge dopamina pri pridobivanju spomina smo uporabili heterorozne miši prenosne dopamine (DAT)+/−). Za oceno njihove lokomotorne aktivnosti na odprtem terenu smo uporabili baterijo osnovnih vedenjskih meritev (Slika 1A), rotarodne predstave (Slika 1B in 1C), in ugotovili, da so te heterorozne miši izpadle popolnoma normalno. Potrdili smo tudi, da je DAT+/− miši kažejo neločljive predstave v stopnji anksioznosti, merjeno s povišanim plusom labirinta (Slika 1D).
Poleg tega smo v DAT-u ocenili osnovne funkcije učenja in spomina+/− miši. Najprej smo uporabili test prepoznavanja novih predmetov in opazili, da so te miške pri preskusih zadrževanja dne 1 pokazale povsem običajne vedenjske lastnosti v primerjavi z nadzorom divjih vrst mladičev (Slika 1E). Poleg tega te miši kažejo tudi običajno zadrževanje strahu, ki je bilo pogojeno s 1 na dan, ki ga ni mogoče razlikovati od njihovih divjih kontrolnih miši (Slika 1F). Zato ti rezultati kažejo, da je DAT+/− miši imajo v teh dveh oblikah primarnih spominskih testov normalno učenje in delovanje pomnilnika.
Preskus prostorskega referenčnega pomnilnika je bil predhodno uporabljen za oceno zaključka vzorca priklica spomina. Podvrgli smo si DAT+/− miši in divji nadzor nad to nalogo. Uporaba protokola prostorskega referenčnega pomnilnika, ki je bil opisan prej [22], smo te miši trenirali v vodnem labirintu skrite platforme. Trening je bil sestavljen iz štirih preskusov na dan, z enournim intervalom med preskusi. Ugotovili smo, da sta oba DAT+/− miši in divji tip sta prikazali primerljivo učljivost in utrditev spomina med dnevnimi sejami 10 in s podobnimi hitrostmi plavanja (Slika 2A in 2B).
Nato smo pregledali njihove spomine na skrito platformo s pomočjo sondinega testa (P1) na dan 11, en dan po zaključku zadnjega treninga. Kot merimo s zasedenostjo kvadrantov, oba DAT+/− miši in njihovi nadzorni mladiči so lahko svoje iskanje usmerili v ciljni kvadrant v prisotnosti polnih znakov (Slika 3A). Še več, DAT+/− miši so imele tudi veliko prednost na območju platforme fantoma in ni bilo nobene razlike v primerjavi z zasedenostjo nadzorne ploščadi (Slika 3B). Nadalje po pričakovanjih oba DAT+/− miši in divji mladiči so pokazali znatno povečanje števila prehodov (Slika 3C). Tako vse te meritve kažejo na DAT+/− miši se lahko te naloge navadno naučijo in normalno pridobijo ta asociativni pomnilnik.
Da bi ugotovili, ali je občutljivo ravnovesje dopamina ključnega pomena za dokončanje vzorca pod delnimi pogoji, smo naslednji dan izvedli drugi test sonde (P2), tako da smo odstranili tri od štirih distalnih pripomočkov (dan 12). Da bi se izognili morebitnemu izumrtju iz prejšnje odpoklicne seje, je bil en blok (preizkušanja 4) usposabljanja opravljen 1 uro po preizkusu sonde P1. Med tem preskusom z delno izločitvijo sonde, medtem ko so kontrolne miši še naprej osredotočale svoj čas iskanja v ciljni kvadrant, namesto na druge kvadrante, DAT+/− miši so pokazale samo uspešnost na ravni priložnosti, izmerjeno z zasedenostjo ciljnega kvadranta (Slika 3D). Poleg tega je meritev zasedenosti površin fantomske platforme nadalje potrdila, da so ti DAT+/− miši so oslabele pri spominjanju lokacije platforme (Slika 3E). Ta primanjkljaj pri iskanju se je izkazal tudi s pomanjkanjem števila prehodov na platformi (Slika 3F), medtem ko so bili divji mladiči v polnosti sposobni za priklic delnega spomina. Zato ti podatki kažejo, da je DAT+/− miši imajo pomanjkanje prostorskih referenčnih spominov v pogojih z delno nastavitvijo.
