Am J Physiol Regul Integral Comp Fiziol. 2011 apr; 300 (4): R876 – R884.
Objavljeno na spletu 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 Minimalizem
Prej smo poročali, da vnos inzulina v ločno jedro hipotalamusa pri podganah zmanjša motivacijo za saharozo, ocenjeno s samozadostno nalogo. Ker vzorec aktivacije centralnega živčnega sistema (CNS) v povezavi s samo-dajanjem saharoze ni bil ovrednoten, smo v tej študiji izrazili izražanje c-Fos kot indeksa aktivacije nevronov. Podgane smo usposobili za stiskanje saharoze v skladu s časovnim načrtom s fiksnim razmerjem (FR) ali progresivnim razmerjem (PR) in preslikali izražanje imunoreaktivnosti c-Fos v CNS v primerjavi z izražanjem c-Fos v kontroliranih kontrolah. Opazili smo edinstveno izražanje c-Fos v medialnem hipotalamusu (arkadna, paraventrikularna, retrohijazmatična, dorsomedialna in ventromedialna jedra) v povezavi z začetkom delovanja PR in izražanjem c-Fos v lateralnem hipotalamusu in ležišču jedra stria terminalis v povezavi s pojavom učinka FR. Izražanje c-Fos se je povečalo v jedrih podgane tako FR kot PR podgan. Naša raziskava poudarja pomen tako vezja hipotalamične energije homeostaze kot limbičnega vezja pri izvajanju naloge za nagrajevanje hrane. Glede na vlogo medialnega hipotalamusa pri uravnavanju energijskega ravnovesja naša raziskava kaže, da lahko to vezje prispeva k uravnavanju nagrad v širšem kontekstu energetske homeostaze.
je bilo ugotovljeno, da je mezolimbični dopaminergični (DA) sklop, vključno z ventralnim tegmentalnim območjem (VTA) in projekcijami na striatum in kortikalna mesta, ključnega pomena pri motiviranju ali nagrajevanju vidikov številnih razredov zlorabe drog (13, 22-24, 26, 48). Nedavne raziskave našega laboratorija in drugih kažejo, da ima tudi to vezje pomembno vlogo pri motiviranju ali nagrajevanju vidikov hrane. Funkcionalna in anatomska interakcija z vezjem, ki uravnava energijsko homeostazo, predlaga poročila o modulaciji nagrajevanja hrane s prehranskim statusom živali (10, 14, 16, 43). Na modulacijo nagrade, vključno z nagrado za hrano, s prehranskim ali presnovnim statusom močno vplivajo nevronski in endokrini signali, vključno z insulinom (15), leptin (11, 18, 21, 30, 32), ghrelin (35), melaninski koncentrirajoči hormon (MCH) (45) in oreksin (5, 7): prisotnost receptorjev, biokemična in celična učinkovitost ter in vivo ali vedenjska učinkovitost teh signalov v centralnem živčnem sistemu (CNS) so bili v zadnjih letih obilno dokazani.
Tudi razširjeno limbično vezje ima vlogo pri hranjenju in nagrajevanju hrane (2, 19, 28). Vendar pa obstajajo dodatna spletna mesta, ki prispevajo k CNS. Zlasti je znano, da je lateralni hipotalamus (LH) že dolgo znan kot mesto, ki posreduje pri prehranjevanju in samo-stimulacijskem vedenju (4, 31). Oreksinergični nevroni in leptinska signalizacija v LH so bili pomembni za hranjenje in nagrajevanje s hrano (5, 29, 30). Nedavno smo opazili, da lahko inzulin, ki ga dajemo bodisi v tretji možganski ventrikel bodisi v ločno jedro hipotalamusa (ARC), lahko zmanjša samo-aplikacijo saharoze, vendar dajanje insulina v VTA ali jedro jedra ni vplivalo na to posebno paradigmo nagrajevanja (15). Tako se zdi, da lahko več hipotalamičnih mest igra pomembno vlogo pri motiviranem iskanju in pridobivanju hrane in v skladu s tem bi lahko domnevali, da se hipotalamična območja v povezavi s hrano samo dajejo. Za začetek preizkušanja te hipoteze smo preslikali izražanje c-Fos v CNS podgan, ki so se usposabljale v paradigmi saharoze za samo-administracijo, po treningu s fiksnimi razmerji (FR) ali po treningu s progresivnimi razmerji (PR), kar je strožja naloga za oceno motivacije (20).
MATERIALI IN METODE
Predmeti.
Preiskovanci so bili samci albino podgan (325–425 g) iz Simonsena (Gilroy, CA). Podgane so gojili na chow ad libitum. Vzdrževali so jih 12: 12-urni cikel svetloba-tema s prižganimi lučmi ob 6. uri zjutraj in bili usposobljeni in testirani med 7. in XNUMX. uro, v postprandialnem in postapsorpcijskem stanju. Vsi postopki, opravljeni na podganah, so sledili smernicam Nacionalnega inštituta za zdravje za oskrbo živali in jih je odobril pododbor za nego in uporabo živali Odbora za raziskave in razvoj pri zdravstvenem sistemu VA Puget Sound.
