DeltaFosB, Cck promotör aktivitesini (2010) dolaylı olarak düzenler

Brain Res. 2010 Mayıs 6; 1329: 10 – 20.

Çevrimiçi yayınlandı 2010 Mart 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ ve Colleen A. McClung^{2, *}

Yazar bilgisi ► Telif Hakkı ve Lisans Bilgisi ►

Bu makalenin yayıncının son düzenlenmiş sürümünü şu adreste bulabilirsiniz: Brain Res

PMC’deki diğer makalelere bakın. anmak yayınlanan makale.

Özet

Kronik kötüye kullanım ilaçlarına maruz kalmanın neden olduğu bazı önemli biyokimyasal, yapısal ve davranışsal değişikliklerden bazıları, yüksek stabiliteye sahip transkripsiyon faktörü ΔFosB'in aracılık ettiği görülmektedir. Önceki çalışmalar göstermiştir ki, 2 hafta boyunca farelerde osFosB aşırı ekspresyonu, çoğu sonradan 8 haftaları expressionFosB ekspresyonunun ardından daha sonra regüle edilen, striatumda sayısız genin ekspresyonunda bir artışa yol açtığını göstermiştir. İlginç bir şekilde, bu genlerin çok sayıda, aynı zamanda, CREB transkripsiyon faktörünü aşırı eksprese eden farelerde de düzenlenmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmadan anlaşılamamıştır, ancak kısa vadeli BFosB’in bu genleri CREB yoluyla düzenleyip düzenlemediği. Burada, ΔFosB aşırı ifadesinin 2 haftalarının, 8 haftalarında dağılan bir etki olan striatumdaki CREB ifadesini arttırdığını bulduk.. Erken indüksiyon, bu beyin bölgesindeki belirli hedef gen promotörlerine artmış CREB bağlanması ile ilişkilidir. Şaşırtıcı bir şekilde, önceki raporlara dayanarak bir CREB hedefi olduğundan şüphelenilen bir gen, kolesistokinin (Cck), striatumdaki CREB tarafından kontrol edilmedi. Yönetmeliğini daha fazla araştırmak için Cck osFosB aşırı ifadesinin ardından, kısa vadeli ΔFosB aşırı ifadesinin her ikisinin de arttığını doğruladık Cck destekleyici aktivite ve gen ifadesi. Aynı zamanda, varsayılan bir CREB bağlanma bölgesinde (CRE) bağlanma aktivitesini arttırır. Cck promoteri. Ancak, CRE sitesi normal bazal ifadesi için gerekli iken Cck, osFosB indüksiyonu için gerekli değildir Cck. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar kısa vadeli ΔFosB indüksiyonunun belirli gen promotörlerinde CREB ekspresyonunu ve aktivitesini arttırmasına rağmen, bu koşullar altında genlerin yukarı regüle edildiği tek mekanizma olmadığını göstermektedir.

Anahtar Kelimeler: çekirdek accumbens, transkripsiyon, bağımlılık

TANITIM

Kötüye kullanım ilaçlarına kronik olarak maruz kalmak birçok beyin bölgesinde biyokimyasal ve yapısal değişikliklere neden olmaktadır. Bu değişikliklerin mesolimbic sistemdeki gen ekspresyon profillerinde değişiklikler içerdiği düşünülmektedir. Bu sistem, orta beyin içindeki ventral tegmental alandan (VTA) orta çekirdekli nöronlara ve bazı diğer beyin bölgelerine (NAc), nukleus akumbensindeki orta sivri nöronlara kadar uzanan dopaminerjik nöronlardan oluşmaktadır. İki transkripsiyon faktörünün, cAMP cevap elemanı bağlayıcı protein (CREB) ve ΔFosB'nin (bir Fos ailesi proteini) aktivitesindeki değişikliklerin, kötüye kullanılan ilaçlara kronik maruz kalmada görülen birçok biyokimyasal, yapısal ve davranışsal değişikliğe aracılık ettiği ileri sürülmüştür ( tarafından gözden geçirildi Nestler, 2005).

CREB, her yerde açık bir şekilde, CREB / ATF ailesinin bir üyesi olan transkripsiyon faktörüdür. CREB homodimerleri, birçok genin promotörlerinde bulunan bir CRE dizisinin (konsensüs: TGACGTCA) varyasyonlarına bağlanır. CREB'in fosforilasyonu (ağırlıklı olarak serin 133'te, diğer bölgeler tanımlanmış olmasına rağmen), dopamin reseptörlerinin akış aşağısında olanlar da dahil olmak üzere çeşitli sinyalleşme basamakları ile uyarılabilir (Cole ve arkadaşları, 1995). Serin 133'te fosforilasyon üzerine CREB, ko-aktive edici CREB bağlayıcı proteini (CBP) veya gen ekspresyonunun artmasına neden olan ilgili proteinleri alır ( Johannessen ve arkadaşları, 2004). Kötüye kullanımın opiat veya psikostimulan ilaçlara kronik olarak maruz kalması, çekirdeğin accumbensindeki CREB aktivitesinde geçici artışlara neden olur. (Barrot ve diğerleri, 2002; Shaw-Lutchman ve diğ., 2002, 2003), Bu ilaçların ödüllendirici özelliklerini azaltmak ve uyuşturucu geri çekilmesinin olumsuz duygusal durumuna katkıda bulunmak için bir uyarlama düşüncesi (Nestler, 2005).

LKötüye kullanım ilaçlarına karşı kalıcı uyarlamaların, kısmen FosB'in oldukça istikrarlı bir ekleme varyantı olan ΔFosB tarafından aracılık ettiği düşünülmektedir. (Nestler ve arkadaşları, 1999; McClung ve arkadaşları, 2004; Nestler, 2008). Fos ailesi üyeleri, bir aktivatör protein 1 (AP-1) kompleksi oluşturmak için Jun ailesi üyeleri ile dimerize olur. AP-1 transkripsiyon kompleksleri, transkripsiyonu düzenlemek için AP-1 yanıt elemanının (konsensüs: TGACTCA) varyasyonlarına bağlanır ( Chinenov ve Kerppola, 2001). Kötüye kullanım ilaçlarına akut maruz kalma Fos-ailesi üyelerinin kısa süreli indüksiyonuna (saatte) (ve artmış CREB aktivitesine) neden olurken, tekrarlanan ilaca maruz kalma son derece stabil ΔFosB'nin birikmesine neden olur (Hope ve diğerleri, 1994; Perrotti ve arkadaşları, 2008), ifadesi haftalarca devam eder.

Yetişkin striatumda ΔFosB veya CREB'yi indüktif olarak aşırı eksprese eden bi-transgenik fareler, psikostimulanlara veya diğer suistimal ilaçlarına tekrar tekrar maruz kalan hayvanlarda tekrarlanan biyokimyasal ve davranışsal fenotiplerin çoğunu gösterir. birBu transgenik hayvanlarda gen ekspresyonu değişikliklerinin nalizi, rFosB'nin kısa süreli (2 haftaları) aşırı ekspresyonu ile düzenlenmiş çok sayıda gen tanımladı, ilaç ödülünde eş zamanlı bir azalma ile bağlantılı değişiklikler. Gen ifadesindeki değişiklikler ve kısa süreli ΔFosB ile davranışsal tepki, 2 veya 8 hafta boyunca CREB'yi aşırı ifade eden hayvanlarda görülenlere oldukça benzerdi (McClung ve Nestler, 2003). Çarpıcı karşıtlıkta, ΔFosB'nin uzun süreli aşırı ekspresyonu (8 hafta), bu aynı genlerin çoğunun ekspresyonunu azaltmış ve ilaç ödülünün artmasına neden olmuştur (Kelz ve diğerleri, 1999; McClung ve Nestler, 2003).