Na koncu smo vprašali, ali lahko obnovimo dokončanje vzorca v teh DAT+/− miši z uporabo farmakoloških metod. Poročali so, da bi lahko majhen odmerek antagonista dopamina, haloperidola, koristil pri lajšanju nekaterih motenj dopamina [20]. Utemeljitev je, da lahko majhen odmerek haloperidola nekoliko ublaži učinek povišanega dopamina v heterozigotih miši, ki nimajo zadostnega ponovnega zajemanja dopamina zaradi izgube enega alela normalnega gena za prevoz dopamina. Za reševalni poskus smo uporabili enak nabor miši. Na dan 13 in dan 14 smo zgornje miši podvrgli tretjem preskusu sonde (P3) pod pogoji s polno meritvijo in četrtem poskusu sonde (P4) pod pogoji z delno nastavitvijo. Spet, da bi preprečili izumrtje, ki bi se lahko zgodilo med poskusom sonde, smo izvedli še en blok (preizkušanja 4) treninga 1 uro po zaključku bodisi preizkusa P2 bodisi P3. Naše meritve zasedenosti ciljnega kvadranta na testu sonde P3 kažejo, da sta DAT oba+/− miši in kontrolni mladiči so skoncentrirali iskanje v ciljnem kvadrantu ob prisotnosti polnih znakov (Slika 4A). Poleg tega je njihov običajni priklic spomina ponovno dokazal merjenje zasedenosti platforme (Slika 4B) kot tudi število prehodov ploščadi (Slika 4C). Tako so bile te mutirane miši v celoti sposobne pridobiti prostorski pomnilnik pod pogoji, ki so bili v celoti pripravljeni.
Na dan 14 smo odstranili tri od štirih distalnih znakov in izvedli četrto sondiranje (P4) pod pogojem delne nastavitve. Vbrizgali smo DAT+/− miši intraperitonealno z majhnim odmerkom haloperidola (0.002 mg / kg telesne teže) 30 minut pred retenzivnimi testi. Divji mladiči so prejeli fiziološko injekcijo. Ugotovili smo, da je DAT+/− miši so svoj čas iskanja skoncentrirale v ciljnem kvadrantu in pokazale statistično podobne rezultate v primerjavi s sorodniki divjega tipa (Slika 4E). Tudi meritev zasedenosti površin fantomske platforme je dodatno potrdila, da so ti DAT+/− miši se lahko spomnijo lokacije platforme (Slika 4F). Njihov običajni priklic spomina je bil ponovno potrjen s povečanjem števila prehodov na platformi, ki je bilo na isti ravni kot pri miših divjega tipa (Slika 4G). Tako ti poskusi kažejo, da je bil primanjkljaj dokončanja vzorca prvotno opažen v DAT+/− miši lahko povzroči neravnovesje dopamina.
