Özet
Çekirdek accumbens (NAcc) 'de dopaminosiseptif nöronlardaki dendritik dikenlerin psikostimulan kaynaklı uyarısı, uzun süreli bağımlılık davranışlarına bağlı adaptif bir nöronal yanıt olarak varsayılmıştır. NAcc, büyük ölçüde, dopamin D1 veya D2 reseptörlerinin yüksek seviyelerini ifade eden, orta büyüklükte sivri nöronların iki farklı alt popülasyonundan oluşur. Bu çalışmada, NAcc'de belirgin D1 veya D2 reseptörü içeren orta büyüklükte dikenli nöronlarda kronik kokain tedavisinden sonra dendritik omurga yoğunluğunu analiz ettik. Bu çalışmalar, D1 veya D2 reseptör promotörünün (Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP) kontrolü altında EGFP'yi eksprese eden transgenik farelerden faydalandı. 28 günlük kokain tedavisi ve 2 günlük geri çekme günlerinden sonra, hem Drd1-EGFP- hem de Drd2-EGFP-pozitif nöronlarda omurga yoğunluğu artmıştır. Bununla birlikte, omurga yoğunluğundaki artış, ilacın kesilmesinden sonraki yalnızca Drd1-EGFP-pozitif nöron 30 günlerinde sürdürüldü. Özellikle, XDUMX-EGFP- ve Drd1-EGFP-pozitif nöronlarda, 2 günlük ilaç geri çekilmesinden sonra ancak sadece Drd2-EGFP-pozitif nöronlarda, ancak sadece 1 günlük ilaç geri çekilmesinden sonra gözlenmiştir. Bu sonuçlar, kronik kokain tedavisinden sonra gözlemlenen artmış omurga yoğunluğunun sadece D30 reseptörü içeren nöronlarda stabil olduğunu ve ΔFosB ifadesinin, D1'taki dendritik dikenlerin yanı sıra D1 reseptörü içeren nöronların korunması ile ilişkili olduğunu göstermektedir NAcc.
Mesolimbik dopaminerjik yol, ventral tegmental alanda, çekirdek akumbensleri (NAcc), koku alma tüberkülünü, prefrontal korteksi ve amigdalayı bozan nöronlardan oluşur.1), persia nigra'daki (pars compacta) nigrostriatal dopaminerjik nöronlar dorsal striatuma (yükselen bir çıkıntı) sağlarlar (2). Psikostimülanlar, sinir terminallerinden dopamin salınımını teşvik ederek, sinaptik yarıktan ve amfetaminden dopamin alımını bloke ederek NAcc: kokaindeki sinaptik konsantrasyonlarını yükseltirler (3-5). Tekrarlanan, aralıklı psikostimulanların uygulanması, bu ilaçların akut uyarıcı etkilerine karşı artan davranışsal tepkiler (duyarlılık) ile sonuçlanır (6-8). Birçok kanıt dizisi, ventral tegmental alanda – NAcc dopaminerjik sistemdeki uyarlanabilir değişikliklerin, ilaca bağlı davranışların altında yatan deneyime bağlı plastiklikteki değişikliklerin merkezinde bulunduğunu göstermektedir.
Dopamine ek olarak, psikostimulanlara yanıt olarak davranışsal duyarlılığın gelişmesi için glutamat gereklidir (9, 10). Ventral striatumdaki orta büyüklükte dikenli nöronlar (MSN'ler), dendritik dikenlerin başlarına sineklenen prefrontal korteksten uyarıcı glutamaterjik projeksiyonlar alır. MSN'ler ayrıca omurga boyunlarına sinoplayan dopaminerjik aksonların ana hedefidir (1, 11, 12). Bu nedenle, MSN'lerdeki dendritik dikenler, dopaminerjik ve glutamaterjik iletimin başlangıçta entegre edildiği hücresel bölmeyi temsil eder.
