Nat Neurosci ต้นฉบับผู้เขียน; มีให้ใน PMC ม.ค. 1, 2014
เผยแพร่ในแบบฟอร์มการแก้ไขขั้นสุดท้ายเป็น:
Nat Neurosci ก.ค. 2013; 16 (7): 10.1038 / nn.3420
เผยแพร่ออนไลน์ Jun 2, 2013 ดอย: 10.1038 / nn.3420
PMCID: PMC3703824
NIHMSID: NIHMS477621
ฮุ่ยหวาง,*,1,2,3 ฟลอเรียน ดูโคลต์,*,1,2 หยานหลิว,2,3 ซูซินหวาง,2,3 และ Mohamed Kabbaj1,2
ฉบับแก้ไขล่าสุดของผู้เผยแพร่บทความนี้มีอยู่ที่ Nat Neurosci
ดูบทความอื่น ๆ ใน PMC ที่ กล่าวถึง บทความที่ตีพิมพ์
นามธรรม
ในท้องทุ่งคู่สมรสคู่สังคม (Microtus Ochrogaster) การผสมพันธุ์ชักนำให้เกิดพันธะคู่ที่ยั่งยืนซึ่งเกิดขึ้นจากการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าและควบคุมโดยสารสื่อประสาทหลากหลายชนิดรวมถึงออกซิโตซิน, vasopressin และโดปามีน ที่นี่เราตรวจสอบกลไก epigenetic ที่อาจเกิดขึ้นซึ่งเป็นสื่อกลางในการควบคุมพันธะคู่ เราแสดงให้เห็นว่า histone deacetylase ยับยั้งโซเดียม butyrate และ TrichoStatin A (TSA) อำนวยความสะดวกในการสร้างการตั้งค่าพันธมิตรใน voles ทุ่งหญ้าเพศหญิงในกรณีที่ไม่มีการผสมพันธุ์ เรื่องนี้เกี่ยวข้องกับกฎระเบียบเฉพาะของ oxytocin (OTR) และ vasopressin ตัวรับ V1a (V1aR) ในนิวเคลียส accumbens ผ่านการเพิ่มขึ้นของ histone acetylation ที่ก่อการของพวกเขา นอกจากนี้การตั้งค่าพันธมิตรที่สะดวกของ TSA นั้นถูกปิดกั้นโดยการปิดกั้น OTR หรือ V1aR ในนิวเคลียส accumbens ที่สำคัญการตั้งค่าคู่ค้าที่เกิดจากการผสมพันธุ์เรียกกฎระเบียบ epigenetic เดียวกันของผู้สนับสนุนยีน OTR และ V1aR เป็น TSA ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า TSA และการผสมพันธุ์ช่วยอำนวยความสะดวกในการตั้งค่าของคู่ค้าผ่านเหตุการณ์ epigenetic โดยให้หลักฐานโดยตรงครั้งแรกสำหรับการควบคุม epigenetic ของพันธะคู่
บทนำ
การเข้าร่วมทางสังคมเป็นลักษณะสำคัญของพฤติกรรมทางสังคมของมนุษย์และการขาดความรู้ความเข้าใจทางสังคมเป็นคุณลักษณะที่พบบ่อยในความหลากหลายของความผิดปกติของระบบประสาทรวมถึงโรคจิตเภทและความผิดปกติของคลื่นความถี่ออทิสติก1. ท้องทุ่งคู่สมรสที่เข้าสังคมคนเดียว (Microtus Ochrogaster) ได้กลายเป็นแบบจำลองที่น่าสนใจมากสำหรับการตรวจสอบฐาน neurobiological ของสิ่งที่แนบทางสังคมในขณะที่ทั้งห้องปฏิบัติการและบุคคลที่มีชีวิตอยู่ฟรีสร้างพันธบัตรคู่ระยะยาว2-4ซึ่งเริ่มต้นครั้งแรกโดยการก่อตัวของพฤติกรรมการเลือกสังกัดพันธมิตรที่มีต่อคู่ค้าที่เรียกว่าการตั้งค่าพันธมิตร5. การก่อตัวของการตั้งค่าของพันธมิตรที่เกี่ยวข้องกับความหลากหลายของสารสื่อประสาทและระบบฮอร์โมนรวมทั้ง neuropeptides oxytocin และ vasopressin (AVP) และ dopamine mesolimbic5.
In ทั่วไปการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าเป็นสื่อกลางผ่าน AVP สารสื่อประสาทในช่องท้อง pallidum และด้านข้างกะบัง (LS) ในเพศชายและสารสื่อประสาท oxytocin ในนิวเคลียส accumbens (NAcc) และเยื่อหุ้มสมองในหญิงในเบื้องต้น6-8.
โดยปกติแล้วจะเกี่ยวข้องกับการให้รางวัลตามธรรมชาติเช่นการผสมพันธุ์โดปามีนยังทำหน้าที่เป็นสื่อกลางที่สำคัญในการเลือกคู่ครองในท้องทุ่ง การเปิดใช้งานตัวรับชนิด dopamine D2 (D2R) ใน NAcc ช่วยอำนวยความสะดวกในขณะที่การเปิดใช้งานตัวรับ dopamine D1 ชนิด (D1R) ยับยั้งการสร้างความพึงพอใจของทั้งคู่ในทุ่งหญ้าชายและหญิง9-11.
ที่สำคัญความแปรปรวนในการแสดงออกของยีนของอุ้งและตัวรับ AVP V1a, OTR และ V1aR ตามลำดับสามารถส่งผลกระทบต่อความต้องการของคู่ค้าได้อย่างมาก ยกตัวอย่างเช่นใน Vole Prairie Voles หญิงการแสดงออกของ OTR ที่เกินความจริงใน NAcc ช่วยให้การตั้งค่าของคู่ค้าง่ายขึ้นหากไม่มีการผสมพันธุ์12-14.
นอกเหนือจากกฎระเบียบของการเชื่อมโยงคู่ออกซิโตซินและ AVP ยังมีส่วนเกี่ยวข้องในพฤติกรรมทางสังคมที่หลากหลายรวมถึงการจดจำทางสังคมความก้าวร้าวและการดูแลมารดา15, 16. สะดุดตาการหยุดชะงักของพฤติกรรมหลังในหนูทำให้เกิด neuroadaptations ยาวนานผ่านกลไก epigenetic รวมทั้ง DNA methylation ของ estrogen receptor alpha17 และยีน AVP18รวมถึงฮิสโตนอะซิติเลชั่นของโปรโมเตอร์รับกลูโคคอร์ติคอยด์19. นอกจากนี้ฮิสโตนดีอาเซติเลส (HDAC) ยังช่วยยับยั้งการแสดงออกของยีนผ่านการเพิ่มฮิสโตนอะซิติเลชั่นในสมองหนู20สามารถย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ได้19และมีอิทธิพลโดยตรงต่อพฤติกรรมทางสังคมเช่นการเปิดกว้างทางเพศ21. ที่สำคัญในสายของเซลล์มะเร็งปอด HDAC inhibitors trichostatin A (TSA) ช่วยเพิ่มการถอดรหัส OTR โดยตรงโดยการส่งเสริมฮิสโตนอะซิติเลชั่นในท้องถิ่น22.