Bu çalışmalarda tanımlanan bir gen kolesistokinin (Cckstriatum dahil birçok beyin bölgesinde üretilen bir nöropeptidHokfelt ve diğerleri, 1980). CCK dopaminerjik iletimi düzenleyebilir (Vaccarino, 1992), ilaç ödüllendirilmesi ve takviye ile ilgilidir (Josselyn ve diğerleri, 1996; Josselyn ve arkadaşları, 1997; Hamilton ve arkadaşları, 2000; Beinfeld ve arkadaşları, 2002; Rotzinger ve diğerleri, 2002) ve striatumda kronik kokain tarafından uyarılır (Ding ve Mocchetti, 1992). Ek olarak Cck promotörün hem CREB hem de AP-1 komplekslerine duyarlı olduğu gösterilmiştir (Haun ve Dixon, 1990; Deavall ve arkadaşları, 2000; Hansen, 2001). Genlerin çoğundan beri (dahil) Cck) hem CREB hem de kısa süreli ΔFosB ifadesinin ardından artmış ekspresyon sergileyen CREB hedef genleri biliniyor veya şüpheleniyordu ().McClung ve Nestler, 2003) kısa vadeli ΔFosB ifadesinin bu genlerin regülasyonuna yol açıp açmadığına karar vermek istedik (buna odaklanarak Cck) CREB'nin düzenlenmesi yoluyla veya daha karmaşık gen düzenleme mekanizmaları yoluyla.

SONUÇLAR

OsFosB aşırı ekspresyonu CREB seviyelerini geçici olarak arttırır

BFosB aşırı ekspresyonunun farelerin striatumundaki CREB protein seviyelerini arttırıp arttırmadığını araştırmak için Western blot kullandık. Bu çalışma için, hem NSE-tTA transgenini hem de TetOp--FosB transgenini taşıyan bi-transgenik farelerden (hat 11A) faydalandık. Doksisiklin yokluğunda, bu fareler striatumdaki dynorphin pozitif nöronlarında ΔFosB ekspresyonunda güçlü bir artış göstermektedir (Kelz ve diğerleri, 1999). ΔFosB'nin aşırı ekspresyonunun bu yöntemi kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir ve kronik kokaine maruz kalan hayvanlarda görülen ΔFosB indüksiyonunu paralize eden bölgeye özgü aşırı ekspresyona izin verir (Hope ve diğerleri, 1994; Kelz ve diğerleri, 1999). BFosB'yi aşırı eksprese eden 11A farelerinde, CREB protein seviyelerinin, 2 ekspresyon haftası sonrasında önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini ve bu seviyelerin 8 ekspresyon haftası sonrasında temel seviyesine döndüğünü tespit ettik (Şekil 1A, n = 8). Kısa süreli ΔFosB aşırı ekspresyonu ile CREB seviyelerindeki değişikliklerin başka bir sistemde tekrarlanıp çoğaltılamayacağını belirlemek için, PC12 hücrelerinde geçici olarak ΔFosB'yi aşırı eksprese ettik ve CREB seviyelerinin kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttığını (p <0.05) bulduk (p <XNUMX).Şekil 1B, n = 4). Bu sonuçlar kısa vadeli ΔFosB ifadesinin CREB protein seviyesini arttırdığını göstermektedir.

CREB seviyeleri, BFosB aşırı ekspresyonu ile artar. Lisatların Western blot analizi (A) 11A fare striata 2 veya 8 hafta boyunca dox kapalı fareler veya (B) PC12 hücreleri, ΔFosB'yi aşırı ifade eder. İçindeki veriler A Dox'taki değişim yüzdesine kıyasla yüzde olarak gösteriliyor ...

Hem FOSB hem de CREB, kısa süreli ΔFosB aşırı ifadesinin ardından striatumdaki belirli hedef genlerin promotörlerine bağlanır.

TargetFosB veya CREB bağlanmasının belirli hedef gen promotörlerinde meydana gelip gelmediğini ve bu bağlamanın kısa süreli overFosB aşırı ekspresyonunu takiben arttırılıp arttırılmadığını belirlemek için striatal doku ChIP (kromatin immünopresipitasyon) analizlerini kullandık. Adresindeki bağlamayı analiz ettik BDNF ve Cck promotörler, kısa vadeli shortFosB aşırı ekspresyonu, CREB aşırı ekspresyonu veya kronik kokain tedavisinin ardından her iki gen de oldukça fazla regüle edildiğinden,McClung ve Nestler, 2003). Ayrıca bağlayıcı olarak analiz ettik. CDK5 promotör ΔFosB'nin bilinen bir doğrudan hedefi olduğundanChen ve arkadaşları, 2000; Bibb ve arkadaşları, 2001; Kumar ve arkadaşları, 2005). Son olarak, prodynorphin promotör, önceki çalışmalarda farklı koşullar altında hem ΔFosB hem de CREB tarafından bağlanılabileceğini bulduğundan,Andersson ve arkadaşları, 2001; Zachariou ve arkadaşları, 2006).

CREB veya ΔFosB'yi tanıyan antikorlar kullanılarak 11 hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı eksprese eden 2A farelerinden striata üzerinde ChIP analizi yapıldı. Normal şartlar altında, ΔFosB’in CDK5 ve prodynorphin destekleyiciler, BDNF or Cck destekleyiciler (Tablo 1). Ayrıca, ΔFosB aşırı ekspresyonu, ΔFosB'nin CDK5 destekçi, ancak prodynorphin promoteri. Daha sonra bu promotörlerde CREB bağlanmasını ölçtük ve CREB'in CDK5, BDNF ve prodynorphin destekleyiciler, ancak Cck promoter, normal striatumda ve 2 hafta boyunca ΔFosB aşırı ekspresyonu, CREB bağlanmasını arttırır. BDNF ve prodynorphin destekleyiciler, ancak CDK5 promoteri. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar osFosB ve CREB'nin aşağıdaki gibi bazı gen promotörlerine bağlanabileceğini göstermektedir prodynorphin ve CDK5Bununla birlikte, CREB bağlanması gibi diğer promotörlere özgüdür. BDNF. Ayrıca, ΔFosB aşırı ekspresyonu, beklendiği gibi belirli promotörlerde ΔFosB bağlanmasında artışa neden olur, ancak bu zaman noktasında gözlenen ΔFosB aracılı CREB endüksiyonu ile tutarlı olarak belirli promotörlere CREB bağlanmasına da yol açar.

Varsayılan düzenleyici proteinlerin, iki hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı eksprese eden farelerde çeşitli promotörlere bağlanması.

Önceki çalışma, uzun süreli ΔFosB aşırı ekspresyonunun indüklediği gen ekspresyonundaki değişikliklerin, spesifik gen promotörlerinde kromatin modifikasyonları, özellikle histon H3'in asetilasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Kumar ve arkadaşları, 2005). Bunun, kısa süreli ΔFosB aşırı ekspresyonu üzerine gen ekspresyonundaki değişiklikleri hesaba katabileceğini belirlemek için asetillenmiş histon H3 (transkripsiyonel olarak aktif kromatin ile ilişkili bir histon modifikasyonu) veya transetil ile ilişkili bir histon modifikasyonu (Lys3, transkripsiyon ile ilişkili bir histon modifikasyonu) ölçtük. aktif olmayan kromatin). 9 hafta boyunca ΔFosB'nin aşırı ekspresyonunun, çalışılan gen promotörlerinden herhangi birinde asetillenmiş H2'in bağlanmasında hiçbir değişiklikle sonuçlanmadığını gördük (Tablo 1). Metillenmiş histon H3'in bağlanmasında önemli bir azalma bulduk; prodynorphin promotör, ancak Cck promotör ve bağlanmada değişiklik olmaz CDK5 ve BDNF promotörler, bunun kısa vadede BFosB'nin gen ekspresyonunu düzenlediği genel bir mekanizma olmadığını öne sürüyorlar. ChIP tahlillerimizdeki artışı hesaba katabilecek hiçbir farklılık bulamadığımız için şaşırdık ve ilgilendik. Cck 11A farelerindeki mRNA ekspresyonu, 2'in osFosB ekspresyonu haftalarını takip eden farelerde ve bu mekanizmanın daha da araştırılmasına karar verdi.