Samo-dajanje saharoze.
Postopki so temeljili na naši objavljeni metodologiji (15) in so bile izvedene na krmljenih podganah. Eksperiment je vključeval tri faze: samodejno oblikovanje za začetek treninga, trening FR in progresivno razmerje (PR) z uporabo algoritma PR Richardson in Roberts (38). Algoritem PR zahteva 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX itd. ročne stiskalnice za uspešne dobave nagrad znotraj seje (38). Podgane so izučile za samoplačniko saharoze 5% (nagrada 0.5 ml), ki je bila dostavljena v posodo za kapljanje tekočine. Škatle za operiranje, ki jih nadzira sistem Med Associates (Georgia, VT), so imele dve ročici, vendar je samo ena ročica (aktivna, izvlečna ročica) aktivirala infuzijsko črpalko. Zabeležene so bile tudi stiskalnice na drugi ročici (neaktivni, stacionarni vzvod). Kot smo že opazili, je bilo število pritiskov na neaktivni vzvod zelo majhno (manj kot pritisk na 10 / sejo). Raztopino saharoze smo dali v posodo za kapljanje tekočine za oralno uživanje (Med Associates, St. Albans, VT). Začetno usposabljanje je potekalo med sejami 1-h v skladu z neprekinjenim načrtom ojačitve (FR1: vsak pritisk ročice je bil okrepljen). Vsako zasedanje se je začelo z vstavitvijo aktivne ročice in osvetlitvijo luči bele hiše, ki je ostala vklopljena celotno sejo. Vsak donos za nagrado je spremljal ločen ton s 5 (2900 Hz, 20 dB nad ozadjem) in svetloba (bela svetloba 7.5 W nad aktivno ročico), pri čemer je čas 20 s časom začetka dobave saharoze. Usposabljanje FR je bilo izvedeno za dneve 10; stabilen odziv je dosežen s petim zasedanjem. PR usposabljanje je bilo izvedeno za največji možni 3 h / dan za 10 dni. PR seje so se končale po odzivu 30 min neaktivnega pritiska ročice, ko se je hišna lučka samodejno ugasnila in aktivna ročica se je umaknila; podgane so odpeljali iz preka in jih vrnili v domače kletke. "Ura ustavitve", poročana v Tabela 2 predstavlja čas, ko je bil sistem izklopljen; zato bi se zadnji pritisk ročice zgodil 30 min pred časom zaustavitve. Podatki o vedenju (Tabela 2) predstavljajo povprečja seje 6-10 za usposabljanje FR in seje 1-9 za PR usposabljanje. Podgane, ki jih upravljajo, so bile odstranjene iz stanovanjske sobe in postavljene v čisto operacijsko komoro z vklopljeno lučjo za 60 min, v okviru postopka, da bi simulirali ravnanje s podganami, ki so same davale saharo, in njihovo uporabo. Medtem ko so bili v opernih škatlah, niso imeli ničesar za jesti ali piti in niso imeli dostopa do ročic.
Zadnji dan so bile podgane nameščene v komore po dnevih treninga in v njih so bile 90 minut, nato pa so jih odstranili za anestezijo, perfuzijo in nadaljnjo imunohistokemijo. Kontrolne podgane so prav tako pripeljali v postopkovno sobo in jih 90 minut hranili v čisti operativni komori, po dnevih treningov, nato pa jih anestezirali in perfuzirali. Takoj po zadnji 90-minutni seji so podgane globoko anestezirali z vdihavanjem izoflurana in jih prepojili z 0.9% NaCl, nato pa s hladno 4% raztopino paraformaldehida. Čas za anestezijo in evtanazijo je temeljil na znanem časovnem poteku največje ekspresije beljakovin c-Fos pri 90–120 minutah po dogodku. Tako bi izražanje c-Fos odražalo aktivacijo centralnega živčnega sistema ob začetku vedenjske naloge, ne pa rezultat tega, da bi živali opravile nalogo in zaužile saharozo. Možgane so odstranili in jih nekaj dni fiksirali v paraformaldehidu; nato so jih nato položili v 20% saharozo-PBS, nato pa v 30% raztopino saharoze-PBS. Možgani so bili razdeljeni na kriostat (kriostat Leica CM 3050S) za imunohistokemijo.
c-Fos imunohistokemija in kvantitacija.