ดังนั้นพื้นฐาน epigenetic ในการสร้างการตั้งค่าพันธมิตรในท้องทุ่งหญ้าสามารถแนะนำ เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้เราประเมินผลของสารยับยั้ง HDAC สองตัวคือโซเดียม butyrate (NaB) และ TSA ต่อการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในท้องทุ่งหญ้าสำหรับผู้ใหญ่หญิง หลังจากนั้นเราตรวจสอบกลไกระดับโมเลกุลที่เป็นสื่อกลางถึงผลกระทบของ TSA ในการกระตุ้นความพึงพอใจของคู่ค้าในท้องทุ่งหญ้าหญิง ในที่สุดเราพยายามที่จะตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลง epigenetic ที่เกิดจาก TSA ในระหว่างการอยู่ร่วมกันก็ถูกเรียกโดยการผสมพันธุ์
ผลสอบ
การรักษา TSA อำนวยความสะดวกในการตั้งค่าพันธมิตร
การฉีดยาเข้าช่องคลอดทางเพศที่ไร้เดียงสาเพศผู้ intracerebroventricularly (ICV.) กับ CSF หรือ CSF ที่มี 0.08, 0.4 หรือ 4 ng ของ TSA ทันทีก่อนการอยู่ร่วมกันของ 6 ชั่วโมงกับผู้ชายโดยไม่ผสมพันธุ์จากนั้นจึงทดสอบความพึงพอใจของคู่ของพวกเขา การอยู่ร่วมกันเป็นเวลาหกชั่วโมงกับผู้ชายที่ไม่มีการผสมพันธุ์ไม่ก่อให้เกิดการสร้างความพึงพอใจของคู่ครองในท้องทุ่งหญ้าหญิง4 และกระบวนทัศน์เชิงพฤติกรรมนี้ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางเพื่อประเมินผลกระทบของยาเสพติดต่าง ๆ ในการอำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้า5.
สัตว์ที่ได้รับการบำบัดน้ำไขสันหลังแสดงให้เห็นว่าไม่มีการสัมผัสแบบคู่ขนานกับคู่ค้าหรือคนแปลกหน้าหลังจากการอยู่ร่วมกันเป็นเวลา 6 ชั่วโมงโดยไม่ผสมพันธุ์t15= 0.76, P = 0.46; รูปที่ 1a) อย่างไรก็ตามสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA ทุกขนาดที่ใช้ในการทดสอบจะใช้เวลากับหุ้นส่วนมากกว่าคนแปลกหน้า (t8= 4.35, P = 0.002 สำหรับ TSA 0.08 nกลุ่ม g; t15= 3.63, P = 0.002 สำหรับ TSA 0.4 nกลุ่ม g; และ t8= 2.58, P = 0.03 สำหรับ TSA 4 nกลุ่ม g) ที่สำคัญไม่พบความแตกต่างของกลุ่มในกิจกรรมของหัวรถจักร (F3,46 = 1.25, P= 0.30, รูปที่ 1b) และไม่มีพฤติกรรมก้าวร้าวโดยหญิงทดสอบที่มีต่อคนแปลกหน้าหรือคู่หูพบว่าแสดงให้เห็นว่าผลกระทบของ TSA นั้นมีความเฉพาะเจาะจงกับความพึงพอใจของสังคมมากกว่าจะเป็นรองจากการเปลี่ยนแปลงของการเคลื่อนไหวหรือความเกลียดชังทางสังคมต่อคนแปลกหน้า
เพื่อตรวจสอบว่า TSA ช่วยเพิ่มฮิสโตนอะซิติเลชั่นในโครงสร้างสมองที่เกี่ยวข้องกับการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าหรือไม่ชุดหญิงสาวที่แยกจากกันถูกฉีดด้วย TSA ขนาดกลาง (0.4) ng) และอยู่ร่วมกับผู้ชายในกรณีที่ไม่มีการผสมพันธุ์ในช่วงเวลา 30 นาที, 2 หรือ 9 ชั่วโมง โดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับโกลบอลฮิสโตน H3 acetylation (Lys14) ที่สามารถตรวจพบได้ตลอดเวลา ณ จุดใด ๆ ทั้งใน NAcc และ caudate putamen (P > 0.05 สำหรับทุกกลุ่ม มะเดื่อ 1c & d) นี่แสดงให้เห็นว่า TSA อำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในกรณีที่ไม่มีการผสมพันธุ์แม้ว่าจะไม่ส่งผลกระทบต่ออะซิติเลชั่นฮิสโตนทั่วโลก H3 ใน NAcc หรือ putamen caudate
ที่สำคัญโซเดียม butyrate ยังอำนวยความสะดวกในการตั้งค่าพันธมิตรในทุ่งหญ้าหญิงหลังจากการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายเป็นเวลา 6 ชั่วโมงโดยไม่ผสมพันธุ์เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของฮีสโตนส่วนกลาง H3 acetylation (Lys14) ใน NAcc (รูปเพิ่มเติม 1) ผลกระทบของ TSA ที่มีต่อการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าสามารถทำซ้ำได้ด้วยตัวยับยั้ง HDAC ตัวอื่นซึ่งบ่งบอกถึงการมีส่วนร่วมของการยับยั้ง HDAC มากกว่าผลกระทบที่ไม่เฉพาะเจาะจงของ TSA ในการอำนวยความสะดวกให้กับคู่ค้า พิจารณาว่า TSA เป็นตัวยับยั้ง HDAC คลาส I / II ที่เฉพาะเจาะจงและเลียนแบบมากขึ้น23, 24และผลกระทบทางพฤติกรรมของ TSA นั้นเด่นชัดกว่า NaB เราเลือกที่จะใช้ TSA มากกว่า NaB เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ของโมเลกุลเฉพาะในส่วนต่อไปของการศึกษา
โมเลกุลมีความสัมพันธ์กับการตั้งค่าพันธมิตรที่อำนวยความสะดวก TSA
เมื่อความผันแปรของระดับการแสดงออกของยีนใน vole NAcc นั้นมีความสัมพันธ์กับกลยุทธ์การผสมพันธุ์ที่แตกต่างกันระหว่าง vog แบบ monogamous และ non-monogamous และการเปลี่ยนแปลงของการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าใน vole prairie โดยเฉพาะ12, 13, 25, 26เราประเมินว่ารูปแบบการสร้างพันธมิตรที่อำนวยความสะดวกด้วย TSA นั้นเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของยีนใน NAcc หรือไม่
การรักษา TSA (0.4) ng, ICV.) เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของระดับ OTR mRNA ใน NAcc หลังจากชั่วโมงการอยู่ร่วมกันของ 2 เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมที่ได้รับการรักษาด้วย CSF (t10 = 2.38, P = 0.038, รูปที่ 2a) ซึ่งมีแนวโน้มว่าจะยั่งยืนหลังจาก 9 ชั่วโมงแห่งการอยู่ร่วมกัน (t9 = 2.17, P = 0.058, รูปที่ 2b) แม้ว่าจะเพิ่มขึ้นเล็กน้อย แต่ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน V1aR mRNA สามารถสังเกตได้ใน NAcc 2 ชั่วโมงหลังจากการฉีด TSA แต่ก็ไม่พบความแตกต่างของกลุ่มอื่น ณ จุดเวลาสำหรับการวัด mRNA อื่น ๆ รวมถึง D1R หรือ D2R (P > 0.05, รูปที่ 2a, b) ที่สำคัญไม่มีการสังเกตความแตกต่างของกลุ่มใน putamen caudate ณ เวลาใดก็ได้และสำหรับ mRNA ที่วัดได้ (P > 0.05 สำหรับทุกกลุ่ม รูปที่ 2c, d) แนะนำว่าการเพิ่มขึ้นของ OTR mRNA ที่พบในสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA นั้นมีความเฉพาะกับ NAcc ยิ่งไปกว่านั้นการปรับขึ้นดังกล่าวเกิดขึ้นหลังจากการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายเท่านั้นเนื่องจากระดับ OTR และ V1aR mRNA ใน NAcc ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง 2 ชั่วโมงหลังจากฉีด TSA โดยไม่มีการอยู่ร่วมกัน (OTR: 100.0% ± 11.70 สำหรับกลุ่ม CSF, 86.7% ± 12.11 สำหรับ TSA กลุ่ม, t12 = 0.79, P = 0.444; V1aR: 100.0% ± 26.24 สำหรับกลุ่ม CSF, 92.3% ± 13.75 สำหรับกลุ่ม TSA, t9 = 0.27, P = 0.791)
สอดคล้องกับระดับ OTR mRNA ที่สูงขึ้นสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA ยังแสดงระดับโปรตีน OTR ที่สูงขึ้นที่จุดเวลาทั้งสองใน NAcc (2 ชั่วโมง: t10 = 2.34, P = 0.041; 9 ชั่วโมง: t10 = 3.16, P = 0.01, รูปที่ 2e, f) แต่ไม่ใช่ putamen caudate (t10 = 0.41, P = 0.69, รูปที่ 2g, h) ที่น่าสนใจในขณะที่ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญของระดับ V1aR mRNA สามารถตรวจพบได้ใน NAcc ที่ 2 หรือ 9 ชั่วโมงหลังจากการฉีด TSA (รูปที่ 2a, b) ระดับโปรตีน V1aR เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 9 ชั่วโมงเมื่อเทียบกับสัตว์ที่ได้รับ CSF ใน NAcc (t9 = 3.46, P = 0.007, รูปที่ 2f) แต่ไม่ได้มี caudate putamen (t10 = 0.98, P = 0.35, รูปที่ 2h) แม้ว่าจะมีการเปลี่ยนแปลงบางอย่าง แต่ระดับโปรตีน D1R และ D2R ใน putamen NAcc และ caudate ไม่ได้รับผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญจากการบริหาร TSA (P > 0.05, รูปที่ 2e-h).