Kısa vadeliΔFosB artar Cck çoklu sistemlerde ifade

Stripatumda ΔFosB'yi aşırı eksprese eden bi-transgenik 11A farelerinin mikroarray karakterizasyonu bulundu Cck 2 haftalarca aşırı ekspresyonun ardından ekspresyon seviyeleri artar ve daha uzun ofFosB ekspresyonu süreleri ile kademeli olarak azalır (Şekil 2A, n = 3). İçin bu etkiyi doğruladık Cck 2 ve 8 haftalarında ayrı bir hayvan grubu üzerinde gerçek zamanlı PCR kullanılarak ve iki zaman noktasında mikroarray analizine benzer sonuçlar bulundu (veriler gösterilmemiştir).

ΔFosB’in kısa süreli aşırı ekspresyonu Cck gen ifadesi. (A) Cck 11, 1, 2 veya 4 hafta boyunca 8A farelerinde ΔFosB aşırı ifadesini izleyen striatumda mRNA ifadesi. Striatal örnekler üzerinde mikroarray analizi yapıldı. Cck seviyeleri ...

BFosB’in düzenleme yeteneğini daha fazla araştırmak Cck ifadesi, geçici olarak transfekte PC12 hücreleri kullandık Cck-lusiferaz raportör plazmidi ve bir ΔFosB ekspresyon plazmidi veya eşit miktarda pCDNA. Hem iki (n = 5-9) hem de üç (n = 11-13) ΔFosB aşın ekspresyonunun günü, Cck-luciferase ifadesi. Ek olarak, üç günlük ΔFosB aşırı ekspresyonu belirgin şekilde daha fazla sonuçlandı Cck- İki günlük aşırı ekspresyona kıyasla, lusiferaz indüksiyonu (Şekil 2B). ΔFosB'nin aşırı ekspresyonu, promotersiz bir lusiferaz yapısının ekspresyonunu indüklememiştir (veriler gösterilmemiştir). Hiçbir tedavi şartı altında bir azalma olmadı Cck-Luciferase aktivitesi belirgindir. Bu sonuçlar kısa vadeli ΔFosB ifadesinin Cck organizatörü ve uzun vadeli ΔFosB aşırı ifadesinin bastırdığı mekanizmayı cevapsız bırakır Cck ifadesi.

OsFosB aşırı ekspresyonu, bir farazi CREB bağlama bölgesinde Cck organizatör

Analizlerimiz bulundu Cck ekspresyon kısa vadeli osFosB ifadesinin ardından arttırılır, ancak ChIP analizlerimizde ne CREB ne de ΔFosB’in Cck promoteri. 'De protein bağlanmasında herhangi bir değişiklik olup olmadığını belirlemek için Cck BFosB aşırı ekspresyonunu takiben promoter, içinde mevcut varsayılan CRE-benzeri siteyi içeren bir sonda ile elektroforetik mobilite kaydırma deneyleri (EMSA) kullandık. Cck promoteri. 11 hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı eksprese eden 2A farelerinin striatalarından elde edilen nükleer özütleri kullanarak, bölgedeki varsayılan CRE bölgesine bağlanmada bir artış bulduk. Cck destekçiŞekil 3 A, C, n = 4). İlginç şekilde, 11A, 8 hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı eksprese eden farelerde Cck ifadesi, aynı zamanda bu sitede daha fazla bağlanma gösterdiŞekil 3B, C, n = 4). Bir karşılaştırma olarak, 2 hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı eksprese eden farelerde bir konsensüs CRE bölgesine bağlanmayı inceledik ve striatal özütlerde sağlam CRE bağlanması bulduk, ancak ΔFosB indüksiyonunu takiben bağlanmada artış olmadı (Şekil 3F, n = 4). Bu nedenle, bu zaman noktasında görülen ΔFosB'nin neden olduğu toplam CREB seviyelerinde artışa rağmen, bu sonuçlar ΔFosB aşın ekspresyonunu takip eden promotörlerde artmış CREB bağlanmasının sadece belirli genlere özgü olduğunu ve global bir fenomen olmadığını tespit eden ChIP analizlerimizle aynıdır. . CREB’nin bağlı olup olmadığını belirlemek için Cck EMSA analizimizdeki promotörde, CREB'ye özgü bir antikorla süper vites deneyleri yaptık. ChIP testlerimizle anlaşmaya vardığımızda, CREB’yi Cck EMSA deneylerinde varsayımsal CRE bölgesini içeren sonda, CREB konsensüs CRE sitesini önemli ölçüde bağladı ve değiştirdi (Şekil 3D, E, n = 4). DNA'daki bağlanma aktivitesi Cck promotör ayrıca, onaFosB'nin, iyi niyetli AP-1 bölgelerine bindingFosB bağlanmasını bloke etmek için yapılan önceki çalışmalarda gösterilen koşullar altında, BFosB'ye karşı bir antikordan da etkilenmedi (veriler gösterilmemiştir) (Hope ve diğerleri, 1994a, 1994b; Chen ve arkadaşları, 1995, Hiroi ve diğerleri, 1998). Ayrıca, 11 haftalarında ΔFosB ekspresyonu sonrası 8A hayvanlarının striata üzerinde ChIP deneyleri yaptık ve yine de hiçbir CREB veya ΔFosB bağlaması bulamadık. Cck promotör (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, ΔFosB ifadesi, protein bağlanmasında bir artışa yol açar. Cck hem 2 hem de 8 ekspresyon haftalarının ardından destekleyici; Bununla birlikte, bu faktörlerin kimliği bilinmemektedir.

Protein bağlanması Cck promoteri. (A, B) Kullanarak elektroforetik mobilite kaydırma testi Cck 2 haftaları (A) veya 8 haftaları (B) için ΔFosB'yi aşırı eksprese eden hayvanlardan gelen striatal dokuya sahip CRE benzeri bölge. (A) 'da, aşırı etiketlenmemiş rakiple rekabet ...

Varsayılan CRE sitesi Cck promotör, arttırılmış promotör aktivitesinden sorumlu değildir

Çünkü bir parçasını kullanarak protein bağlanmasında bir artış bulduk Cck CREFosB aşırı ifadesini takiben olası CRE sitesini içeren promotör, bu sitenin arttırmak için gerekli olup olmadığını belirlemek istedik Cck BFosB aşırı ifadesini takiben ifade. Bu olasılığı test etmek için PC12 hücrelerini Cck-Toplu CRE-benzeri bölgesini içeren-lusiferaz plazmidi veya CREB ile herhangi bir etkileşimi ortadan kaldıracak olan bölgede bir mutasyon içeren bir tanesi. İlginç şekilde, CRE benzeri sitenin mutasyonu bazal azalmıştır Cck % 32 oranında promoter etkinliği (Şekil 4A, n = 9), ancak Cck ΔFosB aşırı ekspresyonu ile promoter indüksiyonu (Şekil 4B, n = 11-13). Bu, ancak Cck promotör, tam bazal aktivite için bozulmamış bir CRE benzeri bölge gerektirir; ΔFosB aşırı ekspresyonu ile indüklenen promotör aktivitesi, CRE benzeri sekans gerektirmez.

