PLoS One. 2014; 9 (11): e113612.
Objavljeno na spletu 2014 Nov 20. doi: 10.1371 / journal.pone.0113612
PMCID: PMC4239080
Bart P. de Kwaasteniet,#1,2,* Chedwa Pinto,#3 Eric HG Ruhé,1,2,6 Guido A. van Wingen,1,2 Jan Booij,2,4 in Damiaan Denys1,2,5
Huaibin Cai, urednik
Ta članek je popravljen. Glej PLoS One. 2015 avgust 13; 10 (8): e0135764.
Minimalizem
Več študij je pokazalo izboljšanje depresivnih simptomov pri depresiji, odpornih na zdravljenje (TRD), po dajanju agonistov dopamina, ki kažejo na nenormalno dopaminergično nevrotransmisijo pri TRD. Vendar pa je vloga dopaminergične signalizacije z merjenjem striatalnega dopamina D2/3 vezava na receptorje (D2 / 3R) pri preiskovancih TRD ni bila raziskana. Smo uporabili [123I] IBZM računalniška tomografija z enim fotonom (SPECT) za raziskovanje vezave striatalne D2 / 3R pri TRD. Vključili smo 6 hudih bolnikov s TRD, 11 hudih bolnikov s TRD na antipsihotikih (skupina TRD AP) in 15 ujemajočih se zdravih kontrol. Rezultati niso pokazali pomembne razlike (p = 0.75) v razpoložljivosti striatalnih D2 / 3R med bolniki s TRD in zdravimi kontrolami. V skupini s TRD AP je bila razpoložljivost D2 / 3R znatno zmanjšana (kar odraža zasedenost D2 / 3R z antipsihotiki) glede na bolnike s TRD in zdravo kontrolo (p <0.001), vendar ni bilo razlik v kliničnih simptomih med bolniki s TRD AP in TRD. Ta predhodna študija torej ne daje dokazov za velike razlike v razpoložljivosti D2 / 3 pri hudih bolnikih s TRD in kaže, da za to podskupino TRD ni značilen spremenjen dopaminergični prenos. Zdi se, da atipični antipsihotiki nimajo klinične koristi pri hudih bolnikih s TRD, ki ostajajo depresivni, kljub močni zasedenosti D2 / 3R.
Predstavitev
Približno tretjina bolnikov z veliko depresivno motnjo (MDD) se ne odzove na dve ali več preskušanj z različnimi razredi antidepresivov in velja za odporne na zdravljenje [1], [2]. Depresivno odporna depresija (TRD) je povezana s splošno slabšo prognozo in visokimi zdravstvenimi stroški [3]. Trenutno je malo znano o patofiziologiji TRD, vendar je več raziskav pri osebah s TRD pokazalo izboljšanje depresivnih simptomov po zdravljenju z agonisti dopamina [4]-[6]. Te ugotovitve torej kažejo, da je nenormalno dopaminergično nevrotransmisija vpletena v patofiziologijo TRD [7].
Aberantna dopaminergična nevrotransmisija je poleg tega povezana tudi z disfunkcionalnimi nagrajevalnimi / motivacijskimi sistemi in anhedonijo; absolutna ali relativna nezmožnost doživeti užitek. Anhedonija je eden od dveh ključnih simptomov, potrebnih za diagnozo MDD [8]. Pri TRD je anhedonija pogosto bolj globoka in dolgotrajna in je povezana s pomanjkanjem nagradnih / motivacijskih sistemov v možganih. Nagrado in motivacijo posreduje mezolimbični sistem, ki je eden glavnih možganskih dopaminergičnih poti [7]. Ta mezolimbični trakt izvira iz ventralnega tegmentalnega območja (VTA) in štrli v ventralni striatum (vključno z nukleus acumbens), hipokampusom in amigdalo.