TSA อำนวยความสะดวกฮิสโตนอะซิติเลชั่นของ oxtr และ avpr1a
การเพิ่มขึ้นของทั้ง mRNA และระดับโปรตีนสำหรับ OTR หลังจากการอยู่ร่วมกันหลังจากการรักษา TSA แนะนำว่า TSA น่าจะเพิ่มการถอดความของ วัวการเข้ารหัสของยีนสำหรับโอทีอาร์แทนที่จะเปลี่ยนการแปลหรือการหมุนเวียนของโปรตีน นอกจากนี้ระดับโปรตีน V1aR สูงขึ้นใน NAcc ซึ่งสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของระดับ mRNA เล็กน้อย แต่ไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษา TSA (มะเดื่อ. 2) พิจารณาว่า TSA เป็นตัวยับยั้งคลาส I และ II HDAC ที่ทรงพลัง23, 24, 27เราตั้งสมมติฐานว่า TSA เพิ่มฮิสโตนอะซิติเลชั่นที่ วัว และ เฉลี่ย1a ผู้สนับสนุนใน NAcc หลังจากนั้นเพิ่มการถอดความของพวกเขา ได้รับสัตว์ชุดใหม่ ICV. การฉีดของ TSA (0.4) ng) และอยู่ร่วมกับชายทันทีโดยไม่ผสมพันธุ์เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะถูกสังเวย หน้าต่างเวลา 30-min ได้รับเลือกจากงานก่อนหน้านี้รายงานการเพิ่มขึ้นของ histone acetylation สูงสุดหลังจากฉีด TSA ในท้องถิ่นในหนูและหนู28, 29. อะเซทิเลชั่น H3K14 ที่ วัว และ เฉลี่ย1a ผู้วิเคราะห์ได้ทำการวิเคราะห์โดยการกระตุ้นด้วยโครมาติน
สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของ OTR mRNA และระดับโปรตีนที่สังเกตเห็นก่อนหน้านี้สัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA แสดงการเพิ่มขึ้นสูงมาก (+ 460%) ในฮิสโตน H3 acetylation ที่ วัว โปรโมเตอร์ของยีนเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ได้รับการรักษาโดย CSF ใน NAcct10 = 5.88, P = 0.0002) แต่ไม่ใช่ caamate putamen (t9= 0.31, P = 0.76, รูปที่ 3a) นอกจากนี้ฮิสโตน H3 acetylation ที่ เฉลี่ย1a ผู้ก่อการยกระดับ 30 ขั้นต่ำอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการบริหาร TSA (+ 196%) ใน NAcc (t10 = 3.12, P = 0.01) แต่ไม่ใช่ putamen caudate (t9= 0.38, P = 0.71) เมื่อเปรียบเทียบกับ CSF ที่ควบคุม (รูปที่ 3b) ดังนั้น TSA จึงเพิ่มไซต์ acetylation ฮิสโตนโดยเฉพาะใน NAcc เร็วเท่า 30 นาทีหลังจากการเริ่มต้นของการอยู่ร่วมกันกับผู้ชาย
TSA อำนวยความสะดวกในการตั้งค่าพันธมิตรผ่าน OTR และ V1aR
จากการทดลองก่อนหน้านี้แบบจำลองโมเลกุลของการกระทำที่เกิดขึ้นในระหว่างการอยู่ร่วมกัน TSA potentiates histone acetylation ที่ วัว และ เฉลี่ย1a ผู้สนับสนุนหลังจากนั้นเพิ่มการถอดรหัสของพวกเขาและส่งผลให้ระดับโปรตีน OTR และ V1aR ที่สูงขึ้นถึง 9 ชั่วโมงหลังจากเริ่มต้นของระยะเวลาการอยู่ร่วมกัน ที่สำคัญเอฟเฟ็กต์ TSA นี้เฉพาะกับไซต์เนื่องจาก putamen หางยังคงไม่ได้รับผลกระทบ ที่นี่เราทดสอบว่าการเพิ่มขึ้น OTA และ V1aR ที่เกิดจาก TSA นี้เกี่ยวข้องกับการอำนวยความสะดวกในการสร้างการตั้งค่าพันธมิตรหรือไม่ หญิงแพรรีโวลได้รับการฉีดเข้าเส้นเลือดภายในของ TSA (0.04)ng ต่อด้าน) โดยมีหรือไม่มีการฉีดก่อน (30 นาทีก่อนการฉีด TSA, 0.5ng ต่อด้าน) ของ CSF หรือ CSF มีหนึ่งในสอง OTR ที่ต่างกัน, OTA (B) และ OTA (T), หรือ V1aR antagonist (V1aRA) ทันทีหลังจากการฉีดยา TSA ตัวเมียจะอยู่ร่วมกับผู้ชายเป็นเวลา 6 ชั่วโมงโดยไม่ผสมพันธุ์ตามด้วยการทดสอบความพึงพอใจของคู่ครอง
สัตว์ที่รักษาด้วยน้ำไขสันหลังไม่แสดงความต้องการของพันธมิตร (t5 = 0.17, P = 0.87, รูปที่ 4a) อย่างไรก็ตามสัตว์ที่ได้รับการรักษาโดย TSA ใช้เวลาติดต่อกับ“ คู่ค้า” มากกว่าคู่กับ“ คนแปลกหน้า” อย่างมีนัยสำคัญมากกว่าการแนะนำว่าการฉีด TSA เพียงครั้งเดียวโดยตรงสู่ NAcc นั้นเพียงพอที่จะอำนวยความสะดวกให้กับพันธมิตรt5 = 7.04, P = 0.0009) สิ่งที่น่าสนใจคือการปิดกั้นของ OTR หรือ V1aR โดยการรักษาก่อนด้วย OTA (B), OTA (T) หรือ V1aRA ป้องกันผลกระทบของ TSA (P > 0.05 สำหรับทุกกลุ่ม) เนื่องจากไม่พบความแตกต่างของกลุ่มในขมิ้นอ้อย (F4,32 = 1.89, P = 0.14, รูปที่ 4b) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า TSA ใน NAcc อำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าผ่านกลไก OTR- และ V1aR ซึ่งเป็นสื่อกลางในลักษณะพฤติกรรมที่เฉพาะเจาะจง
การผสมพันธุ์ทำให้เกิดระบบประสาทที่คล้ายคลึงกันเช่นเดียวกับ TSA
จากการสังเกตการณ์ก่อนหน้านี้ของเราเราได้พิสูจน์แล้วว่าการเพิ่มขึ้นของ epigenetic potentiation ของ oxytocin และ vasopressin neurotransmission ในหญิง NAcc นั้นเพียงพอที่จะอำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในกรณีที่ไม่มีการผสมพันธุ์ เพื่อตรวจสอบว่า neuroadaptations เหล่านี้ยังเกิดขึ้นในช่วงการก่อตัวตามธรรมชาติของการตั้งค่าของคู่ค้า, หญิงสาวท้องทุ่งถูกนำมารวมกันกับผู้ชายในช่วง 24 ชั่วโมงในการปรากฏตัวของการผสมพันธุ์ซึ่งก่อให้เกิดการตั้งค่าพันธมิตร4และเสียสละ เราสังเกตการเพิ่มขึ้นของทั้ง OTR และ V1aR mRNA และระดับโปรตีนใน NAcc เมื่อเปรียบเทียบกับเพศหญิงที่ไร้เดียงสา (OTR: + 38%, t10 = 2.68, P = 0.02 สำหรับ mRNA และ + 58% t8 = 3.05, P = 0.01 สำหรับโปรตีน V1aR: + 89%, t14= 2.53, P = 0.02 สำหรับ mRNA และ + 26% t20 = 2.23, P = 0.037 สำหรับโปรตีน รูปที่ 5a, b).
