PLoS One 2014 ก.ค. 29; 9 (7): e102524 doi: 10.1371 / journal.pone.0102524 eCollection 2014
นามธรรม
การสัมผัสโคเคนเรื้อรังทั้งในผู้ติดยาเสพติดและในรูปแบบของการติดยาเสพติดหนูช่วยลดกิจกรรมเยื่อหุ้มสมอง prefrontal ซึ่งต่อมา dysregulates การประมวลผลรางวัลและฟังก์ชั่นการบริหารที่สูงขึ้น ผลกระทบสุทธิของการทำ gating ที่บกพร่องของพฤติกรรมนี้เพิ่มความเสี่ยงต่อการกำเริบของโรค ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของโคเคนที่เกิดขึ้นในการแสดงออกของเซลล์ประสาทปัจจัยสมอง (BDNF) ในเยื่อหุ้มสมอง prefrontal cortex (PFC) เป็นกลไก neuroadaptive ที่ blunts เสริมประสิทธิภาพของโคเคน เนื่องจาก BDNF เป็นที่ทราบกันว่ามีผลต่อการอยู่รอดของเส้นประสาทและพลาสติกซินแนปติกเราทดสอบสมมติฐานว่าการเลิกโคเคนด้วยตนเองจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทและความหนาแน่นของ synaptic ใน PFC การใช้เทคนิคใหม่การตรวจเอกซเรย์เรย์อาเรย์และการย้อมสี Golgi การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาในหนู PFC ได้รับการวิเคราะห์หลังจาก 14 วันของการจัดการโคเคนด้วยตนเองและวัน 7 ที่ถูกบังคับให้เลิกบุหรี่ ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการแตกแขนงโดยรวมของ dendritic และความหนาแน่น synaptic รวมจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนู PFC ในทางตรงกันข้ามความหนาแน่นของเงี่ยง dendritic บางเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในชั้น V เสี้ยมเซลล์ประสาทของ PFC การค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างแบบไดนามิกเกิดขึ้นในระหว่างการเลิกโคเคนซึ่งอาจนำไปสู่กิจกรรมที่ไม่ได้รับการสังเกตของ PFC ในบุคคลที่ติดโคเคน
บทนำ
การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างความเป็นพลาสติกภายในวงจรรางวัลถูกเสนอให้เป็นกลไกสำคัญที่เอื้อให้โคเคนสามารถรักษาพฤติกรรมการแสวงหายาได้อย่างมีประสิทธิภาพ (ทบทวนใน [1]) การศึกษาก่อนหน้าแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของ dendritic arborization และความหนาแน่นของกระดูกสันหลังในนิวเคลียส accumbens (NAc) [2]-[4]พื้นที่หน้าท้อง [5]และเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า (PFC) [6] หลังจากได้รับโคเคน ในขณะที่การศึกษาส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมที่ผิดปกติของ NAc แต่มีการศึกษาน้อยกว่ามากที่ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงใน PFC มีหลักฐานหลายบรรทัดที่แสดงให้เห็นถึงความผิดปกติของสาร PFC จากการสัมผัสโคเคนเรื้อรังในผู้ติดสารทั้งสองคน [7], [8] และในรูปแบบของการติดยาเสพติดหนู [9], [10]. ดังนั้นการจำแนกลักษณะการเปลี่ยนแปลงเชิงโครงสร้างที่เกิดขึ้นใน PFC จึงเกี่ยวข้องกับการทำความเข้าใจเหตุการณ์โมเลกุลที่เป็นสาเหตุของการติดยาเสพติด
