Fadok JP, Darvas M, Dickerson TMK, Palmiter RD
(2010) โปรดหนึ่ง 5 (9): e12751 ดอย: 10.1371 / journal.pone.0012751
Jonathan P. Fadok1,2, Martin Darvas2, Tavis MK Dickerson2, Richard D. Palmiter2
1 บัณฑิตศึกษาสาขาวิชาชีววิทยาและพฤติกรรม, มหาวิทยาลัยวอชิงตัน, ซีแอตเทิล, วอชิงตัน, สหรัฐอเมริกา,
2 ภาควิชาชีวเคมีและสถาบันการแพทย์ Howard Hughes, มหาวิทยาลัยวอชิงตัน, ซีแอตเทิล, วอชิงตัน, สหรัฐอเมริกา
สารสื่อประสาทโดปามีน (DA) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเรียนรู้ในการปรับสภาพความกลัวพาฟโลเวียน กระบวนทัศน์ที่เรียกว่าสะดุ้งกลัวความสามารถ (FPS) หนูที่ขาดความสามารถในการสังเคราะห์ DA ไม่สามารถเรียนรู้ความสัมพันธ์ระหว่างสิ่งกระตุ้นที่มีเงื่อนไขกับ footshock ที่ทำให้เกิดความกลัว ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่าการคืนค่าการสังเคราะห์ DA ให้เป็นเซลล์ประสาทของพื้นที่หน้าท้อง (VTA) นั้นเพียงพอสำหรับการฟื้นฟู FPS ที่นี่เราใช้วิธีการกู้คืนไวรัสแบบเลือกเป้าหมายเพื่อกำหนดพื้นที่สมอง mesocorticolimbic ที่ได้รับสัญญาณ DA จาก VTA ต้องการ DA สำหรับ FPS เราแสดงให้เห็นว่าการฟื้นฟูการสังเคราะห์ DA ให้กับทั้ง amolgdala basolateral (BLA) และนิวเคลียส accumbens (NAc) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับหน่วยความจำระยะยาวของ FPS ข้อมูลเหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับวงจรที่ขึ้นอยู่กับโดปามีนที่เกี่ยวข้องในการสร้างหน่วยความจำที่เกี่ยวข้องกับความกลัว
บทนำ
DA ถูกสังเคราะห์โดยเซลล์ประสาทในนิวเคลียสที่ไม่ต่อเนื่องภายในสมองรวมถึง hypothalamus, จมูกหลอด, และหน้าท้องส่วนกลาง [1] DA neurons ใน VTA ของโครงการสมองส่วนล่าง ventral midbrain ไปยังพื้นที่สมอง limbic ที่มีความสำคัญต่อการปรับสภาพความกลัวเช่นเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า, hippocampus, amygdala และ NAc [1], [2] สอดคล้องกับบทบาทของ DA ในการปรับสภาพความกลัวอัตราการยิงของเซลล์ประสาท DA ถูกเปลี่ยนแปลงโดยสิ่งเร้าที่ทำให้เกิดความกลัวรวมถึงตัวชี้นำที่ทำนายผลลัพธ์ที่น่ารังเกียจ [4], [5], [6] นอกจากนี้เพื่อตอบสนองต่อสิ่งเร้าที่น่ากลัวหรือสถานการณ์ที่เครียดระดับ DA เพิ่มขึ้นในหลาย ๆ ส่วนของสมอง [7], [8], [9], [10] และการเปลี่ยนแปลงทางเภสัชวิทยาและพันธุกรรมของฟังก์ชัน DA สามารถขัดขวางการเรียนรู้ในกระบวนทัศน์ปรับสภาพความกลัว [11], [12], [13]
ในการปรับความหวาดกลัวให้ Pavlovian มาตรการกระตุ้นที่เป็นกลางเช่นแสงถูกจับคู่กับสิ่งเร้าที่ไม่มีเงื่อนไขเช่นการสั่นสะเทือน หลังจากการฝึกอบรมการนำเสนอมาตรการกระตุ้นเพียงอย่างเดียวทำให้เกิดการตอบสนองต่อความกลัว [3] FPS เป็นกระบวนทัศน์การปรับความกลัวแบบ Pavlovian ที่ใช้กันทั่วไปซึ่งการเรียนรู้ได้รับการประเมินโดยการเพิ่มขึ้นของคำตอบในการตอบสนองต่อเสียงรบกวน [15] ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาท DA ใน VTA นั้นเพียงพอสำหรับการเรียนรู้ในกระบวนทัศน์ FPS [12] นอกจากนี้เราแสดงให้เห็นว่า DA ใน BLA นั้นเพียงพอที่จะสร้างหน่วยความจำระยะสั้น (STM) แต่ไม่ใช่หน่วยความจำระยะยาว (LTM) ของสมาคมคิวช็อก จากเป้าหมายที่เหลืออยู่ของเซลล์ประสาท VTA DA, NAc ได้รับการปกคลุมด้วยเส้นที่ใหญ่ที่สุดและดังนั้นจึงเป็นเว็บไซต์ที่ผู้สมัครที่สำคัญสำหรับการสร้าง LTM สำหรับ FPS [2]