เนื่องจากทั้ง mRNA และระดับโปรตีนสำหรับ OTR และ V1aR นั้นเพิ่มขึ้นจากการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์เราจึงทำการตรวจสอบต่อไปว่าการควบคุมนี้มีความเกี่ยวข้องกับการปรับปรุง epigenetic ของ วัว และ เฉลี่ย1a การถอดความของยีน ชุดใหม่ของเพศหญิงจึงอยู่ร่วมกันกับชายเป็นเวลา 6 ชั่วโมงกับผสมพันธุ์และ acetylation H3K14 ที่ วัว และ เฉลี่ย1a โปรโมเตอร์ที่วัดโดยการกระตุ้นด้วยโครมาติน สอดคล้องกับ OTR และ V1aR mRNA และระดับโปรตีน, ทุ่งหญ้าดอกเพศเมียมีระดับ H3K14 acetylation ที่สูงขึ้น วัว และ เฉลี่ย1a ผู้ก่อการใน NAcc เมื่อเทียบกับเพศหญิงnaïve (วัว: t9 = 2.64, P = 0.02; เฉลี่ย1a: t9 = 2.91, P = 0.017 รูปที่ 5c, d) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ากระบวนทัศน์การอยู่ร่วมกันที่น่าเชื่อถือทำให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้าในท้องทุ่งหญ้าหญิงทำให้เกิดการแสดงออกของ OTR และ V1aR ใน NAcc ผ่านกลไก epigenetic ซึ่งสังเกตได้หลังจากการรักษา TSA
การสนทนา
ในการศึกษาปัจจุบันเรารายงานเป็นครั้งแรกที่การควบคุม epigenetic ของการสร้างการตั้งค่าพันธมิตร อันดับแรกเราแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มฮิสโตนอะซิติเลชั่นใน NAcc โดยการบริหารของสารยับยั้ง HDAC ช่วยอำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในช่องคลอดทุ่งหญ้าสำหรับผู้ใหญ่หญิง Tไก่เราได้เปิดเผยหลักฐานโดยตรงว่าการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในผู้หญิงนั้นขับเคลื่อนด้วย epigenetically เนื่องจากการอยู่ร่วมกันและการผสมพันธุ์กับผู้ชายเพิ่มขึ้น วัว และ เฉลี่ย1a การแสดงออกของยีนผ่านการปรับปรุงฮิสโตนอะซิติเลชั่นใน NAcc. การบริหาร TSA ในการชักชวนคู่ค้าที่เกิดจาก NAcc และนำไปสู่ระดับที่สูงขึ้นของ OTR mRNA และโปรตีนใน NAcc ยิ่งไปกว่านั้นถึงแม้ว่าอะมิโนฮิสโตนทั่วโลก H3 ไม่ได้รับผลกระทบในผู้หญิงที่ได้รับการรักษาด้วย TSA แต่การเพิ่มระดับฮิสโตนอะซิติเลชั่นในผู้หญิง วัว โปรโมเตอร์ใน NAcc พบว่าเร็วที่สุดเท่าที่ 30 นาทีหลังจากการบริหาร TSA ในที่สุดการบล็อก OTR ใน NAcc ก็เพียงพอที่จะป้องกันการตั้งค่าพันธมิตรที่อำนวยความสะดวกแก่ TSA. เนื่องจากการตรวจพบการปรับเปลี่ยนที่ขับเคลื่อนด้วย epigenetically ที่คล้ายกันหลังจากการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์ภายใต้ขั้นตอนที่ทราบกันว่าทำให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้าข้อมูลของเราจึงนำเสนอแบบจำลองสำหรับการควบคุม epigenetic ของพฤติกรรมทางสังคม Dการอยู่ร่วมกันกับผู้ชาย, TSA, หรือการผสมพันธุ์ทำให้เกิดฮิสโตนฮิสโตน H3 เฉพาะที่รวดเร็ว วัว ก่อการใน NAcc ที่ช่วยเพิ่มการถอดรหัสของมันส่งผลให้ OTR mRNA และระดับโปรตีนที่สูงขึ้นซึ่งหลังจากนั้นอำนวยความสะดวกในการสร้างการตั้งค่าพันธมิตร
ในหญิงท้องทุ่ง voles, 6 ชั่วโมงแห่งการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายที่ไม่มีผสมพันธุ์ไม่ได้ก่อให้เกิดการตั้งค่าพันธมิตร4และกระบวนทัศน์เชิงพฤติกรรมนี้ถูกใช้เพื่อตรวจสอบผลกระทบของการเปลี่ยนแปลงทางเภสัชวิทยาที่มีต่อการชักนำให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้า5. ในการศึกษาของเราในขณะที่การควบคุมที่ใช้น้ำเกลือหรือน้ำไขสันหลังไม่ได้พัฒนาความพึงพอใจของคู่ค้า เนื่องจาก NaB หรือ TSA ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อการเคลื่อนที่โดยรวมผลกระทบต่อการตั้งค่าพันธมิตรดูเหมือนจะเป็นพฤติกรรมที่เฉพาะเจาะจงมากกว่าผลกระทบที่สองต่อการเคลื่อนที่ ผลกระทบเฉพาะของ TSA นี้ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมจากการสังเกตระดับโมเลกุลของเรา แน่นอนแม้ว่าจะบริหาร ICVเราสามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงเฉพาะของการแสดงออกของยีนใน NAcc แต่ไม่ใช่ในโครงสร้างที่อยู่ติดกัน นอกจากนี้แม้ใน NAcc, D1R และ D2R mRNA และระดับโปรตีนยังคงไม่ได้รับผลกระทบ ลักษณะเฉพาะดังกล่าวนั้นน่าประหลาดใจสำหรับตัวยับยั้ง HDAC ในวงกว้างเช่น TSA ซึ่งส่งผลกระทบต่อทั้งคลาส I และ II HDACs อย่างไรก็ตามมีรายงานว่า TSA มีผลกระทบต่อการแสดงออกของยีนย่อย ๆ เพียงเล็กน้อยในจีโนมสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม30-32รวมถึงในหนู20.