Uporabili smo svojo ustaljeno metodologijo za količinsko določanje imunoreaktivnega proteina c-Fos v možganskih odsekih (12). Začetni kvalitativni zaslon celotnih možganov je bil izveden za izražanje c-Fos. Drsno nameščeni 12-μm koronalni odseki s celimi možgani so bili oprani 3 krat v PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Odseki so bili nato blokirani za 1 h pri sobni temperaturi v PBS, ki je vseboval 5% normalnega kozjega ali osličnega seruma. Odseke smo nato večkrat sprali v PBS in jih inkubirali čez noč pri 4 ° C v primarnih raztopinah protiteles, sestavljenih iz PBS. Odseke smo sprali trikrat v PBS in nato inkubirali v temi pri sobni temperaturi v sekundarni raztopini protiteles, sestavljeni v PBS, za 1 h. Odseke smo nato ponovno oprali v PBS in jih montirali, pokrov pa je zdrsnil v pritrdilni medij Vectashield (set Laboratories, Burlingame, CA). Digitalne slike odsekov so bile pridobljene s fluorescentnim mikroskopom Nikon Eclipse E-800, povezanim s kamero Optiphot in z uporabo programske opreme Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Nato smo se osredotočili na omejeno število področij, ki kažejo očitno razliko med pogoji, za količinsko količino in za fenotipizacijo nevronov. Konkretno smo se osredotočili na jedro in lupino jedra (NAc); sprednje in zadnje ležišče jedra stria terminalis (aBNST, pBNST); medialna hipotalamična področja [ventromedialno jedro (VMH), dorsomedialni hipotalamus (DMH), paraventrikularno jedro (PVN), retrohijazmatično območje (RCh) in ARC]; lateralni hipotalamus (LH), vključno s hrbtnimi in ventralnimi regijami ter perifornično (peF) območjem; VTA; možgansko steblo [nižje olivno, hipoglosalno (nXII) jedro samotnega trakta, stransko retikularno jedro in jedra adrenalina / noradrenalina C1 / A1]. Odseki 12-µm, ki se ujemajo z atlasom, so bili ocenjeni za izražanje in kvantizacijo c-Fos v izbranih odsekih in regijah na podlagi atlasa Paxinosa in Watsona (34). Prosim poglej Tabela 1 za določene stereotaksične koordinate. Glavni namen testov je bil primerjati vsako vedenjsko nalogo z ustreznim nadzorom (PR proti PRC; FR proti FRC). Za optimizacijo možnih razlik glede na vedenje in pogoje nadzora so bili za analizo izbrani vrhunski izvajalci iz skupin PR in FR. Tako smo analizirali podgane 4 / 12 PR in 3 / 12 FR: Te podgane so imele aktivno stiskalno številko ročice (primarna končna točka vedenja), ki je bila večja od enega standardnega odklona nad povprečjem za njihovo vedenjsko skupino. Analizirana je bila tudi podhlad kontrolnih podgan (podgane 5 PRC in 3 FRC, ki so bile istočasno prisotne v podružnicah za postopek in FR ali PR). Po postopku FR je bila vzeta dodatna skupina treh podgan, da posnemajo dodano trajanje postopka PR (tj. Skupno 20 dni, ko se PR podgane prepeljejo skozi FR in nato PR), da se oceni, ali razlike med FR in PR so bile posledica vedenjske naloge ali trajanja postopka. Možgani FRext niso bili sistematično analizirani in pregledovani, vendar so bila z drugimi štirimi skupinami testirana posebna področja interesa, da se omogoči primerjalno kvantitativno določanje, kot je natančno navedeno v rezultatih.
Za kvantitativno določitev (pri povečavi 40 ×) so bila izbrana atlasno uravnana področja. Programska oprema ImagePro Plus (Media Cybernetics) je bila uporabljena za zajem slike želenega območja. Za štetje je bilo določeno območje in določeno je bilo prag za pozitivno število celic. Enako območje in ozadje (prag) sta bila uporabljena za odseke iz ustreznih eksperimentalnih skupin, programsko štetje pozitivnih celic (količinsko določanje) pa je bilo izvedeno v isti seji za vse eksperimentalne skupine, da se preprečijo spremembe med nastavitvijo ozadja med sejo. Za statistično analizo so bili odšteti od posamezne podgane le, če so ustrezni ali celotni odseki skozi vsako območje (kot je opredeljeno v Tabela 1) so bili na voljo; podatki za določeno območje niso bili odvzeti podgani, če je bilo za to območje nepopolno dvostransko zastopanje.
Kvalitativna dvojno označena analiza imunofluorescence.