วรรณกรรมขนาดใหญ่สนับสนุนบทบาทของ DA ภายใน NAc สำหรับกระบวนการเรียนรู้แบบเชื่อมโยงในกระบวนทัศน์ตามรางวัล [16] ขณะนี้ยังไม่ชัดเจนว่า DA ใน NAc นั้นมีความสำคัญต่อการเรียนรู้ในการกำหนดเงื่อนไขความกลัวของ Pavlovian หรือไม่ อย่างไรก็ตามการศึกษาพบว่าระดับ DA เพิ่มขึ้นใน NAc ในการตอบสนองต่อสิ่งเร้าที่น่ากลัวและชี้นำการทำนาย [10] ยิ่งไปกว่านั้น NAc ยังถูกควบคุมโดย BLA [16], [17] ซึ่งเป็นนิวเคลียสที่จำเป็นสำหรับการปรับสภาพความกลัวและ DA ช่วยให้การทำงานของเซลล์ประสาททั้งใน NAC และ BLA [18], [19], [20], [21] ] ดังนั้นจึงเป็นไปได้ว่าการเชื่อมต่อระหว่าง BLA และ NAc และการส่งสัญญาณ DA ในทั้งสองภูมิภาคนี้เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการปรับสภาพความกลัวของ Pavlovian
เพื่อตรวจสอบว่า DA มีความจำเป็นใน NAc และ BLA สำหรับ LTM ในการปรับเงื่อนไขแบบกลัว Pavlovian หรือไม่เราใช้รูปแบบเมาส์โดปามีนบกพร่อง (DD) ที่ขาดความสามารถในการสังเคราะห์ DA เนื่องจากการแทรกตัวถอดรหัส / การถอด loxP คาสเซ็ตต์ในยีนไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (Thfs) [22] ในการปรากฏตัวของ Cre recombinase การส่งสัญญาณ DA สามารถเลือกคืนสู่พื้นที่เป้าหมายที่เฉพาะเจาะจงได้โดยการเปิดใช้งาน Thfs allele อีกครั้งผ่านการกำจัด Cassette ที่หยุดทำงาน เราใช้ไวรัส retrogradely-trafficked virus ที่แสดง Cre recombinase เพื่อเลือกคืนค่า DA ให้เป็น NAc เพียงอย่างเดียวหรือทั้ง NAc และ BLA ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า DA ใน NAc และ BLA นั้นเพียงพอสำหรับการสร้าง LTM สำหรับ FPS
ผลสอบ
การคืนค่า TH ในหนู DD ที่ได้รับการช่วยเหลือจากไวรัส
เพื่อตรวจสอบว่าในสมอง DA จำเป็นสำหรับการสร้าง LTM สำหรับ FPS อย่างไรฟังก์ชั่น DA ได้รับการกู้คืนในหนู DD ผ่านการฉีด CAV2-Cre recombinase ไวรัสตัวนี้เลือกที่จะติดเชื้อเซลล์ประสาทและถูกส่งย้อนหลังจากแหล่งฉีด [23] หากฉีดเข้าไปในนิวเคลียสเป้าหมายของเซลล์ประสาท DA ในหนู DD ไวรัสนี้จะถูกส่งกลับไปยังเซลล์ประสาท DA ของสมองกลางหน้าท้องซึ่งมันจะกระตุ้นเทปหยุดการทำงานซึ่งจะกระตุ้นการทำงานของยีน Th คืนการผลิต TH และให้การผลิต DA เฉพาะกับ เป้าหมายที่เลือก [22] เราใช้เทคนิคนี้ในเมาส์สองกลุ่มแยกกัน เนื่องจาก NAc เป็นเป้าหมายที่ใหญ่ที่สุดของเซลล์ประสาท DA ของ VTA [2] เราตั้งสมมติฐานว่านิวเคลียสนี้อาจมีความสำคัญสำหรับการสร้าง LTM สำหรับ FPS; ดังนั้นการฉีดทวิภาคีของ CAV2-Cre จึงถูกสร้างขึ้นใน NAc ในหนึ่งกลุ่ม นอกจากนี้เรายังทดสอบสมมติฐานว่าอาจจำเป็นต้องใช้ DA ในหลายเป้าหมายของ VTA สำหรับ LTM ในการทดสอบสิ่งนี้ได้ทำการฉีดสารทวิภาคีเข้าไปในหนูทั้งสองและ NA ของ BL
อิมมูโนวิทยาใช้เพื่อยืนยันการเรียกคืนการทำงานของ TH ในหนู DD ที่ฉีดไวรัส (รูปที่ 1) ตามที่คาดไว้มีสัญญาณที่ชัดเจนสำหรับ TH ในหนูควบคุมซึ่งร่วมกับ DA transporter (DAT) (รูปที่ 1A – D) ตรวจพบ TH ใน BLA ของหนูควบคุม (รูปที่ 1E) อย่างไรก็ตาม DAT immunoreactivity นั้นต่ำมากใน BLA ดังนั้นจึงไม่แสดง Immunohistochemistry ได้ดำเนินการกับเนื้อเยื่อสมองจากหนู DD ที่ไม่ได้ฉีด (รูปที่ 1 F-J) ไม่มีสัญญาณ TH ที่ตรวจพบได้ใน NAc (รูปที่ 1F, G) แต่ยังมีการย้อมสี DAT (รูปที่ 1H, I) BLA ของหนู DD นั้นส่วนใหญ่ไร้การย้อมสี TH (รูปที่ 1J)
รูป 1
การเลือกคืนค่า TH ในหนูที่ได้รับการช่วยเหลือจากไวรัส
อิมมูโนฮิโตเคมีจากหนู DD ที่ถูกฉีดใน NAc แสดงให้เห็นว่า TH ได้รับการฟื้นฟูในระดับสูงของ NAc (รูปที่ 1K – N) ไม่พบ TH ที่ตรวจพบได้ใน BLA ของหนู DD ที่ถูกฉีด NA (รูปที่ 1O) การช่วยเหลือสองครั้งใน NAc และ BLA ส่งผลให้เกิดสัญญาณที่แข็งแกร่งสำหรับ TH ใน NAc (รูปที่ 1P – S) และสัญญาณ TH ที่แข็งแกร่งใน BLA (รูปที่ 1T) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการฉีดไวรัสของ CAV2-Cre นั้นมีประสิทธิภาพสูงในการฟื้นฟูการแสดงออกของ TH เฉพาะบริเวณสมองที่ฉีด