เราแสดงให้เห็นว่า acetylation ของฮิสโตน H3 บน Lys14 ที่ วัว ก่อการ, การดัดแปลงที่เกี่ยวข้องกับการถอดความของยีนที่เพิ่มขึ้นรวมถึงในช่วงที่เป็นพลาสติกในสมอง33, 34ขีดเส้นใต้ที่สูงขึ้น OTR mRNA และระดับโปรตีน ในการตอบสนองต่อ TSA acetylation ฮิสโตนที่ วัว ผู้ก่อการเพิ่มและอำนวยความสะดวกในการเปิดใช้งานการถอดรหัสในเซลล์มนุษย์22สนับสนุนการค้นพบของเราว่า วัว สามารถควบคุม epigenetically เนื่องจากการปิดล้อมของ OTR ใน NAcc นั้นเพียงพอที่จะป้องกันผลกระทบทางพฤติกรรมของ TSA ข้อมูลของเราแนะนำว่าการแสดงออกของ OTR ใน TSA ที่เกิดจาก TSA ในระหว่างการอยู่ร่วมกันเป็นสื่อกลางในการอำนวยความสะดวกในการตั้งค่าพันธมิตร นอกจากนี้ 24 ชั่วโมงแห่งการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์เป็นกระบวนการที่ทราบกันดีว่าจะกระตุ้นให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้าในทุ่งหญ้าหญิงทำให้เกิดการแสดงออกที่คล้ายกันใน OTR ใน NAcc ของผู้หญิง นี่คือข้อตกลงที่สมบูรณ์กับการมีส่วนร่วมที่เป็นที่รู้จักของ oxytocin และตัวรับของมันในทางชีววิทยาของการสร้างการตั้งค่าพันธมิตรใน voles หญิง การผสมพันธุ์ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของระดับออกซิโตซินนอกเซลล์ใน NAcc25และการฉีดออกซิโตซินในท้องถิ่นเข้าสู่ NAcc ช่วยให้เกิดการตั้งค่าของคู่ค้าในกรณีที่ไม่มีผสมพันธุ์8. นอกจากนี้ OTR คู่อริยังบล็อกการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าที่เกิดจากการบริหารของอุ้งหรือผสมพันธุ์8, 35. ที่สำคัญการแสดงออกของ OTR ที่ไกล่เกลี่ยด้วยเชื้อไวรัสนั้นเพียงพอที่จะอำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้า12, 13.
นอกจากการเสริมสร้างบทบาทของ OTR แล้วผลลัพธ์ของเรายังแสดงหลักฐานสำหรับการกระตุ้นการแสดงออกของยีน OTR ผ่านกลไก epigenetic ระหว่างการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายในกรณีที่ไม่มีผสมพันธุ์ อันที่จริงแม้ว่าจะไม่เพียงพอที่จะทำให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้า แต่การอยู่ร่วมกันโดยไม่มีการผสมพันธุ์ในช่วงเวลาสั้น ๆ จะเป็นการเปิดใช้งานกระบวนการทางระบบประสาท. ยกตัวอย่างเช่นการสัมผัสกับชายสองชั่วโมงทำให้เกิดการยกระดับเล็กน้อย แต่ไม่มีนัยสำคัญในการปล่อยออกซิโตซินใน NAcc ของผู้หญิง25. ดังนั้นจึงสามารถเสนอได้ว่า TSA หรือ NaB มีอิทธิพลต่อ neuroadaptations ที่เกิดจากการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายช่วยในการพัฒนาความพึงพอใจของคู่ค้า น่าสนใจว่า potentiation ดังกล่าวได้รับการรายงานในสัตว์ฟันแทะที่ Class I และ II HDAC inhibitors รวมถึง NaB และ TSA ช่วยให้การรวมเหตุการณ์การเรียนรู้ที่ไม่ส่งผลให้เกิดความจำระยะยาวในสัตว์ควบคุม36, 37. เพื่อสนับสนุนแนวคิดนี้การอยู่ร่วมกันเป็นระยะเวลานานขึ้น (เช่น., 48hours) สามารถชักนำให้เกิดความพึงพอใจของคู่ค้าแม้ในกรณีที่ไม่มีการผสมพันธุ์4. นอกจากนี้ยังเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องทราบว่าการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์ในผู้หญิง NAcc การควบคุม OTR และ V1aR การแสดงออกผ่านกลไก epigenetic เช่นเดียวกับที่สังเกตหลังจากการอยู่ร่วมกันกับการรักษา TSA ซึ่งแสดงให้เห็นว่า TSA และการผสมพันธุ์ การสร้างการตั้งค่าพันธมิตร ที่สำคัญ TSA ไม่ก่อให้เกิด OTR และ V1aR upregulation ใน NAcc หญิงในกรณีที่ไม่มีการอยู่ร่วมกันกับผู้ชาย พรึบนี้สนับสนุนสมมติฐานที่ TSA อำนวยความสะดวกในการก่อตัวของการตั้งค่าพันธมิตรผ่าน potentiation ของ neuroadaptations ภายนอกตามธรรมชาติที่เกิดจากการอยู่ร่วมกันกับผู้ชายมากกว่าการเปิดใช้งานด้วยตัวเองหรือ neuroadaptations เหล่านี้ที่แตกต่างกัน
Oการศึกษาของคุณยังเน้นถึงบทบาทที่สำคัญของ NAcc V1aR ในการสร้างความพึงพอใจของคู่ครองของผู้หญิงเนื่องจากสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA แสดงระดับ V1aR ที่สูงขึ้นซึ่งการปิดล้อมป้องกันการก่อตัวของพันธมิตรที่สะดวกต่อ TSA. ยิ่งไปกว่านั้นผลกระทบเหล่านี้มีความสัมพันธ์กับฮิสโตนอะซิติเลชั่นที่สูงขึ้น เฉลี่ย1a ผู้ก่อการแม้จะไม่มีการยกระดับ V1aR mRNA อย่างมีนัยสำคัญเนื่องจากมีจุดเวลาที่ไม่เหมาะสม แม้ว่าเราจะไม่สามารถออกกฎระเบียบของความมั่นคงของโปรตีนโดย TSA ผ่าน acetylation ของโปรตีนที่ไม่ใช่ฮิสโตน38การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่าคล้ายกับ วัว ผู้ก่อการ TSA อาจส่งเสริม เฉลี่ย1a การถอดความผ่าน acetylation ฮิสโตนท้องถิ่น ในขณะที่การมีส่วนร่วมของ AVP ในพันธะคู่ชายได้รับการอธิบาย5บทบาทในพฤติกรรมของผู้หญิงยังคงเป็นที่ถกเถียงกัน ในมือข้างหนึ่ง ICV. การฉีดยา AVP อำนวยความสะดวกในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าในทั้งชายและหญิง voles ซึ่งถูกป้องกันโดยการปิดล้อมของ V1aR หรือ OTR อย่างใดอย่างหนึ่ง39. ในทางกลับกัน ICV. การฉีดของ V1aR คู่ปรับคู่ปรับ - เหนี่ยวนำให้เกิดคู่ปรับในเพศชาย