The Cckbenzeri CRE sitesi için gerekli değildir Cck osFosB ile indüksiyon. (A) Cck-luciferase aktivitesi normal ya da normal transfeksiyondan 2 gün sonra ölçüldü Cck-lusiferaz veya CRE benzeri sitenin mutasyona uğradığı. * p <0.05 (B) Cck-lusiferazdır ...

cFos bağlanır Cck organizatör

Önceki çalışmalar olduğunu bulduk cFos mRNA kısa süreli ΔFosB ifadesiyle artar, ancak uzun ΔFosB ifadesinden sonra, kokain tedavisinin striatumda cFos'u indükleme kabiliyeti azalır (McClung ve Nestler, 2003; Renthal ve diğerleri, 2008). Bu nedenle, cFos'un artışa katkısı olabilir. Cck kısa vadeli ΔFosB ifadesini izleyen ifade. CFos için spesifik bir antikorla ChIP analizleri gerçekleştirdik ve cFos bağlanmasını ölçtük. Cck Kısa vadeli ΔFosB ifadesi olan ve olmayan promotör. CFos’un bağlandığı Cck promotör, bu bağlanma ΔFosB aşırı ekspresyonunu takiben anlamlı şekilde artmadı (Şekil 5, n = 5). Bu, cFos’un Cck promotör, genel düzenlemesine katkıda bulunabilir Cck İfade, ancak düzenlemelerin düzenlenmesinde yer almamaktadır. Cck BFosB tarafından destekleyici.

cFos bağlanır Cck promoteri. Kromatin immünopresipitasyon deneyleri, doFosB'den aşırı eksprese eden farelerin dox üzerinde veya dox çıkarılmasından sonra 2 haftalarında striatal doku kullanılarak cFos için spesifik bir antikorla gerçekleştirildi. Gerçek zamanlı PCR analizi ...

TARTIŞMA

Bu çalışma, ΔFosB’in striatumdaki gen ekspresyonunu düzenlediğini ve kısa süreli ekspresyon sonrası çoklu mekanizmalar yoluyla bunu yaptığını gösteren önceki bulguları doğrular ve genişletir. 2'in aşırı eksprese edilmesinin ardından, ΔFosB'nin ekspresyonda değişikliklere yol açan belirli genlerde promotörlere doğrudan bağlandığını gösterdik (örn. CDK5). Ayrıca, kültürlenmiş hücrelerde ve striatumda gözlenen bir etki olan CREB protein seviyelerini yükseltir, diğer gen promotörlerinde CREB bağlanmasının artmasına neden olur (yani dynorphin ve BDNF). Önceki bir çalışmada, striatumdaki BFosB'nin kısa süreli aşırı ekspresyonunun, CREB aşırı eksprese edildiğinde bulunan aynı gen ekspresyon değişikliklerinin çoğuna yol açtığını ve kokain tercihinin ölçümlerinde benzer davranışsal tepkilere yol açtığını bulduk (McClung ve Nestler, 2003). Dolayısıyla, ΔFosB'nin CREB'nin indüksiyonuna yol açtığı ve aynı zamanda CREB'nin bazı gen promotörlerine bağlanmasına yol açtığı bu bulgu, gen ekspresyon değişikliklerinin neden bu iki transkripsiyon faktörü tarafından paylaşıldığını açıklamaya yardımcı olur.

CREB'in ΔFosB tarafından uyarılması ilginçtir, çünkü kötüye kullanım ilaçlarının serin 133-fosforile edilmiş CREB seviyelerinde değişikliklere neden olduğu gösterilmiştir (Mattson ve diğerleri, 2005) ve CRE aracılı transkripsiyonu artırın (Barrot ve diğerleri, 2002; Shaw-Lutchman ve diğ., 2002, 2003), genel CREB seviyelerini değiştirmeden. CREB seviyelerindeki değişikliklerin geçici olması ve bu nedenle diğer çalışmalarda kolayca gözden kaçırılması mümkündür. Elimizde, belirli deneylerde CREB mRNA'da kokaine bağlı artışlar gördük, ancak bu etki oldukça değişkendir (yayınlanmamış gözlem). Hem 11A transgenik fareleri hem de PC-12 hücreleri, kısa süreli ΔFosB aşırı ekspresyonunun ardından CREB indüksiyonu gösterdiğinden, bu, CREB'nin gerçekten de osFosB (veya ΔFosB'nin hedefi) tarafından indüklendiğini, gende ilaç kaynaklı değişiklikleri açıklamak için başka bir mekanizma sağladığını göstermektedir. ifadesi.

Şaşırtıcı bir şekilde, ne CREB ne de ΔFosB’in Cck rağmen destekçi Cck ifadesi kısa süreli ΔFosB ifadesinin ardından açıkça düzenlenmiştir. Cck, hem VTA hem de NAc'de ifade edilen bol miktarda bir nöropeptiddir (Hokfelt ve diğerleri, 1980) ve muhtemelen kötüye kullanılan ilaçlara karşı davranışsal tepkilerde rol oynar (Josselyn ve diğerleri, 1996; Josselyn ve arkadaşları, 1997; Hamilton ve arkadaşları, 2000; Beinfeld ve arkadaşları, 2002; Rotzinger ve diğerleri, 2002). Hücre kültürü analizlerinde Cck promotör, kapsamlı bir şekilde karakterize edildi ve CREB ve AP-1 aile üyelerine duyarlı olduğu gösterilmiştir ( Hansen, 2001). Haun ve Dixon (1990) AP-1 komplekslerinin Cck CRE benzeri site in vitrove daha sonra, SK-N-MC nöroblastom hücrelerinin kullanılmasıyla, CRE benzeri sitenin mutasyonunun, aşırı eksprese edilmiş cFos / cJun (Rourke ve diğerleri, 1999). Nitekim, biz de artış görüyoruz Cck promotör etkinliği (Şekil 2) ve CRE benzeri elemanın içinde veya çevresinde bağlama (Şekil 3) başka bir AP-1 ailesi üyesi olan ΔFosB'nin aşırı ifadesi üzerine, ancak ΔFosB’in Cck organizatör in vivo or in vitro, aşırı ekspresyonu üzerine bile.

Birçok çalışma CREB’nin Cck destekleyici aktivite. Cck CRE benzeri site omurgalılar üzerinde korunmaktadır (Hansen, 2001) ve bazı hücre kültürü analizlerinde, hem CREB hem de AP-1 kompleksleri bu bölgeye bağlanır ve Cck promotör etkinliği (Haun ve Dixon, 1990; Deavall ve arkadaşları, 2000; Hansen, 2001). Ek olarak, birkaç bilinen aktivatör Cck ifadesinin (bFGF, PACAP, peptonlar ve depolarizasyon dahil) CREB (Hansen ve arkadaşları, 1999; Deavall ve arkadaşları, 2000; Bernard ve arkadaşları, 2001; Gevrey ve arkadaşları, 2002; Hansen ve arkadaşları, 2004). bizim Cck-luciferase raportör gen verileri, CRE-benzeri bölge için düzenlemelerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar Cck promotör aktivite, çünkü bu sitenin mutasyonu bazal azalır Cck promotör etkinliği ve CckYapısal olarak aktif bir CREB şekli olan VP16-CREB tarafından indüklenen lusiferaz ekspresyonu, bu bölge mutasyona uğradığında kaybolur (yayınlanmamış gözlem). Bu nedenle, CREB’in Cck striatal ekstraktlardaki promotör, başlangıçta veya CREB seviyeleri arttırıldığında kısa vadeli ΔFosB aşırı ekspresyonu üzerine yükselir. Bu, CREB seviyelerinin olduğunu savunuyor kendiliğinden Bu bölgedeki bağlayıcılık miktarını belirlemede tek faktör değildir ve bu başkalarının çalışmaları ile desteklenmektedir (Cha-Molstad ve arkadaşları, 2004). Diğerlerinin promotörlerinden beri, daha önce olduğu gibi CREB hedef genlerini tanımladı. BDNF ve prodynorphin, CREB'yi bağladı, bulma konusunda CREB'in bağlayıcı olmadığına eminiz. Cck striatal nükleer özütlerde promoter. Ayrıca, indüksiyon CckosFosB tarafından lusiferase aktivitesi, CREFosB’in düzenleme yapmadığını düşündüren, sağlam CRE-benzeri bölgeye bağlı değildi. Cck CREB'in direkt olarak bağlanmasını düzenleyen ifade. Cck promoteri.