Dopamin, iki ana reseptör alt familyasına, D1 alt ailesine (D1 ve D5 alt tipleri) ve D2 alt ailesine (D2, D3 ve D4 alt tipleri) etki eder.13). Dorsal striatumda, anatomik çalışmalar, striatonigral MSN'lerin yüksek seviyede D1 reseptörleri (P ve dynorphin maddesiyle birlikte) içerdiğini, striatopallidal MSN'lerin ise ağırlıklı olarak D2 reseptörleri (enkefalin ile birlikte) eksprese ettiğini göstermiştir.14-17). NAcc'den gelen tahminler, dorsal striatumdan daha karmaşıktır; NAcc'nin kabuk ve çekirdek kısımları, ventral pallidumun farklı alt bölgelerine ve ventral tegmental alana ve vaktinde nigra'ya ayrılır.18). D2 reseptörleri ve enkefalin ventral palliduma projeksiyonlarda yüksek oranda ifade edilirken, D1 reseptörleri ve P maddesi ventral pallidum ve ventral tegmental alana projeksiyonlarda eşit olarak dağılmış olarak bulunur (P).19). D1 veya D2 reseptörleri için seçici olan agonistlerin ve antagonistlerin çalışmaları, hem D1 hem de D2 reseptörlerinin, psikostimulan bağımlı davranış değişiklikleri için gerekli olduğunu gösterdi (20-25). Bununla birlikte, bu reseptörlerin rolleri farklı görünmektedir. Örneğin, D1 reseptörlerinin uyarılması, kokain primer enjeksiyonları ve kokaine bağlı çevresel işaretler tarafından indüklenen kokaini hafifletirken, D2 reseptörlerinin uyarılması, kokaine bağlı geri kazanımı kolaylaştırır (26-28).
Psikhostimulan bağımlılığı ile ilişkili davranışsal anormallikler son derece uzun ömürlüdür. Bu nedenle, dopamin ve glutamat tarafından düzenlenen nöronal devrelerde moleküler ve yapısal seviyedeki uzun süreli ilaca bağlı değişiklikleri belirlemeye büyük ilgi gösterilmiştir (29-32). Özellikle, kokaine veya amfetamine uzun süre maruz kalmanın NAcc'deki dendritik dallanma noktalarının ve dikenlerin sayısını arttırdığı bulunmuştur (33-35). Bu yapısal değişikliklerin, son ilaç maruziyetinden sonraki ≈1 – 3.5 aya kadar sürdüğü gösterilmiştir (30, 35) ve psikostimulanın maruz kalmasıyla ilişkili sinaptik plastisitede uzun süreli değişikliklerin altında durduğu ileri sürülmüştür.
Bu çalışmanın amacı, D1 veya D2 reseptörlerini eksprese eden akümülatör MSN'lerin alt popülasyonlarında kokaine bağlı yapısal dendritik omurga değişikliklerini incelemektir. Bu çalışmalarda, EGFP'yi D1 (Drd1-EGFP) veya D2 (Drd2-EGFP) dopamin reseptör promotörünün (DrdXNUMX-EGFP) kontrolü altında eksprese eden bakteri yapay kromozom (BAC) transgenik farelerini kullandık36). Sonuçlar, başlangıçta D1 reseptörü içeren MSN'lerde ve D2 reseptörü içeren MSN'lerde başlangıçta artan omurga yoğunluğu olmasına rağmen, değiştirilmiş omurga yoğunluğunun sadece D1 reseptörü içeren nöronlarda stabil olduğunu gösterir. Dahası, ΔFosB transkripsiyon faktörü ekspresyonunda da benzer değişiklikler bulduk, bu da ΔFosB'nin NAC'de D1 reseptörü içeren nöronların yanı sıra D2'ta dendritik dikenlerin oluşumunda ve / veya korunmasında rol oynayabileceğini öne sürüyor.
Sonuçlar
Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP BAC Transgenik Farelerde MSN'lerin Analizi.
Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP BAC transgenik farelerinde dorsal ve ventral striatumdan MSN'lerin projeksiyon paterni, GFP ekspresyonunun analizi ile karakterize edilmiştir (36). Dorsal striatumun MSN'lerinde GFP'nin diferansiyel ifadesi, genellikle sırasıyla endojen D1 veya D2 reseptörlerine karşılık gelir (36). Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP farelerinde NAcc'de GFP'nin diferansiyel ekspresyonunu ayrıca analiz ettik (İncir. 1a ve b). NAcc'deki nöronların ≈58% 'i, Drd1-EGFP farelerinde GFP ifade etmesine rağmen (İncir. 1a), NAcc'deki nöronların UM48'i, Drd-2-EGFP farelerinde GFP'yi eksprese etti (İncir. 1b). MSN'ler, NAcc'deki tüm nöronların% 90 – 95'ini temsil eder (12, 37). D1 reseptörleri sadece MSN'lerde, D2 reseptörleri ise MSN'lerde ve striatal nöronların% 1 – 3'ini temsil eden kolinerjik internöronlarda eksprese edilir (37). Bu faktörler dikkate alındığında, sonuçlar, minimal olarak, NAcc'deki MSN'lerin% ≈10 – 15’inin hem D1 hem de D2 reseptörlerini ifade etmesinin muhtemel olduğunu göstermektedir.
Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP Farelerinde Dendritik Diklerin Analizi.
Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP farelerinde GFP ekspresyonu, nöronal hücre gövdelerinin boyanmasında faydalı olmuştur. Bununla birlikte, dendritlerdeki ve dendritik dikenlerdeki GFP sinyali, anti-GFP antikorlarıyla immüno-lekelemeden sonra analizlerine izin vermek için çok zayıftı. Parçacık aracılı flüoresan boyaların balistik teslimi yakın zamanda nöronal popülasyonları hızlı ve etkili bir şekilde etiketlemek için kullanılmıştır (38). Tüm nöronlar bu teknik kullanılarak etiketlenebilir ve yöntem Golgi-Cox boyama ile karşılaştırılabilir görünmektedir. NAcc'de nöronların dendritik morfolojisini analiz etmek için, sabit akümülasyon dilimleri, bir gen tabancası kullanılarak lipofilik floresan boya 1,1-diotadesil-3,3,3 x, 3-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) ile etiketlendi. DiI-lekeli bir MSN örneği gösterilmiştir. İncir. 1c. Kullanılan koşullar altında, diğer etiketli nöronların üst üste binen dendritleri olmadan etiketli nöronları gözlemledik. Daha yüksek büyütmede, dendritik dikenleri içeren ayrıntılı dendritik morfoloji gözlenebilir (İncir. 1d).
Daha sonra, GFP için Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP transgenik farelerinde DiI etiketleme ve immünohistokimya kombinasyonunu kullandık; bu, doku geçirgenliği için düşük bir konsantrasyonda deterjan kullanılarak mümkün hale getirildi (bkz. Yöntemler). MSN'lerin hücre gövdelerinde DiI lekesi ve GFP ifadesinin dikkatlice karşılaştırılması yoluyla, Drd1-EGFP'deki DiI ve GFP pozitif veya DiI pozitif ve GFP negatif nöronları tanımlayabildik (İncir. 2a) veya Drd2-EGFP (İncir. 2b) fareler. Aşağıdaki çalışmalar için, Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP farelerinden sadece DiI ve GFP-pozitif nöronlardaki dendritik morfolojiyi analiz ettik.
Kronik Kokain Tedavisi, Drd1-EGFP ya da Drd2-EGFP'yi İfade Eden Accumbal MSN'lerde Artmış Omurga Yoğunluğu ile sonuçlanır.
Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP farelerine arka arkaya dört hafta boyunca art arda kokain (30 mg / kg) veya salin enjekte edildi (bkz. Yöntemler). Son ilaç tedavisinden sonra iki gün (2WD) veya 30 gün (30WD), beyin yukarıda tarif edildiği gibi DiI etiketleme ve immünohistokimya için işlendi. Daha önce yapılan bir çalışmada, amfetaminle yapılan kronik tedavinin, NAcc'de MSN'lerin distalde değil proksimal dendritlerinde omurga yoğunluğunu arttırdığı bildirilmiştir.35). Bu nedenle, analizimizi, terminal bölgeler dahil olmak üzere distal dendritler (yani, ikinci veya üçüncü dereceden dalları olanlar) ile sınırlandırdık. 2WD'de analiz edildiğinde, Drd1-EGFP pozitif MSN'lerde omurga yoğunluğu arttığı bulundu (salin grubunun% 128'u) (İncir. 3a ve c) ve Drd2-EGFP-pozitif nöronlarda daha az oranda (salin grubunun% 115) (İncir. 3 b ve d). 30WD'den sonra, artmış omurga yoğunluğu Drd1-EGFP-pozitif nöronlarda (salin kontrolünün% 118'i) korundu (İncir. 3 a ve c) fakat Drd2-EGFP pozitif nöronlarda (İncir. 3 b ve d).
Dendritik dikenlerin morfolojisi uzunlukları ve omurga başının genişliği bakımından değişkendir. Bu nedenle dendritik çıkıntıları 2WD'de kokainden dört omurga sınıfına (güdük, mantar, ince ve filopodia) ayırdık (veriler gösterilmemiştir). Mantar türü yoğunluğu (119.7 ± 4.0%, P <0.01) ve ince dikenler (120.0 ± 3.4%, P Drd0.01-EGFP pozitif MSN'lerde kokain tedavisi ile <1) artarken, güdük yoğunluğu (% 182.4 ± 21.6, P <0.05) ve mantar dikenleri (122.5 ± 5.0%, P <0.01), Drd2-EGFP-pozitif MSN'lerde artmıştır. Drd1-EGFP-pozitif nöronlarda kısa dikenlerde veya Drd2-EGFP-pozitif nöronlarda ince dikenlerde önemli bir artış yoktu.
Kronik Kokain, NAcc'de Drd1-EGFP- veya Drd2-EGFP-Pozitif MSN'lerde BFosB İfadesini Etkiler.
OsFosB Fos transkripsiyon faktörleri ailesinin bir üyesidir. Akut kokain uygulaması, NAcc'de birkaç Fos izoformunun hızlı ve geçici bir indüksiyonunu indüklemesine rağmen, tekrar tekrar kokaine maruz kalma, ΔFosB seviyesini arttırır. Ayrıca, BFosB ifadesindeki artış, ilaca maruz kalmasının sona ermesinden sonra haftalar veya aylar boyunca NAcc'de devam eder ve ilaç alımının kesilmesinden sonra bile, uzun süreli gen ekspresyonunun düzenlenmesinde yer aldığı ileri sürülmüştür (29, 39, 40).
CcFosB'nin NAcc'de Drd1-EGFP veya Drd2-EGFP farelerinden DcXXUMUM-EGFP veya DrdXNUMX-EGFP farelerinden indüksiyonunu incelemek için, çift etiketleme ile FosB ve GFP ekspresyonunu analiz ettik (İncir. 4 ve Tablo 1) Anti-FosB antikoru, FosB'in tüm formlarını tanır, ancak artan immünostain'in ΔFosB'yi temsil ettiğini varsayıyoruz (bkz. Yöntemler daha fazla tartışma için). Salinle tedavi edilen farelerde, Drd16-EGFP-pozitif nöronların% 1'i ve Drd15-EGFP-pozitif nöronların% 2'i nispeten zayıf bir yoğunlukla FosB immüno-reaktivitesini ifade etmişlerdir (İncir. 4 a ve b ve Tablo 1). Tekrarlayan kokain tedavisi ve ardından 2WD, ΔFosB'yi ifade eden Drd1-EGFP-pozitif nöronların sayısında önemli bir artışa neden oldu (GFP-pozitif nöronların% 55'i) (İncir. 4c ve Tablo 1). Drd2-EGFP-pozitif nöronlarda ΔFosB ekspresyonunda daha küçük fakat yine de önemli bir artış bulundu (GFP-pozitif nöronların% 25'i) (İncir. 4d ve Tablo 1). Omurga yoğunluğundaki değişikliklerde olduğu gibi, artmış ΔFosB ekspresyonu Drd1-EGFP-pozitif nöronlarda (GFP-pozitif nöronların% 46'inde) ancak Drd2-EGFP-pozitif nöronların (15'in% GFP-pozitif nöronlarında) tutulmamıştır 30WD (İncir. 4 e ve f ve Tablo 1). Artan ΔFosB ifadesinde gözlenen dikkat edin İncir. 4f Drd2-EGFP negatif nöronlarda bulunur.