แต่ไม่ใช่ในทุ่งหญ้าหญิง voles40. อย่างไรก็ตามการศึกษาทั้งหมดเหล่านี้ใช้ ICV. การฉีดเพื่อป้องกันไม่ให้มีความเข้าใจเพิ่มเติมเกี่ยวกับโครงสร้างที่เกี่ยวข้อง ที่นี่เราให้หลักฐานแรกว่าสารสื่อประสาท AVP ภายใน NAcc สามารถมีส่วนร่วมในการสร้างการตั้งค่าพันธมิตรใน voles หญิงในขณะที่วรรณกรรมส่วนใหญ่อธิบายการมีส่วนร่วมในพื้นที่ต่าง ๆ เช่นช่องท้อง pallidum, ผนังด้านข้างกะบังนิวเคลียสของเตียง stria terminalis และ amygdala ในเพศชาย5. ดังนั้นจึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะต้องทราบว่าการปิดกั้นของทั้ง OTR หรือ V1aR ใน NAcc ของผู้หญิงนั้นเพียงพอที่จะป้องกันการก่อตัวของความพึงพอใจของคู่ค้าหลังจากการรักษาด้วย TSA แนะนำว่าการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้านั้นต้องมีการเปิดใช้งาน. Tการค้นพบของเขาสอดคล้องกับและสนับสนุนการสังเกตก่อนหน้านี้ในช่องท้องทุ่งเพศชายที่การเข้าถึงพร้อมกันทั้ง OTR และ V1aR ใน LS เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับคู่ค้าที่เกิดจาก AVP6. ยิ่งไปกว่านั้นการสังเกตการเพิ่มขึ้นของระดับ OTR และ V1aR ในสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย TSA นั้นยังรองรับความต้องการของการกระตุ้นการทำงานของสารสื่อประสาท AVP และออกซิโตซินพร้อมกันสำหรับการเชื่อมคู่
เมื่อใช้ร่วมกับ oxytocin และ AVP สารสื่อประสาทโดปามีนใน NAcc modulate ในการสร้างความพึงพอใจของคู่ค้าใน voles หญิง9. ถึงแม้ว่าการผสมพันธุ์จะกระตุ้นโดปามีนใน NAcc9ความผันแปรของระดับตัวรับจะสังเกตได้หลังจากระยะเวลานาน - ยาวกว่า 24h- ของการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์ซึ่งสำคัญต่อการบำรุงรักษาพันธะคู่10. สอดคล้องกับข้อสังเกตเหล่านี้หญิงสาวท้องทุ่งที่ได้รับการรักษาด้วย TSA ได้แสดงความพึงพอใจของคู่ค้าโดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในตัวรับ dopamine D1R และ D2R ดังนั้นการขาดกฎระเบียบตัวรับโดปามีนนี้จึงเป็นข้อพิสูจน์อีกประการสำหรับความจำเพาะของ TSA
รายงานข้อมูลของเราเป็นครั้งแรกที่องค์ประกอบ epigenetic ในระบบประสาทชีววิทยาของพันธะคู่และแนะนำว่า TSA ก่อให้เกิด "สถานะอนุญาต" ในท้องทุ่งหญ้าหญิง potentiating การตอบสนองโมเลกุลของธรรมชาติเพื่อการอยู่ร่วมกันและส่งเสริมการก่อตัวของปฏิสัมพันธ์ทางสังคมที่แข็งแกร่ง นำไปสู่การตั้งค่าพันธมิตร. ดังนั้นจึงเป็นเรื่องดึงดูดที่จะตั้งสมมติฐานว่าการตั้งค่าพันธมิตรที่อำนวยความสะดวกแก่ TSA สามารถเสริมสร้างความเข้มแข็งให้มากขึ้นและนำไปสู่ความผูกพันถาวร ถึงแม้ว่าจะมีการระบุ HDACs เฉพาะที่เกี่ยวข้อง แต่ก็น่าสนใจที่จะตรวจสอบผลกระทบของ TSA ต่อพฤติกรรมอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับกลยุทธ์ชีวิตคู่สมรสในทุ่งหญ้าท้องนาเช่นการรุกรานแบบเลือกและการดูแลแบบผู้ปกครองสองคน เมื่อพิจารณาถึงความเกี่ยวข้องของท้องทุ่งในการสร้างแบบจำลองกลไกทางระบบประสาทของพันธะคู่ในมนุษย์5และสารยับยั้ง HDAC ที่มีแนวโน้มแล้วในการทดลองทางคลินิก24, 41, 42ข้อมูลของเราปูทางให้กับความเป็นไปได้ทางเภสัชวิทยาใหม่ ๆ ที่มีอิทธิพลต่อพฤติกรรมทางสังคม
วิธีการ
Subjects
เพศหญิงnaïveทุ่งหญ้า voles (Microtus Ochrogaster) จากการผสมพันธุ์ในห้องปฏิบัติการถูกหย่านมเมื่ออายุ 21 วันและตั้งอยู่ในคู่พี่น้องเพศเดียวกันในกรงพลาสติก (12 × 28 × 16 × XNUMX ซม.) พร้อมน้ำและอาหาร โฆษณาฟรี. กรงทั้งหมดได้รับการบำรุงรักษาภายใต้ 14: 10 h วงจรมืดแสงและอุณหภูมิประมาณ 20 ° C สัตว์ทุกตัวจะถูกสุ่มเข้ากลุ่มทดลองเมื่อถึงอายุ 70 – 90 วัน จำนวนสัตว์ที่ใช้ขึ้นอยู่กับการศึกษาก่อนหน้านี้ในกลุ่มของเราและคนอื่น ๆ รวมกับการวิเคราะห์พลังงาน ขั้นตอนการทดลองได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและใช้สัตว์ประจำสถาบันที่ Florida State University
ยาเสพติด
Sodium butyrate (NaB) ละลายในน้ำเกลือและ Trichostatin A (TSA) ละลายในน้ำไขสันหลังประดิษฐ์ (CSF, BioFluids, Rockville, MD) ทั้งคู่ซื้อจาก Sigma-Aldrich (St Louis, MO) NaB ถูกฉีดเข้าทางเยื่อบุช่องท้อง (IP) ที่ปริมาณ 600 mg / kg ซึ่งเป็นที่ทราบกันว่ากระตุ้นให้เกิดฮิสโตนอะซิติเลชั่นในโครงสร้างสมองหลายชนิดในหนู43, 44. ปริมาณรังสีที่ใช้สำหรับ TSA นั้นมีพื้นฐานมาจากงานก่อนหน้านี้ที่ระบุถึงประสิทธิภาพในการกระตุ้นให้เกิดเหตุการณ์ฮิสโตนอะเซทิเลชั่นและการแสดงออกของยีนในหนู19, 20. ตัวรับ V1aR ตัวเลือกที่คัดค้าน V1aRA d(CH2)5[Tyr (Me)] AVP และ OTR คู่ปรับ OTA (B), [d(CH2)5, Tyr (Me)2Thr4, Tyr-NH29] -OVT) ได้มาจาก Bachem (Torrance, CA) ตัวเลือก OTR ตัวที่สองที่เลือกได้มากกว่า OTA (T) dGly-NH2-d(CH2)5 [เทอร์ (Me)2, Thr4] OVT45ได้รับความกรุณาจากดร. มอริซแมนนิ่ง (มหาวิทยาลัยโทเลโดรัฐโอไฮโอ) คู่อริและปริมาณที่ใช้เหล่านี้ได้รับการคัดเลือกจากการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นถึงการเลือกของพวกเขาสำหรับ V1aR หรือ OTR ตามลำดับ35, 39, 46-49.