PFC ควบคุมการควบคุมแรงกระตุ้นและการตัดสินใจดังนั้นจึงมีบทบาทสำคัญในความสามารถของแต่ละบุคคลในการควบคุมพฤติกรรมโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการพึ่งพายา [8], [11]. ตัวอย่างเช่นในบุคคลที่ติดโคเคนการเปิดใช้งานเยื่อหุ้มสมอง prefrontal ลดลงเกี่ยวข้องกับการถอนยาเสพติดและกระจัดกระจายตอบสนองผู้บริหารระดับสูง [7], [8]ซึ่งสามารถเพิ่มความเสี่ยงต่อการกำเริบของโรค ในหนูกิจกรรมของเซลล์ประสาทที่เพิ่มขึ้นใน PFC เกี่ยวข้องกับปริมาณโคเคน [9], [10]พฤติกรรมการแสวงหาสิ่งเสพติด [12]และการคืนสถานะโคเคนหลังจากการถอน [13]-[15]. นอกจากนี้ Bistability พังผืดถูกยกเลิกใน PFC ตามการบริหารโคเคนเรื้อรัง [16]. ในที่สุดกิจกรรมเมแทบอลิซึมที่เกิดจากยาใน PFC จะถูกทื่อในหนูที่ฉีดยาท้าทายระหว่างถอนตัวจากการบริหารโคเคนด้วยตนเอง [9], [17]. การศึกษาเหล่านี้บ่งชี้ว่าโคเคนเรื้อรังก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการทำงานอย่างลึกซึ้งใน PFC ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนของการยับยั้งประสาทและ / หรือการลดลงของการกระตุ้นประสาทใน PFC อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่เกิดขึ้นใน PFC หลังจากการใช้ยาเรื้อรังยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างชัดเจน
ในการศึกษาปัจจุบันเราพยายามที่จะตรวจสอบว่าการเลิกบุหรี่จากโคเคนนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างใน PFC หรือไม่ การตรวจสอบการดัดแปลงทางสัณฐานวิทยาโดยใช้วิธีการดั้งเดิมการย้อมสี Golgi เช่นเดียวกับเทคนิคใหม่ อาเรย์เอกซ์เรย์เป็นวิธีการที่ไม่เหมือนใครซึ่งรวมการแยกส่วนเนื้อเยื่อบางเฉียบกับอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์และการสร้างภาพสามมิติขึ้นใหม่เพื่อให้สามารถตรวจวัดปริมาณความหนาแน่นของซินแนปส์ได้ทั้งหมด [18], [19]. จากการใช้วิธีการเหล่านี้ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่ามีความเป็นพลาสติกอย่างมากในหนู PFC เพื่อตอบสนองต่อการงดโคเคน
วัสดุและวิธีการ
สัตว์และที่อยู่อาศัย
หนูสปราก - ดอว์ลีย์ตัวผู้ (Rattus norvegicus) ที่มีน้ำหนัก 250–300 กรัมได้มาจาก Taconic Laboratories (Germantown, NY) สัตว์ต่างๆได้รับอาหารและน้ำที่มีอยู่ในกรงที่บ้าน โปรโตคอลการทดลองทั้งหมดสอดคล้องกับแนวทางที่ออกโดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกาและได้รับการอนุมัติจาก Perelman School of Medicine ที่มหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนียและคณะกรรมการดูแลและใช้สัตว์ในสถาบันของมหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย
ศัลยกรรม
ก่อนการผ่าตัดหนูจะได้รับยาสลบด้วยคีตามีน 80 mg / kg และไซลินซีน 12 mg / kg (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) สายสวนแบบ Silastic ที่ไม่น่าเชื่อ (เส้นผ่านศูนย์กลางด้านใน 0.33 mm, เส้นผ่านศูนย์กลางภายนอก 0.64 mm) ถูกแทรกลงในเส้นเลือดคอด้านขวาและเย็บให้เข้าที่ จากนั้นสายสวนนั้นถูกส่งผ่านใต้ใบมีดใต้ผิวหนังและส่งไปยังแท่นตาข่ายแบบตาข่าย (CamCath, Cambridge, UK) ที่ถูกเย็บใต้ผิวหนังด้านบนเหนือกระดูกสะบัก หลอดสวนถูกชะล้างทุกวันด้วย 0.3 ml ของยาปฏิชีวนะ Timentin (ticarcillin disodium / โปแตสเซียม clavulanate, 0.93 mg / ml; Henry Schein, Melville, NY) ละลายใน heparinized saline (10 U / ml) สายสวนถูกปิดผนึกด้วยพลาสติก obturators เมื่อไม่ใช้งาน