Relativno malo nevroloških slik je preučilo dopaminergični sistem pri MDD z bodisi pozitronsko-emisijsko tomografijo (PET) bodisi z računalniško tomografijo z enim fotonskim emisijam (SPECT) in poročalo o nedoslednih ugotovitvah [9], [10]. Študije, ki preiskujejo dopamin D2/3 o razpoložljivosti receptorjev (D2 / 3R) so poročali o povečani dostopnosti striatalnih D2 / 3R pri bolnikih z MDD v primerjavi s kontrolo [11], [12]kot tudi povečana strijatalna razpoložljivost D2 / 3R pri podskupini bolnikov z MDD s psihomotorno zaostalostjo [13], [14]. Povečana razpoložljivost D2 / 3R lahko odraža bodisi povečano regulacijo D2/3 receptorji, povečana afiniteta receptorja za radioligand ali zmanjšana sinaptična koncentracija dopamina [7]. Zato so dokazi o spremenjeni dopaminergični funkciji pri MDD nedvomni, saj tudi druge študije niso pokazale razlik med MDD in zdravimi kontrolami. [15], [16]. Razlaga teh nedoslednih ugotovitev je lahko ta, da so te študije vključevale bolnike z MDD z raznovrstnimi kliničnimi značilnostmi, ki bi lahko bile podvržene različnim kliničnim podskupinam. Zanimivo je, da so za TRD značilne bolj poglobljene disfunkcije mrež za uravnavanje razpoloženja glede na depresijo, ki ni odporna na zdravljenje [17], [18], kar kaže, da so bolniki s TRD na najslabšem koncu neprekinjenega spektra depresije. Poleg tega so bolniki s TRD pogosto bolj anhedonski in psihomotorno zaostali in se večino časa niso odzvali na serotonergična ali noradrenergična zdravila, zato so lahko motnje pri bolnikih s TRD povezane z zmanjšano dopaminergično signalizacijo. Doslej strijatalne vezave D2 / 3R pri bolnikih s TRD niso raziskali.
Zato je bil cilj te študije raziskati strijatalno vezavo D2 / 3R pri hudih bolnikih s TRD, da bi preizkusili hipotezo, ali je za TRD bolnike značilen zmanjšan dopaminergični prenos, kar se odraža s povečano vezavo D2 / 3R. Izvedli smo in vivo meritve strijatalne vezave D2 / 3 pri bolnikih z zdravilom 6 TRD v primerjavi z zdravstvenimi kontrolami 15. Dodatno smo raziskali vpliv antipsihotikov na strijatalno razpoložljivost D2 / 3R pri bolnikih z 11 TRD in ali so ta zdravila povezana z izboljšanjem simptomatologije.
Metode
Predmeti
Vključili smo paciente 6 TRD, paciente 11 TRD na antipsihotike (skupina TRD AP) in zdrave kontrolne subjekte 15, ki se ujemajo glede na starost in spol. Bolnike s TRD so zaposlili na oddelku za psihiatrijo Akademskega medicinskega centra (AMC) v Amsterdamu in bolnišnici St. Elisabeth v Tilburgu. Študijo sta odobrila Medicinsko etični odbor AMC Univerze v Amsterdamu (METC AMC) in Medicinsko etični odbor bolnišnice St. Elizabeth (METC St. Elisabeth). Vsi subjekti so dali pisno informirano privolitev. Kriteriji za vključitev oseb, ki prejemajo TRD in TRD AP, so bili: (i) starost med 18 in 65 leti; (ii) skupna lestvica stopnje depresije Hamiltona (HAM-D) ≥18; (iii) primarna diagnoza MDD v skladu z merili za diagnostiko in statistiko pri duševnih motnjah (DSM-IV) in ocenjena s strukturiranim kliničnim intervjujem za DSM-IV (SCID) [19]. Za zajem najhujših bolnikov s TRD smo vključili le bolnike z trajanjem bolezni> 2 leti, ki se niso odzvali na (i) vsaj dva ustrezna zdravljenja dveh različnih sodobnih antidepresivov (selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina, zaviralci ponovnega privzema serotonina in norepinefrina). , ali noradrenergični in specifični serotonergični antidepresivi) in (ii) triciklični antidepresiv in (iii) ireverzibilni zaviralec monoaminooksidaze (MAO) in (iv) vsaj 6 sej dvostranske elektrokonvulzivne terapije (ECT). Merila za izključitev so bila: (i) Parkinsonova bolezen, demenca ali epilepsija; (ii) bipolarna motnja; (iii) shizofrenija ali zgodovina psihoze, ki ni povezana z MDD; (iv) zloraba alkohola ali substanc v zadnjih 6 mesecih; in (v) asocialna osebnostna motnja. V strukturiranem kliničnem intervjuju za motnje DSM-IV so pregledali zdrave kontrole, da bi potrdili odsotnost psihiatrične ali nevrološke bolezni [19]. Nihče od zdravih udeležencev ni poročal o družinski anamnezi psihiatrične bolezni. Uporabili smo HAM-D [20] in lestvica stopnje depresije Montgomery Asberg (MADRS) [21] za količinsko opredelitev resnosti depresije. Za določitev stopnje odpornosti na zdravljenje je bila uporabljena Maudleyjeva postopna metoda (MSM) [22],[23]. Rezultat MSM vključuje različne klinične parametre; trajanje trenutne depresivne epizode, resnost simptomov in raven delovanja, merjeno z oceno globalne ocene delovanja (GAF). Za celoten seznam teh kliničnih spremenljivk navajamo Fekadu in sod [22].
