Optogenetics razkriva vlogo za akumalnega medija trde kirurgije nevronov, ki izražajo receptorje dopamin D2 v kokain-induced vedenjske senzibilizacije (2014)

Pojdi na:

Minimalizem

Predlagane so bile dolgotrajne prilagoditve, ki jih povzročajo droge v jedru nucleus accumbens (NAc) in prispevajo k odvisnosti od drog. Pri tem smo uporabili optogenetski pristop za preučevanje vloge srednjih živčnih nevronov NAc (MSN), ki izražajo receptorje za dopamin D2 (D2Rs) pri vedenjski senzibilizaciji zaradi kokaina. Adeno-povezane virusne vektorje, ki kodirajo kanalrodhodin-2 (ChR2), smo dali v NAc transgenih miši D2R-Cre. To nam je omogočilo selektivno fotostimuliranje D2R-MSN-jev v NAc. D2R-MSN tvorijo lokalna inhibitorna vezja, ker je fotostimulacija D2R-MSN izzvala inhibitorne postsinaptične tokove (IPSC) v sosednjih MSN-jih. Fotostimulacija NAc D2R-MSN vivo ne vplivajo niti na iniciacijo niti na izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina. Vendar pa je fotostimulacija med karenco prekinila izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina. Ti rezultati kažejo, da imajo D2R-MSN-ji NAc ključno vlogo pri plastičnosti, ki jo povzroči umik, in lahko prispevajo k ponovitvi bolezni po prekinitvi zlorabe drog.

ključne besede: optogenetika, srednji steberni nevroni, dopamin D2 receptorji, kokain, zasvojenost z drogami

Predstavitev

Dopaminsko (DA) signaliziranje je povezano z pričakovanjem nagrajevanja in ciljno usmerjenim vedenjem (Wise, 2004; Goto in Grace, 2005; Berridge, 2007). Ena od dobro znanih patologij dopaminergičnih motenj je odvisnost od drog (Robinson in Berridge, 1993, 2003). Po večkratni izpostavljenosti odvisnim snovem se pri mezolimbični poti DA pojavijo prilagoditvene spremembe na molekularni in celični ravni; to lahko privede do odvisnosti od drog, kar je kronična, ponavljajoča se motnja, pri kateri kompulzivno vedenje zaradi drog in obnašanje drog vztraja kljub resnim negativnim posledicam (Thomas et al., 2008; Baik, 2013). Karakterizacija modifikacij, ki potekajo v mezolimbičnem dopaminergičnem sistemu, je tako ključna za razumevanje odvisnosti od drog.

Receptorji dopamin D1 (D1R) in D2 (D2R) so visoko izraženi v srednjih živčnih nevronah (MSN) striatuma. Predlagano je bilo, da dolgotrajne prilagoditve, ki jih povzročajo droge v ventralnem striatumu, bolj znane kot nucleus accumbens (NAc), prispevajo k razvoju zasvojenosti kot tudi vedenju za iskanje drog in ponavljanju (Lobo in Nestler, 2011; Smith et al., 2013). Dopaminergična celična telesa iz ventralnega tegmentalnega območja večinoma inervirajo NAc. Več kot 95% celic znotraj NAc so MSN, ki prejmejo vzbujevalne vhode iz štirih glavnih regij možganov: prefrontalni korteks, ventralni subikulum hipokampusa, bazolateralna amigdala in talamus (Sesack in Grace, 2010; Lüscher in Malenka, 2011). MSN-je v NAc-ju lahko razdelimo na dve veliki podpopulaciji: MSN-ove neposredne poti, ki izražajo D1R in projektirajo neposredno na sredinska območja DA, in posredne MSN-je, ki izražajo D2R in projektirajo v ventralni palidum (Kreitzer in Malenka, 2008; Sesack in Grace, 2010; Lüscher in Malenka, 2011; Smith et al., 2013). Ker je MSN GABAergic, bo aktivacija MSN-jevih nevronov zavirala njihove cilje v smeri toka, ki so tudi GABAergic (Chevalier in Deniau, 1990). Zato bo aktivacija D1R-MSN-jev vzbujala nevrone srednjega možganskega DA, kar bo prispevalo k urejanju vedenja, povezanega z nagrajevanjem (Lüscher in Malenka, 2011; Bocklisch et al., 2013).

Nedavne študije z uporabo gensko spremenjenih miši, ki izražajo Cre rekombinazo na način, specifičen za celični tip, so pokazale različne vloge za D1R-MSN in D2R-MSN v kokainskem obnašanju. Takšne miši omogočajo genetsko ciljanje specifičnih toksinov, optogenetskih sond ali DREADD (oblikovalski receptorji, ki jih izključno aktivira dizajnerska droga) za selektivno manipulacijo D1R-MSN ali D2R-MSN. Ta pristop je privedel do nekakšnega soglasja o vlogi MSN-jev pri obnašanju odvisnosti: D1R-MSN očitno spodbujajo zasvojenost, medtem ko za D2R-MSN ni bila predlagana nobena posebna vloga (ali zaviralna vloga) pri razvoju zasvojenosti z drogami. (Hikida et al., 2010; Lobo et al., 2010; Ferguson et al., 2011; Bock et al., 2013). Izpostavljenost kokainu očitno povzroča sinaptične spremembe in spremembe v izražanju genov v obeh MSN populacijah (Lobo et al., 2010; Lobo in Nestler, 2011; Grueter et al., 2013). Čeprav se zdi, da D1R-MSN in D2R-MSN igrajo nasprotujoče si vloge v odvisnosti od kokaina, natančna vloga D2R-MSN ni jasna.

Pred tem je bilo dokazano, da miši z izločanjem D2R (KO) kažejo normalno vedenjsko preobčutljivost pri kokainu in vedenje pri iskanju kokaina, le rahlo zmanjšanje občutljivosti zaradi odsotnosti D2R (Baik et al., 1995; Chausmer et al., 2002; Sim et al., 2013). Vendar pa izpostavljenost stresu med prekinitvijo zdravljenja zavira izražanje vedenjske senzibilizacije, ki jo povzroča kokain, in vedenje pri iskanju kokaina in ponavljanju bolezni pri miših D2R KO (Sim et al., 2013). Specifično znižanje D2R v NAc ne vpliva na bazalno lokomotorno aktivnost, niti na vedenjsko senzibilizacijo zaradi kokaina, vendar podeljuje sposobnost stresa, da zavira izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina (Sim et al., 2013). Te ugotovitve močno kažejo, da blokada D2R v NAc ne preprecuje vedenjske senzibilizacije, ki jih posreduje kokain. Namesto tega se zdi, da ima D2R v NAc pomembno vlogo pri regulaciji sinaptičnih modifikacij, ki jih sproži stres, med umikom, kar vodi do povečanja vedenja pri iskanju kokaina in ponavljanju (Sim et al., 2013).

Tu smo uporabili optogenetiko za nadaljnjo oceno vloge NAc D2R-MSN-jev pri vedenjski senzibilizaciji zaradi kokaina. Z uporabo možganskih rezin ugotavljamo, da fotostimulacija D2R-MSN aktivira lokalna inhibitorna vezja znotraj NAc, ki vključujejo sosednje MSN-je. Fotostimulacija NAc D2R-MSN vivo ne vpliva niti na sprožanje niti na izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina. Vendar pa ponavljajoča aktivacija NAc D2R-MSN med prekinitvijo zdravljenja zmanjša odvisnost, ki jo povzroča kokain. Naši rezultati kažejo, da imajo D2R-MSN-ji NAc ključno vlogo pri plastičnosti, ki jo povzroči odtegnitev, in lahko prispevajo k ponovitvi bolezni po prekinitvi zlorabe drog.