โคเคนการดูแลตนเอง
หนูได้รับอนุญาตให้ 7 วันฟื้นตัวจากการผ่าตัดก่อนที่จะเริ่มทำการบริหารตนเองด้วยโคเคน หนูได้รับการสุ่มให้เป็นหนึ่งในสองกลุ่ม: สัตว์ที่บริหารด้วยตนเองโคเคนและการควบคุมน้ำเกลือเทียม หนูแต่ละคนได้รับการฝึกฝนให้ตอบสนองต่อการฉีดโคเคนที่เกิดขึ้นโดยบังเอิญนั้นถูกจับคู่กับอาสาสมัครที่ได้รับหมายเลขเดียวกันและรูปแบบเวลาของการให้เงินทุนเดียวกันกับหนูที่ได้รับโคเคนจากการทดลองด้วยตนเอง การกดคันโยกสำหรับหนูที่มีน้ำเกลือนั้นไม่มีผลตามกำหนดการ
ในขั้นต้นหนูทดลองโคเคนถูกวางไว้ในห้องผ่าตัดแบบแยกส่วน (Med Associates, St. Albans, VT) และได้รับอนุญาตให้กดคันโยกสำหรับการฉีดโคเคนทางหลอดเลือดดำ (0.25 mg โคเคน / 59 µl น้ำเกลือแช่ 5 s) อัตราส่วนกำหนดการ 1 (FR1) ของการเสริมแรง เมื่อหนูทดลองโคเคนได้รับยาโคเคนอย่างน้อย 20 ในช่วงผ่าตัดเดียวภายใต้ตาราง FR1 ความต้องการในการตอบสนองถูกเปลี่ยนเป็นตารางเวลาเสริมแรง FR5 สำหรับการตอบสนองต่อตารางอัตราส่วนคงที่จำนวนสูงสุดของการฉีดโคเคนถูก จำกัด ไว้ที่ 30 ต่อเซสชันการดูแลตนเองทุกวันและระยะเวลาการหมดเวลาของ 20 ตามด้วยการฉีดโคเคนในแต่ละครั้ง . มีการดำเนินการเซสชัน 2 ชั่วโมงทุกวัน (7 วัน / สัปดาห์) โดยรวมเป็นวันที่ 14 คำตอบของคันโยกที่ไม่ได้ใช้งานซึ่งไม่มีการกำหนดเวลาไว้จะถูกบันทึกระหว่างการฝึกซ้อมทั้ง FR1 และ FR5
หลังจาก 14th เซสชั่นการผ่าตัดรายวัน, หนูทดลองโคเคนและการควบคุมน้ำเค็มแบบแอกถูกส่งกลับไปยังกรงที่บ้านของพวกเขาซึ่งพวกเขาได้รับ 7 วันจากการเลิกยาเสพติดที่ถูกบังคับ บน 7th วันของการงดโคเคน, สมองถูกลบออกและ PFC ถูกชำแหละบนน้ำแข็ง เจ็ดวันของการงดโคเคนถูกเลือกเพื่อเปรียบเทียบโดยตรงกับการศึกษาที่ตีพิมพ์ก่อนหน้าของเราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากโคเคนในการแสดงออก PFC BDNF [20].
ปะ
หนูถูกดมยาสลบ (100 mg / kg, ip sodium pentobarbital) และ perfused กับ 4% paraformaldehyde ในน้ำแข็งเย็น 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA) ซีกโลกหนึ่งอันจากสมองแต่ละอันถูกใช้เพื่อการย้อมสี golgi และอีกซีกโลกหนึ่งสำหรับเอกซเรย์เรย์ ซีกอาเรย์ถูกโพสต์คงที่ใน 4% PFA กับซูโครส 2.5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและ Golgi ซีกโลกถูกโพสต์คงที่สำหรับ 48 h ใน 4% PFA
การตรวจเอกซ์เรย์
การทดลองเอกซ์เรย์ของอาเรย์ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [19], [21]. สังเขปเนื้อเยื่อ PFA ถูกฝังอยู่ในส่วนเรซิ่นและโคโรนา (70 นาโนเมตร) ที่ระดับของ mPFC ถูกตัดและเก็บเป็นริบบิ้น ริบบิ้นถูกไฮเดรตใน 50 mM glycine ใน Tris และบล็อกในสารละลายปิดกั้น (0.05% Tween / 0.1% bovine เซรั่มอัลบูมินในบัฟเฟอร์ Tris (50 mM Tris / 150 mM NaCl, pH 7.6) Chemicon), PSD65 (การส่งสัญญาณเซลล์) หรือ synaptophysin (Abcam) ในการปิดกั้นการแก้ปัญหาค้างคืนที่ 95 ° C ริบบิ้นถูกชะล้างด้วย Tris buffer และย้อมด้วยแอนติบอดีรองที่ 