Odseki možganov so bili odvzeti podganam, pri katerih je bil kvantificiran c-Fos, za dvojno označeno imunohistokemijo. Ker nismo želeli motiti vedenjskih lastnosti živali, jih niso predhodno obdelali s kolhicinom, da bi optimizirali vizualizacijo peptidnih nevrotransmiterjev. Zato je bila vizualizacija nevronskih fenotipov, aktiviranih v povezavi z nalogo samoupravljanja, omejena. Za začetek ocenjevanja fenotipov aktiviranih nevronov na številnih lokacijah centralnega živčnega sistema so bile posnete digitalne slike (pridobljene, kot je opisano v zgornjem oddelku) s povečavo 20 ×, 40 × ali 60 × (kot je prikazano v slikovnih legendah). . Postopek dvojnega barvanja za glutamat dekarboksilazo (GAD), tirozin hidroksilazo (TH), CRF, nevropeptid Y (NPY), z Agouti povezan peptid (AgRP) in triptofan hidroksilazo je bil primerljiv s testom c-Fos imunoreaktivnosti na njegovi lastno, le da smo mešanico c-Fos-Ab in enega od drugih primarnih protiteles uporabili za inkubacijo čez noč pri 4 ° C; prav tako sta bili obe sekundarni protitelesi v isti raztopini in inkubirani 1 uro v temi pri sobni temperaturi. Za preskus oreksina smo uporabili 20-minutno 50-odstotno izpiranje etanola pred blokado. Za določitev ustrezne razredčitve primarnih protiteles so bili opravljeni začetni optimizacijski testi. Primarna protitelesa so bila zajčji anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) in mišji anti-c-Fos (1: 800) (oba iz Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); miši proti GAD (1: 1,000), miši proti tirozin hidroksilazi (1: 500) in ovčje anti-triptofan hidroksilaze (vse iz Chemicon, Temecula, CA); zajčji anti-CRF (1: 500) (darilo dr. Wylieja Valea, Salk Institute, CA); kunec anti-NPY (1: 1,000), kunec anti-AGRP (1: 1,000) in kozji anti-oreksin A (1: 5,000), vsi iz Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Uporabljena sekundarna protitelesa so bili konjski konjugirani kozji zajec ali miška (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), kozji anti-miš Alexa ali Fluor 3 proti ovčjim IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; vsa sekundarna protitelesa smo razredčili pri 488: 1. dvojno imunsko barvanje c-Fos / MCH smo testirali serijsko; najprej za MCH (500: 1 primarnih protiteles, Millipore) s sekundarnim protitelesom proti zajcem Alexa-2,500-koz (488: 1). Diapozitivi so bili ponovno blokirani s 500% normalnim kozjim serumom in obarvani za anti-c-Fos (5: 1) in cy500-kozji anti-kunec kot sekundarno protitelo. Za preskus MCH smo uporabili 3-minutno 20-odstotno izpiranje etanola pred blokado.
Statistične analize.
Podatki skupine so v besedilu, tabelah in slikah predstavljeni kot ± SE. Pomen je opredeljen kot P ≤ 0.05. Statistične primerjave se opravijo med eksperimentalnimi skupinami (FR v primerjavi s PR) ali med eksperimentalnimi skupinami in ustreznimi kontrolami (PR v primerjavi s PRC; FR v primerjavi s FRC) z uporabo neparne študentske t-test. Pearsonovi koeficienti korelacije med aktivnimi pritisnimi vzvodi in izražanjem c-Fos v različnih možganskih regijah ter korelacija izražanja c-Fos med različnimi možganskimi regijami v enakih eksperimentalnih pogojih so bili izračunani z uporabo programa statistične analize StatPlus: mac LE za različico Mac OS 2009 pri AnalystSoft. Testirali smo linearne korelacije (Pearsonova R statistično) med izražanjem c-Fos v različnih regijah CNS. Preučili smo tudi povezave med izražanjem c-Fos v različnih aktiviranih regijah CNS in vedenjem. Za te korelacije so bili uporabljeni podatki FR in PR pri podganah, pri katerih je bila izvedena kvantitacija c-Fos.
REZULTATI
količinsko določanje c-Fos
Kot smo že opazili, je bilo število aktivnih ročnih pritiskov bistveno večje za zmogljivost PR v primerjavi z FR (Tabela 2), število nagrad saharoze pa je bilo med FR učinkom večje. Dolžina seje za PR podgane je bila približno 90 min (čas zaustavitve - 30). Tabela 3 navaja število imunoreaktivnih celic c-Fos v vseh regijah CNS, kjer je bila izvedena kvantitacija. Vzorec izražanja c-Fos za podgane FR in PR je povzet v Slika 1. Prišlo je do pomembne aktivacije medialnega hipotalamusa (MH)za, sestavljen iz ARC, PVN, RCh, DMH in VMH) podgan, ki se ukvarjajo s stiskanjem ročice PR za saharozo, vendar pri podganah, ki se ukvarjajo s pritiskanjem vzvodne frekvence za saharozo, ni bilo splošne aktivacije v primerjavi z ustreznimi kontrolami. V medialnem hipotalamusu PR podgan je prišlo do te aktivacije v PVN, ARC in VMH (Slika 2). Stiskanje vzvoda FR, ne pa stiskanje PR-ročice, je bilo povezano s pomembno aktivacijo znotraj LH (ki temelji predvsem na aktiviranju znotraj periforničnega območja). Tako aktivni stiskalni vzvodi kot hipotalamični c-Fos izraz so bili primerljivi med skupinama FRext in FR (MHza, 946 ± 26 in 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 in 186 ± 10; LHza, 468 ± 79 in 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 in 173 ± 15), kar nakazuje, da je razlika v vzorcu izražanja med skupinami FR in PR povezana ne s trajanjem usposabljanja / izkušenj, ampak z naravo instrumentalne naloge. Za skupino FR je prišlo do pomembnega povečanja izražanja c-Fos v BNST, opaženega tako v aBNST kot v pBNST. Tako pritisk vzvoda FR kot PR sta bila povezana s povečanimi imunopozitivnimi nevroni c-Fos v lupini NAc; Pri podganah, ki se ukvarjajo s stiskanjem vzvodne frekvence FR, so se v jedru NAc znatno povečale količine c-Fos, pri podganah, ki se ukvarjajo s stiskanjem ročice PR, pa je bil nepomemben trend povečanja izražanja c-Fos. c-Fos ni bil povečan v VTA z nalogo PR, čeprav je bil pri nalogi FR opazen neznaten trend povečanja. Končno se je c-Fos bistveno povečal v hipoglossalnem (kranialnem živcu XII) jedru v možganskem steblu podgan, ki so se usposabljali za PR, ne pa za FR.