เพื่อยืนยันว่าการช่วยเหลือไวรัสของ TH นำไปสู่การฟื้นฟู DA ในหนู DD ที่ถูกฉีดเราได้ทำการวัดปริมาณ DA, DA metabolites และ norepinephrine โดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC; Table 1) สำหรับการทดลองนี้เราทำการช่วยเหลือใน NAc หรือ amygdala เพื่อพิจารณาว่าการกู้ภัย TH ในเป้าหมายหนึ่งของการคาดการณ์ DA จะมีผลต่อระดับ DA ในภูมิภาคอื่นที่ไม่ใช่การฉีด เราพบว่าหนู DD dopamine ที่พร่องไปนั้นมีระดับควบคุม 0.51% ของ DA ในระดับควบคุม NAc และ 1.39% ใน amygdala หนู DD ที่ได้รับการช่วยเหลือ NAc มีระดับ DA ซึ่งเป็น 34.0% ของการควบคุมใน NAc; ทว่าระดับ DA ใน amygdala นั้นเหมือนกับระดับ DD ที่ไม่ถูกฉีด (1.57%) Amygdala ที่ได้รับการช่วยเหลือหนู DD มีระดับ DA ใน amygdala ที่เป็น 38.4% ของการควบคุม แต่ระดับ DA ใน NAc นั้นเหมือนกับระดับ DD ที่ไม่ได้รับการช่วยเหลือ (0.46%) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการช่วยเหลือโดยใช้ไวรัสของ TH นำไปสู่ระดับ DA ที่สูงขึ้นในภูมิภาคเป้าหมายที่ถูกฉีดของหนู DD
นอกจากนี้การฉีดไวรัสเข้าสู่ NAc หรือ amygdala ไม่ได้นำไปสู่การเพิ่มระดับ DA ในเป้าหมายอื่น ในที่สุดเนื่องจาก TH ถูกแสดงออกในเซลล์ประสาท noradrenergic ของหนู DD [24], [25] เราจึงแสดง TH จำนวนเล็กน้อยที่เห็นใน IHC ของ BLA ในหนู DD ไปยังซอน noradrenergic การปรากฏตัวของ norepinephrine ใน BLA ของหนู DD ที่ไม่ได้รับการช่วยเหลือได้รับการยืนยันด้วย HPLC (ตาราง 1)
1 ตาราง
ปริมาณ HPLC ของ DA, NE และ DA metabolites
โดปามีนเป็นสิ่งจำเป็นใน NAc และ BLA สำหรับหน่วยความจำระยะยาว
อาการตกใจที่อาจเกิดจากความกลัวเป็นรูปแบบหนึ่งของการปรับสภาพแบบพาฟโลเวียน ซึ่งการกระตุ้นแบบมีเงื่อนไขกระตุ้นการตอบสนองที่ทำให้ตกใจโดยเสียงเพิ่มขึ้น [15] เพื่อให้แน่ใจว่าการคืนค่า DA แบบเลือกเฉพาะเฉพาะกับ NAc หรือเฉพาะกับ NAc และ BLA จะไม่ทำให้การตอบสนองของเสียงสะท้านบกพร่องในตัวเอง เส้นโค้งการตอบสนองการตกใจจึงถูกสร้างขึ้นสำหรับการควบคุมและหนู DD ที่ได้รับการช่วยชีวิต (รูปที่ 2A) การวิเคราะห์ความแปรปรวนของการวัดซ้ำแบบสองทาง (RM ANOVA) เผยให้เห็นผลกระทบที่มีนัยสำคัญของความเข้มของเสียง (F (4,172) = 37.1, p <0.01) แต่ไม่มีกลุ่มตามปฏิกิริยาการรักษา การรบกวนของฟังก์ชัน DA ยังทำให้เกิดความแตกต่างในการตรวจจับเซ็นเซอร์ที่อาจทำให้ FPS [15], [26] บกพร่องได้ ในการวิเคราะห์การตรวจจับด้วยเซ็นเซอร์หนูเมาส์ทั้งหมดได้รับการทดสอบที่หลายระดับในกระบวนทัศน์การยับยั้งพรีพัลส์ (PPI) (รูปที่ 2B) มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญของความเข้มข้นของพรีพัลส์ (RM ANOVA F(2,86) = 57.79, p<0.01) แต่ไม่มีกลุ่มตามปฏิกิริยาระหว่างการรักษา ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการช่วยชีวิตแบบเลือกได้ของการส่งสัญญาณ DA ไปยัง NAC หรือ NAc และ BLA ที่เกิดจากการทดลองของเราไม่ได้เปลี่ยนการตอบสนองของเสียงตกใจหรือการตรวจจับด้วยเซ็นเซอร์ภาพที่ 2 การฟื้นฟู DA สำหรับทั้ง NAc และ BLA ก็เพียงพอแล้วสำหรับ LTM สำหรับ FPS หนูเมาส์อยู่ภายใต้กระบวนทัศน์การปรับสภาพความกลัว (รูปที่ 2C) ระหว่างการฝึก หนูทดลอง 30 ครั้ง โดยจับคู่ light cue 10 วินาทีกับ footshock เล็กน้อย (0.5 วินาที, 0.2 mA) หน่วยความจำระยะสั้น (STM) ได้รับการทดสอบ 10 นาทีหลังการฝึกและ LTM ได้รับการทดสอบ 24 ชั่วโมงต่อมา ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มก่อนการปรับสภาพ หลังจากการฝึกอบรม STM