Materiali in metode

Miši

D2-Cre BAC transgene miši na ozadju C57BL / 6 so bile pridobljene iz MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). V vedenjskih poskusih so kot kontrole za D2-Cre miši uporabili koščke, ki niso imeli transgena D2-Cre. Miševi so vzdrževali v posebni pregradi brez patogenov pod stalnimi temperaturnimi in vlažnimi pogoji in na temnem urniku 12-h svetlobe 12-h. Nega in ravnanje z živalmi sta bila izvedena v skladu s standardi, ki so jih odobrili Institucionalni odbori za nego živali in uporabo Korejske univerze in KIST.

Priprava virusnega vektorja

Karl Deisseroth (Stanford Univ.) je dal velikodušno pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE. Za pripravo AAV so bile HEK293T celice gojene v DMEM medijih z antibiotiki in FBS. Dan pred transfekcijo smo na pet 90-cm posode nanesli štiri plošče nad 10% konfluento iz 15-cm posodic in inkubirali za 18-22 h ali do 60 do 70% konfluence. HEK293T celice so bile transfektirane s pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ in pHelperjem z uporabo jetPEI transfekcijskega reagenta (QBiogene). Koktajl DNA / DMEM / PEI smo vorteksirali in inkubirali pri sobni temperaturi za 20 min. Po inkubaciji dodamo transfekcijsko zmes v vsako 15 cm posodo. Transfektirane celice smo po transfekciji zbrali 48 h in inkubirali z 0.5% natrijevim deoksiholatom (Sigma; D6750) in 50 enotami / ml benzonazne nukleaze (Sigma; E1014) pri 37 ° C za 1 h. Po odstranitvi celičnih delcev s centrifugiranjem pri 3000 × g za 15 min smo supernatant filtrirali skozi 0.45 mm PVDF filter (Millipore). Čiščenje AAV-DJ delcev smo izvedli z uporabo HiTrap heparinske afinitetne kolone (GE Healthcare). Za koncentracijo AAV so bile uporabljene centrifugalne filtrirne enote Amicon ultra-15 z izrezom molekulske mase 100,000. Koncentrirani virus, alikvoten in zamrznjen za shranjevanje pri -80 ° C. Končna koncentracija virusa je bila 36 × 1012 virusnih delcev na ml za vsak AAV.

Stereotaksično vbrizgavanje in namestitev optičnih vlaken

Živali smo anestezirali z ip injekcijami 1.6 µl Zoletila in 0.05 µl ksilazina (Rompun, Bayer) na gram telesne teže in jih namestili v stereotaksični aparat (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Za injiciranje virusov je bila uporabljena 31-milimetrska igla za brizgo za dvostransko infundiranje 2 µl virusa v NAc pod kotom 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV −4.5) s hitrostjo 0.1 ul / min. Iglo je 10 minut po injiciranju pustila na mestu, preden jo je počasi umaknila. Optična kanila za implantacijo je bila sestavljena iz cirkonijeve obročke (premera 1.25 mm in dolžine 4.5 mm) in ravne konice optičnega vlakna (premera 200 µm). Implantacija optične kanile v NAc za osvetlitev D2-MSN je bila izvedena takoj po injiciranju virusov. Koordinate za implantacijo optične kanile so bile kot 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV −4.2) za ciljanje na NAc. Za lažje pritrjevanje optičnega vlakna sta bila dva vijaka pritrjena v lobanjo na zadnji strani mesta implantacije optičnega kanila. Za pritrditev optične kanile na lobanjo so na površino lobanje okoli dna kanile nanesli C&B Superbond (Sun Medical). Ko se je C&B Superbond strdila, je bila kanila sproščena iz držala, okoli kanile in vijakov pa je bil nanešen zobni cement (Poly-F, Dentsply). Za zapiranje reza okoli mesta kanila je bilo uporabljeno lepilo za tkivo Vetbond (3 M, 7003449). Po vsaditvi so miši 5 dni zapored dobivali subkutano injekcijo antibiotikov (Enrofloksacin, 12 mg / kg, q 5 ur) in analgezijo (Carprofen, 24 mg / kg, q 3 ur).

In vivo fotostimulacija

200 µm obližni kabel je bil povezan z zunanjim delom kronično vsadljivega optičnega vlakna z uporabo rokava. Optična vlakna so bila preko adapterja FC / PC pritrjena na modro lasersko diodo (473 nm, MBL-III 473-150 mW), svetlobni impulzi pa so bili ustvarjeni preko stimulatorja (BNC 575). Za fotostimulacijo nevronov, ki izražajo ChR2, je bila stimulacijska paradigma frekvenca 20 Hz, trajanje impulza 5 ms in 2 – 5 mW moč svetlobe. Svetlobna moč, ki jo oddaja obližni kabel, je bila izmerjena z merilnikom moči (PM100D) s svetlobnim senzorjem S121C.

Vedenjska analiza

Vedenjski poskusi so bili izvedeni z moškimi mišmi D2-Cre v 11 – 13 tednih starosti, z izjemo miši, ki so bile podvržene elektrofiziološki analizi, ki so bile stare 5 – 6 tedne. Starostno primerljivim D2-Cre in Cre negativnim kontrolnim mišim smo injicirali virus in jih namestili posamično in pustili, da se aklimatizirajo na kletko do vedenjskega testa. Za vsako manipulacijo so miši prenesli v eksperimentalno sobo 60 min pred začetkom poskusa, da bi omogočili navajanje in zmanjšali stres (svetlost eksperimentalne sobe je bila 70 lux). Vsaka eksperimentalna naprava je bila med poskusi očiščena z 70% etanolom, da bi odstranili morebitne vonjave.

Preobčutljivost na kokain

Za začetek preobčutljivosti na kokain so miši navadili na injekcije fiziološke raztopine (ip) za zaporednih 3 dni in nato injicirali fiziološko raztopino ali kokain (15 mg kg-1, ip) za 5 zaporednih dni. Miši smo intraperitonealno (ip) injicirali bodisi kokain hidroklorid (Johnson Mattney, Edinburgh, UK), raztopljen v fiziološki raztopini (0.9% NaCl) ali fiziološki raztopini z iglo 30 G. Takoj po vsakem injiciranju smo miši testirali na horizontalno lokomotorno aktivnost v komori odprtega polja za 30 min. Za merjenje učinka fotostimulacije na iniciacijo in izražanje senzibilizacije (sl (Slika​,war​,war​,war5), 5Miševi smo dali obojestransko osvetlitev z modro svetlobo preko dvojnih vlaknenih optičnih vezij na NAc v štirih 3-min obdobjih med 30 min sejami v domačih kletkah. Patch vrvi iz kanile iz optičnih vlaken, ki je bila nameščena na lobanji miši, smo odstranili in mišim dali vsaj 10 min počitek. Miši smo nato injicirali bodisi kokain ali slanico (coc 1d-coc 5d). Po začetku preobčutljivosti je bil kokain umaknjen za 14 dni brez injiciranja fiziološke raztopine. V tem karenci ni bila uporabljena fotostimulacija. Izražanje vedenjske preobčutljivosti na kokain je bilo nato določeno z injekcijo izzivnega odmerka zdravila (10 mg kg-1, ip) po fotostimulaciji NAc, kot je prikazano na sliki Figure5A.5A. Za merjenje učinka fotostimulacije v karenci kokaina (slika 3) (Figure6), 6miši smo podvrženi istemu protokolu za senzibilizacijo, kot je opisano zgoraj (za sliko Slika5) 5) razen fotostimulacije. Po uvedbi preobčutljivosti na kokain je bila fotosimulacija na dan nukleozidnega karcinoma nanesena na 1 h v celotni karenci 14 dni. Po 14 dneh odtegnitve so vse skupine miši injicirali izzivni odmerek kokaina (10 mg kg-1).