Da bi izključili možnost, da bi bili rezultati za fenotip, injiciran s haloperidolom v preskušanju P4, posledica pretreniranosti med ponovljenimi testi sonde, smo uporabili drug sklop DAT+/− in nadzirati lutke in ponoviti celoten poskus. Kot pričakovano, oba DAT+/− miši in njihovi divji miši so pokazali dobro stopnjo učenja med tekom 10 dnevnega treninga (Slika 5A). Na dan 11 smo te miši podvrgli testom odpoklica s celotno iztočnico, pri rezultatih testov za zadrževanje spomina med DAT-om ni bistvene razlike.+/− miši in kontrolne stelje, merjene z zasedenostjo kvadrantov (Slika 5B), ciljna zasedenost kvadranta (Slika 5C) in število prehodov na platformi (Slika 5D). Eno uro po opravljenem testu sonde, smo te miši prekvalificirali z enim več treningov, da preprečimo kakršen koli učinek izumiranja. Na dan 12 so bile te miši podvržene testom odpoklica z delno cue. Nizki odmerek haloperidola (ali fiziološke raztopine) za kontrolne tablete je bil injiciran v mišice intraperitonealno 30 minut pred preskušanjem z delno cepivo. Ugotovili smo, da je to zdravljenje resnično privedlo do normalnih učinkov pri mutiranih miših. Mutantne in kontrolne miši so imele primerljive zmogljivosti v zasedenosti kvadrantov (Slika 5E), ciljna zasedenost kvadranta (Slika 5F) in število prehodov na platformi (Slika 5G). Tudi merjenje hitrosti plavanja ni pokazalo razlik (Slika 5H). Zato so ti podatki jasno pokazali, da je bil v DAT rešen primanjkljaj z delno iztočnico rešen+/− miši, ki jih je imel haloperidol, niso bile posledica večkratnega pretreniranja med več poskusi sonde.
Razprava
Za dopaminski sistem je znano, da je ključnega pomena za uravnavanje številnih kognitivnih procesov [8], [16]-[18], [23]-[25], naša današnja študija prvič dokazuje, da je neravnovesje dopamina, ki je posledica izgube enega alela normalnega gena za dopaminski transporter, povzročilo poseben primanjkljaj v zaključku vzorca med asociativnim odpoklicem prostorskega spomina. Primanjkljaj priklica spomina je očiten le v pogojih delne-prostorske iztočnice, ne pa tudi v pogojih s polno iztočnico. Poleg tega se zdi, da ta primanjkljaj spomina odraža zelo specifično obliko pomnilnega primanjkljaja, ker široki vidiki osnovnega vedenja (lokomotiva na prostem, rotarod in anksioznost) in drugih oblik spomina, kot so pogojevanje strahu in prepoznavanje novih predmetov, ostanejo običajni.
Obstaja več potencialnih molekul in celičnih scenarijev, ki lahko skupno prispevajo k opazovanemu prostorskemu primanjkljaju pri odpoklicu, med katerim je dopamin glavni molekul kandidat, ki je podlaga za ta proces spomina. To je zato, ker pozornost in delovni spomin, ki ga primarno nadzira signali dopamina, naj bi bili kritični za pridobivanje prostorskih spominov [15]-[18], [26]. Dobro je znano, da dopaminergični nevroni, ki izvirajo le iz ventralnega tegmentalnega območja in substantia nigra compacta, štrlijo skoraj povsod v možgane, vključno s predfrontalno skorjo, medialnim temporalnim repom in hipokampusom [5], [19], [27]-[28], področja, za katera je znano, da se aktivirajo med iskanjem pomnilnika, kot tudi postopki pozornosti [3], [9]-[14], [29], [30]. Glede na široke dokaze, da je dopamin bistven za pozornost in delovni spomin [15]-[18] in da je genetski polimorfizem gena DAT vpleten v ADHD [31]-[33]Možno je, da lahko tako pozornost kot delovni pomnilnik igrata vlogo pri dokončanju vzorca pomnilnika v pogojih z delno nastavitvijo z regulacijo dopamina, posredovano z DAT. Tako je primanjkljaj izpolnitve spominskega vzorca, opažen pri heterozigotih mutiranih miših DAT, lahko posledica nezmožnosti miške, da bi izpolnila povečane potrebe po pozornosti med delnim priklicem spomina na podlagi iztočnice, ki je posledica motnje sinaptičnega dopamina.