ได้รับการฟื้นฟูอย่างสมบูรณ์ในหนู DD พร้อมการคืนค่า NAc และ BLA STM ในหนูเมาส์ DD ที่ฉีดด้วย NAc บกพร่อง แต่ผลกระทบนี้ล้มเหลวในการเข้าถึงความสำคัญ อย่างไรก็ตาม พวกมันมี LTM น้อยกว่าหนูควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05; Bonferroni posttest) LTM ได้รับการฟื้นฟูอย่างสมบูรณ์เพื่อควบคุมระดับในหนูเมาส์ DD ที่ฉีดทั้งสองข้างเข้าไปใน NAc และ BLA ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มในปฏิกิริยาเชิงพฤติกรรมต่อการกระแทกเท้า (รูปที่ 2D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า DA ใน NAc และ BLA นั้นเพียงพอที่จะอำนวยความสะดวกให้กับ LTM สำหรับ FPS
การสนทนา
DA คิดว่าจะช่วยให้เกิดการรวมตัวกันและการสร้าง LTM ในบริเวณสมองลิมบิคที่สำคัญเช่น amygdala, NAc และ hippocampus [27], [28], [29], [13] และการศึกษาก่อนหน้าได้แนะนำบทบาทของ DA ใน Pavlovian XNUMX] ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่า DA มีความสำคัญต่อเสถียรภาพของการติดตามหน่วยความจำในกระบวนทัศน์ FPS [12] นอกจากนี้การฟื้นฟูการทำงานของ DA ไปยังวงจร mesocorticolimbic ที่เกิดจาก VTA นั้นเพียงพอที่จะเรียกคืน STM และ LTM สำหรับ FPS แต่การกู้คืนไปยัง BLA เพียงอย่างเดียวเท่านั้นที่ได้รับการกู้คืน STM [12] อย่างไรก็ตามไซต์ของการดำเนินการ DA ที่จำเป็นสำหรับการสร้าง LTM ในการเรียนรู้ประเภทนี้ไม่เป็นที่รู้จัก ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการคืนค่าการสังเคราะห์ DA สำหรับ NAc และ BLA นั้นเพียงพอสำหรับ LTM สำหรับ FPS นอกจากนี้เรายังพบว่าการคืนค่าของเซลล์ประสาท TH ถึง DA ที่ฉายไปยัง NAc นั้นไม่มีประสิทธิภาพในการช่วยชีวิต STM ในขณะที่การฟื้นฟู BLA [12] หรือการกู้คืนทั้ง BLA และ NAc สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า NAc อาจมีความสำคัญต่อการสร้าง LTM มากกว่า STM
ข้อแม้หนึ่งที่อาจเป็นไปได้สำหรับวิธีการฟื้นฟูไวรัสก็คือเซลล์ประสาท DA สามารถส่งการคาดการณ์หลักประกันไปยังเป้าหมายมากกว่าหนึ่งเป้าหมาย ดังนั้นการฉีดไวรัสเข้าไปใน NAc สามารถคืนค่า TH และดังนั้น DA ไปยัง BLA ผลการศึกษาทางอิมมูโนวิทยาของเราชี้ให้เห็นว่าเซลล์ประสาท DA ที่ทำลายเซลล์ NAc นั้นเป็นประชากรที่แตกต่างจากกลุ่ม BLA เนื่องจากการฉีดไวรัสในบริเวณสมองส่วนหนึ่งช่วยเพิ่มการย้อมสี TH ในภูมิภาคนั้น ผล HPLC เสริมสร้างการโต้แย้งนี้เพราะระดับ DA จะเพิ่มขึ้นใน NAc ของหนู DD ที่ช่วยชีวิต NAc และไม่อยู่ใน amygdala การค้นพบนี้สอดคล้องกับการศึกษาจำนวนมากที่สำรวจความแตกต่างของเซลล์ประสาท DA ตามเป้าหมายการฉายภาพ [30], [31], [32], [33]
วงจรและกลไกพื้นฐานที่จำเป็นสำหรับ DA ทั้งใน NAc และ BLA สำหรับการควบคุมความกลัวของ Pavlovian ยังคงไม่ได้รับการแก้ไข BLA ส่งการคาดการณ์ไปที่ NAc [16], [34] และการซิงค์เหล่านี้อาจได้รับความสามารถในระยะยาวซึ่งสัมพันธ์กับการเรียนรู้และหน่วยความจำ [35] ยิ่งไปกว่านั้น DA อำนวยความสะดวก LTP ใน BLA และ NAc [18], [21] ดังนั้นในช่วงที่สภาวะความกลัวของ Pavlovian เป็นไปได้ว่า DA ใน BLA จะอำนวยความสะดวกให้กับกิจกรรมของเซลล์เสี้ยมแบบกลูตามาเทอจิก [19], [20], [36], รวมถึงเซลล์เหล่านั้นซึ่งนำไปสู่ NAc [34] LTP ของ BLA ถึง NAc ซิงก์ดังนั้นจึงส่งเสริมการสร้าง LTM การกำหนดเวลาที่แน่นอนของเหตุการณ์ที่ต้องพึ่งพา DA ใน BLA และ NAc สำหรับ FPS จะช่วยเพิ่มความเข้าใจในกระบวนการนี้
วัสดุและวิธีการ
แถลงการณ์ด้านจริยธรรม
หนูทุกตัวได้รับการปฏิบัติตามแนวทางที่กำหนดโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติและขั้นตอนการใช้หนูได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์แห่งมหาวิทยาลัยวอชิงตัน (2183-02)