Protokol računalniške tomografije z enotno fotonsko emisijo
SPECT skeniranje je bilo izvedeno z enosektričnim možganskim skenerjem 12 detektorja (Neurofocus, Inc., Medfield, MA, ZDA). Preiskovanci so bili opravljeni z meritvijo potencialnega vezavnega potenciala D2 / 3R (BP)ND) z uporabo selektivnega antagonista D2 / 3R [123I] jodbenzamid ([123I] IBZM). Uporabili smo bolus / stalno tehniko infuzije, ki je bila podrobno opisana že prej [24], [25]. SPECT podatki so bili pridobljeni za 60 minut, začenši z 120 minut po infuziji radioliganda. Na dan skeniranja osebe niso smele uporabljati alkohola, kave in cigaret, ker je bilo to povezano s spremenjenim strijatalnim sproščanjem dopamina [26], [27].
Rekonstrukcija slike in analiza
Podatki SPECT so bili rekonstruirani v načinu 3-D in korekcija atenuacije vseh slik je bila izvedena, kot je opisano prej [28]. Za kvantifikacijo je bila izvedena analiza območja zanimanja (ROI). Fiksni ROI so bili postavljeni za striatum in kot referenco okcipitalna skorja [25]. Povprečna in trajnostna in srednja okcipitalna vezava sta bila povprečno določena od desne in leve ROI. Potem pa BPND je bilo izračunano kot razmerje med specifično in nespecifično vezavo ((skupna aktivnost v striatumu - aktivnost v zatilni skorji) / aktivnost v zatilni skorji). Vse preiskave je analiziral en preiskovalec (CP), ki je bil slep za klinične podatke. Da bi izmerili medsebojni sporazum, sta dva avtorja (CP in BdK) neodvisno analizirala BPND pri desetih predmetih. Korekcijski koeficient znotraj razreda (ICC) je bil 0.94 za levi in 0.95 za desni striatum, kar kaže na odlično soglasje obeh ocenjevalcev.
Statistična analiza
Razlike v starosti, HAM-D in MADRS ocene so bile ovrednotene z enosmerno analizo variacije (ANOVA) in razlikami med spoloma s testom chi-kvadrat. Primerjava strijatalne razpoložljivosti D2 / 3R med TRD, TRD AP in zdravimi kontrolnimi osebami je bila izvedena tudi z ANOVA. Z uporabo najmanjše pomembne razlike (LSD) ANOVA post-hoc test smo raziskovali razlike v razpoložljivosti D2 / 3R med bolniki s TRD in zdravimi kontrolnimi skupinami, med bolniki s TRD AP in zdravimi kontrolami ter med bolniki s TRD AP in TRD. Ker na razpoložljivost D2 / 3R vpliva starost [29] in spol [30], smo te spremenljivke dodatno vključili kot kovarijate v skupinske analize z uporabo enosmerne analize kovariance (ANCOVA). Za stopnjo pomembnosti je bila izbrana dvostranska verjetnostna vrednost 0.05.
Rezultati
Značilnosti pacienta
TRD, TRD AP in kontrolni subjekti so bili primerljivi glede na starost in spol (Tabela 1). Rezultati HAM-D in MADRS se med bolniki s TRD in TRD AP niso razlikovali, kar kaže na razliko v resnosti depresije med obema skupinama. Srednji rezultati MSM bolnikov s TRD so bili 11.8 (± 1.0) in za bolnike s TRD AP 11.8 (± 0.5), kar kaže na visoko stopnjo odpornosti na zdravljenje v obeh skupinah. Poročajo o pregledu uporabe zdravil vsakega bolnika s TRD in TRD AP Tabela 2.