Naša ugotovitev, da je zaradi neravnovesja dopamina prišlo do pomanjkanja spomina, je zanimiva tudi glede na klinično demenco, ki so jo opazili pri Parkinsonovih bolnikih. Zdi se, da ti pacienti ponavadi ohranijo sposobnost učenja, utrjevanja in shranjevanja novega spomina, vendar so močno prikrajšani za pridobivanje spominov, zlasti pod delnimi zunanjimi navodili ali samoiniciativnim odpoklicem [34], [35]. Ta primanjkljaj je še posebej velik, ko ni bilo eksplicitnih napotkov [8], [23], [34]-[36], kar nadalje nakazuje, da je lahko dopamin vključen v postopek priklica spomina. Te vrste primanjkljaja priklica spomina pri Parkinsonovih bolnikih so v nasprotju s pomanjkanjem spomina v drugih nevrotransmiterskih sistemih [37] ali zgodnja demenca pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo, ki so navadno oslabljeni pri učenju in utrjevanju novih spominov ob ohranjanju sposobnosti priklica starih spominov [34], [35]. To ponazarja potrebo po razvoju različnih terapevtskih strategij zaradi različnih ranljivosti za razlikovanje med molekularnimi in časovnimi procesi znotraj spominskih vezij.
Naša demonstracija, da je mogoče popolno reševanje dokončanja vzorca z injekcijo haloperiodola v času odpoklica okrepiti predstavo o vlogi uravnoteženih ravni dopamina pri pridobivanju spomina. Ta farmakološki poskus reševanja ponuja dodatne dokaze za časovno specifičnost, ki povzroči delni primanjkljaj odpoklica na podlagi iztočnic. Treba je opozoriti, da disfunkcije dopamina pri DAT+/− miši in pri Parkinsonovi pacienti se med seboj precej razlikujejo, vendar oboje pripelje do pomanjkanja vzorca. Ta skupnost zagotavlja kolektivno podporo mnenju, da je občutljivo ravnovesje dopaminskega sistema ključnega pomena za iskanje spomina, neravnovesje v kateri koli smeri (navzgor ali navzdol) pa bi povzročilo primanjkljaj v dokončanju spominskega vzorca med odpoklicem. Pomembno bi radi poudarili, da naše današnje analize ne bi smeli razlagati kot dokaz za uporabo mišjih mutant DAT kot modela Parkinsonove bolezni. Po drugi strani, vivo merjenje dopamina pri homozigotih miših DAT kaže znatno zmanjšanje sproščanja dopamina, ki ga sproži porušitvena stimulacija [38]-[40]. To kaže, da je zmožnost prevajanja nevronske aktivnosti vdreti v dopaminske signale v različnih možganskih regijah knockout miši. Možno je, da lahko zmanjšane spremembe razmerja dopamina privedejo do spremenjenih fizioloških sprememb v vzorcih vžiganja v nevronskih vezjih, ki sodelujejo pri obdelavi spomina. Trenutno ni znano, ali se podobna sprememba pojavlja tudi pri heteroroznih miših DAT ali pri bolnikih s Parkinsonovo boleznijo.