Izražanje c-Fos so opazili v drugih regijah osrednjega živčevja, vključno z amigdalo in možgansko skorjo (Slika 3). Vendar je bilo izražanje opaženo tako v pogojih nadzora, kot tudi v povezavi z nalogami PR in FR, kar kaže na to, da bi lahko nespecifični vidiki postopka (ravnanje, premik v procesno sobo) povzročili to aktiviranje. Kvantitacija v teh regijah ni bila izvedena. Prav tako so opazili aktivacijo v možganskih matičnih regijah, ki niso nXII, vendar se je pojavila v povezavi s stanji nadzora in z nalogami, kar kaže tudi na vlogo pri nespecifičnem vzburjenju ali vedenjski aktivaciji.
Preizkusili smo korelacijo med izražanjem c-Fos v različnih regijah CNS. Z združevanjem podatkov iz skupin, ki pritiskajo na vzvod, smo ugotovili negativno korelacijo med izražanjem c-Fos v LH in VMH; tako je bila aktivacija VMH povezana z zmanjšano splošno aktivacijo LH (Pearsonova R, -0.7986; t = −3.7534; P = 0.0056). Opazili smo tudi pomembno pozitivno korelacijo med izražanjem c-Fos v periforničnem območju LH in VTA (Pearsonova R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), skladno z znano monosinaptično povezljivostjo med tema dvema regijama (glej razpravo v Ref. 2 in 13). Ugotovili smo pomembno negativno korelacijo med izražanjem c-Fos v VTA v primerjavi z lupino NAc, ne glede na to, ali je bil ločeno testiran za učinkovitost FR (Pearsonova R, -0.9262; t = −4.9125; P = 0.008) ali za PR uspešnost (Pearsonova R, -0.9897; t = −9.7624; P = 0.0103), kar je skladno z znanimi vzajemnimi vhodi med črtastimi regijami v substantia nigra in VTA (2, 13). Preizkusili smo tudi korelacije med izražanjem c-Fos v različnih regijah CNS in vedenjem. Z združitvijo podatkov iz skupin, ki pritiskajo na vzvod, smo opazili pomembno pozitivno povezavo med c-Fos v ARC in aktivnimi stiskalnicami (Pearsonova R, 0.8208; t = 3.8017; P =
Identifikacija nevronov, aktiviranih z vnosom saharoze, in motivacija za saharozo.
Na možganskem steblu c-Fos-pozitivni nevroni niso pokazali pozitivnega imuno obarvanja na TH, encim, ki omejuje hitrost na epinefrin in norepinefrin (in dopamin); zato se zdi, da ti kateholaminergični nevroni niso bili aktivirani z nalogami FR ali PR. Vendar pa so nekateri c-Fos-pozitivni nevroni pokazali pozitivno imuno obarvanje na triptofan hidroksilazo, kar kaže, da je bila aktivirana populacija serotoninskih nevronov. Kot je prikazano v Slika 4, v ARC-ju so c-Fos-pozitivna celična telesa obdala vlakna, obarvana z AGRP, in podoben vzorec imuno-obarvanja z NPY vlakna / c-Fos so opazili (ni prikazan). V PVN se zdi, da so c-Fos-pozitivni nevroni obkrožali CRF-pozitivne nevrone, vendar kolokalizacije niso opazili (podatki niso prikazani). Slika 5 prikazuje imunološko obarvanje za oreksin in MCH v LH. Oreksinske nevrone smo našli tako v dLH kot v peLH. Čeprav smo v peLH opazili MCH-pozitivne nevrone, v tej regiji LH v bistvu ni bilo kolokalizacije s c-Fosom. Vendar smo opazili kolokalizacijo c-Fos v oreksin-pozitivnih nevronih znotraj peLH (Slika 6, vrh) in zelo omejena c-Fos kolokalizacija z MCH v vLH (Slika 6, dno). Ponovno je treba poudariti, da je za peptidne nevrotransmiterje, kot je CRH, mogoče podcenjevati lokalizacijo in kolokalizacijo s c-Fosom, ker podgane niso predhodno obdelale s kolhicinom. Končno se znotraj jedra nahajajo jedro in lupina (Slika 7) opazili so c-Fos koimuno obarvanje z GAD, sintetičnim encimom za nevrotransmiter GABA, za podgane FR in PR. V VTA je bilo močno obarvano za TH; vendar so bili c-Fos-pozitivni nevroni redko opaženi in ni bilo videti, da izključno kolokalizirajo s TH.