สัตว์และการรักษา
หนู DD ถูกสร้างขึ้นตามที่อธิบายไว้ [22] สั้น ๆ DD (Thfs / fs; DbhTh / +) หนูพาอัลลีลไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (Th) ที่ไม่ทำงานสองตัวซึ่งสามารถเปิดใช้งานได้ตามเงื่อนไขโดย Cre recombinase หนู DD มี dopamine β-hydroxylase (Dbh) อัลลีลที่ไม่บุบสลายและ Dbh allele หนึ่งตัวที่มีการแทรกเป้าหมายของยีน Th เพื่อให้สามารถผลิต norepinephrine [24], [25] ได้ตามปกติ สัตว์ควบคุมจะมีอย่างน้อยหนึ่งอัลลีลที่ไม่บุบสลาย หนูตัวผู้และตัวเมียถูกทดสอบพฤติกรรมระหว่างอายุ 2 – 6 เดือน หนูทุกตัวอยู่ภายใต้วงจร 12 12 (แสง: มืด) ในสภาพแวดล้อมที่ควบคุมอุณหภูมิด้วยอาหาร (5LJ5; PMI Feeds, St. Louis, MO) และน้ำที่มีให้ดื่ม การทดลองพฤติกรรมทั้งหมดได้ดำเนินการในระหว่างรอบแสง เนื่องจาก DD ของหนูนั้นมีอาการ hypophagic อย่างรุนแรงพวกมันจึงถูกฉีดทุกวัน (ทางเยื่อบุช่องท้อง) ด้วย 3, 4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-Dopa) ที่ 50 mg / kg ที่ปริมาณ 33 µl / g 10 [25] หลังฉีดไวรัสหนู DD ได้รับการรักษาด้วยการฉีด L-Dopa ทุกวันจนกว่าพวกเขาจะสามารถกินได้อย่างเพียงพอโดยไม่ต้องรักษา L-Dopa เพิ่มเติม
การฉีดไวรัส
Isoflurane (1.5 – 5%) - หนูวางยาสลบได้ถูกวางลงในอุปกรณ์สเตอริโอ (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) สำหรับการฟื้นฟูการทำงานของยีน Th ในนิวเคลียส accumbens เพียงอย่างเดียว recombinant CAV2-Cre ไวรัส (titered ที่ 2.1 × 1012 อนุภาค / มล.) ถูกฉีดทั้งสองข้าง 1.7 µl / ซีกโลก) เป็น DD และเมาส์ควบคุม สำหรับการคืนค่า DA ไปเป็น NAc และ BLA สองเท่าไวรัส CAV0.75-Cre ถูกฉีดเข้าสู่ NAc ทั้งสองข้างต้นและ BLA (พิกัดหน่วยเป็นมิลลิเมตร: 4.75 ด้านหลังถึง Bregma, 0.5 ventral สู่ Bregma; 2 µl / ซีกโลก) ใน DD และเมาส์ควบคุม คำอธิบายโดยละเอียดของเวกเตอร์ไวรัสนี้ได้รับการเผยแพร่ [1.5] ไวรัสถูกฉีดในช่วงระยะเวลา 3.25 นาทีโดยใช้เข็มฉีดยา 5-gauge (Hamilton, Reno, NV) ที่ติดอยู่กับปั๊ม micro-infusion (WPI, Sarasota, FL) หนูควบคุมจาก NAc เพียงอย่างเดียวและกลุ่มกู้ภัยคู่ได้รับการรวบรวมเป็นกลุ่มเดียวและไม่แตกต่างกันในพารามิเตอร์พฤติกรรมใด ๆ
อุปกรณ์
ห้องควบคุมเสียงรบกวน (SR-Lab, เครื่องมือซานดิเอโก, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย) ถูกนำมาใช้เพื่อวัดการยับยั้ง prepulse, การตอบสนองที่น่าตกใจและความหวาดกลัวที่มีพลังอำนาจตามที่อธิบายไว้ [12] แอมพลิจูดพีคของการตอบสนองถูกใช้ในการคำนวณการยับยั้งแบบพรีพัลส์, การตอบสนองที่น่าตกใจ, ความหวาดกลัวที่มีศักยภาพและปฏิกิริยาตอบสนองที่น่าตกใจ ตรวจสอบระดับเสียงโดยใช้เครื่องอ่านระดับเสียง (RadioShack, Fort Worth, TX) หน่วยการสอบเทียบถูกนำมาใช้เพื่อให้แน่ใจว่าการอ่านการตอบสนองที่น่าตกใจ (San Diego Instruments, San Diego, CA) ไฟ 8-watt ถูกติดตั้งที่ผนังด้านหลังของกล่อง startle เพื่อใช้เป็นคิว
เส้นโค้งการตอบสนองที่น่าตกใจ
หลังจากช่วงเวลาแห่งความเคยชิน 5 นาทีสัตว์จะถูกนำเสนอด้วยชุดทดลอง 10 ที่มีระดับชีพจรเสียงที่เพิ่มขึ้น: จากค่า null ซึ่งไม่มีเสียงถึง 105 dB โดยมี ITI เป็น 30 วินาที พัลส์เสียงทั้งหมดคือ 40 msec
ยับยั้งการเต้นของชีพจรก่อน