4![[อัตราส่วน]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 ในโซลูชันการปิดกั้น (แพะต่อต้านเมาส์ Alexa-flour 488 และแพะต่อต้านกระต่าย cy3 หรือลาต่อต้านกระต่าย cy5) ริบบิ้นถูกย้อมสีด้วย DAPI เพื่ออำนวยความสะดวกในการค้นหาไซต์เดียวกันในทุกส่วน เก็บภาพสแกนแบบเรียงต่อกันโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence Zeiss AxioImager Z2 อิมเมจจากไซต์เดียวกันในแต่ละส่วนของ 20 – 30 ต่อริบบิ้นได้มาที่ 63x ด้วยโปรแกรมอัตโนมัติที่เชี่ยวชาญสำหรับการตรวจเอกซเรย์เรย์
การวิเคราะห์ภาพรังสีของอาเรย์
อิมเมจอนุกรมจากริบบิ้นแต่ละอันถูกเปิดตามลำดับแปลงเป็นสแต็กและจัดแนวกับปลั๊กอิน MultiStackReg และ StackReg (ความอนุเคราะห์จาก B. Busse ที่ Stanford University และ [21], [22]. กล่องครอบตัด (19.5 µmx19.5 µm) ถูกใช้เพื่อเลือกภูมิภาคที่น่าสนใจ (ROI) ในนิวโทรปิลเพื่อการหาปริมาณ การเลือกต้องแยกเซลล์ร่างกายของเซลล์ประสาทหรือคุณสมบัติการบดบังอื่น ๆ สำหรับการวิเคราะห์ภาพอัตโนมัติ, พืชผลที่น่าสนใจ (หรือ ROIs) สำหรับ synaptophysin, กรดกลูตามิก decarboxylase-65 (GAD65) และ PSD95 ถูกกำหนดระดับอัตโนมัติตามลำดับด้วยอัลกอริธึมอัตโนมัติใน ImageJ พืชถูกให้รหัสและการวิเคราะห์ถูกทำให้ตาบอดในสภาพ โปรแกรมตรวจจับตามเกณฑ์อัตโนมัติเพื่อคำนวณจำนวนของ puncta ที่ระบุว่าเป็น synapses เชิงบวกที่ใช้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23]. ความหนาแน่นของเทอร์มินัลแบบ presynaptic, เทอร์มินัลโพซินแนปทิคแบบ excitatory และเปอร์เซ็นต์ของ synapses ของ GAD-positive (ยับยั้ง) ถูกคำนวณจากค่าเฉลี่ยของไซต์ตัวอย่าง 75 ต่อสัตว์ที่เก็บจากเนื้อเยื่อบล็อกสองแห่งจาก PFC (n
=โคเคน 5 ที่ได้รับการรักษา 5 สัตว์ที่ได้รับการบำบัดด้วยเกลือ) สำหรับ 29,154 postsynaptic puncta และ 53,565 presynaptic puncta จากไซต์การสุ่มตัวอย่าง 818 จากไซต์การสุ่มตัวอย่าง 5 ทั่วสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย 29,662 และ 17,034 presynaptic puncta ค่ามัธยฐานสำหรับค่าความหนาแน่นของไซแนปส์และร้อยละของการยับยั้งไซแนปส์ต่อสัตว์ถูกคำนวณและทดสอบ t-run โดยใช้สื่อสัตว์เพื่อทดสอบว่ามีความแตกต่างระหว่างค่าเฉลี่ยของกลุ่มหรือไม่
วิธี Rapid-Golgi
การย้อมสี Golgi ส่วนเดียวดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [24], [25]. สรุป mPFC จากซีกโลกหนึ่งของสัตว์แต่ละตัวถูกตัดเป็นส่วน 100 µm โคโรนาและโพสต์คงที่ใน 1% osmium tetraoxide ตามด้วยการล้างสามครั้งใน 0.1 M PB, pH 7.4 ส่วนถูกบ่มในโพแทสเซียม dichromate 3.5% ค้างคืนล้างในเวลาสั้น ๆ และแทรกซึมด้วยเงินไนเตรต 1.5% โดยวิธีการแซนวิช [25]. ส่วนถูกติดตั้งบนสไลด์เคลือบเจลาตินด้วยซูโครส 20% และถูกทำให้แห้งผ่านชุดความเข้มข้นของแอลกอฮอล์ตามด้วยการขจัดไขมันในไซลีนและแผ่นปิดฝา
การวิเคราะห์ Golgi