DISKUSIJA
V trenutni študiji smo uporabili izražanje neposrednega zgodnjega gena, c-Fos, da smo ocenili vzorec akutne aktivacije CNS, povezanega z začetkom pritiska na ročico za samodejno dajanje saharoze, bodisi kot relativno nezahtevno nalogo (FR) ali postopno zahtevnejša naloga je misliti, da odraža motivirano iskanje nagrade, kot je saharoza, in močno vključi limbično vezje (22, 24, 49) (PR). Hipotalamični vzorci aktivacije so se med obema nalogama razlikovali, LH / limbična aktivacija prevladuje v nalogi FR in medialna hipotalamična / limbična aktivacija prevladuje v PR nalogi (glej Slika 1). Za to obstaja več možnih razlogov. Prvič, te paradigme bi se lahko "preslikale" kot kvalitativno različne izkušnje v CNS. Podgane, ki so trenirali v izvedbi FR, bi pričakovali enostavno in visoko nagrajeno dejavnost. Pričakovanje koristne hrane naj bi močno vplivalo na vzorec c-Fos, opažen pri podganah FR. Navidezna kvalitativna razlika v vzorcu aktivacije kaže na to, da je druga možnost - da imajo PR-živali preprosto več izkušenj z nalogo - manj verjetna, kar je podprlo tudi naše merjenje c-Fos v hipotalamusu podgan, ki so prejemale seje 20 FR , ki je pokazal aktivnost, podobno skupini FR, ne skupini PR. Obe možnosti bi lahko preizkusili s sistematičnim povečevanjem težav pri usposabljanju FR in ocenjevanjem sprememb v aktivaciji CNS. V tem primeru bi lahko napovedali kakovostno spremembo vzorca aktivacije. Kljub temu, da število izkušenj z usposabljanjem morda ne upošteva vzorca aktiviranja CNS, bi povprečno število nagrad saharoze v seji lahko: nalogo za PR bi bilo mogoče preprosto naučiti kot izkušnjo, ki je "manj koristna", in to je lahko funkcionalno povezano z pomanjkanje aktivacije LH. Tako lahko vzorec aktivacije CNS na začetku seje odraža interoceptivno stanje, kakršno je paradigma pogojenih mest: moč aktivacije znotraj limbičnega vezja je vezana na učenje in motivacijo. Opazili smo variabilnost izražanja c-Fos v medialnem hipotalamusu pri živalih FRC. Zlasti znotraj PVN lahko ta spremenljivost prikrije aktivacijo pri podganah FR, pri čemer so opazili trend povečanja c-Fos in FRC podgan (Tabela 3). Vendar se celotna medialna hipotalamična aktivacija med FR in FRC živalmi ni razlikovala.
Upoštevati je treba, da čeprav je bil naš cilj prepoznati mesta CNS, ki prispevajo k pojavu vedenja, časovna ločljivost nekoliko upošteva. Kot je razvidno spodaj, je zdaj razvidno, da se z aktiviranjem različnih populacij nevronov posreduje različna podkomponenta instrumentalnega ali operaterskega vedenja (13, 23, 33, 49). Ne moremo popolnoma izključiti, da bi aktiviranje zaradi zelo neposrednega stiskanja ali lizanja nagrad morda nekoliko pripomoglo k aktivacijskim vzorcem, ki smo jih opazili. Naše ugotovitve dajejo osnovo za nadaljnjo preiskavo vloge določenih mest CNS v različnih vidikih ali sestavnih delih naloge samoupravljanja in za takšne študije merjenje drugih takojšnjih zgodnjih genov z različnimi časovnimi poteki "vklop" in "izklop" (36) bo zelo koristno.
Korelacije, ki smo jih našli pri izražanju c-Fos med različnimi možganskimi regijami, podpirajo znano funkcionalno povezanost hipotalamičnih in primarnih limbičnih regij za to posebno nagradno nalogo, na primer med LH in VMH ter med perifornično regijo LH in VTA (glej razpravo v Ref. 2 in 13). Preučili smo tudi korelacije med izražanjem c-Fos v različnih aktiviranih regijah in vedenjem. Povezava med c-Fos v ARC in aktivnimi pritiski vzvoda ustreza natančno opredeljeni vlogi ARC pri vnosu hrane (1); z našim prejšnjim opažanjem je injiciranje inzulina posebej v ARC zmanjšalo samo-dajanje saharoze (15); s predhodnimi poročili o kritični vlogi ARC in njegovih endorfinergičnih nevronov pri pridobivanju in uspešnosti samokokacije kokaina (40-42); in z identificiranimi projekcijami od ARC do NAc (17). Tako najbrž ARC igra ključno vlogo v motiviranem vedenju za iskanje in pridobivanje številnih vrst nagrajujočih dražljajev, vključno s hrano, vendar ni omejeno nanje. Nazadnje smo opazili pomembno aktivacijo PVN in VMH z začetkom iskanja PR saharoze. To je skladno z dobro opisanimi vlogami teh medialnih hipotalamičnih jeder pri uravnavanju vnosa hrane, neposredni sinaptični povezanosti z ARC in identificiranih povezavah z limbičnim vezjem (1, 27, 37).