CREB’le etkileşim içinde olduğumuzu tespit edemiyoruz Cck promotör tarafından desteklenmektedir Renthal ve diğ. (2009)Fosforile edilmiş CREB (pCREB) ve ΔFosB'nin kronik kokain maruziyetinden sonra striatumda bağlanmadaki global değişikliklere bakmak için bir ChIP-yonga yaklaşımı kullandı. Bu deneylerde, DNA-protein kompleksleri ΔFosB veya pCREB antikorları ile immüno-çökeltildi ve etiketlendikten sonra çökeltilmiş DNA, bir promotör mikro-dizisine hibritlendi. Daha önce birçok CREB hedef genini bu yaklaşımla tanımlamış olmasına rağmen (örneğin, BDNF, prodinorfin), Cck tanımlanmadı. Ek olarak, CREB'nin bir konsensüs CRE bölgesine bağlanmasının kültürlenmiş hücre hatları arasında büyük ölçüde değiştiği gösterilmiştir (Cha-Molstad ve arkadaşları, 2004). CREB ile etkileşimi bulan önceki çalışmaların tümü Cck promotör hücre kültüründe (EMSA ve ChIP örneklerimizin türetildiği beyin değil) gerçekleştirildi ve protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için jel kaydırma deneyleri kullanıldı. Bir EMSA bir faktörün bir DNA dizisine bağlanma potansiyelini değerlendirebilirken, ChIP analizleri bu etkileşimlere yeni bir bakış açısı sağlar in vivo. Ayrıca, verilerin her ikisinin de indüksiyonunu gösteren Cck promotör aktivitesi veya CREB Cck promoter, peptonlar gibi faktörler tarafından uyarılmış hücrelerden elde edildi (Bernard ve arkadaşları, 2001), depolarizasyon (Hansen ve arkadaşları, 2004) veya cAMP ve ERK dahil çeşitli hücre içi sinyal kaskadlarının aktivatörleri (Hansen ve arkadaşları, 1999). Deneylerimizde, kullanılan tek “uyaran”, indüklemek için yeterli olan ΔFosB'un aşırı ifadesiydi. Cck ifadesi. Beraber ele alındığında, bu CREB’in Cck promotör, hücre tipine ve belirli sinyal yollarının aktivasyonuna büyük ölçüde bağlıdır. Ek olarak, Cck CRE benzeri promotör element (en azından indirgenmemiş PC12 hücrelerinde ve fare striatumda), CREB veya PFB'nin doğrudan bir hedefi değildir. İlginç bir şekilde FosB CREB ile ekspresyon ayrıca hücre tipine ve stimülasyon tipine de özgüdür. Andersson tarafından yapılan bir çalışma ve diğerleri. CREB antisens oligonükleotitlerinin fare striatuma enjekte edilmesinin kısmen FosB kokain uygulamasının ardından (Andersson ve arkadaşları, 2001). Bununla birlikte, L-Dopa'nın yeteneğini indükleyebildiklerini de buldular. FosB 6-OHDA lezyonlu striatumdaki ekspresyon, CREB antisens oligonükleotitlerin varlığından etkilenmedi.

CREB ve ΔFosB’in dolaylı olarak Cck promotör ve kromatin yapısındaki değişiklikler, ΔFosB'yi indükleyen çeşitli uyaranlara cevap olarak belgelenmiştir.Tsankova ve arkadaşları, 2004; Kumar ve arkadaşları, 2005; Renthal ve diğerleri, 2008ΔFosB'nin kromatin yapısını değiştirerek promotör aktivitesini dolaylı olarak değiştirebileceğini düşündük. Bununla birlikte, 2 hafta boyunca ΔFosB'yi aşırı ifade eden farelerde, histondaki H3 asetilasyonunda herhangi bir değişiklik olmamıştır. Cck destekçiTablo 1). Bu, ChIP-chip verileriyle desteklenir. Renthal ve diğ. (2009), asetillenmiş H3 bağlanmasında hiçbir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Cck Kronik kokaine maruz bırakılan farelerde promotör. Beri Cck promoter, striatumda aktiftir, baskıcı metillenmiş histon H3 bağlanması beklenmedi veya gözlenmedi. İlginç bir şekilde, asetillenmiş H3 bağlanmasında ΔFosB aşırı ekspresyonu nedeniyle de değişiklik olmadı. BDNF promotör (artmış CREB bağlanması gösterdi) veya CDK5 ve prodynorphin promotörler (ki artmış BFosB bağlanması gösterdi). Promotör aktivitesindeki değişikliklerle ilgili sayısız histon modifikasyonu olduğundan Rando ve Chang, 2009), bu genlerin indüksiyonu ile ilişkili muhtemel başka kromatin modifikasyonları vardır. Herhangi bir tek kromatin modifikasyonu, promoter aktivitesinin seviyesini sıklıkla öngörmekle birlikte, belirli bir genin aktivasyonu sırasında değişmeyebilir. Gelecekteki çalışmalarda, çevresindeki kromatin yapısındaki diğer potansiyel değişikliklere bakmak ilginç olacaktır. Cck BFosB aşırı ifadesini takip eden destekleyici. İlginçtir, kronik kokain (muhtemelen üzerinden OsFosB indüksiyonunun, nötral fizyolojiyi, ERK sinyallemesini ve kokaine davranışsal tepkileri değiştirdiği görünen sirtuin 1 ve 2, sınıf III histon deasetilaz ekspresyonunu indüklediği gösterilmiştir (Renthal ve diğerleri, 2009). Bir histon deasetilazının uyarılması, çok sayıda genin ekspresyonunu eşzamanlı olarak düzenleme kabiliyetine sahip olacaktır. üzerinden kromatin yapısındaki global değişiklikler.

Katılan olası bir aday Cck BFosB aşırı ifadesini takiben düzenleme, AP-1 aile üyesi cFos idi. CFos'un ifadesi CREB (Sheng ve diğerleri, 1990; Impey ve diğerleri, 2004) ve cFos aşırı ekspresyonu (bağlanma ortağı cJun'un aşırı ekspresyonu ile uyumlu) artar Cck promotör etkinliği (Rourke ve diğerleri, 1999). Bu nedenle, kısa vadeli ΔFosB aşırı ekspresyonu nedeniyle artan CREB seviyeleri cFos seviyelerini arttırabilir ve Cck CRE benzeri site. cfos mRNA iki hafta ΔFosB aşırı ekspresyonunu takiben farelerde indüklenir (McClung ve Nestler, 2003) ve kronik kokain veya uzun süreli ΔFosB aşırı ekspresyonuna maruz kalan farelerde azalmış (Renthal ve diğerleri, 2008). Burada cFos'un doğrudan Cck Bununla birlikte, striatal dokudaki promotör ΔFosB aşırı ekspresyonu, bağlanmayı önemli ölçüde arttırmaz. Bu, cFos’un düzenleme ile ilgili olabileceğini gösterir. Cck Genel olarak ifade, sadece cFos'un bağlanmasındaki bir değişiklik ΔFosB’in düzenlediği mekanizma olabilir. Cck ifadesi. Bununla birlikte, ΔFosB'nin cFos'ta (örneğin değiştirilmiş fosforilasyon) translasyon sonrası değişiklikleri indüklemesi veya bir bağlayıcı partnerin (cJun gibi) veya ko-aktivatör proteininin ekspresyonunu indüklemesi mümkündür. Bununla birlikte, bozulmamış CRE benzeri bölge (daha önce AP-1 kompleksleri için bağlayıcı bir yer olduğu gösterilmiştir), bkz. Haun ve Dixon, 1990) artan için gerekli değildir Cck ΔFosB aşırı ekspresyonu ile görülen promoter aktivitesi (raportör gen deneylerimizde değerlendirildiği üzere), diğer trans-etkili faktörlerin de ΔFosB tarafından düzenlenmesinin nedenidir.