วัดค่า PPI ตามที่อธิบายไว้ [12] โดยสังเขปหลังจากช่วงเวลาแห่งความเคยชินหนูได้นำเสนอด้วย 5, 40-msec, 120-dB, การทดลองแบบพัลส์คนเดียว หนูถูกนำเสนอด้วยการทดลอง 50 ของการทดลองชีพจรเดี่ยวอย่างใดอย่างหนึ่งหนึ่งในสามของการทดลองเตรียมความพร้อม (5, 10 และ 15-dB เหนือพื้นหลัง) หรือการทดลองที่ไม่มีอะคูสติกกระตุ้น คำนวณการยับยั้ง Prepulse สำหรับแต่ละระดับของ prepulse โดยใช้สูตรต่อไปนี้:% inhibition = [(การตอบสนองของ startlese โดยเฉลี่ยในการทดลอง prepulse / การตอบสนอง startle โดยเฉลี่ยในการทดลองแบบพัลส์คนเดียว) × 100]
ความกลัวที่มีพลังอำนาจ
หนูทั้งหมดได้รับการทดสอบโดยใช้กระบวนทัศน์ FPS 3 วันตามที่อธิบายไว้ [12] ในเวลาสั้น ๆ บนพื้นฐานหนูได้รับชุดทดลองแบบหลอกหลอกของชุดทดลอง 20 แยกอย่างสม่ำเสมอระหว่างคิวและเงื่อนไขที่ไม่มีคิว ในวันที่ 2 หนูได้รับการจับคู่ 30 (2 ขั้นต่ำหมายถึง ITI) ของแสงคิว 10-วินาทีด้วย 0.2-mA, 0.5-sec footshock หนูถูกนำไปไว้ในกรงที่บ้านของพวกเขาเป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะทดสอบหน่วยความจำระยะสั้น ในวันที่ 3 มีการประเมิน LTM สูตรต่อไปนี้ถูกใช้เพื่อคำนวณจุดเริ่มต้นที่น่ากลัว:% potentiation = [(ค่าเฉลี่ยของการตอบสนองต่อการทดลองคิว / ค่าเฉลี่ยของการตอบสนองในการทดลองแบบไม่คิว - 1) × 100]
immunohistochemistry
เนื้อเยื่อสมองของเมาส์ถูกเตรียมไว้สำหรับการวิเคราะห์เนื้อเยื่อโดยใช้เทคนิคมาตรฐานตามที่อธิบายไว้ [12] ส่วนโคโรนาลอยอิสระ (30 µm) ได้รับอิมมูโนเต็ดกับกระต่ายต่อต้าน -TH (1 2000, มิลลิพอร์) และแอนติบอดีต่อต้าน DAT (1 1000, มิลลิพอร์) แอนติบอดีรอง ได้แก่ Cy2- หรือ Cy3- ผัน (1 200, Jackson ImmunoResearch) ภาพถ่ายถูกถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ไบรท์ฟิลด์ตั้งตรง (Nikon)
โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง
หนูถูกกำจัดด้วย Beuthanasia (250 mg / kg) จากนั้นนำสมองออกและนำไปวางบนแผ่นหินอ่อนน้ำแข็งเย็น การใช้เมทริกซ์สมองของเมาส์ (Activational Systems, Warrren, MI), ชิ้นหนา 1-mm ถูกถ่ายผ่าน NAc หรือ amygdala จากนั้นนำหมัดทิชชู่ (เส้นผ่านศูนย์กลาง 1- มม.) ใส่ลงในหลอดหมุนเหวี่ยง 1.7 mL และแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกว่าพวกเขาจะถูกส่งไปยังน้ำแข็งแห้งไปยังห้องปฏิบัติการหลักทางด้านประสาทวิทยา (ศูนย์วิจัยมหาวิทยาลัย Venderbilt สำหรับการวิจัยเกี่ยวกับโมเลกุลประสาทวิทยา)
การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (La Jolla, California)
กิตติกรรมประกาศ
เราขอขอบคุณ Larry Zweifel สำหรับความคิดเห็นที่เป็นประโยชน์เกี่ยวกับต้นฉบับเกล็นดา Froelick และ Albert Quintana สำหรับความช่วยเหลือด้านจุลวิทยาและ Valerie Wall สำหรับการบำรุงรักษาอาณานิคมของเมาส์ เราขอขอบคุณดร. มิเกลชิลลอน (หน่วยผลิตเวกเตอร์ของ CBATEG ที่ Universitat Autonoma แห่งบาร์เซโลนา) สำหรับ CAV2
เชิงอรรถ
ความสนใจในการแข่งขัน: ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีความสนใจในการแข่งขัน
เงินทุน: การตรวจสอบนี้ได้รับการสนับสนุนบางส่วนโดย Howard Hughes Medical Institute, Public Health Service, National Research Service Award, T32 GM07270 จาก National Institute of General Medical Sciences และ NIH National Institutes of General Medical Sciences 'Grant 4 R25 GM 058501- 05. ผู้ให้ทุนไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษาการรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูลการตัดสินใจเผยแพร่หรือจัดทำต้นฉบับ
อ้างอิง
1 Bjorklund A, Dunnett SB ระบบประสาทของ Dopamine ในสมอง: การปรับปรุง เทรนด์ Neurosci 2007; 30: 194 202- [PubMed]
2 ฟิลด์ HL, Hjelmstad GO, Margolis EB, Nicola SM เซลล์ประสาทในพื้นที่หน้าท้องในการเรียนรู้พฤติกรรมการกินและการเสริมแรงเชิงบวก Annu Rev Neurosci 2007; 30: 289 316- [PubMed]