SPECT slikanje
Med bolniki s TRD in zdravimi kontrolnimi skupinami (p = 2) ni bilo pomembnih razlik v povprečju progastega D3 / 0.75R, kar kaže na to, da dopaminergični nevrotransmisija ni bila bistveno spremenjena pri bolnikih s TRD (Tabela 1, Slika 1 in In2) .2). Standardizirana velikost učinka je bila 0.21. Poleg tega je bila povprečna razpoložljivost D2 / 3R skupine TRD AP znatno nižja v primerjavi s TRD (p = 0.001) in zdravo kontrolno skupino (p <0.001). Ker so bili antipsihotiki, ki so jih uporabljali bolniki s TRD AP, vsi antagonisti dopaminskih receptorjev, to dokazuje močno zasedenost striatnih D2 / 3R (Tabela 1, Slika 2; zasedenost 50% ± 20%). Popravek starosti in spola ni bistveno vplival na te rezultate.
Razprava
Ta predhodna študija je, kolikor nam je znano, prva, ki je raziskala razpoložljivost progastega D2 / 3R v TRD. Vključili smo edinstveno skupino hudih bolnikov s TRD, ki so bili upravičeni do globoke možganske stimulacije, z boleznijo, daljšo od 2 let, opredeljeno kot neodzivnost na vsaj štiri ustrezna zdravljenja različnih antidepresivov in vsaj 6 seje dvostranskih ECT. Nismo pokazali nobenih pomembnih razlik v strijatalni razpoložljivosti D2 / 3R pri bolnikih s TRD glede na zdrave kontrolne skupine, kar kaže na to, da dopaminergični nevrotransmisija pri TRD ni bistveno spremenjena. Poleg tega so preiskovanci s TRD AP pokazali znatno zmanjšano strijatalno razpoložljivost D2 / 3R glede na TRD in zdrave kontrolne osebe, kar odraža pomembno zasedenost D2 / 3R (ocenjeno na približno 50%) zaradi teh atipičnih antipsihotikov. Zanimivo je, da kljub velikim razlikam v zasedenosti receptorjev depresivni simptomi pri bolnikih s TRD AP niso bili izboljšani.
Pred tem je kazalo, da je zlasti TRD povezan z dopaminergično disfunkcijo [7]. Ker je za TRD značilno bolj poglobljeno delovanje omrežij za uravnavanje razpoloženja [17], [18], pričakovali smo, da bodo pokazali hujšo dopaminergično disfunkcijo in kot tako povečali razpoložljivost D2 / 3R v primerjavi s kontrolo. Kljub temu pri bolnikih s TRD nismo opazili pomembne razlike v razpoložljivi strijatalni D2 / 3R v primerjavi s kontrolo. Za to ugotovitev predlagamo več razlag. Prvič, druge študije so poročale o razlikah v razpoložljivosti D2 / 3R pri psihomotornih bolnikih [13], [14]. V našem vzorcu smo uporabili postavko 8 (razpon od 0 do 4) rezultatov HAM-D za merjenje psihomotorne zaostalosti, ki je pokazala, da so ti bolniki s TRD le zmerno trpeli zaradi psihomotorne zaostalosti. Na žalost v naši raziskavi primanjkuje občutljivejših testov za merjenje motorične zaostalosti, kot je naloga prsta [14]. Zato ne moremo izključiti možnosti, da so bili pri naših bolnikih manj psihomotorno zaostali kot v prejšnjih raziskavah [13], [14]. Drugič, v sedanji vzorec so bili bolniki z TRD vključeni šele po neodgovoru na zaviralce MAO. Ker zaviralci MAO zvišajo koncentracijo dopamina, je mogoče hipotezo, da zlasti v podskupini bolnikov z dobrim odzivom na zaviralce MAO lahko obstaja hipodopaminergično stanje. To bi lahko razložilo, zakaj v trenutnem vzorcu neodzivnih na zaviralce MAO niso bile ugotovljene razlike v strijatalni razpoložljivosti D2 / 3R. Vendar ta hipoteza še ni bila raziskana. Tretjič, sedanji vzorec je lahko premajhen, da bi zaznal razlike v prosti razpoložljivosti D2 / 3R med TRD in kontrolnimi osebami. Pomembno pa je, da je bila standardizirana velikost učinka majhna (d = 0.21). To pomeni, da je treba vključiti vsaj paciente 343, da se pokaže pomembna razlika v skupini (pri statistični moči 0.8). Zato se zdi, da je možnost, da bodo prihodnje večje študije povečale razpoložljivost D2 / 3R v tej podskupini bolnikov s TRD, majhna. Poleg tega so naše sedanje ugotovitve skladne z več raziskavami MDD, ki prav tako niso poročale o razlikah v razpoložljivi D2 / 3R glede na zdrave kontrole [15], [16]. Vendar pa so te študije vključevale različne klinične skupine, pri katerih so bili večinoma občutljivi na zdravljenje bolniki in krajše trajanje bolezni, kar ovira neposredne primerjave.