Čeprav je v zvezi z nevronskimi vezji, ki se aktivirajo med prostorskim spominom, malo znano, je verjetno, da zaposli več regij, vključno s predfrontalno skorjo, medialno temporalno skorjo in hipokampusom. To se dobro ujema z anatomskimi dokazi, da dopaminergični izhodi iz ventralnega tegmentalnega območja močno projicirajo na ventralno območje CA1 in entorhinal cortex[13], [28]. Ta predfrontalna-hipokampalna-VTA zanka ima lahko ključno vlogo pri ustvarjanju kontekstualne poznavanja, kar posledično spodbuja dokončanje vzorca med delnim odpoklicem prostorskega spomina na podlagi izvlečka z olajšanjem pozornosti, urejene z dopaminom. [3], [14], [26], [28]. V prihodnjih študijah bo pomembno, da se podrobneje opredelijo anatomske lokuse, iz katerih izvirajo opaženi primanjkljaji izpolnjevanja vzorca. Zlasti zanimivo bi bilo raziskati mesta kandidatov, kot so sprednja cingularna skorja, temporalna skorja in hipokampus z uporabo farmakoloških, genetskih in obsežnih in vivo tehnik zapisovanja [11], [41]-[44]. Pomembno je tudi oceniti, ali genetska kompenzacija ali počasne spremembe v mutiranih možganih prispevajo k opazovanemu primanjkljaju priklica. Obstajajo tudi znaki, da so lahko tudi drugi nevrotransmiterji kritično vključeni v regulacijo pridobivanja spomina [3], [37], [45], [46], in zelo zanimivo bi bilo pregledati in primerjati njihove dinamične interakcije med delnim zaključevanjem vzorca, ki ga sproži iztočnica, in popolnim iskanjem spomina na podlagi iztočnic. Na koncu naša študija kaže, da je občutljivo ravnovesje ravni dopamina ključnega pomena za dokončanje vzorca med asociativnim odpoklicem prostorskega spomina.
Materiali in metode
Etične izjave
Vsa dela na živalih, opisana v študiji, so bila opravljena v skladu s smernicami NIH in odobrena s strani institucionalnega odbora IACUC na Medical College of Georgia (Številka odobritve AUP: BR07-11-001).
Izdelava in genotipizacija mutantnih miši
Miše DAT so bile velikodušno darilo laboratorija dr. XiaoXija Zhuanga z univerze v Chicagu. Vzreja in genotipizacija hepatroznih miši DAT je enaka kot je opisano [6]. Za naše poskuse so bile v razmerju 1 enakomerno uporabljene tako moške kot samice miši![[razmerje]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR za DAT+/− miši je sledil protokol, kot je opisano [6]. Vse miši so bile vzdrževane v standardnih pogojih (23.1 ° C, 50.5% vlažnost) v zavodu za živali Medicinskega kolidža v državi Georgia. Vsi poskusi so bili izvedeni v zvočno izolirani in specializirani sobi za vedenje. Vsi eksperimentatorji so bili slepi za genotip posamezne živali.
Naloga za prepoznavanje novosti predmeta
Eksperimentalni protokol je bil enak predhodnemu opisu [37], [47]. Na kratko so bile miši posamezno naseljene v škatli z odprtim poljem (20 × 20 × 10 visoki palci) v dneh 3. Med vadbo sta bila na odprtem terenu postavljena dva nova predmeta in žival je bila dovoljena raziskovati 15 min. Zabeležen je bil čas, namenjen raziskovanju posameznih predmetov. Med enournimi testi odpoklica je bila žival postavljena nazaj v isti okvir, v katerem je bil eden izmed znanih predmetov med usposabljanjem nadomeščen z novim predmetom, in mu omogočili prosto raziskovanje 15 min. Indeks preferenc, razmerje časa, porabljenega za raziskovanje katerega koli od obeh predmetov (vadba) ali novega (zadrževalna seja), glede na skupni čas, namenjen raziskovanju obeh predmetov, je bil uporabljen za merjenje spomina za prepoznavanje.
Preskusi na odprtem polju in rota palice
Protokoli so bili enaki kot je opisano [48]. Za merjenje aktivnosti na odprtem polju smo miši postavili v odprto polje, izdelano iz črne škatle 14 × 14. Polje je bilo označeno z majhnimi kvadratnimi mrežami 2 × 2 (7 kvadratki s kvadratki 7 s skupnimi 49 kvadratki). Aktivnost na odprtem terenu živali smo merili s številom križancev, ki so jih miši opravile v 3-minutnem obdobju. Za merjenje testa Rota-palice smo miši postavili na pospešeno vrteče se lesene palice. Palica je dolga 12 in premera 1 palca. Začetna hitrost vrtenja je bila pri 4 vrtljajih in nato vztrajno pospeševala do 40 vrtljajev. Učinkovitost je bila izmerjena s časom (v sekundah), ki je mišem uspel ostati na vrtljivi palici med petminutnimi ali enournimi preizkusi priklica.