cannulation stereotaxic และ microinjection
หญิงถูกดมยาสลบด้วยโซเดียม pentobarbital (1mg / 10g น้ำหนักตัว) และ 26 mm X, 2.5 เกจวัดสเตนเลสสตีลคู่มือ cannulae (พลาสติกหนึ่ง, Roanoke, VA) ถูกฝังแบบ stereotaxically มุ่งหน้าไปยังโพรงด้านข้าง (ข้างเดียว; rostral, 0.6 mm ด้านข้างและ 1.0 mm ventral to bregma) หรือไซต์เฉพาะสำหรับ NAcc (ทั้งสองข้าง, แท่งจมูกที่ −2.6 mm, 2.5 mm rostral, ± 1.7 mm ventral ถึง bregma) หลังจากการกู้คืน 1.0 วันอาสาสมัครได้รับ microinjections ของ CSF หรือ CSF ที่มีความเข้มข้นต่างกันของ TSA เมื่อเลือกใช้คู่อริ OTR หรือ V4.5aR พวกเขาจะถูกฉีด 3 นาทีก่อน TSA การฉีดทำด้วยเข็มเกจ 1 ที่ขยาย 30 มม. ด้านล่าง cannula ที่แนะนำเข้าไปในพื้นที่เป้าหมายในปริมาณการฉีดของ 33 nL เข้าไปในโพรงด้านข้าง (ICV.) หรือ 200 nL ต่อด้านลงใน NAcc เข็มถูกเชื่อมต่อกับแฮมิลตัน Syringe (แฮมิลตันรีโน NV) ผ่านท่อเอทิลีน - 20 และภาวะซึมเศร้าลูกสูบดำเนินการอย่างช้าๆต้องใช้ 1 นาทีต่อการฉีด ในตอนท้ายของการทดลองอาสาสมัครทุกคนต้องถูกประหารชีวิตโดยการตัดหัวอย่างรวดเร็วและสมองสกัดเพื่อตรวจสอบการวาง cannulae โดยผู้สังเกตการณ์ตาบอดกับสภาพการทดลอง กลุ่มตัวอย่างที่มี cannulae วางผิดตำแหน่งถูกแยกออกจากการวิเคราะห์ข้อมูล
การทดสอบการอยู่ร่วมกันและการตั้งค่าพันธมิตร
ติดตามทันที IP., ICVหรือการฉีดยาภายในตัวผู้ผู้หญิงอยู่ร่วมกับผู้ชายเป็นเวลา 6 ชั่วโมงโดยไม่ผสมพันธุ์ ไม่มีการผสมพันธุ์ถูกตรวจสอบโดยการตรวจสอบพฤติกรรมของวิดีโอเทป สำหรับการสืบสวนของ neuroadaptations ที่เกิดจากการอยู่ร่วมกันกับการผสมพันธุ์, หญิงเอสโตรเจน (2µg ต่อวัน, IP., สำหรับ 3 วัน) อยู่ร่วมกับผู้ชายในช่วง 6 หรือ 24 ชั่วโมงและการมีอยู่ของการผสมพันธุ์ได้รับการยืนยัน posteriori บนวิดีโอเทป (ตั้งแต่ 6 ถึง 11 ศึกในช่วง 6 ชั่วโมงแรกของการอยู่ร่วมกัน)
การทดสอบการกำหนดลักษณะของคู่ค้าดำเนินการทันทีหลังจากการอยู่ร่วมกันของ 6 ชั่วโมงดังที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้11. โดยสังเขปเครื่องทดสอบสามห้องประกอบด้วยกรงที่เป็นกลางซึ่งเชื่อมต่อกับกรงที่เหมือนกันสองกรงซึ่งแต่ละกรงมีสัตว์กระตุ้นซึ่ง ได้แก่ "คนแปลกหน้า" ตัวผู้ที่ไม่คุ้นเคยหรือ "คู่หู" ตัวผู้ที่คุ้นเคยซึ่งใช้ในช่วงระยะเวลาการอยู่ร่วมกัน ผู้ทดลองหญิงมีอิสระในการเคลื่อนไหวตลอดทั้งเครื่องในระหว่างการทดสอบ 3 ชั่วโมงและสิ่งกระตุ้นที่ตัวผู้ถูกล่ามไว้ภายในกรงทำให้ไม่สามารถสัมผัสกันโดยตรง ทั้งเซสชั่นถูกบันทึกวิดีโอและระยะเวลาของการติดต่อแบบเคียงข้างกันของผู้เข้าร่วมหรือคนแปลกหน้าจะถูกวัดปริมาณโดยผู้ทดลองที่ได้รับการฝึกอบรมโดยไม่ทราบถึงกลุ่มทางชีววิทยา ความชอบของพันธมิตรหมายถึงอาสาสมัครที่ใช้เวลาในการติดต่อทางร่างกายกับคู่ค้ามากกว่าคนแปลกหน้าอย่างมีนัยสำคัญตามที่กำหนดโดยคู่สองหาง t-ทดสอบ. นอกจากนี้อุปกรณ์สามห้องยังมีเซ็นเซอร์โฟโตแคมซึ่งช่วยให้สามารถกำหนดกิจกรรมการเคลื่อนไหวของหัวรถจักรที่ระบุด้วยจำนวนข้อมูลของตัวเมียในห้องกระตุ้น คะแนนของหัวรถจักรนี้ช่วยให้เราสามารถควบคุมผลกระทบรองของยาต่อพฤติกรรมของเพศหญิงเช่นกิจกรรมทั่วไป, ความวิตกกังวลหรือการสำรวจสภาพแวดล้อมที่แปลกใหม่ซึ่งดัดแปลงโดยกลุ่มของเราและคนอื่น ๆ12.