Kot je bilo pričakovano, so preiskovanci s TRD AP pokazali znatno zmanjšano strijatalno razpoložljivost D2 / 3R v primerjavi s preiskovanci TRD (kar odraža zasedenost D2 / 3R s strani antipsihotikov). Trenutno zasedenost D2 / 3R (približno 50%) v skupini TRD AP je primerljiva z atipičnimi antipsihotiki pri bolnikih s shizofrenijo [31], [32]. Ker nismo pokazali pomembnih razlik v depresivnih simptomih med temi skupinami pri ustrezni stopnji zasedenosti, to kaže, da niti monoterapija ali povečanje z atipičnimi antipsihotiki v tej specifični skupini TRD ne prinašata kliničnih koristi, kar kaže na to, da bi te antipsihotike pri teh bolnikih lahko zmanjšali. Pomembno je, da imajo vsa antipsihotična zdravila, ki jih uporabljajo bolniki s TRD AP, opazen 5-HT2A zasedenost receptorjev, za katero se je izkazalo, da izboljšuje simptome depresije [33]. 5-HT2A zasedenost receptorjev pri teh bolnikih zato ne more pojasniti pomanjkanja kliničnega izboljšanja v tej skupini. Razlaga za neodzivnost je lahko ta, da so ti netipični antipsihotiki vsi antagonisti dopaminskih receptorjev. Zanimivo je, da je več raziskav pokazalo, da so dodatni agonisti dopamina, kot je pramipeksol, učinkoviti pri bolnikih s TRD [6], [34], [35] kar kaže na to, da bi lahko bilo zdravljenje povečevanja dopaminskih agonistov učinkovito tudi pri sedanjih bolnikih s TRD. Ugibamo, da je za povečanje motivacijskih procesov v možganih lahko koristna neposredna stimulacija dopaminskih receptorjev D2 / 3. [36].
Kljub pogosti uporabi netipičnih antipsihotikov pri psihotični depresiji [37], [38], dokazano je bilo učinkovito povečanje majhnih odmerkov teh zdravil pri (ne psihotičnih) bolnikih s TRD [39], [40]. Vendar je bil v teh razširitvnih študijah TRD večinoma opredeljen kot neodzivnost na samo dve preskušanji antidepresivov. Prisotni bolniki s TRD se poleg tega niso odzvali na več razredov antidepresivov, kot so triciklični antidepresivi in zaviralci MAO, kar lahko nadalje pojasni neodzivnost na atipične antipsihotike, ki pri hujših bolnikih s TRD morda nimajo klinične koristi. Vendar bi bilo potrebno randomizirano nadzorovano preskušanje, da bi dokončno ugotovili, ali je antipsihotično povečanje pri hudem TRD klinično koristno.