Dvignjeni labirintni testi
Protokoli so bili enaki kot je opisano [49]. Povišan plus labirint je izdelan iz nerjavečega jekla, ki je pobarvan mat črno in je sestavljen iz štirih krakov (dve odprti brez sten in dve zaprti z 15.25 cm visokimi stenami) dolžine 30 cm in širine 5 cm. Vsaka roka labirinta je pritrjena na trde kovinske noge, tako da je dvignjena 40 cm nad mizo, na kateri počiva. Dejavnost je zabeležil digitalni fotoaparat (Logitech Camera, model št. N231), postavljen 130 cm nad labirint. Testiranje je potekalo pod slabo svetlobo (ena 40-W in ena mehka bela žarnica 60-W, oba pod kotom, da ustvarjata posredno osvetlitev na labirintu) med svetlobno fazo cirkadianskega cikla (med 0900 h in 1400 h). Labirint smo med preskusi očistili z 5% ocetno kislino. Beli hrup (30 dB) prikrije zunanji hrup v ozadju. Na preskusni dan so živali v domače kletke pripeljali v preskusno sobo in vsak par živali nato odstranili iz njegove domače kletke in postavili v ločeno kletko za 5 min, preden so jih postavili na labirint. Živali so bile nameščene posamično v sredino labirinta, pri čemer je bil položaj glave med mišmi izenačen, vedenje pa je bilo zabeleženo za 5 min. čas, preživet na odprti roki in zaprti roki (ko so vse štiri šape glodalca na odprti ali zaprti roki), so bile zabeležene in analizirane.
Vsebinsko kondicioniranje strahu
Kondicioniranje strahu je bilo izvedeno, kot je opisano prej [45]. Poskus je bil izveden v sistemu za pripravo strahu, komori, ki je v zvočno oslabljeni škatli s hišno lučjo na stropu in rešetko iz nerjavečega jekla (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Tla rešetke so bila priključena na generator udarcev, slušni signal pa je izviral iz zvočnika, pritrjenega na steno komore. Vse dražljaje smo samodejno nadzirali z osebnim računalnikom s programom Graphic State. Pred kletko so postavili video kamero, da bi posneli vedenje. Z mišmi smo rokovali 3 dni in jih nato nastanili v vadbeni komori 5 min. Uporabljeni pogojeni dražljaj (CS) je bil zvok 85 dB pri 2.8 kHz, brezpogojni dražljaj (ZDA) pa je bil neprekinjeni udarni udarec stopala pri 0.8 mA za 2 s. Po enem samem končanem paru CS / US je žival ostala v komori še en 30 s za merjenje takojšnje zamrznitve. Med zadrževalnim testom smo vsako miško postavili nazaj v isto komoro, zamrznitvene odzive pa smo zabeležili za 5 min (kontekstualni odziv na zmrzovanje). Vsi testi so bili posneti pod rdečo svetlobo. Skupni čas zamrzovanja je bil izmerjen kot indeks spomina na strah. Obnašanje z zmrzovanjem je bilo opredeljeno kot popolno pomanjkanje gibanja brez dihanja. Obnašanje zamrzovanja je bilo ocenjeno s programsko opremo (Coulbourn Instruments) in pretvorjeno v odziv na zmrzovanje [odmrzovanje odziva 
= (skupni čas zamrzovanja / skupni čas testiranja) × 100%].