การสกัด RNA และโปรตีน
ผู้หญิงถูกสังเวยด้วยการตัดหัวอย่างรวดเร็วและสมองถูกสกัดและแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งทันที ส่วนชเวียน (200 µm) ถูกตัดบน cryostat และน้ำค้างแข็งติดตั้งบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ การเจาะเนื้อเยื่อทวิภาคีที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 1 มม. ถูกนำมาจากพูเมนทั้งหมดของ NAcc และ caudate ซึ่งเป็นพื้นที่ควบคุมและเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกระทั่งผ่านการประมวลผล RNA ทั้งหมดและโปรตีนถูกสกัดโดยใช้โปรโตคอล TRI-Reagent ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Molecular Research Center, Cincinnati, OH)
การวิเคราะห์การแสดงออกโปรตีนโดย Western-blot
หลังจากการแยกเจลโพลีอะคริลาไมด์ 10% (15% สำหรับฮิสโตน) โปรตีนจะถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสและบ่มด้วยแอนติบอดีหลักต่อไปนี้: แอนตี้ - OTR (sc-8102, 1: 1000), -V1aR 18096: 1), -D500R (sc-1, 33660: 1), -D1000R (sc-2, 9113: 1, เทคโนโลยีชีวภาพ Santa Cruz, Santa Cruz, CA), -actin (A1000, 2066 XIGUMA, เซนต์หลุยส์มิสซูรี่หรือฮิสโตนต่อต้านแอนติไซด์ H1 (Lys1000, # 3 – 14, 06: 911) และรวม H1 (# 1000 – 3, 05: 928, 1: 1000, 81: 96, Millipore, Temecula, CA) แอนติบอดีทั้งหมดได้รับการตรวจสอบความถูกต้องสำหรับการใช้งานในมนุษย์หนูและหนูโดยที่ทุ่งหญ้าท้องนานั้นมีเปอร์เซ็นต์ที่คล้ายคลึงกันสูง (ตั้งแต่ 6.0 ถึง 3%) หลังจากการผสมพันธุ์ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ HRP-conjugated เยื่อหุ้มเซลล์จะถูกเปิดเผยด้วยสารตั้งต้น ECL (ECL SuperSignal West Dura, Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) และสัมผัสกับฟิล์ม Fuji XAR (Fuji Film, Tokyo, Japan, ญี่ปุ่น) การวัดปริมาณดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ภาพ AIS 3 (การวิจัยการถ่ายภาพ, เซนต์แคเทอรีน, ออนแทรีโอ, แคนาดา) และสัญญาณทั้งหมดได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานภายในเยื่อหุ้มเดียวกันกับแอคตินยกเว้นสัญญาณ acetyl-HXNUMX ซึ่งปรับมาตรฐานเป็นสัญญาณฮิสโตน HXNUMX ทั้งหมด ข้อมูลปกติจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของสัตว์ที่รักษาด้วยน้ำไขสันหลัง
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบกึ่งปริมาณเชิงปริมาณ (RT-PCR)
0.5 µg ของ RNA ทั้งหมดได้รับการประมวลผลสำหรับการสังเคราะห์ดีเอ็นเอเสริมแล้ววิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้50 ด้วยการปรับสภาพให้เป็นยีน nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) ปฏิกิริยาทั้งหมดถูกทำขึ้นเป็นสามส่วนและตรวจสอบความจำเพาะของพวกมันด้วยการวิเคราะห์เส้นโค้งและการแยกเจลอะกาโรสของ 2% ลำดับไพรเมอร์ที่ใช้มีดังนี้: 5'-TCCAAGGCCAAAATCCGCACGG-3 'GAGGGGGGGGAGGACGACGAGGGGGGGAGAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (เรฟ) สำหรับ AVP5aR, 3'- TTAACAACAATGGGGCTGTG-5 '(สำหรับ) และ 3'-GGCATGAGGGATCAGGTAAA-5' (เรฟ) สำหรับ D3R, 1'-GTGAAGGCGCTGTAGAGGAC-5 '(สำหรับ) และ 3'-CGGTGTGTTCATCATCTGCT-5' (เรฟ ) สำหรับ D3R และ 1'-CTATTAATCCCCGCCTGACC-5 '(สำหรับ) และ 3'-GGAGCTCGATTTGTTTCTGC-5' (Rev) สำหรับ NADH ข้อมูลมาตรฐานจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของสัตว์ที่ได้รับการบำบัดด้วยน้ำไขสันหลัง
การไม่เพิ่มปริมาณโครมาติน
histone H3 acetylation (Lys14) ใน NAcc และ caudate putamen เนื้อเยื่อเจาะถูกวิเคราะห์โดยใช้ชุดเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อ G Magna ChIP โปรตีน (มิลลิพอร์, เทเมคูลา, แคลิฟอร์เนีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากเชื่อมขวางด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 1% โครมาตินจะถูกตัดโดยใช้ Misonix XL-2000 เป็นชิ้นส่วนของ 200 – 600 bp การไม่เพิ่มปริมาณของ acetylated histone H3 (Lys14) ได้ถูกรับรู้ด้วย 10µg ของแอนติบอดี acetyl-H3 (Lys14) แอนติบอดี (มิลลิวินาที) ข้ามคืนที่ 4 ° C หลังจากล้างแล้วการชะล้างจากเม็ดบีดและการกลับด้านของ cross-link DNA จะถูกทำให้บริสุทธิ์และถูกวิเคราะห์ใน triplicates โดย RT-PCR บนแพลตฟอร์ม iCycler (ดูด้านบน) ด้วยเส้นโค้งมาตรฐานภายในที่ทำจากตัวอย่าง INPUT ที่รวมเข้าด้วยกัน ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบมาเพื่อขยายภูมิภาค 236 bp ยาวซึ่งตั้งอยู่ที่ 128 bp ต้นน้ำของการเข้ารหัส exon ครั้งแรกสำหรับทุ่งหญ้า OTR (วัว, Genbank ภาคยานุวัติAF079980) หรือ 192 bp-long region ตั้งอยู่ 141 bp upstream ของการเข้ารหัส exon ครั้งแรกสำหรับทุ่งหญ้าท้องนา V1aR (เฉลี่ย1a, Genbank ภาคยานุวัติAF069304) ลำดับมีดังนี้: 5'-CTCCGGAGAGGGGGGTAGT-3 '(Fwd) และ 5'-ACCGCTTCCCCGAGAGTAGGG-3' (Rev) สำหรับ วัวและ 5'-GGTGGACCAGCCAGACCCCA-3 '(Fwd) และ 5'-TGCAGAGCCAGGCGCTTTCC-3' (Rev) สำหรับ เฉลี่ย1a. ตัวอย่างแต่ละตัวได้รับการทำให้เป็นมาตรฐานด้วยค่า INPUT ตามลำดับจากนั้นข้อมูลจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของสัตว์ที่ได้รับการบำบัดด้วยน้ำไขสันหลัง
การวิเคราะห์ทางสถิติและการประมวลผลข้อมูล
สำหรับการวิเคราะห์การตั้งค่าของพันธมิตรสัตว์ที่แสดงพฤติกรรมการผสมพันธุ์ในช่วงระยะเวลาการอยู่ร่วมกันหรือมี cannulae ที่วางผิดตำแหน่งได้รับการยกเว้น สำหรับการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลอื่น ๆ ทั้งหมดจะมีการแยกจุดข้อมูลสูงสุดหนึ่งจุดต่อกลุ่มชีวภาพเมื่อถูกระบุว่าเป็นค่าเริ่มต้น การทดลองส่วนใหญ่ถูกจำลองแบบยกเว้นเมื่อผลลัพธ์ชัดเจนมาก เวลาที่ใช้ในการสัมผัสสัตว์ทั้งสองแบบเคียงข้างกันระหว่างการทดสอบความพึงพอใจของคู่ค้านั้นถูกวิเคราะห์ด้วยการจับคู่แบบสองด้าน t-ทดสอบ. คะแนนการเคลื่อนที่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้แบบสองด้าน t- ทดสอบ (สำหรับสองกลุ่ม) หรือ ANOVA แบบทางเดียว (สำหรับมากกว่าสองกลุ่ม) และเมื่อเหมาะสม PLSD ของ Fischer's โพสต์-hoc ทำการทดสอบด้วยเกณฑ์ที่มีนัยสำคัญ P <0.05 หลังจากการตรวจสอบความเป็นปกติแล้วข้อมูลอื่น ๆ ทั้งหมดจะถูกวิเคราะห์ด้วยสองด้าน t- ทดสอบสมมติว่าผลต่างที่เท่ากันหรือไม่เท่ากันทดสอบล่วงหน้า การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ StatView (SAS Institute) เมื่อข้อมูลได้มาตรฐานในการควบคุม (% ของ CSF, Saline หรือ Mating group) การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการกับข้อมูลดิบ
กิตติกรรมประกาศ
งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยสถาบันสุขภาพจิตแห่งชาติ (NIMH) มอบ MHR21-083128 ให้ MK และ ZW และ MHR01-058616 ถึง ZW เราขอขอบคุณดร. มอริซแมนนิ่ง OTA (T)
เชิงอรรถ
ขัดผลประโยชน์: ผู้เขียนรายงานว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
ผลงานผู้แต่ง
HW, FD และ YL ทำการทดลอง HW และ FD วิเคราะห์ข้อมูล HW, FD, ZW และ MK ออกแบบการศึกษา FD, ZW และ MK เขียนบทความ ผู้เขียนทุกคนพูดถึงผลลัพธ์และแสดงความคิดเห็นในต้นฉบับ
อ้างอิง
;