The Cck Lusiferaz raportör gen deneylerimizde kullanılan promotör fragmanı korunmuş bir Sp1 bağlanma bölgesi ve bir E-box içerir (Hansen, 2002 tarafından gözden geçirilmiştir). Özellikle, E-box dizilerinin çok sayıda transkripsiyon faktörünü bağladığı gösterilmiştir ( Forrest ve McNamara, 2004). PC12 hücrelerini kullanarak, E-box mutasyonunun azaldığını gördük. Cck promotör aktivitesi, ancak promotörün ΔFosB'ye verdiği cevabı değiştirmez (veriler gösterilmemiştir). İlginçtir ki, bir Cckhem CRE bölgesinde hem de E-box'ta mutasyon içeren lusiferaz raportörü saptanabilir bazal aktiviteye sahip değildir ve ΔFosB aşırı ekspresyonuna (yayınlanmamış gözlem) cevap vermez. BFosB aksiyonunun diğer potansiyel aracı Cck promotör, bazı formlarının striatumda kronik psikostimulan maruziyeti ile indüklendiği bilinen ATF'lerdir (Green ve arkadaşları, 2008). Bununla birlikte, bu ATF'lerin ΔFosB indüksiyonu için herhangi bir kanıt bulamadık (veriler gösterilmemiştir) ve ATF'lerin, mutasyona uğramış CRE-benzeri bölgeye bağlanması beklenmezdi. Cck promoteri.

Bu çalışmanın bir ihmali, ΔFosB'yi aşırı ifade etmek için bi-transgenik bir sistem kullandığımızdır ve bu nedenle bu paradigma ile kronik kokain uygulaması arasındaki paralelliklerin çizilmesinde muhafazakar olması gerekir. Bununla birlikte, 11A transgenik fareleri, aşırı ekspresyon bu beyin bölgesi ile sınırlı olduğundan, striatumdaki ΔFosB'nin spesifik etkilerine bakmak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır.Chen ve arkadaşları, 1998) kokain uygulaması, daha sonra, striatumu dolaylı olarak etkileyebilecek çok çeşitli diğer beyin bölgelerinde değişikliklere neden olur. Ayrıca, birkaç çalışma, kronik kokain ile tedavi edilen transgenik olmayan hayvanlara kıyasla, 11A farelerinde benzer davranışsal ve moleküler fenotipleri belgelemiştir (Kelz ve diğerleri, 1999; McClung ve Nestler, 2003; Renthal ve diğerleri, 2009). Bunlara ek olarak, Bibb ve diğ. (2001) benzer striatal düzeyleri bildirildi Cdk5 CDK11 hedeflerinde, p5 ve DARPP-35'teki benzer değişikliklerin yanı sıra, aynı 32A suşunda mRNA ve protein indüksiyonu ve ayrıca CDKXNUMX hedeflerindeki benzer değişikliklerle karşılaştırıldığında.

Sonuç olarak, kısa süreli ΔFosB ifadesinin, striatumda genlerin çoklu mekanizmalar yoluyla indüklenmesine yol açtığını tespit ettik. Bunlar arasında doğrudan promotör bağlanması, CREB proteini ve aktivitesinin uyarılması, henüz belirlenmemiş yolaklara ek olarak kromatin modifikasyonu bulunur.

DENEY PROSEDÜRLERİ

Hayvanlar

Bu çalışmada erkek bi-transgenik 11A hayvanları (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) kullanılmıştır ve Kelz ve diğerleri, 1999. ΔFosB'yi aşırı ifade etmek için fareler, 3 ve 6 arasındaki haftalar arasında doksisiklinden çıkarıldı, kontrol fareleri, doksisiklin üzerinde tutuldu. Tüm fareler grup içine yerleştirildi ve bir 12: 12 aydınlık / karanlık döngüsünde muhafaza edildi, 7 am'de yandı ve 7 pm'de yandı. ad lib yemek ve suya erişim. Tüm fare deneyleri, Dallas'taki University of Texas Southwestern Tıp Merkezi'nin hayvan bakımı ve kullanım komitesi tarafından onaylanan protokollerle uyumluydu.

Muhabir ve ekspresyon plazmitleri

Vahşi türü (WT) Cck promotör-lusiferaz raportörü, pGL200-luc vektörüne (Promega) yaklaşık olarak bir 3 bp PCR fragmanı eklenerek hazırlandı. Bu fragman, fare genomik DNA'sından (primer: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' yukarı ve 5 'TACCTTTGGATGGGGGAAATCG 3' akış aşağı) 'dan elde edildi ve başlangıçta pGEM-TX ProXAXA Vector vektörüne yerleştirildi. Ardından promotor fragmanı, pGL1360-luc'nin Kpn1 / Xho1 kısıtlama enzim bölgelerine klonlandı.

İçinde CRE nokta mutasyonu oluşturmak için Cck promoter, daha önce bildirilen CRE benzeri bir siteye yönelik bir mutajenik primer (sens primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisens primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3' ile Quikagen üretimi talimatı ile birlikte Quikagen üretimi talimatı 3.1 ') . Bu, bildirilen CRE benzeri siteyi (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC'ye dönüştürür. Tüm raportör plazmitleri, DNA sekanslama ile doğrulandı. ΔFosB ekspresyon plazmidi, pCDNA XNUMX'in çoklu klonlama sahasına yerleştirilmiş tam uzunlukta bir ΔFosB sekansı içerir ve daha önce tarif edilmiştir (Ulery ve Nestler, 2007).

Hücre kültürü ve DNA transfeksiyonu

Sıçan feokromositoma (PC12) hücreleri Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı F-12'de tutuldu, 10 ° C'de% 5 at serumu,% 1 fetal sığır serumu ve% 37 penisilin / streptomisin ile desteklendi.₂. Hücreler, 360 μg muhabir ve 350 μg ifade yapısı ile 0 mm boşluk küvetlerinde 850 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde BTX 800 elektroporatör (4V, 10 ohm ve 5 μF) kullanılarak elektroporasyon yoluyla transfekte edildi. Toplam DNA miktarlarını normalleştirmek için boş vektör plazmit (pCDNA) kullanıldı. Transfeksiyondan sonra hücreler, belirtilen miktarlarda 35 mm kolajen kaplı tabaklar üzerinde büyütüldü.

Lusiferaz tahlilleri

Transfeksiyondan iki veya üç gün sonra, hücreler Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde 3 kez yıkandı, lize edildi (25 mM glisilglisin, 15 mM MgSO kullanılarak₄, 4 mM EGTA,% 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT) toplandı ve santrifüjleme yoluyla temizlendi. 30 μL lisatı, 140 μL lusiferaz tahlil tamponu (25 mM glisilglisin, 15 mM MgSO ile birleştirildi.₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM potasyum fosfat, 1 mM koenzim A, pH 7.8). Lüminesans aktivitesi, çukur başına otomatik bir 800 μL 40 mM luciferin enjeksiyonundan sonra bir FLx-1 mikroplaka floresan okuyucusu kullanılarak ölçülmüştür. Lusiferaz aktivitesi, bir BioRad protein tahlili ile belirlenen toplam protein içeriğine normalleştirildi.

Elektroforetik mobilite kaydırma deneyi

Bi-transgenik 11A farelerden bilateral striatum dilimlerinin nükleer özleri (2 veya 8 hafta boyunca doksisiklin açık veya kapalı tutulduğu yerlerde) (McClung ve Nestler, 2003) göre hazırlanmıştır Huang ve Walters (1996). ³²P etiketli çift sarmallı oligonükleotit probları, Promega Gel Shift Assay sistem protokolü (#E3300) kullanılarak hazırlandı ve sondalar, Roche Quick Spin Kolonları kullanılarak saflaştırıldı. Konsensüs CRE ve AP-1 prob dizileri Promega'dan (sırasıyla #E328A ve E320B) ve Cck CRE dizileri (Cck-CRE sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisensi: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT) idi.

Promega Gel Shift Assay sistem prosedüründe (#E3300) modifikasyonlar kullanılarak bağlanma reaksiyonları ve elektroforez gerçekleştirildi. Etiketli probun 50,000 CPM'si, 10 stg striatal nükleer özü ile birleştirildi. Radyoaktif işaretlenmiş probların yerleştirilmesinden önce soğuk rakip DNA veya antikorları eklenmiştir. Süper vites deneyleri için, CREB antikorunun 2 μg'si (Upstate Biotechnology # 06-083) kullanıldı. Reaksiyonlar,% 4 poliakrilamid jelleri üzerinde elektroforezlendi, kurutuldu ve filme maruz bırakıldı (1 saat ila 2 günleri için yoğunlaştırıcı elekler kullanılarak).