Slika 1 

Selektivna fotostimulacija srednjih kosti nevronov v nucleus accumbens. (A) Selektivna ekspresija ChR2 v NAc D2R nevronih z dobavo virusnih vektorjev AAV-DIO-ChR2-EYFP. merilne lestvice: slika ozadja, 1 mm: vstavi, 200 µm. (B) Konfokalne slike ...
Slika 2 

Fotostimulacija D2RCre-MSN poganja lokalna zaviralna vezja. (A) Konfokalna podoba žive rezine NAc, ki prikazuje nevron, napolnjen z barvilom, ki ne izraža ChR2 in sosednjo celico (puščico), ki izraža ChR2 in se lahko fotostimulira. (B) IPSC ...
Slika 3 

Lastnosti NAc celic. (A) Dvofotonska fluorescenčna slika nevronov, napolnjenih z Alexa 594. (A1) prikazuje nevron iz skupine ChR2 + / AP, medtem ko (A3) prikazuje nevron iz skupine ChR2− / IPSC. (A2) in (A4) so slike z visoko povečavo ...
Slika 4 

Vplivi in-vivo optogenetske aktivacije D2-MSN v NAc na bazalno lokomotorno aktivnost. () Sagittalen pogled na D2 Cre miši, ki so bili injicirani v NAc z AAV-DIO-ChR2-EYFP, sledila pa je bilateralna implantacija kanile iz optičnih vlaken. Stimulacija z modro svetlobo 473 nm ...
Slika 5 

Učinki aktivacije D2-MSN med senzibilizacijo na kokain. (A) Eksperimentalna shema za foto-stimulacijo D2-MSN med začetkom in izražanjem preobčutljivosti na kokain. Modra osvetlitev (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) je bila dostavljena za štiri ...
Slika 6 

Učinki aktivacije D2-MSN med umikom do ponavljajoče se izpostavljenosti kokainu. (A) Eksperimentalna shema za foto-stimulacijo D2-MSN med umikom kokaina. Osvetlitev modre svetlobe (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) je bila poslana v osmih obdobjih 3-min ...

Imunofluorescenca in konfokalna laserska mikroskopija

Za imunofluorescenco smo miši anestezirali z Zoletilom (Virbac, 1.6 ul / g, intraperitonealno) in 0.05 ul / g Rompuna (Bayer) in perfundirali s filtrirno steriliziranim 0.1 M PBS, ki mu je sledila fiksacija z uporabo 4% paraformaldehid / PBS raztopine (Sigma). Nato smo odstranili možgane in jih fiksirali za 4 h z ledeno hladnim fiksativom, kot zgoraj. Možgane smo nato dehidrirali v 30% saharozi / 0.1 M PBS za 2 dni. Možgane so nato zamrznili in 40-μm debele konsekularne sekcije pripravili na kriostatu (Leica CM 1900, Nemčija). Odseke (40 um) smo blokirali za 1 h v 0.1 M PBS, ki je vseboval 5% normalni kozji serum in 0.2% Triton X-100 in inkubirali s kunčjim poliklonskim anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) pri 4 ° C preko noči. Po pranju s PBS, ki vsebuje 0.2% Triton X-100, smo vzorce inkubirali pri RT za 1 h z Alexa kozjim anti-kunčjim IgG (568: 1; Molekularne sonde, Eugene, OR, ZDA) in 500 / ml 0.2, 4; 6-diamidino-2-fenil-indol HCl (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, ZDA) v PBS, ki vsebuje 1% normalni kozji serum in 0.2% Triton X-100. Kot negativno kontrolo smo vzorce inkubirali samo z DAPI in sekundarnimi protitelesi. Oddelki so bili pregledani na C1 Plan Apo × 40 / 1.4 vodni konfokalni laserski sistem skeniranja (LSM 700, Zeiss, Berlin, Nemčija).

Elektrofiziologija in fotostimulacija v rezinah nucleus accumbens

Miši so bile uporabljene za poskuse 4 tednov po injiciranju virusa, da bi dosegli optimalno izražanje ChR2-EYFP. Miši smo nato anestezirali in jih obglavili za pripravo akutnih možganskih rezin. Možgane smo hitro odstranili in takoj dali v ledeno mrzlo rezalno raztopino, ki je vsebovala (v mM) sahurozo 250, 26 NaHCO3, 10 D-glukoza, 3 Myo-inozitol, 2.5 KCl, 2 Na-piruvat, 1.25 NaH2PO4, 0.5 askorbinska kislina, 1 Kynurenic kislina in 7 MgCl2 ki smo ga mehurčali z 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Rezine koronalnih možganov (debeline 250 µm), ki so vsebovale NAc, so bile pripravljene z vibratom (Leica VT 1200 S) in so bile nato inkubirane v umetni cerebrospinalni tekočini (ACMF), ki vsebuje (v mM): 11 D-glukozo, 125 NaCl, 25 NaHCO31.25 NaH2PO42.5 KCl, 1.25 MgCl2 in 2.5 CaCl2 pred 34 ° C za 1 h pred snemanjem. Rezine so bile nato prenesene v potopno snemalno komoro, v kateri je O2raztopino ACSF nenehno superfuziramo. Celice v NAc in VTA so bile vizualizirane z uporabo 2-fotonskega mikroskopa (Olympus FV1000 MPE, Tokio, Japonska), opremljenega z 25X lečo za potopno vodo in infrardečo DIC optiko. Snemanje z objemkami s celimi celicami smo dobili iz NAc celic z Multiclamp 700B ojačevalnikom in Digidata 1440A digitalizatorjem (Molecular Devices, LLC). Podatke smo vzorčili s programsko opremo pCLAMP 10.2 in nadalje analizirali z uporabo programske opreme Clampfit 10.2 (Molecular Devices, LLC). Elektrode z uporovami med 3 – 5 M with so bile napolnjene z notranjo raztopino, ki je vsebovala (v mM): 130 K-glukonat, 2 NaCl, 2 MgCl220 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA in 10 Na2- fosfokreatin s pH, prilagojenim na 7.3 z 1 N KOH. V podskupini eksperimentov smo na rezino možganov nanesli bikukulin (10 µM) na možgansko rezino, da blokiramo receptorje GABA.