Ugotovili smo pomembno negativno korelacijo med izražanjem c-Fos v VTA in NAc lupini, bodisi testirano na FR ali PR delovanje. Nekoliko presenetljivo je bilo, da močnejše aktivacije VTA niso opazili v povezavi s samo-dajanjem saharoze PR ali FR (v primerjavi s kontrolo). Morda ta ugotovitev odraža čas našega merjenja in se osredotoči na potencialna mesta CNS, dejavna ob začetku naloge, za kar so bile te živali dobro usposobljene. To bi bilo skladno z Schultzovimi opažanji in tezo (44), da aktivacija dopaminskih nevronov služi kot označevalec nepričakovanih dražljajev ali nagrad in ta aktivacija se zmanjšuje v povezavi s treningom. Vendar se je pokazalo, da se strijatalno sproščanje dopamina med jemanjem saharoze pri treniranih živalih pojavlja kot zelo natančen in časovno diskreten dogodek (39). Tako je mogoče, da bi bili trendi, ki smo jih opazili, z večjo študijsko skupino (tj. Več statistične moči) zelo pomembni. Opazili smo aktivacijo NAc v povezavi z jemanjem saharoze FR in PR. O aktivaciji in inhibiciji NAc nevronov so poročali v povezavi z instrumentalno uspešnostjo nagrajevanja, vzorec aktivacije / aktivnosti pa je odvisen od treninga in okolja ter je povezan z različnimi sestavnimi deli vedenja (npr. Orientacija, pristop, vnos) (6, 33, 50). Kot je razloženo zgoraj, merjenje c-Fos ne bi zajelo tako specifične aktivnosti. Carlezon je predlagal, da je "nagrada" večinoma povezana z zmanjšanjem aktivnosti nevronov NAc, tj. Srednjih bodicastih nevronov (3). To ni v skladu z našimi opažanji - bistveno izboljšan NAc c-Fos v primerjavi z upravljanjem kontrol in c-Fos-pozitivnih nevronov, kolokaliziranih z GAD, skladno z aktivacijo srednje spiniranih nevronov (GABAergic) -, vendar nismo posebej ocenili "zaviranja nevronskih NAc" “. Aktivacija in inhibicija NAc se lahko pojavita med instrumentalnimi nalogami z anatomsko in časovno specifičnostjo. Z vidika te študije je mogoče sklepati, da je NAc vključen v začetek instrumentalnega jemanja saharoze, pri čemer jedro NAc prispeva k motorični aktivaciji, lupina NAc pa prispeva k motoričnim in motivacijskim vidikom naloge.
Opazili smo tudi aktiviranje obeh glavnih regij BNST (sprednje in zadnje) pri FR podganah. BNST je del limbičnega vezja, ki modulira nevroendokrine odzive na ponavljajoče se izkušnje z dražljaji (8, 9) in je v širšem smislu povezano z učenjem ponavljajočih se dražljajev. Čeprav je bila njegova vloga razjasnjena najbolj izčrpno v zvezi s ponavljajočimi se stresnimi izkušnjami, naša ugotovitev kaže na širšo vlogo BNST: BNST lahko modulira odzive CNS na ponavljajoče se pozitivne, pa tudi negativne ali stresne dražljaje. Ker smo to aktivacijo opazili že ob začetku FR, ne pa tudi PR-ja, uspešnost, je BNST zaposlovanje lahko vezano na povečane nagrade za saharozo pri treningu FR. Naše opazovanje neposredne aktivacije CRF nevronov kaže, da instrumentalno odzivanje na saharozo ni glavni stresor; vendar je izražanje c-Fos v drugih PVN nevronih skladno z modulacijo napetostnega vezja (46). Pravzaprav sta Ulrich-Lai in njegovi sodelavci poročali, da z drugačno paradigmo prehrane / hranjenja vnos saharoze modulira PVN funkcijo (47). Nazadnje smo opazili aktivacijo jedra hipoglossalnega živca v povezavi s PR, ne pa tudi z učinkom FR. O pomenu tega je mogoče le ugibati; ena od možnosti je, da se pri podganah, ki zaužijejo manj saharoze, poveča vsebnost saharoze v okusu.