Immunoblotting

PC12 hücreleri için, 35 mm'lik transfekte hücrelerin plakaları buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde yıkandı ve lizatlar, buz soğukluğunda RIPA liziz tamponunda (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA,% 1 deoksikolat, 1) hazırlandı. % Triton X-100,% 0.1 sodyum dodesil sülfat) içeren proteaz inhibitörleri. Sonikasyon, temizleme ve Bradford protein tahlilinden sonra, lizatlar tamamen denatüre edildi ve her numuneden 50 ug,% 10 SDS poliakrilamid jelleri üzerinde elektroforeze tabi tutuldu. Proteinler PVDF membranına aktarıldı,% 1 Tween-3 (TBS-T süt) içeren Tris tamponlu salin içinde% 0.1 yağsız kuru süt içinde 20 saat süreyle bloke edildi ve 4 ° C'de gece boyunca birincil antikorlar (CREB- 06: 083'de kullanılan Upstate Biotechnology # 1-1,000; TBS-T sütünde seyreltilmiş GAPDH-Sigma # G8795, 1: 80,000'de kullanılır. TBS-T'de çok sayıda yıkamadan sonra, lekeler, TBS-T süt içinde 1: 5,000 oranında seyreltilmiş alkalin fosfatazla konjuge sekonder antikorlar (Sigma) kullanılarak oda sıcaklığında bir saat boyunca incelenmiştir. Tris tamponlu salin içinde birçok yıkamadan sonra, renk reaksiyonu BioRad (# 170-6432) talimatlarına göre gerçekleştirildi. Membranlar gece boyunca kurutuldu, düz yataklı bir tarayıcıda tarandı ve ImageJ kullanılarak dansitometri gerçekleştirildi (aşağıya bakınız).

Striatal ekstreler için Western blot tahlilleri daha önce yayınlandığı gibi yapıldı (Hope ve diğerleri, 1994). Doku, dekapite edilmiş farelerden çıkarıldı, buza yerleştirildi ve 1 mm kalınlığında bir beyin matrisine kesildi. Doku zımbaları daha sonra alındı ve kullanılana kadar -80 ° C'de donduruldu. Doku, hem fosfataz hem de proteaz inhibitörlerini (Roche, Sigma) içeren modifiye edilmiş deterjan bazlı bir tamponda buz üzerinde sonikasyona tabi tutuldu. Sonikasyondan sonra, örnekler kaynar suda denatüre edildi ve 15,000 dakika boyunca 15xg'de santrifüjlendi; süpernatan daha sonra toplandı ve işlendi; Protein konsantrasyon miktarları daha sonra bir Bradford tahlili (Bio-Rad) kullanılarak ölçülmüştür. Numuneler% 10 akrilamid / bisakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı, bir PVDF zarına aktarıldı,% 5 süt içinde bloke edildi ve primer antikorlarla (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY) inkübe edildi. Lekeler daha sonra bir kemilüminesans sistemi (Pierce) kullanılarak görüntülendi. Tüm numuneler GAPDH'ye (Fitzgerald, Concord, MA) normalleştirildi. Testin doğrusal aralığında olduğumuzdan emin olmak için standart eğriler yapıldı.

Dansitometri analizi

PC12 immünoblotları için, densitometri analizi, rodbard kalibrasyonu ile ImageJ kullanılarak yapıldı. Her bir ölçümden ortalama arka plan sinyali çıkarıldı ve her bir örnek için CREB'nin GAPDH sinyaline oranı hesaplandı. Striatal immünoblotlar ve EMSA analizi için, arkaplan çıkarma işlemiyle Scion Image 1.62c kullanıldı.

Kromatin immüno-çökeltme (ChIP)

ChIP deneyleri yöntemlerine göre yapıldı Tsankova ve diğ. (2004) ve Kumar ve diğ. (2005). Kısaca, doksisiklin üzerinde veya dışında tutulan 11A farelerinden iki taraflı striatal numuneler,% 1 formaldehit ile çapraz bağlandı ve çapraz bağlama, glisin ile söndürüldü (nihai konsantrasyon 0.125 M). Bu numuneler, korteks çıkarılmış olarak, akümbens çekirdeği seviyesinde alınan tüm beyin dilimlerinden alındı. Kromatin, sonikasyon yoluyla yaklaşık 0.2 ila 1 kb fragmanlara kesildi, Protein G boncukları (Thermo Scientific # 22852) ile temizlendi ve -80 ° C'de dondurulmuş giriş örnekleri. Her çökeltme için 60 ile 100 ug arasında kromatin kullanıldı. Her bir birincil antikordan 5-10 ug kullanıldı (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, asetillenmiş H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metillenmiş H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Antikor-kromatin kompleksleri, üreticinin talimatlarına göre (Thermo Scientific # 22852) Protein G artı boncuklarla immüno-çökeltildi. Girdi ve çökelmiş numunelerin ters çapraz bağlanmasının ardından, her numune kantitatif PCR'ye (qPCR) tabi tutuldu. Tüm bu antikorların ChIP için kullanımı kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır (Tsankova ve arkadaşları, 2004; Kumar ve arkadaşları, 2005; Renthal ve diğerleri, 2009).

İlgili her gen promotöründe protein bağlanma seviyeleri, qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA) ile ilişkili DNA miktarının ölçülmesiyle belirlendi. Girdi veya toplam DNA (immüno-çökeltilmemiş) ve immüno-çökeltilmiş DNA, SYBR Green (Applied Biosystems, CA) varlığında üç kopya halinde çoğaltıldı. Her numuneden Ct değerleri, Dizi Dedektörü 1.1 yazılımı kullanılarak elde edildi. DNA şablonunun nispi nicelemesi ΔΔCt metodu (Tsankova ve arkadaşları, 2004). Kullanılan primerler: BDNF promotörü 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promotörü: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotörü: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodinorfin promotörü: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

istatistiksel analiz

Tüm veriler ortalama ± ortalamanın standart hatası olarak sunulur. İstatistiksel fark Student'ın iki kuyruklu t-testi ile belirlendi (p <0.05). Çoklu karşılaştırmalar yapıldığında, p değerleri Bonferroni düzeltmesi kullanılarak ayarlandı.

Teşekkür

Yardımcı tartışmalar için Will Renthal ve Arvind Kumar'a teşekkür ederiz. Ayrıca bu deneyleri finanse ettiği için NIDA'ya teşekkür ederiz.

Dipnotlar

Yayıncının Sorumluluk Reddi Beyanı: Bu, yayına kabul edilmiş, düzenlenmemiş bir el yazmasının PDF dosyasıdır. Müşterilerimize bir hizmet olarak el yazmasının bu ilk sürümünü sunuyoruz. Makalede, nihai alıntı şeklinde yayınlanmadan önce ortaya çıkan kanıtın kopyalanması, dizilmesi ve incelenmesi yapılacaktır. Lütfen, üretim sürecinde içeriği etkileyebilecek hataların ve dergiye uygulanan tüm yasal feragatlerin tespit edilebileceğini unutmayın.