NAc celice, ki izražajo ChR2-EYFP so bile fotostimulirane z LED svetlobnim virom (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Modra svetloba LED je bila nadalje filtrirana in oslabljena s filtrirno kocko, opremljeno s filtrom vzbujanja (470 – 495 nm); utripanja svetlobe (trajanje 10 ms, 0.0366 – 0.354 mW / mm2) so bile dostavljene v rezino možganov preko objektivne leče 25X na frekvencah 5 – 40 Hz. V podskupini eksperimentov so bili merilni fotonapeti v celicah, ki izražajo ChR2, kot odziv na utripajoče luči trajanja 2 s.

Statistična analiza

Podatki so predstavljeni kot sredstva ± sem in so bili analizirani z dvosmernim Studentovim t-test, ali z dvosmerno analizo variance, ki ji sledi Bonferroni naknadnega test. A P-vrednost <0.05 se je štela za statistično pomembno.

Rezultati

Selektivna fotostimulacija srednjih kosti nevronov v nucleus accumbens

Za določitev vloge NAc D2R-MSN-jev pri kokain-posredovanem odvisnem vedenju smo uporabili optogenetski pristop za stimulacijo nevronov NAc D2R. Za selektivno kontrolo aktivnosti D2R-MSN v NAc s svetlobo, so bili virusni vektorji, ki kodirajo AAV-DIO-ChR2-EYFP, stereotaksično injicirani v NAc D2R-Cre BAC transgenskih miši. 4 tednov po injiciranju virusa so v NAc opazili robustno izražanje ChR2-EYFP. (Figure1A) .1A). Specifičnost ekspresije ChR2 v D2R-MSN je bila potrjena z imunofluorescenčno konfokalno analizo: izražanje YRP-označenega ChR2 je bilo lokalizirano z D2R v NAc (slika (Figure1B), 1B), ki kaže, da je bil ChR2 izražen v D2R-izraženih nevronih v NAc.

Čeprav je bil tak pristop uporabljen v drugih študijah (npr. Lobo et al., 2010), podrobnosti o postopkih injiciranja virusa se razlikujejo od laboratorija do laboratorija, zato je pomembno, da dokumentiramo optogenetski nadzor v naših posebnih poskusnih pogojih. Ocenili smo funkcionalno izražanje ChR2-a tako, da smo iz MSN-jev v NAc rezinah posneli celotne celice. MSN-ji so bili identificirani z: (1) relativno hiperpolariziranim potencialom membrane mirovanja (RMP), običajno bolj negativnim kot -80 mV; (2) pravilen vzorec izstrelitve AP v odziv na uporabljene tokovne impulze; (3) dolga latenca do sprožitve prve AP med trenutnim impulzom; (4) odsotnost napetosti "upogibanja" med hiperpolarizacijo, ki jo povzroča kationski tok, aktiviran s hiperpolarizacijo (Ih); in (5) relativno majhne velikosti celičnih teles (Chang in Kitai, 1985; O'Donnell in Grace, 1993; Le Moine in Bloch, 1996; Taverna et al., 2008). Modra svetloba (470 nm) je bila uporabljena na celotnem vidnem polju (0.78 mm2), medtem ko napetostne vpetje MSN-jev pri zadrževalnem potencialu -69 mV. Nekatere MSN so izrazile ChR2, ki je vidna kot fluorescenca YFP v njihovih somatih (puščice na slikah). 1C1, C3). Tovrstni nevroni so pokazali precejšnje fotonapetosti, pri katerih so svetlejši dražljaji svetlobe izzvali večje fotorektorje (slika (Figure1D) .1D). Razmerje med amplitudo maksimalne fototokne in jakosti svetlobe (slika 1). \ T (Figure1E) 1E) je imela polovično maksimalno občutljivost za svetlobo 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 in maksimalno maksimalno amplitudo 1.16 ± 0.16 nA (srednja vrednost ± sem, n =

V trenutnih pogojih, MSN, ki izražajo ChR2, so zanesljivo odzvali AP v odzivu na vlake svetlobnih impulzov (10 ms trajanje; Slika1F) .1F). V teh pogojih je svetloba večja od 0.1 mW / mm2 zadostovali za prikaz AP (slika 3) (Figure1G, 1G, n = 5). AP so zanesljivo izzvali pri fotostimulacijskih frekvencah do 20 Hz, medtem ko so pri 40 Hz svetlobno-inducirani odzivi povzeli, da bi povzročili trajno depolarizacijo, ki je bila manj učinkovita pri vzbujanju AP (številke 1F, G).

Fotostimulacija D2R-MSN poganja lokalna zaviralna vezja

Da bi raziskali posledice D2R-MSN aktivnosti na lokalna vezja v NAc, smo fotostimulirali presinaptično MSN, ki izraža ChR2, medtem ko merimo postsinaptične odzive v ChR2-negativnih MSN-jih (slika (Figure2A) .2A). Nevron je prikazan na sliki Slika2A2A ne izraža ChR2, kar kaže odsotnost fluorescence EYFP, kot tudi odsotnost fotorektorov kratke latence, kot so prikazani na sliki Figure1D.1D. Vendar, ko so bile postsinaptične MSN številke zadržane kot potencial −69 mV, utripa lučka 10 ms trajanje navzven, po latenci 9.0 ± 0.42 ms (slika (Figure2B, 2B, n = 15). Da bi določili naravo teh odzivov, je bil postsinaptični membranski potencial variiral med -99 mV do -39 mV, medtem ko je bila uporabljena svetlobna bliskavica (slika (Figure2C) .2C). Odzivi, ki jih povzroča svetloba, so variirali z membranskim potencialom (slika 3) (Figure2D, 2D, n = 6) in njihovo polarnost obrnili na -81 ± 3.4 mV. Glede na to, da je ravnotežni potencial za kloridne ione -80 mV pod našimi ionskimi pogoji, lahko svetlobno inducirani izhodni tokovi nastanejo zaradi fluksa klorida, ki ga posreduje postsinaptični GABAA receptorje. Da bi preizkusili to možnost, GABAA antagonistu receptorja bikuculin (10 uM) dodamo zunanji raztopini. To zdravilo je popolnoma zavrlo odzive, ki jih povzroča svetloba (Figure2B), 2B), ki potrjuje, da so bili svetlobno inducirani odzivi GABAergični inhibitorni postsinaptični tokovi (IPSC).

Glede na njihove odzive na fotostimulacijo se lahko MSN, ki smo jih zabeležili, razvrstijo v eno od 4 skupin: (1) celice, ki izražajo zadostno količino ChR2, da sprožijo AP kot odgovor na fotostimulacijo (ChR2 + / AP), ki so bile opisane zgoraj; (2) celice, ki izražajo majhno količino ChR2, ki dokazuje podpolni depolarizacijo kot odziv na svetlobo (ChR2 + / No AP); (3) tihe celice, ki niso imele ekspresije ChR2, ampak so prejele svetlobno inducirane IPSC od presinaptičnih MSN-jev, ki izražajo ChR2 (ChR2− / IPSC); in (4) ChR2-negativne celice, ki niso pokazale IPSC kot odziv na fotostimulacijo drugih MSN-jev (ChR2− / No IPSC). Relativni delež celic v vsaki od teh kategorij je prikazan na sliki Slika2E2E (n = 53). Na splošno je skoraj polovica celic (45.3%) izrazila ChR2 (vsota skupin (1) in (2)). Nobena od MSN-jev, ki smo jih posneli, ni pokazala fotorektor in IPSC kot odziv na fotostimulacijo; to kaže, da D2R-pozitivne MSN številke ne inervirajo drugih članov iste celične populacije znotraj NAc.