สไลด์ Golgi ถูกเขียนและวิเคราะห์สภาพตาบอดและวิเคราะห์โดยผู้ทดลองคนเดียวกัน ภาพเส้นประสาทและการลากเส้นและภาพตัวแทนของกระดูกสันหลัง dendritic ถูกเก็บรวบรวมโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ BX51 Olympus ที่ตั้งตรงด้วยเวทีมอเตอร์รวม (ก่อนวิทยาศาสตร์, ร็อกแลนด์, แมสซาชูเซต) ด้วยวัตถุประสงค์ 20 × 0.7 NA สำหรับการวิเคราะห์กิ่งเดนนิก, เซลล์ประสาท 7 ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ต่อสัตว์ เราวัดความยาวและความซับซ้อนของเซลล์ประสาทโดยใช้แมโคร NeuronJ และการวิเคราะห์ Sholl ขั้นสูงตามลำดับ จำนวนจุดตัด (จุดสาขา) ภายในวงกลมศูนย์กลางที่รัศมีระหว่าง 5 – 250 µm (รวมถึงฐาน dendrites พื้นฐานและปลาย) ถูกวัดและเปรียบเทียบระหว่างกลุ่ม สำหรับการวิเคราะห์ความหนาแน่นของกระดูกสันหลังกลุ่ม 4 – 5 ที่มีความยาวอย่างน้อย 20 µm จากการแช่แข็งฐานรองอันดับที่สามได้รับการวิเคราะห์ต่อเซลล์ประสาทจากเซลล์ประสาท 5 – 7 ต่อสัตว์โดยใช้ Zeiss AxioImager Z2 epifluorescence ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของกระดูกสันหลังถูกจำแนกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26]. ความหนาแน่นของเส้นตรงเชิงกระดูกสันหลังสำหรับแต่ละส่วนของ dendritic และสัณฐานวิทยากระดูกสันหลัง (บาง, ม่อต้อ, เห็ด, รูปถ้วย) ของกระดูกสันหลังแต่ละถูกเปรียบเทียบระหว่างกลุ่ม ซอฟต์แวร์โอเพ่นซอร์สจากสถาบันสุขภาพแห่งชาติ (อิมเมจเจ) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล Golgi และอาเรย์เอกซ์เรย์
ผลสอบ
การงดโคเคนช่วยลดความหนาแน่นของไซแนปส์ทั้งหมด
การตรวจเอกซ์เรย์ของอาเรย์นั้นใช้เพื่อวัดการเปลี่ยนแปลงทั้งใน excitatory และ synapses เพื่อยับยั้งการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาเฉพาะที่เกิดขึ้นใน PFC เพื่อตอบสนองต่อการงดเว้นจากการบริหารตนเองด้วยโคเคน การตรวจเอกซ์เรย์ของอาเรย์เป็นวิธีการที่ให้ปริมาณงานที่แม่นยำของการยับยั้งรวมและ excitatory synapses ในโครงสร้างที่มีขนาดเล็กเกินไปที่จะระบุได้อย่างเหมาะสม [19]. ในฐานะที่เป็นทั้งยับยั้งและ excitatory synapses เป็นส่วนประกอบที่สำคัญของวงจรรางวัลยาเสพติด [13], [27], [28] เราใช้วิธีการใหม่นี้เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของสาร PFC ในระหว่างการงดเว้นจากโคเคน ส่วน PFC เจ็ดสิบนาโนเมตรจากซีกโลกหนึ่งสมองของ 5 yoked-saline และ 5 โคเคนที่มีประสบการณ์ของหนูโคเคนถูกย้อมด้วยแอนติบอดีต่อ PSD95 ซึ่งเป็นเครื่องหมาย excitatory postsynaptic, synaptophysin, presynaptic marker และ GAD65 ความหนาแน่นของไซแนปส์และหาเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งไซแนปส์ในเยื่อหุ้มสมองชั้น V (รูปที่ 1A และ 1B) ผลการวิจัยของเราระบุว่าในช่วงที่งดเว้นจากโคเคนมีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความหนาแน่นของรูป 1C) ซึ่งใช้วัดเทอร์มินัล presynaptic ทั้งหมด [t (7)=2, p <0.05] ไม่มีความหนาแน่นของไซแนปส์กระตุ้นลดลงอย่างมีนัยสำคัญ [t (8)=0.48, p=0.32] วัดจากการนับ PSD95 puncta (รูปที่ 1D) ที่น่าสนใจมีแนวโน้มที่ไม่สำคัญต่อการเพิ่มขึ้นของเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการบวก GAD65 ที่เป็นบวก [t (8)=−1.39, p=0.9] (รูปที่ 2E).