Preskusi prostorskega referenčnega spomina
Preskus prostorskega referenčnega spomina je bil vodni labirint skrite platforme. Sledili smo protokolu, kot so ga predhodno opisali Nakazawa in sod. [22]. Izobraževanje je obsegalo štiri preskuse na dan, med eno preizkušnjo pa eno uro. Gibanje miši je bilo spremljano z video kamero in merjeno s programsko opremo (Noldul Information Technology, Nizozemska). Vse zabeležene in analizirane so bile zamude pri pobegu na ploščad, kot tudi zasedenost kvadrantov in prečkanje ploščadi. Bazen ima premer 118 cm, ploščad pa premer 9.5 cm. Opravljeni so bili štirje sondi. Prvi preizkus sonde (P1) je bil izveden dan po zadnjem treningu pod pogoji, ki so bili v celoti pripravljeni (Day 11). Drugi test sonde (P2) je bil izveden na dan 12 pod pogoji delne nastavitve (z odstranjevanjem treh od štirih vizualnih napisov, ki so bili obešeni na steni črne zavese). Za DAT+/− miši, izvedli smo tretji poskusni preskus (P3) na dan 13 pod pogoji polne nastavitve in četrti preizkus sonde (P4) na dan 14 pod pogoji z delno nastavitvijo. Še en blok (preizkušanja 4) usposabljanja je bil opravljen 1 uro po testih P1, P2 in P3, da bi preprečil morebitno izumrtje, ki bi se lahko zgodilo med poskusom sonde. Poleg tega smo za izključitev učinka sestavljenosti, ki bi ga verjetno predpretrenirali pred P4 (test sonde z delnim nanosom in injiciranjem haloperidola), podvrgli drugi skupini DAT+/− miši ter njihovi nadzorni divji mladiči na dveh dodatnih testiranjih (P3 'in P4' preskusi). Testiranje sonde P3 je bilo izvedeno en dan po zadnjem treningu pod pogoji, ki so bili pripravljeni na dan (10. dan). Preizkus sonde P4 je bil izveden 11. dne pod pogoji delne nege. Med vsemi našimi testi sonde je bila ploščad odstranjena in mišem je bilo dovoljeno plavati v bazenu toliko časa, kot so jih uporabljali med treningom (60 sek). Zabeležen je bil čas, porabljen v vsakem kvadrantu. Za obnovitev ravni dopamina [6], [20], [21], miši iz DAT+/− in kontrolnim skupinam smo injicirali intraperitonealno bodisi haloperidol (0.002 mg / kg telesne teže) bodisi s fiziološko raztopino 30 minut pred preskušanji sond P4 in P4 '.
Analiza podatkov
Za upoštevanje korelacije znotraj živali med ponavljajočimi meritvami so bili uporabljeni linearni mešani modeli za oceno vedenjske učinkovitosti v vodnem labirintu Morris, prepoznavanje novih predmetov, testiranje kontekstualnega strahu in testi rotirajočih palic. Za določitev pomena teh vedenjskih meritev med DAT je bila uporabljena metoda Tukey – Kramer+/− miši in kontrolni sorodniki. V preskusih na prostem in povišanih vrednostih labirinta sta bila za določanje učinkov genotipa uporabljena enosmerni ANOVA in post hoc Dunnettov test. Neprekinjene spremenljivke so predstavljene kot povprečje in standardna napaka povprečja (SEM). Podatki so bili analizirani z uporabo SPSS različice 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Razlike so bile pomembne pri P <0.05.
Priznanja
Zahvaljujemo se dr. Xiaoxi Zhuang z univerze v Chicagu za zagotavljanje DAT+/− KO miši in Brianna Klein za tehnično pomoč pri poskusih.
Opombe
Konkurenčne interese: Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi.
Financiranje: Ta raziskava je bila podprta s sredstvi NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance in komisije za znanost in tehnologijo občine Šanghaj (10140900500) (vsi JZT). Kitajska nacionalna znanstvena fundacija (81000592), Komisija za znanost in tehnologijo občine Šanghaj (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 in 10JC1411200), Šanghajska občinska komisija za izobraževanje (11ZZ103) za FL in XMS. Finančniki niso imeli nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranju in analizi podatkov, odločitvi o objavi ali pripravi rokopisa.
;