Ta klasifikacija odgovorov na svetlobo kaže, da fotostimulacija celic ChR2 + / No AP (skupina 2) in ChR2− / IPSC celic (skupina 4) ne bo ustvarila nobenih električnih signalov, ki bi lahko prispevali k aktivnosti vezja. Da bi opredelili učinke fotostimulacije na funkcijo vezja, smo podrobno opisali lastnosti številk ChR2 + / AP (skupina 1), ki bodo generirale AP, ko je NAc fotostimuliran, in ChR2− / IPSC celice (skupina 3), ki so postsnaptične glede na številke MSN ChR2 + / AP, ker prejemajo IPSC, ki jih povzročajo svetlobe. Obe celici ChR2 + / AP in ChR2− / IPSC v NAc sta bili identificirani kot kirurški nevroni (slika (Figure3A) .3A). V teh dveh skupinah ni bilo bistvenih razlik v morfoloških ali elektrofizioloških lastnostih nevronov. Na primer, somate nevronov v teh dveh skupinah so bile podobne velikosti (slika 3) (Figure3B) .3B). Poleg tega njihovi RMP (−83.0 ± 1.7 proti −85.0 ± 1.8 mV; pomeni ± sem; n = 10, slika Slika 3C) 3C) in vhodne upornosti (113 ± 15 proti 133 ± 13 MΩ, n = 6, slika Slika 3D) 3D) prav tako niso bili drugačni (p > 0.05 študentov z dvema repama t-test), medtem ko njihovi AP sprožijo vzorce kot odziv na trenutne impulze (slike 3E, F) so bili tudi podobni (p > 0.05 študentov z dvema repama t-test, n = 6). Če povzamemo, fotostimulacija D2R-MSN-jev v NAc aktivira lokalna inhibitorna vezja z postsinaptičnimi nevroni, ki so zelo podobni D2R-MSN, vendar ne izražajo D2R.

Optogenetska stimulacija NAc D2R-MSN-jev pri vedenjski senzibilizaciji zaradi kokaina

Nato smo preučili vedenjske posledice vivo fotostimulacija NAc D2R-MSN. Ker fotostimulacija D2R-MSN v hrbtnem striatumu zmanjša lokomotorno aktivnost (Kravitz et al., 2010) smo začeli z opisovanjem učinkov akumbensov D2R-MSN aktivacije na bazalno lokomotorno aktivnost. V ta namen smo D2R-Cre miši injicirali DIO-AAV-ChR2-EYFP virus dvostransko v NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN so bile potem fotostimulirane z modro svetlobo (473 nm, trajanje impulza 5 ms, 20 Hz), ki so bile dostavljene NAc prek optičnih vlaken. Fotostimuli so bili uporabljeni v štirih obdobjih trajanja 3-min v seji 50 min, ko so miši držali v komori za snemanje gibalne aktivnosti (slika 1). (Figure4A) .4A). Vzporedno s tem smo kot kontrolni ne-Cre WT miši podobno injicirali virus in prejeli podobno osvetlitev modre svetlobe. D2-Cre (+) NAc-ChR2 miši so pokazali primerljivo ali nekoliko zvišano raven bazalne lokomotorne aktivnosti v primerjavi z kontrolnimi mišmi D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (številke 4B, C). Fotostimulacija D2R-MSN v D2-Cre (+) NAc-ChR2 miših je povzročila znatno zmanjšanje lokomotorne aktivnosti, ki se je iztekla po zaustavitvi svetlobnega dražljaja (Figure4B) .4B). V kontrolnih miših D2R-Cre (-) NAc-ChR2 niso opazili takšnih učinkov (slike 4B, C), kar kaže, da so bili učinki fotostimulacije posledica aktivacije ChR2, ne pa možnih nespecifičnih učinkov, kot je segrevanje možganskega tkiva. Zato so naši podatki pokazali, da je fotostimulacija D2R-MSN v NAc povzročila zmanjšanje lokomotorne aktivnosti.

Ti rezultati so pokazali našo zmožnost nadzora aktivnosti D2R-MSN znotraj NAc vivo. Nato smo uporabili to sposobnost za preučevanje vpliva D2R-MSN aktivnosti na vedenjsko senzibilizacijo na ponavljajočo uporabo kokaina. Vedenjska senzibilizacija se nanaša na postopek, ki omogoča začetno izpostavljenost psihostimulantom, kot je kokain, da se poveča sposobnost poznejših izpostavljenosti drog, da stimulira lokomotorno aktivnost. Ta proces je mogoče ločiti na iniciacijske in ekspresijske faze: iniciacija opisuje takojšnje nevronske dogodke, ki povzročajo vedenjsko senzibilizacijo (Vanderschuren in Kalivas, 2000; Sim et al., 2013), medtem ko je znano, da je izražanje dolgotrajna oblika vedenjske plastičnosti, ki traja tudi po prekinitvi zdravljenja (Vanderschuren in Kalivas, 2000; Sim et al., 2013). Zato smo med ponavljajočimi se intraperitonealnimi (ip) injekcijami kokaina preučevali vedenjsko senzibilizacijo zaradi kokaina, medtem ko smo z uporabo optogenetike nadzorovali aktivnost D2R-MSN v NAc med vsako od teh faz.

Po navajanju na injiciranje fiziološke raztopine v času 3 dni so miši injicirali kokain (15 mg / kg) v zaporednih dneh 5 in lokomotorni odzivi so bili zabeleženi za 30 min po vsakem injiciranju (slika 1). (Figure5A) .5A). Fotostimuli so bili dostavljeni med sejami 30 min pred vbrizgavanjem kokaina, ki so segli v obdobjih osvetlitve 3 min z obdobji 5 min, ko je bila svetloba izklopljena (slika (Figure5A) .5A). Glede na to, da fotostimulacija D2R-MSN v NAc zmanjša bazalno lokomotorno aktivnost (Figure4), 4), so bili fotostimuli dostavljeni tik pred uporabo kokaina, da bi se izognili možnim motnjam vedenjskih odzivov na injekcijo kokaina.

Oba kontrolna miša D2-Cre (-) NAc-ChR2 in D2-Cre (+) NAc-ChR2 so pokazali izrazito povečanje lokomotorne aktivnosti kot odziv na ponavljajoče se injekcije kokaina (slika 1). (Figure5B), 5B), kar kaže na začetek preobčutljivosti. Videti je, da fotostimulacija D2R-MSN-jev v NAc ni vplivala na začetek vedenjske senzibilizacije, ker je bila vedenjska senzibilizacija zaradi kokaina podobna pri miših D2-Cre (+) NAc-ChR2 in kontrolnih miših D2-Cre (-) NAc-ChR2.

Po indukciji vedenjske senzibilizacije s ponavljanjem takšnih injekcij kokaina (15 mg / kg) za 5 dni je zdravilo preklicano za 14 dni, stopnja izražanja preobčutljivosti pa je bila preiskana z izzivanjem miši z manjšim odmerkom kokaina (10 mg). / kg). Izražanje preobčutljivosti je dolgotrajna oblika vedenjske plastičnosti, ki traja tudi po prekinitvi zdravljenja (Steketee in Kalivas, 2011; Sim et al., 2013). Da bi preučili vlogo D2R-MSN-jev pri izražanju preobčutljivosti, je bila NAc fotostimulirana neposredno pred dajanjem kokaina (slika (Figure5A) 5A) in preobčutljivost je bila izmerjena kot količina lokomotorne aktivnosti, povzročene z injekcijo kokaina.