การงดโคเคนช่วยลดการแตกแขนงของเดนไดริทในขณะที่เพิ่มความหนาแน่นของกระดูกสันหลังใน PFC
วิธี Golgi ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในการแตกแขนของเส้นประสาทและความหนาแน่นของกระดูกสันหลัง dendritic เพื่อยืนยันการเปลี่ยนแปลง ultrastructural สังเกตในความหนาแน่นของ synapse (รูป 1) เราทำการชุบ Golgi อย่างรวดเร็วในส่วนเดียวบนชุดย่อยของเซลล์ประสาทใน PFC จากซีกโลกอื่นของสัตว์ชนิดเดียวกันที่ใช้สำหรับการศึกษาเอกซเรย์เรย์ ได้ทำการประเมินการแยก Dendritic การนับ Dendritic ของกระดูกสันหลังและสัณฐานวิทยาของกระดูกสันหลัง เซลล์ประสาทเสี้ยมที่เป็นตัวแทนสองชนิดจาก PFC ของการควบคุมแอกเทียมน้ำเกลือและหนูที่สัมผัสโคเคน รูปที่ 2A. พล็อต Sholl วัดจำนวนจุดตัด (จุดสาขา) ภายในวงกลมศูนย์กลางที่รัศมีระหว่าง 5 – 250 µm ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าหลังจากวันที่ 7 ถูกงดการบังคับจากโคเคนการบริหารตนเองมีการลดความซับซ้อนของ dendritic (รูปที่ 2B) วัดซ้ำสองทางการวิเคราะห์ ANOVA ของข้อมูล sholl plot เปิดเผยผลกระทบสำคัญของการรักษา [F(1,738)=30.59, p <0.0001] และรัศมี [F(245, 738)=289.6, หน้า <0.0001] (รูปที่ 2B) ยืนยันการสูญเสีย dendrites ที่เห็นด้วยกับการสูญเสีย synapses ที่วัดในการศึกษาอาเรย์ (รูป 1C) การวิเคราะห์ลำดับเบสที่สองและสามเผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกระดูกสันหลัง dendritic หลังจาก 7 วันของการงดโคเคน [t (6)=−3.12, หน้า <0.05] (รูปที่ 2D) โดยเฉพาะอย่างยิ่งการงดเว้นจากการสัมผัสโคเคนเพิ่มจำนวนของชนิดย่อยของกระดูกสันหลังบางในขณะที่ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญกับชนิดย่อยของกระดูกสันหลังอื่น ๆ (รูปที่ 2E) ตามที่เปิดเผยโดยสองทางซ้ำมาตรการ ANOVA กับผลกระทบหลักของการรักษา [F(1,30)=11.9, p=0.0017], ชนิดย่อยกระดูกสันหลัง [F(4,30)=57.7, p <0.0001] และการรักษาที่มีนัยสำคัญ x ปฏิกิริยาย่อยของกระดูกสันหลัง [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001]
การสนทนา
ในการศึกษาปัจจุบันเราแสดงให้เห็นว่ามีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและ synaptic เด่นชัดในชั้น V ของ PFC หลังจากวัน 7 ที่ถูกบังคับจากการโคเคนด้วยตนเอง โดยเฉพาะมีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการแยก dendritic ของเซลล์ประสาทเสี้ยมและการสูญเสียทั่วไปในความหนาแน่นของ synapse เป็นวัดโดยความหนาแน่นลดลงของ boutons presynaptic โดยรวมที่มีป้ายกำกับด้วย synaptophysin แม้จะสูญเสียความหนาแน่น presynaptic, dendrites ฐานของเซลล์ประสาทชั้นพีระมิดวีรับการเพิ่มขึ้นของความหนาแน่นกระดูกสันหลัง dendritic, โดยเฉพาะอย่างยิ่งบางกระดูกสันหลังพลาสติก. เนื่องจากเราไม่พบการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญของความหนาแน่นของ PSD95 จึงสามารถคาดการณ์ได้ว่าการลดลงของเทอร์มินัล presynaptic แต่การเพิ่มขึ้นของความหนาแน่นของกระดูกสันหลังอาจเกิดจากการเพิ่มขึ้นของจำนวนมัลติบูติน นอกจากนี้ยังเป็นที่น่าสังเกตว่าเราสังเกตเห็นแนวโน้มการเพิ่มขึ้นของการยับยั้ง synapses ใน PFC เนื่องจากหนามบางนั้นมีส่วนเกี่ยวข้องกับความเป็นพลาสติก [29]การเพิ่มขึ้นของกระดูกสันหลังเหล่านี้อาจเป็นตัวแทนของปั้นชดเชยเพื่อรักษาอินพุต synaptic ในเซลล์ประสาทที่เสียเหล่านี้ซึ่งได้สูญเสียกิ่ง dendritic