Sınıflandırma şartları:

Bölüm: #1 Sinir sistemlerinin Hücresel ve Moleküler Biyolojisi

Referanslar

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. cAMP yanıt elemanı-bağlayıcı protein, bozulmamış dopamine bağlı gen ekspresyonu için gereklidir, ancak dopaminle işaretlenmiş striatumda olmaz. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Fırtına DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Çekirdekteki CREB aktivitesi, duygusal uyarıcılara karşı davranışsal tepkilerin kapılarını kabuk kontrolüne alıştırır. Proc Natl Acad Sci ABD A. 2002; 99: 11435 – 40. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Kokain muamelesi çekirdeğin içindeki hücre dışı kolesistokinin (CCK) artırır, uyanık, serbestçe hareket eden sıçanlar kabuğuna neden olur, kokaine davranışsal olarak duyarlılaştırılmış sıçanlarda bir etki yaratır. J. Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptonlar, siklik adenozin monofosfat tepki elemanı bağlayıcı faktörler yoluyla bağırsak kolesistokinin gen transkripsiyonunu uyarır. Endokrinoloji. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Kronik kokaine maruz kalmanın etkileri nöronal protein Cdk5 tarafından düzenlenir. Doğa. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. CREB transkripsiyon faktörünün hücre tipine spesifik olarak cAMP-cevap elemanına bağlanması. Proc Natl Acad Sci ABD A. 2004; 101: 13572 – 7. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Umut BT, Nestler EJ. Delta FosB ve FosB benzeri proteinlerin elektrokonvülsif nöbet ve kokain tedavisi ile düzenlenmesi. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N., Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Beyinde uyarılabilir, hedeflenmiş gen ekspresyonu olan transgenik hayvanlar. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Hipokampusta siklin bağımlı kinaz 5'in kronik elektrokonvülsif nöbetlerle indüklenmesi: ΔFosB'nin rolü. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Pek çok türde yakın karşılaşmalar: transkripsiyon düzenleme spesifikliğine aracılık eden Fos-Jun etkileşimleri. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Amfetamin ve dopamine nöronal adaptasyon: sıçan striatumda prodinosfin gen regülasyonunun moleküler mekanizmaları. Nöron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. STC-1 hücrelerinde PACAP ile CCK gen transkripsiyonunun kontrolü. Am J Physiol Gastrointest Karaciğer Physiol. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Sıçan striatumda kolesistokinin mRNA içeriğinin dopaminerjik düzenlenmesi. Beyin Res Mol Beyin Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. İd transkripsiyon faktörleri ailesi ve vasküler lezyon oluşumu. Arteriyosler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Cholesystokinin geninin protein hidrolizatları tarafından transkripsiyonel aktivasyonu için siklik AMP- ve kalsiyum bağımlı protein kinazların ko-gereksinimi. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
Yeşil TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Çekirdekte aktive transkripsiyon faktörlerinin (ATF'ler) ATF2, ATF3 ve ATF4 indüklenmesi ve duygusal davranışlarının düzenlenmesi. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Sıçan çekirdeğinde dopamin ve kolesistokinin taşması, akut ilaç uygulamasına yanıt olarak accumbens. Sinaps. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitojenle aktive olan protein kinaz ve protein kinaz A sinyal yolları, siklik adenozin 3 ′, 5′-monofosfat yanıt elementi bağlayıcı proteinin aktivasyonu yoluyla kolesistokinin transkripsiyonunu uyarır. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Nöronal kolesistokinin gen transkripsiyonunun düzenlenmesi. Scand J Klinik Lab Yatırım Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Kolesistokinin gen transkripsiyonu: promotor elementler, transkripsiyon faktörleri ve sinyal yolları. Peptidler. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl ve forskolin, CREB'nin ve ko-aktifleştirici CBP'nin koordinat aktivasyonu yoluyla kolesistokinin gen ekspresyonunu sinerjik olarak düzenler. J. Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Sıçan kolesistokinin geninin ekspresyonu için gerekli olan transkripsiyonel bir arttırıcı, insan c-fos geninin -296 elementine benzer bir sekans içerir. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Kahverengi JR, YeH, Saudou F., Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB geninin kronik elektrokonvülsif nöbetlerin moleküler, hücresel ve davranışsal eylemlerindeki temel rolü. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Meso-limbik nöronlarda dopamin ve CCK'nın bir arada bulunduğuna dair kanıt. Doğa. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
BT Umut, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Kronik elektrokonvülsif nöbet (ECS) tedavisi, beyinde değişmiş kompozisyon ve özelliklere sahip uzun ömürlü bir AP-1 kompleksinin ekspresyonu ile sonuçlanır. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
BT BT, Nye HE, Kelz MB, Öz DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Beyinde kronik kokain ve diğer kronik tedaviler tarafından değiştirilmiş Fos benzeri proteinlerden oluşan uzun ömürlü bir AP-1 kompleksinin uyarılması. Nöron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Sıçan striatumda AP-1 transkripsiyon faktörü DNA bağlama aktivitesinin dopaminerjik düzenlenmesi. Nörobilim. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Patron JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. CREB rejiminin tanımlanması: transkripsiyon faktörü düzenleyici bölgelerin genom çapında bir analizi. Hücre. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi Milletvekili, Moens U. CREB'i ne işe yarar? Hücre Sinyali 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. CCK (A) ve CCK (B) 'nin muhalif etkileri, sıçanlarda koşullandırılmış aktivitenin gelişimi üzerine baskı yapar. Davranış Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Sıçanlarda kokain tarafından üretilen şartlandırılmış aktivitenin elde edilmesine CCK (A) reseptörü katılımının kanıtı. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Öz DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Beyindeki deltaFosB transkripsiyon faktörünün ekspresyonu, kokaine duyarlılığı kontrol eder. Doğa. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal K, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Öz DW, Nestler EJ. Kromatin remodeling, striatumdaki kokaine bağlı plastikliğin altında yatan anahtar bir mekanizmadır. Nöron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N., Nagarkar D, Kreuter JD, Umut BT. Kokain ile duyarlılaştırılmış sıçanların çekirdeğindeki çekirdeklerde kokainin neden olduğu CREB fosforilasyonu, hücre dışı sinyale bağlı kinazın aktifleştirilmesiyle sağlanır, ancak protein kinaz A'nın etkisizleştirilmesi A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Gen ekspresyonu ve kokain ödülünün CREB ve DeltaFosB tarafından düzenlenmesi. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: Beyinde uzun süreli adaptasyon için moleküler bir anahtar. Beyin Res Mol Beyin Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Uzun süreli sinirsel ve davranışsal esnekliğin moleküler bir aracısı. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Bağımlılık için ortak bir moleküler yol var mı? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkripsiyonel bağımlılık mekanizmaları: DeltaFosB'in rolü. Philos Trans R Soc Lond B Biol Bilim. 2008; 363: 3245-55. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal K, Labirent I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Öz DW, Nestler EJ. DeltaFosB indüksiyonunun beyinde kötüye kullanılan uyuşturucularla belirgin özellikleri. Sinaps. 2008; 62: 358-69. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Kromatin yapısının genom çapında görünümü. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Renthal K, Carle TL, Labirent I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB, kronik amfetamin maruziyetinden sonra c-fos geninin epigenetik duyarsızlaştırılmasına aracılık eder. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Kiralık A, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Labirent I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Yığın, Kabbaj M, Nestler EJ. Kokain tarafından yapılan kromatin regülasyonunun genom çapında analizi, sirtuinler için bir rolü ortaya koymaktadır. Nöron. 2009; 62: 335-48. [PMC ücretsiz yazı] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Mesolimbic dopamin fonksiyonunun kolesistokinin modülasyonu: motive olmuş davranışların düzenlenmesi. Farmakol Toksikol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Kolesistasinin gen promotöründe yan yana E-box ve cAMP / TPA'ya duyarlı elemanlar arasındaki negatif işbirliği. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Fırtına D, Nestler EJ. Naltreksonla çökeltilmiş morfin çekilmesi sırasında CRE aracılı transkripsiyonun bölgesel ve hücresel haritalaması. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Fırtına D, Nestler EJ. Fare beyninde CRE aracılı transkripsiyonun amfetamin tarafından düzenlenmesi. Sinaps. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membran depolarizasyonu ve kalsiyum, transkripsiyon faktörü CREB'nin fosforilasyonu yoluyla c-fos transkripsiyonunu indükler. Nöron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Akut ve kronik elektrokonvülsif nöbetler sonrası sıçan hipokampüsündeki gen promotör bölgelerindeki histon modifikasyonları. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. DeltaFosB transkripsiyonel aktivitesinin Ser27 fosforilasyonuyla düzenlenmesi. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Çekirdek, psikostimulan ödülü ve ilgili davranışlarda dopamin-CCK etkileşimlerini tetikler. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Çekirdekteki BFosB için önemli bir rol morfin eyleminde rol oynar. Nature Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]