V obeh skupinah miši, ki so bile predhodno obdelane s kokainom - D2-Cre (-) miši NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) in D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - pojavil se je izrazit senzibilizacijski izraz (slika 3) (Figure5C) .5C). Časovni potek sprememb v gibanju kokaina je bil med obema skupinama podoben (slika 3) (Figure5C), 5C), pri čemer se med dvema skupinama ni opazila pomembna razlika. Ta dva poskusa fotostimulacije skupaj kažeta, da aktivacija D2R-MSN v NAc ne vpliva na iniciacijo ali izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina.

Fotostimulacija NAc D2R-MSN med odvzemom zdravila

Kronični stres med prekinitvijo zdravljenja po ponavljajoči se izpostavljenosti kokainu povzroči selektivno pridobivanje D2R-odvisnega mehanizma prilagajanja, ki nadzoruje povečanje števila kokaina in ponavljajočega se vedenja v povezavi s spremembami sinaptične plastičnosti v NAc (Sim et al. 2013). To kaže, da se mehanizmi, ki so povezani z odvzemom drog, razlikujejo od tistih, ki so vključeni v senzibilizacijo zaradi drog. Zato smo nadalje pregledali, ali fotostimulacija D2R-MSN-jev v NAc med odvzemom kokaina vpliva na izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina.

Po indukciji vedenjske senzibilizacije s ponavljajočim se injiciranjem kokaina, kot je bilo opisano zgoraj, so bile miši D2-Cre (-) in D2-Cre (+) v karenci 14 dneva razdeljene v dve skupini: ena skupina je bila podvržena dnevni stimulaciji modre svetlobe. NAc za 1 h (3 min × 8-krat), medtem ko druga skupina ni bila (Figure6A) .6A). Ponavljajoča fotostimulacija D2R-MSN-jev v NAc med odvzemom kokaina ni vplivala na izražanje preobčutljivosti pri miših D2-Cre (-) :: coc-coc (Figure6B) .6B). Nasprotno pa je bila pri D2-Cre (+) :: coc-coc miših izraz senzibilizacije znatno oslabljen s ponavljajočo se fotostimulacijo med odvzemom zdravila (slika 1). (Figure6B), 6B), čeprav časovni potek stimulacije gibanja kokaina ni bil prizadet (slika 3) (Figure6C) .6C). Tako je fotostimulacija D2R-MSN-jev NAc med prekinitvijo zdravljenja zmanjšala izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina (interakcija s kokainom × foto-stimulacija) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, slika Figure6B) .6B). Ti podatki kažejo, da aktivacija D2R-NAc MSN-jev v obdobju odtegnitve drog vpliva na iskanje kokaina in ponavljajoče se vedenje.

Razprava

Precejšnji dokazi kažejo, da je vedenjska senzibilizacija zaradi kokaina povezana z okrepljenim dopaminergičnim prenosom v mezokortikolimbičnem sistemu, ki obsega ventralno tegmentalno območje, prefrontalni korteks in nucleus accumbens (NAc). Zlasti izrazna faza vedenjske senzibilizacije je označena s trajno hiper odzivnostjo zdravila po prenehanju zdravljenja, ki je povezana s kaskadnimi prilagoditvenimi mehanizmi (Kalivas in Duffy, 1990; Robinson in Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998), ki bi lahko prispevala k kompulzivnemu uživanju drog (Robinson in Berridge, 1993; Kalivas et al., 1998; Steketee in Kalivas, 2011). Predlagano je bilo, da lahko spremembe v molekularni, celični in vedenjski plastičnosti v NAc, ki jih povzročajo kokain, v povezavi z signalizacijo DA receptorjev v MSN-jih, uravnavajo odvisnostno vedenje, ki ga povzroča zdravilo (Lobo et al., 2010; Schmidt in Pierce, 2010; Ferguson et al., 2011; Pascoli et al., 2011; Bocklisch et al., 2013; Grueter et al., 2013).

Nedavne študije z uporabo gensko spremenjenih miši, ki pogojno izražajo Cre rekombinazo, so odkrile vloge za D1R-MSN ali D2R-MSN v kokainskem odvisnem vedenju. Optogenetska aktivacija D1R-MSN-jev NAc po 6 dneh ponavljajoče se uporabe kokaina poveča lokomotorno aktivnost, medtem ko aktivacija D2R-MSN-jev po poročanju nima učinka (Lobo et al., 2010). Ti podatki kažejo, da ponavljajoča se izpostavljenost kokainu poveča proizvodnjo D1R-MSN-jev NAc. Inhibicija MSN-ja, ki izraža D1R, s toksinom tetanusa (Hikida et al., 2010) zmanjšuje kokainsko pogojeno prednostno mesto (CPP), medtem ko po ukinitvi sinaptičnega prenosa v D2R-MSN niso opazili nobenih sprememb kokainskega CPP (Hikida et al., 2010). Optogenetska aktivacija D1R-MSN v dorzalnem striatumu povzroči trajno okrepitev, medtem ko stimulativni D2 receptorski ekspresijski nevroni povzroči prehodno kaznovanje (Kravitz et al., 2012). Nedavna študija je tudi poročala, da inhibicija D2R-MSN-jev s kemicogenetskim pristopom povečuje motivacijo za pridobivanje kokaina, optogenetska aktivacija D2R-MSN pa zavira samo-dajanje kokaina (Bock et al., 2013). Po drugi strani pa Bocklisch et al. (2013) je poročal, da D1R-MSN-jev NAc projektira v VTA, posebej za GABAergične nevrone v VTA, medtem ko D2R-MSN ne projektirajo neposredno v VTA. To vezje pomeni, da optogenetska aktivacija D1R-MSN disinhibira DA nevrone, kar končno poveča kokainsko povzročeno zasvojenost (Bocklisch et al., 2013).

Kljub navidezno preprosti organizaciji teh dveh populacij MSN-jev dejstvo, da MSN-ji prejemajo več vhodov in imajo različne izhode od / do drugih možganskih področij, pa tudi tvorijo lokalna vezja med MSN in drugimi razredi interneuron, rezultat D1R- MSN in D2R-MSN lahko prinesejo kompleksne in različne molekularne, celične in vedenjske posledice.

Prej je bilo dokazano, da D2R prispeva k sinaptičnim modifikacijam, ki so nastale med umikom zdravila, in ti povečujejo relaps za iskanje kokaina, ne da bi to vplivalo na začetno pridobivanje zdravil ali iskanje drog (Sim et al., 2013). Naši trenutni podatki kažejo, da fotostimulacija D2R-MSN v NAc povzroči zmanjšanje bazalne lokomotorne aktivnosti. Lobo et al. (2010) ni odkril nobenih sprememb v gibanju, ko je bil aktiviran bodisi podtip MSN, temveč so pregledali samo celotno lokomotorno aktivnost, namesto da bi pregledali takojšnje odzive bazalne lokomotorne aktivnosti na fotostimulacijo. Kravitz et al. (2010) je tudi ugotovila, da optogenetska aktivacija D2R-MSN v dorzalnem striatumu zmanjšuje tudi lokomotorno aktivnost. Naši podatki so tako prvi, ki dokazujejo, da je bazalna lokomotorna aktivnost inhibirana s fotostimulacijo D2R-MSN-jev NAc in prva sistematično preučuje časovni potek bazalne lokomotorne aktivnosti med fotostimulacijo teh nevronov.