การศึกษาก่อนหน้าแสดงให้เห็นว่าโคเคนเพิ่ม arborization dendritic และความหนาแน่นของกระดูกสันหลังใน NAc [2]-[4]. เมื่อเร็ว ๆ นี้ Dumitriu และคณะ 2012 [30] แสดงให้เห็นว่าโคเคนแบบไดนามิกเปลี่ยนแปลงสันหลังใกล้เคียงในแกน NAc และเปลือก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเปลือกการถอนตัวจากโคเคนเพิ่มขึ้นเงี่ยงบางในขณะที่ลดความหนาแน่นของหัวเห็ดกระดูกสันหลังในเปลือก NAc [30]. ตรงกันข้ามกับการศึกษา NAc มีเพียงไม่กี่การศึกษาที่ตรวจสอบผลของโคเคนต่อสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทใน PFC [6], [31]. ข้อมูลของเราสอดคล้องกับการศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าโคเคนทำให้เกิดความหนาแน่นของกระดูกสันหลังเพิ่มขึ้นใน PFC [31]. โดยเฉพาะอย่างยิ่งหนูที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องในเงี่ยงถาวรและมีเสถียรภาพเช่นหนามนำเสนอ 3 วันโพสต์ถอน, ใน dendrites ปลายแสดงให้เห็นคะแนนการตั้งค่าโคเคนปรับอากาศที่สูงขึ้นและสมาธิสั้นโคเคนที่เกิดขึ้น [31]. การศึกษาก่อนหน้านี้ในเซลล์ประสาทหนู PFC ชั้น II-III รายงานค่าประมาณ 3 เงี่ยงต่อ endm ของ dendrite บน dendrites ทั้ง apical และ basal ซึ่งเป็นระดับที่หนาแน่นอย่างน่าประหลาดใจที่สามารถแก้ไขได้โดยความเครียด [32]. ค่าของเราในหนูควบคุมของ ∼2 spines / 10 µm ของกลุ่ม dendritic ต่ำกว่าซึ่งอาจเกิดจากประชากรของเซลล์ประสาทที่แตกต่างกันวิเคราะห์ (dendrites basal V ชั้น) หรือความแตกต่างในเทคนิคการถ่ายภาพ ในการศึกษาครั้งนี้เราใช้วิธีการย้อมสี Golgi แบบรวดเร็วส่วนเดียวในขณะที่การฉีดอิออนโตฮอร์ทีฟของสีย้อมสีเหลืองของลูซิเฟอร์รวมกับการถ่ายภาพคอนโฟคอลถูกใช้โดย Radley [32] การมองเห็นสัณฐานวิทยาของเส้นประสาทและ dendritic นอกจากนี้การค้นพบของเรายังเน้นถึงความสำคัญของระยะเวลาของการงดเว้นจากการบริหารตนเองของโคเคนที่นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในสมอง รายงานที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของ arborization dendritic หลังจากถอนโคเคนในหนูเพศเมียระยะยาว (24 – 25 วัน) [6]ในทางตรงกันข้ามกับการลดลงที่เราสังเกตเห็นหลังจาก 7 วันของการงดเว้นบังคับในหนูตัวผู้ แม้จะมีความแตกต่างด้านระเบียบวิธีและความแตกต่างในข้อมูลการแตกแขนง แต่มีกระดูกสันหลังจำนวนเพิ่มขึ้นในการศึกษาทั้งสองยืนยันการปรับโครงสร้างวงจรขนาดใหญ่ระหว่างการเลิกโคเคน การศึกษาในอนาคตจะอธิบายระยะเวลาของเหตุการณ์เหล่านี้เพื่อพิจารณาว่าการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเหล่านี้เป็นการชั่วคราวหรือยาวนาน