Priznavamo več omejitev te študije. Prvič, več raziskav je pokazalo, da striatum ne vsebuje samo D2 / 3 receptorjev, ampak tudi dopaminske D1 receptorje, ki delujejo po različnih celičnih poteh [41]. Dopaminski receptor D1 je del poddružine, podobne D1, ki vsebuje tudi receptor D5 za dopamin [41]. Striralni D1 receptorji so del neposredne nigrostriatalne izhodne poti, medtem ko D2 receptorji prevladujejo v posredni poti [42]. Kljub tem funkcionalnim razlikam je študija na živalih pokazala, da sočasna aktivacija receptorjev D1 in D2 v lupini nukleusov nastane kooperativni učinek na regulacijo motivacije, tj. Nagradne procese nagrajevanja z dopaminom [43]. Odkar je depresija povezana z nefunkcionalnim sistemom nagrajevanja / motivacije [44], [45], te ugotovitve kažejo, da lahko spremenjena ekspresija receptorjev D1 privede do motenj motivacijskega sistema pri bolnikih z MDD. Vendar pa, kolikor vemo, nobena študija na ljudeh ni raziskovala progaste razpoložljivosti D1 pri MDD niti pri TRD. Radioligand Pozitron-emisijske tomografije (PET) [11C] SCH23390 se veže na dopaminske D1 podobne receptorje [46]in v manjši meri na D5 receptorje. Ker je ekspresija receptorjev D5 v striatumu nižja, [11C] Vezava SCH23390 bo odražala predvsem razpoložljivost receptorjev D1. [11C] SCH23390, pa tudi drugi ligandi, kot so [11C] NNC 756 [47] ali [11C] SKF 82957 [48] zato bi ga lahko uporabili za raziskovanje razpoložljivih receptorjev D1 strijatalnega dopamina pri bolnikih z MDD in TRD.
Drugič, trije od šestih bolnikov s TRD je uporabljalo psihotropna zdravila, ki so lahko vplivala na razpoložljivo D2 / 3R. Eden od teh bolnikov je uporabil zaviralec MAO, ki v striatumu poveča koncentracijo sinaptičnega dopamina [49]. Zato bi lahko uporaba tega zdravila s povečano konkurenco z radioligandom zmanjšala razpoložljivost D2 / 3R pri tem bolniku. Vendar pa izključitev tega pacienta ni spremenila rezultatov. Pravzaprav so potrebna velika povečanja koncentracije dopamina za zmanjšanje [123I] vezava IBZM in vivo. Drugi bolnik s TRD je uporabil mirtazapin, ki je noradrenergičen in specifičen serotonergični antidepresiv (NaSSA). Čeprav mirtazapin nima afinitete do dopaminskih receptorjev, pa z aktivacijo 5-HT poveča sproščanje dopamina v predfrontalni in okcipitalni skorji.1A receptorja in blokade adrenergičnih receptorjev α2 [50], [51]. Vendar pa ni dokazov, da mirtazapin povečuje sproščanje strijatalnega dopamina, kar kaže na to, da se strijatalna vezava D2 / 3R z uporabo mirtazapina ne spremeni. Tretjič, z [123I] IBZM lahko in vivo merimo strijatalne D2 / 3R. Vendar posledično ne moremo izključiti razlik v ekstrastratičnih D2 / 3R v TRD, ki jih ni mogoče količinsko ovrednotiti. Nazadnje nismo izbrali pacientov s TRD na podlagi simptomatologije, kot sta psihomotorna zaostalost in / ali anhedonija, ki bi lahko predstavljala podskupino z zmanjšano razpoložljivostjo D2 / 3R.
V zaključku pričujoča študija ni odkrila razlik v razpoložljivi receptorji D2 / 3R pri bolnikih z MDD, ki so zelo odporni na zdravljenje, pri zdravih osebah. To je v nasprotju s hipotezo, da je za TRD značilen spremenjen dopaminergični prenos. Rezultati so pokazali tudi, da je dodatno zdravljenje z antipsihotiki zmanjšalo razpoložljivost receptorjev D2 / 3R (zaradi zasedenosti D2 / 3R s strani antipsihotikov) pri TRD. Pomembno je tudi, da ker depresivni simptomi pri teh bolnikih s TRD AP niso zmanjšali, to kaže na to, da pri atipičnih antipsihotikih klinične prednosti pri bolnikih, ki so jim jemali različna antidepresiva in ostajajo depresivni.
Priznanja
Zahvaljujemo se Elsmarieke van de Giessen in Evelien Zoons za zagotavljanje zdrave kontrole, pacientov in zdravih kontrol za sodelovanje pri skeniranju SPECT. Pod pogojem, da so zdrave kontrole: EvdG, EZ.
Izjava o financiranju
Dr. HG Ruhéja podpira NWO / ZonMW VENI-Grant #016.126.059. Finančniki niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije, zbiranju in analiziranju podatkov, odločitvi za objavo ali pripravi rokopisa.
Reference
;