3 Maren S. Neuroiology ของปรับอากาศกลัว Pavlovian Annu Rev Neurosci 2001; 24: 897 931- [PubMed]
4 Brischoux F, Chakraborty S, Brierley DI, Ungless MA การกระตุ้นทางเซลล์ของโดปามีนในเซลล์ VTA ที่หน้าท้องโดยการกระตุ้นพิษ Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106: 4894 – 4899 [PMC บทความฟรี] [PubMed]
5 Guarraci FA, Kapp BS การศึกษาลักษณะทางอิเล็กโทรโซไซน์ของเซลล์ประสาทส่วนปลายของหน้าท้อง dopaminergic บริเวณหน้าท้องในช่วงการปรับสภาพความกลัวแบบพาเวียเวียนในกระต่ายตื่นตัว Behav Brain Res 1999; 99: 169 179- [PubMed]
6 Joshua M, Adler A, Mitelman R, Vaadia E, Bergman H. Midbrain dopaminergic neurons และเซลล์ cholinergic striatal ที่โดดเด่นเข้ารหัสความแตกต่างระหว่างรางวัลและเหตุการณ์ aversive ในยุคที่แตกต่างกันของการทดลองปรับอากาศแบบน่าจะเป็นแบบดั้งเดิม J Neurosci 2008; 28: 11673 11684- [PubMed]
7 Abercrombie ED, Keefe KA, DiFrischia DS, Zigmond MJ ผลที่แตกต่างของความเครียดต่อการปลดปล่อยโดปามีนในร่างกายใน striatum นิวเคลียส accumbens และเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าตรงกลาง J Neurochem 1989; 52: 1655 1658- [PubMed]
8 Inglis FM, Moghaddam B. การเคลือบด้วยโดปามิคกี้ของ amygdala นั้นตอบสนองต่อความเครียดได้ดี J Neurochem 1999; 72: 1088 1094- [PubMed]
9 Kalivas PW, Duffy P. การกระตุ้นด้วยการเลือกการส่งโดปามีนในเปลือกของนิวเคลียสจะเกิดความเครียด ความต้านทานของสมอง 1995; 675: 325 328- [PubMed]
10 Pezze MA, Heidbreder CA, Feldon J, Murphy CA การตอบสนองแบบเลือกของนิวเคลียส accumbens core และ shell dopamine เพื่อการกระตุ้นตามบริบทอย่างกว้างขวางและไม่ต่อเนื่อง ประสาท 2001; 108: 91 102- [PubMed]
11 de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML Dopamine D2 กลไกการรับในการแสดงออกของความกลัวปรับอากาศ Pharmacol Biochem Behav 2006; 84: 102 111- [PubMed]
12 Fadok JP, Dickerson TM, Palmiter RD โดปามีนเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการกำหนดเงื่อนไขความกลัว J Neurosci 2009; 29: 11089 11097- [PMC บทความฟรี] [PubMed]
13 Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic สูตรโดปามีนในเส้นทางแห่งความหวาดกลัว Prog Neurobiol 2004; 74: 301 320- [PubMed]
14 Ponnusamy R, Nissim HA, Barad M. การปิดกั้นอย่างเป็นระบบของตัวรับโดปามีนคล้าย D2 ช่วยอำนวยความสะดวกในการสูญเสียความกลัวที่มีเงื่อนไขในหนู เรียนรู้ Mem 2005; 12: 399 406- [PMC บทความฟรี] [PubMed]
15 Koch M. ชีววิทยาของการตกใจ Prog Neurobiol 1999; 59: 107 128- [PubMed]
16 Sesack SR, Grace AA เครือข่ายของรางวัล Cortico-Basal Ganglia: microcircuitry Neuropsychopharmacology 2010; 35: 27 47- [PMC บทความฟรี] [PubMed]
17 McGaugh JL อะมิกดาลาปรับเปลี่ยนการรวมความทรงจำของประสบการณ์การปลุกอารมณ์ Annu Rev Neurosci 2004; 27: 1 28- [PubMed]
18 Bissiere S, Humeau Y, Luthi A. โดปามีนประตู LTP เหนี่ยวนำใน amygdala ด้านข้างโดยการยับยั้งการยับยั้ง feedforward Nat Neurosci 2003; 6: 587 592- [PubMed]
19 Kroner S, Rosenkranz JA, Grace AA, Barrionuevo G. Dopamine ปรับความตื่นเต้นง่ายของเซลล์ประสาท amygdala basolateral ในหลอดทดลอง J Neurophysiol 2005; 93: 1598 1610- [PubMed]
20 Marowsky A, Yanagawa Y, Obata K, Vogt KE subclass พิเศษของ interneurons ไกล่เกลี่ย dopaminergic การอำนวยความสะดวกของฟังก์ชั่น amygdala เซลล์ประสาท 2005; 48: 1025 1037- [PubMed]