V tej študiji smo ugotovili, da optogenetska aktivacija D2R-MSN-jev v NAc ni vplivala na uvajanje ali izražanje vedenjske senzibilizacije. Vendar pa je fotostimulacija D2R-MSN med prekinitvijo zdravljenja zmanjšala izraz senzibilizacije zaradi kokaina. Zato naši podatki kažejo, da D2R-MSN-jeve podatke pridobivajo posebej v karenci, ki spreminja ekspresijo genov ali druge oblike signalizacije in tako sproži spremembe sinaptične plastičnosti, kar vodi do sprememb v vedenjski senzibilizaciji zaradi kokaina. Ni znano, kako te MSN številke uporabljajo specifične prilagoditve tipa celic, ki lahko povzročijo njihove različne posledice pri obnašanju, povezanih z odvisnostjo. Grueter et al. (2013) je predlagal, da ΔFosB v NAc različno modulira sinaptične lastnosti in obnašanje, povezano z nagrajevanjem, na način, ki je specifičen za tip celice in podregijo. Nedavno so Chandra et al. (2013) je poročalo, da je ponavljajoča aktivacija D2R-MSN, vendar ne D1R-MSN, povzročila znižanje gena Tiam2, beljakovine, vključene v preureditev aktinskega citoskeleta, podobno kot kokain. Zato je za razumevanje mehanizmov, ki prinašajo trajne učinke obnašanja, povzročenega z zdravili, pomembno določiti celično selektivno indukcijo molekularnih dogodkov v teh MSN, ki nadzorujejo sinaptično prilagajanje ponavljajoči se izpostavljenosti zdravilu.

V povezavi s ponavljajočo izpostavljenostjo zdravilom je bilo predlagano, da ima odtegnitev pomembno vlogo, ker se nekatere spremembe pojavijo le nekaj tednov po zadnji izpostavljenosti kokainu. To kaže, da je abstinenca pomemben posrednik pri razvoju plastičnosti (Robinson in Berridge, 2003; Boudreau in Wolf, 2005; Boudreau et al., 2007; Kourrich et al., 2007). Te ugotovitve povečujejo možnost, da bi bil umik sam po sebi lahko vzrok za spremembe v NAc, ki so pod nadzorom signalizacije, odvisne od D2R. Naš rezultat, ki kaže, da aktivacija D2R-MSN-jev v NAc med prekinitvijo zdravljenja vpliva na vedenjsko senzibilizacijo zaradi kokaina, zagotavlja prepričljivo podporo tej zamisli.

Pred tem je bilo dokazano, da ponavljajoča se izpostavljenost stresu med prekinitvijo zdravljenja zavira izražanje vedenjske senzibilizacije, ki jo povzroča kokain, ter vedenje kokaina in ponavljanje pri miših D2R KO (Sim et al., 2013). Zato je zanimivo, da fotostimulacija D2R-MSN med odvzemom drog zmanjša tudi izražanje senzibilizacije. Snaptična plastičnost, povzročena s stresom, pri glutamatičnih sinapsah se spremeni v NAc miših D2R KO (Sim et al., 2013). Čeprav še ni znano, ali fotostimulacija D2R MSN ali kronični stres v karenci izzove podobne spremembe v sinaptični plastičnosti, naše sedanje ugotovitve podpirajo hipotezo, da imajo D2R-MSN-ji NAc ključno vlogo pri plastičnosti, ki jo povzroči umik, in lahko prispevajo k po prekinitvi zlorabe drog. Potrebne bodo nadaljnje raziskave za ugotovitev funkcionalnih nevronskih vezij, pri katerih sodelujejo D2R MSN-je med odvzemom zdravil, ter analizirati in primerjati posledice fotostimulacije D2R-MSN in kroničnega stresa na sinaptično plastičnost v tem določenem vezju.

Druga možna vloga MSN-jev, ki izražajo D2R, bi lahko bila zaviranje izhoda D1R-MSN iz NAc. Prejšnje raziskave kažejo, da čeprav MSN-ji načrtujejo dolge aksone na oddaljene cilje, se pojavijo obsežna prekrivanja med sorodniki aksona in dendritičnimi drevesi sosednjih projekcijskih nevronov (Grofová, 1975; Preston et al., 1980; Wilson in Groves, 1980). To bi lahko pomenilo možno lokalno sinaptično povezljivost za MSN znotraj NAc. Znotrajcelični posnetki parov nevronov projekcij trnov so pokazali funkcionalne inhibitorne povezave med MSN-ji v striatumu podgan (Czubayko in Plenz, 2002; Tunstall et al., 2002; Koos et al., 2004; Gustafson et al., 2006). Prav tako so poročali, da sinapsi, ki jih tvorijo ponavljajoči se aksoni zavarovanja MSN-jev v striatumu, niso naključni, D2R-MSN pa sinaptične povezave tako z drugimi D2R-MSN-ji kot z D1R-MSN-ji, medtem ko D1R-MSN skoraj izključno tvorijo sinaptične povezave z drugimi D1R-MSN (Taverna et al., 2008). Čeprav so poročali tudi o GABAergični povezavi z lokalnimi ponavljajočimi se aksonalnimi kolaterali med akumalnimi MSN-ji (Taverna et al., 2004), še vedno ni jasno, ali D2R-MSN naključno oblikujejo lokalna mikrovezja ali prispevajo k mikrovezjem v NA z prednostno povezavo, kot v striatumu. Naši podatki kažejo, da D2R-MSN-ji v NAc, ki izražajo ChR2, ustvarijo sinaptične povezave s sosednjimi MSN-ji, ki izražajo D1R, in da D2R-MSN nato izvajajo zaviralni stik z D1-MSNs za modulacijo D1R-posredovanega spodbujanja zasvojenosti.

V zaključku smo pokazali, da optogenetska aktivacija NAc D2R-MSN spreminja plastičnost, ki jo povzroča odtegnitev, ki se pojavi med odvisnostjo od kokaina. Glede na to, da se zdi, da je aktivnost D2R-odvisne signalizacije v karenci ključni regulator za izražanje vedenjske senzibilizacije zaradi kokaina, predlagamo, da so D2R-MSN pomemben posrednik dolgotrajne prilagoditve za iskanje drog in ponovitev bolezni. Identifikacija molekularnih substratov D2R-odvisne signalizacije, skupaj z identifikacijo specifičnega vezja NAc D2R-MSN, uporabljenih pri ponavljajoči se izpostavljenosti zdravilu, bi morala zagotoviti nove cilje za terapevtske intervencije pri ponovitvi zdravljenja.

Izjava o konfliktu interesov

Avtorji izjavljajo, da je bila raziskava izvedena v odsotnosti komercialnih ali finančnih odnosov, ki bi se lahko razumeli kot potencialno navzkrižje interesov.