Iskanje saharoze in jemanje saharoze je treba obravnavati kot multimodalnostno izkušnjo, časovno dinamično, saj bi zaužitje povzročilo periferne signale, povezane s kalorično vsebnostjo saharoze, pa tudi navadovanje in alilietezijo znotraj seje (25). Medtem ko so se naše raziskave osredotočile na vpliv perifernih endokrinih signalov, tj. Insulina in leptina, na modulacijo nagrajevanja hrane, so njihovi učinki lahko neposredno osrednji posredniki oddajnikov in nevropeptidov, ki imajo kratkoročno ali dolgoročno vlogo. hranjenja ali nagrade za hrano (glej razpravo v ref. št. 14). Trenutna študija ponuja nekaj vpogleda v to; opazili smo nekaj aktivacije nevronov, ki izražajo MCH ali oreksin, dva nevropeptida, ki sta oreksigena. Te ugotovitve lahko v resnici podcenjujejo vlogo MCH ali oreksina pri nagrajevanju hrane, saj imunocitokemija pri podganah, ki se ne zdravijo s kolhicinom, nedvomno omejuje vizualizacijo obeh nevropeptidov. Identifikacija aktiviranih oreksinskih nevronov v LH je v celoti skladna s številnimi raziskavami, ki vključujejo oreksinske nevrone pri hranjenju, nagrajevanju s hrano in bolj splošni nagradi za stimulacijo (npr. 5, 7, 29). Opazili smo aktiviranje peFLH oreksinskih nevronov. Aston-Jones in sodelavci (5) so secirali vloge različnih populacij nevronov LH oreksina v vedenjskem nagrajevanju in vpleteli nevrone peFLH oreksina v vzburjenje, v nasprotju z nagrado kot takšno. Naša ugotovitev torej kaže na vlogo LH oreksina pri vzburjenju in morda usmerjenosti k aktivnemu vzvodu ali vzorcu za jemanje saharoze.
V prihodnosti je pomembna edinstvenost ali posplošljivost saharoze kot spodbudnega dražljaja. Ali je vzorec zgodnje aktivacije CNS, o katerem poročamo, specifičen za hrano kot spodbudo, ali posplošuje na druge koristne dražljaje, še ni treba določiti. Kot že zgoraj omenjeno, zlasti pri nalogah za FR, bi bilo pričakovati, da bo zaužitje številnih nagrad saharoze povzročilo presnovne posledice z modulacijo sproščanja hormonov (na primer holecistokinin, grelin, inzulin) in spremembami v periferni in živčni aktivaciji CNS. Od teh sprememb ne bi bilo pričakovati, da bodo imele neposredno vlogo pri zgodnjih vzorcih aktivacije CNS, ki smo jih izmerili, vendar bodo morda igrali vlogo pri učenju nagrade za saharozo med treningom. Spet so lahko nevropeptidi, kot je oreksin, kritično vpleteni.
Naša raziskava po našem vedenju predstavlja prvi prikaz aktivacije specifičnih medialnih hipotalamičnih jeder ob začetku samoulaganja saharoze, vključno s PVN, vpletenimi v homeostazo in odzivnost na stres, in ARC, ki je kritičen za energijsko homeostazo, zaznavanje hranil in uravnavanje vnosa hrane. Pomembno je, da smo v povezavi s pojavom PR opazili aktiviranje medialnega hipotalamusa in NAc, kar kaže, da igrajo tako homeostatična kot nekatera limbična mesta vlogo pri uvedbi samo-dajanja saharoze. Dodatna mesta z limbičnimi vezji se lahko pozneje naberejo.
Perspektive in pomen
Medtem ko bi v preteklosti študije motivacijskega in nagrajevalnega vedenja najmočneje implicirale limbično vezje CNS, je bilo nabranih veliko dokazov, ki poudarjajo kritično funkcionalno interakcijo med vezjem limbičnega in energijskega homeostaze. Sedanja študija zdaj kaže na pomemben pomen specifičnih medialnih hipotalamičnih jeder pri motiviranem delu za saharozo. Z nadaljnjo raziskavo lahko s pomočjo te študije ocenimo, ali je vloga medialnega hipotalamusa potrebna in ali je njegova aktivacija vpletena v motivirano iskanje drugih nagrad, kot so zlorabe drog. Poleg tega izsledki te študije dajejo utemeljitev za proučevanje sprememb motiviranega vedenja v okoliščinah, ki so sočasno s spremenjeno medialno hipotalamično fiziologijo, na primer pri debelosti.
PODPI
To raziskavo je podprl Nacionalni inštitut za zdravje DK40963. Dr. Dianne Figlewicz Lattemann je višja znanstvena raziskovalna kariera, program za biomedicinske laboratorijske raziskave, oddelek za veteranske zadeve Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Dr. Sipols podpira Latvijski svet znanosti 04.1116.
ZAHVALA
Zahvaljujemo se dr. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius in JE Blevins za nasvete in koristne razprave.
VIRI
;