21 Wolf ME, Sun X, Mangiavacchi S, Chao SZ แรงกระตุ้นจิตและจิตประสาทพลาสติก Neuropharmacology 2004; 47 (Suppl 1): 61 – 79 [PubMed]
22 Hnasko TS, Perez FA, Scouras AD, Stoll EA, Gale SD, และคณะ สร้างการคืนค่าโดปามีนที่พึ่งพึ่ง recombinase ของ nigrostriatal ในหนูที่ได้รับโดปามีนซึ่งมีอาการขาดเลือดกลับมีภาวะ hypophagia และ bradykinesia Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 8858 – 8863 [PMC บทความฟรี] [PubMed]
23 Soudais C, Laplace-Builhe C, Kissa K, Kremer EJ การถ่ายโอนเซลล์ประสาทพิเศษจากเวกเตอร์ adenovirus สุนัขและการขนส่งถอยหลังเข้าคลองที่มีประสิทธิภาพในร่างกาย FASEB J. 2001; 15: 2283 – 2285 [PubMed]
24 Szczypka MS, Rainey MA, Kim DS, Alaynick WA, Marck BT, et al. พฤติกรรมการให้อาหารในหนูที่ขาดโดพามีน Proc Natl Acad Sci US A. 1999; 96: 12138 – 12143 [PMC บทความฟรี] [PubMed]
25 Zhou QY, Palmiter RD หนูที่ขาดโดพามีนนั้นไวต่อการแพ้อย่างรุนแรง adipsic และ aphagic เซลล์ 1995; 83: 1197 1209- [PubMed]
26 Swerdlow NR, Braff DL, Geyer MA แบบจำลองสัตว์ที่มีช่องว่างเซ็นเซอร์เซ็นมอเตอร์: สิ่งที่เรารู้สิ่งที่เราคิดว่าเรารู้และสิ่งที่เราหวังว่าจะรู้ในไม่ช้า Behav Pharmacol 2000; 11: 185 204- [PubMed]
27 LaLumiere RT, Nawar EM, McGaugh JL การปรับการรวมหน่วยความจำโดยเปลือก amygdala หรือนิวเคลียส accumbens เปลือกต้องเปิดใช้งานพร้อมกันรับโดพามีนในพื้นที่สมองทั้งสอง เรียนรู้ Mem 2005; 12: 296 301- [PMC บทความฟรี] [PubMed]
28 Manago F, Castellano C, Oliverio A, Mele A, De Leonibus E. บทบาทของตัวรับโดปามีน, D1-like และ D2-like, ภายในนิวเคลียส accumbens subregions, แกนกลางและเปลือกบนการรวมหน่วยความจำในการหลีกเลี่ยงการพิจารณาคดีหนึ่งครั้ง งาน. เรียนรู้ Mem 2009; 16: 46 52- [PubMed]
29 Rossato JI, Bevilaqua LR, Izquierdo I, Medina JH, Cammarota M. Dopamine ควบคุมการเก็บรักษาความจำระยะยาว วิทยาศาสตร์. 2009; 325: 1017 1020- [PubMed]
30 Lammel S, Hetzel A, Hackel O, Jones I, Liss B, et al. คุณสมบัติที่เป็นเอกลักษณ์ของเซลล์ประสาท mesoprefrontal ภายในระบบโดปามีน mesocorticolimbic คู่ เซลล์ประสาท 2008; 57: 760 773- [PubMed]
31 ฟอร์ด CP, Mark GP, Williams JT คุณสมบัติและการยับยั้ง opioid ของเซลล์ประสาทโดปามีน mesolimbic แตกต่างกันไปตามสถานที่เป้าหมาย J Neurosci 2006; 26: 2788 2797- [PubMed]
32 Margolis EB, ล็อค H, Chefer VI, Shippenberg TS, Hjelmstad GO, และคณะ Kappa opioids คัดเลือกควบคุมเซลล์ประสาทโดปามีนที่ฉายไปที่เยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 2938 – 2942 [PMC บทความฟรี] [PubMed]
33 Margolis EB, Mitchell JM, Ishikawa J, Hjelmstad GO, ทุ่ง HL เซลล์ประสาทโดปามีนในสมองส่วนกลาง: เป้าหมายการฉายกำหนดระยะเวลาการกระทำและการยับยั้งตัวรับโดปามีน D (2) J Neurosci 2008; 28: 8908 8913- [PubMed]
34 McGaugh JL, McIntyre CK, Power AE การปรับ Amygdala ของการรวมหน่วยความจำ: การมีปฏิสัมพันธ์กับระบบสมองอื่น ๆ Neurobiol Learn Mem 2002; 78: 539 552- [PubMed]
35 Popescu AT, Saghyan AA, Pare D. NMDA การอำนวยความสะดวกที่ขึ้นอยู่กับความเป็นพลาสติกของ corticostriatal โดย amygdala Proc Natl Acad Sci US A. 2007; 104: 341 – 346 [PMC บทความฟรี] [PubMed]
36 Rosenkranz JA, Grace AA การปรับโดปามีนที่สื่อถึงศักยภาพของอะมิกดาล่าที่มีกลิ่นปรากฏขึ้นในระหว่างการปรับสภาพพาฟโลเวียน ธรรมชาติ. 2002; 417: 282 287- [PubMed]
;