Priznanja

To delo je podprla Nacionalna raziskovalna fundacija Koreje (NRF), ki jo je financiral Ministrstvo za znanost, IKT in načrtovanje prihodnosti s strani Raziskovalnega programa za možgane (Ja-Hyun Baik; št. 2013M3C7A1056101) in z bio in medicinsko tehnologijo Razvojni program (za Ja-Hyun Baik; št. 2013M3A9D5072550) in program World Class Institute (WCI) Nacionalne raziskovalne fundacije Koreje (NRF), ki ga financira Ministrstvo za znanost, IKT in načrtovanje prihodnosti (Georgeu J. Augustinu) WCI 2009-003), kot tudi korejski univerzitetni štipendij (Ja-Hyun Baik) in nepovratna sredstva CRP iz Nacionalne raziskovalne fundacije Singapurja (Georgeu J. Augustinu).

Reference

  1. Baik JH (2013). Dopaminsko signaliziranje v vedenju, povezanim z nagrajevanjem. Spredaj. Nevronska vezja 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., et al. (1995). Parkinsonsko podobna lokomotorna okvara pri miših brez receptorjev za dopamin D2. Narava 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). Razprava o vlogi dopamina v nagradi: primer spodbujevalne poudarke. Psihofarmakologija (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-xPubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF, et al. (2013). Krepitev posredne posredne poti spodbuja odpornost na kompulzivno uporabo kokaina. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, hiša DR, Yvon C., de Roo M., et al. (2013). Kokain onemogoča dopaminske nevrone s povečanjem prenosa GABA v ventralnem tegmentalnem območju. Znanost 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). AMPA receptorji celične površine v podganah podganjih podgan se povečajo med odvzemom kokaina, a se po internalizaciji po izzivu kokaina povezujejo s spremenjeno aktivacijo protein-kinaz, aktiviranih z mitogenom. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Vedenjska senzibilizacija na kokain je povezana z večjo površinsko ekspresijo receptorja AMPA v nucleus accumbens. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH, et al. (2013). Optogenetska inhibicija D1R, ki vsebuje nevrone nucleus accumbens, spremeni regulacijo Tiam1, ki jo povzroča kokain. Spredaj. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Projekcijski nevroni iz nucleus accumbens: intracelularna študija označevanja. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Kokainsko inducirana lokomotorna aktivnost in diskriminacija kokaina v miših mutantov dopaminskega D2 receptorja. Psihofarmakologija (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Disinhibicija kot osnovni proces pri izražanju striatnih funkcij. Trendi Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Hitro sinaptično prenašanje med striatnimi projekcijskimi nevroni. Proc. Natl. Acad. Sci. ZDA 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y, et al. (2011). Prehodna nevronska inhibicija razkriva nasprotne vloge posrednih in neposrednih poti v senzibilizaciji. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). Dopaminergična modulacija limbičnega in kortikalnega pogona nucleus accumbens v ciljno usmerjenem vedenju. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). Identifikacija striatnih in paladnih nevronov, ki se širijo na substratno nigro. Eksperimentalna študija z retrogradnim aksonalnim transportom hrenov peroksidaze. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, RC Malenka (2013). ΔFosB diferencialno modulira nucleus accumbens neposredno in posredno funkcijo poti. Proc. Natl. Acad. Sci. ZDA 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Primerjalna analiza napetosti in toka s povratno zvezo in sinaptičnim prenosom v striatni mikrovezki in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Različne vloge sinaptičnega prenosa v neposrednih in posrednih striatnih poteh do nagrajevanja in averzivnega vedenja. Nevron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Vpliv akutnega in dnevnega zdravljenja kokaina na zunajcelični dopamin v nucleus accumbens. Synapse 5, 48 – 58 10.1002 / sin.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Vloga senzibilizacije pri hrepenenju in ponovitvi bolezni pri odvisnosti od kokaina. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Primerjava IPSC-jev, ki so jo sprožili trni in hitri nevroni v neostriatumu. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Izkušnje s kokainom nadzorujejo dvosmerno sinaptično plastičnost v nucleus accumbens. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., et al. (2010). Regulacija parkinsonskega motoričnega obnašanja z optogenetskim nadzorom vezij bazalnih ganglij. Narava 466, 622 – 626 10.1038 / narava09159 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Različne vloge za neposredne in posredne poti striatnih nevronov v okrepitvi. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatalna plastičnost in funkcija bazalnega ganglija. Narava 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., Bloch B. (1996). Ekspresija D3 dopaminskega receptorja v peptidergičnih nevronih nucleus accumbens: primerjava z dopaminskimi receptorji D1 in D2. Nevroznanost 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., et al. (2010). Specifična specifična izguba BDNF signalizacije posnema optogenetsko kontrolo kokainske nagrade. Znanost 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Strateško ravnotežje deluje v odvisnosti od drog: različne vloge neposrednih in posrednih poti srednje velikih neonov. Spredaj. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Sinaptična plastičnost, ki jo povzroča zdravilo, odvisnost: od molekularnih sprememb do preoblikovanja vezja. Nevron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Fiziološke in morfološke lastnosti akumbenskega jedra in nevronov lupine, zabeleženih in vitro. Synapse 13, 135 – 160 10.1002 / sin.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Preobrnitev sinaptičnega potenciala, povzročenega s kokainom, ponastavi prilagodljivo vedenje, ki ga povzroči zdravilo. Narava 481, 71 – 75 10.1038 / narava10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Projekcija srednjega nevrona iz podganjega neostriata: intracelularna študija peroksidaze hrena. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-xPubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Nevronske osnove za hrepenenje po drogah: teorija o zasvojenosti, ki spodbuja senzibilizacijo. Brain Res. Brain Res. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Odvisnost. Annu. Rev. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Nevroadaptacije zaradi kokaina pri prenosu glutamata: potencialne terapevtske tarče za hrepenenje in zasvojenost. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Mreža za nagrajevanje kortiko-bazalnih ganglijev: mikrocirkuliranje. Nevropsihofarmakologija 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, et al. (2013). Vloga receptorjev dopamin D2 v plastičnosti obnašanja, ki jo povzroča stres. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Prilagoditve kokaina v projekcijskih nevronih D1 in D2 accumbens (dihotomija, ki ni nujno sinonim za neposredne in posredne poti). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Želja po drogah: vedenjska senzibilizacija in ponovitev vedenja zaradi iskanja drog. Pharmacol. Rev. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). V modelih Parkinsonove bolezni so motnje ponavljajočih se kolateralnih povezav striatnih srednjih nevronov. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Neposredni fiziološki dokazi za sinaptično povezljivost med srednje velikimi črevesnimi nevroni v podganah nucleus accumbens in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Nevroplastičnost v mezolimbičnem dopaminskem sistemu in odvisnosti od kokaina. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [PMC brez članka] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Inhibitorne interakcije med projekcijskimi nevroni v črtastem traku. J. Neurophysiol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Spremembe dopaminergičnega in glutamatergičnega prenosa pri indukciji in izražanju vedenjske senzibilizacije: kritični pregled predkliničnih študij. Psihofarmakologija (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Fina struktura in sinaptična povezava skupnega živčnega nevrona podganjih neostriatumov: študija, ki je uporabljala intracelularno injekcijo hrenov peroksidaze. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Wise RA (2004). Dopamin, učenje in motivacija. Nat. Rev. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]