การค้นพบของเราบ่งชี้ว่าการงดเว้นจากการบริหารตนเองด้วยโคเคนทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างแบบไดนามิกและทำให้เกิดการปรับโครงสร้างองค์กรแบบซินแนทิคใหม่ใน PFC ผลลัพธ์เหล่านี้อาจอธิบายกิจกรรมการขาดออกซิเจนใน PFC ที่เกิดขึ้นจากการสัมผัสโคเคนซ้ำ [8], [33]. นอกจากนี้การค้นพบของเรายังสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นถึงการเลิกใช้สาร PFC [7], [8]และเพิ่ม GABA นอกเซลล์ใน medial PFC ระหว่างการถอนโคเคน [34]. ดังนั้นกลไกการบัญชีสำหรับกิจกรรม PFC hypo หลังจากสัมผัสโคเคนเรื้อรัง [8], [10] อาจรวมถึง (1) การเพิ่มขึ้นของการลดลงของ GABAergic, (2) ในการลดกลูตามาเทอริกและ / หรือ (3) ในการลดลงของ dopaminergic synaptic ไปยัง PFC การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าการเลิกบุหรี่จากโคเคนช่วยลดความหนาแน่นของ synapse โดยรวมอย่างมีนัยสำคัญตามที่ระบุโดยการลดจำนวนของ synaptophysin puncta synaptic บวก ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ามีการลดลงของการตอบสนองหลัง synaptic ใน PFC ซึ่งอาจเป็นสื่อกลางโดยการลดกลูตาเมตหรือโดปามีนที่ลดลง มีการศึกษาแสดงให้เห็นว่าโคเคนทำให้ลดกลูตาแมทเทอริก [35], [36]. อย่างไรก็ตามจากการใช้วิธี Golgi เราสังเกตการเพิ่มขึ้นของจำนวนของ dendritic spines บางบน dendrites ฐานของเซลล์ประสาทเสี้ยมซึ่งแสดงการเพิ่มขึ้นของ excitatory input ใน PFC ไปยัง neurites ที่เหลืออยู่ ข้อมูลที่ขัดแย้งกันอย่างเห็นได้ชัดเหล่านี้อาจสะท้อนถึงการสูญเสียประสาทโดยรวมที่เกี่ยวข้องกับการสูญเสีย dendrites ที่เราสังเกตเห็นด้วยการตอบสนองการชดเชยซึ่งอาจเป็นสื่อกลางโดย BDNF ที่เพิ่มขึ้นดังที่แสดงในการค้นพบครั้งก่อน [20]เพื่อเพิ่มความหนาแน่นของเงี่ยง dendritic บนเซลล์ประสาทที่เหลืออยู่
โดยรวมแล้วการค้นพบของเราบ่งชี้ว่ามีการจัดระเบียบใหม่ใน PFC ระหว่างการเลิกโคเคน โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการเชื่อมต่อ synaptic, การสูญเสียของการแยก dendritic และเพิ่มจำนวนของครีบบางในหนู PFC หลังจาก 7 วันของการเลิกยาเสพติดบังคับจากการบริหารตนเองโคเคน ผลลัพธ์เหล่านี้อาจให้โครงสร้างพื้นฐานสำหรับกิจกรรมการสังเกตการแพ้ใน PFC ของผู้เสพโคเคนเรื้อรังและอาจอธิบายถึงการสูญเสียการควบคุมความรู้ความเข้าใจที่เกิดขึ้นระหว่างการติดโคเคน
กิตติกรรมประกาศ
ผู้เขียนขอขอบคุณ Gavin Sangrey สำหรับความช่วยเหลือของเขาในการเตรียมแคปซูลฝังตัว
คำแถลงเงิน
งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย NIDA มอบ DA22339 และ DA033641 (RCP & GSV) และ DA18678 (RCP) HDS ได้รับการสนับสนุนโดยรางวัล K01 รายบุคคล (DA030445) ผู้ให้ทุนไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษาการรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูลการตัดสินใจเผยแพร่หรือจัดทำต้นฉบับ
อ้างอิง
;