Tartışma
Dopaminerjik nörotransmisyonda uzun süreli adaptasyonların, psikostimulan ilaçlarla ilişkili bağımlılık davranışlarının altında olduğuna inanılmaktadır. Özellikle, NAcc'deki MSN'lerin dendritik omurga yoğunluğundaki psikostimulanın neden olduğu artışların, sinaptik bağlantının yeniden organize edilmesine bağlı olduğu varsayılmıştır (30). NAcc, büyük ölçüde, ya D1 veya D2 dopamin reseptörlerinin yüksek seviyelerini ifade eden iki farklı MSN alt popülasyonundan oluşur. Bu çalışmada, kronik kokain tedavisinden sonra NAcc'de belirgin D1 veya D2 reseptör içeren MSN'lerde omurga yoğunluğunu analiz ettik. Elde edilen sonuçlar, başlangıçta artmış omurga yoğunluğu başlangıçta D1 reseptörü içeren MSN'lerde ve D2 reseptörü içeren MSN'lerde meydana gelmesine rağmen, değiştirilmiş omurga yoğunluğunun sadece D1 reseptörü içeren nöronlarda stabil olduğunu göstermektedir. Dahası, D1 ve D2 reseptörü içeren MSN'lerde ΔFosB transkripsiyon faktörü ekspresyonunda benzer bir değişiklik paterni bulduk.
Bu çalışmalar, D1 veya D2 reseptör promotörünün kontrolü altında MSN'lerin spesifik alt popülasyonlarında GFP'yi eksprese eden BAC transgenik farelerini kullandı. Dahası, GFP için immünohistokimyayı DiI kullanarak nöronların balistik etiketlemesi ile birleştiren bir çift etiketleme yöntemi geliştirdik. Önceki çalışmalar, psikotik uyarıcıların omurga yoğunluğu üzerindeki etkisini analiz etmek için Golgi-Cox yöntemini kullandı (34) ve burada kullanılan DiI metodu, nicel olarak karşılaştırılabilir sonuçlar verdi. Çift etiketleme yöntemini geliştirdik, çünkü Golgi boyaması immünohistokimya ile uyumlu değil. İmmün boyama genellikle, genellikle lipofilik boyaların zardan çözünmesine yol açan bir işlem olan deterjanlarla doku geçirgenliğini gerektirir (38). Bununla birlikte, mevcut çalışmalarımızda, GFP immün boyama doku geçirgenliği için yüksek konsantrasyonda bir deterjan gerektirmedi ve bu nedenle lipofilik boya etiketlemesi ile birlikte kullanılabilir. Çift etiketleme yöntemimiz, dendritik dikenlerdeki yapısal değişikliklerin çalışmaları için, örneğin GFP'nin kortekste spesifik nöron popülasyonlarında eksprese edildiği BAC transgenik fare çizgilerinin analizi için kullanıldığında genellikle yararlı olmalıdır (36).
Yine de biraz tartışmalı olsa da, D1 ve D2 reseptörlerinin büyük ölçüde sırasıyla doğrudan (striatonigral) ve dolaylı (striatopallidal) striatal projeksiyon nöronlarına anatomik olarak ayrıldığına inanılmaktadır (17, 41). Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP farelerinde GFP'nin lokalizasyonunun ilk karakterizasyonu, bu sonuç ile tutarlıydı (36). Üstelik, Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP farelerinden NAcc'deki GFP-pozitif nöron sayısı analizimiz, MSN'lerin% XXUMUM'unun sadece D50 reseptörlerini ifade ettiği, yalnızca X1 –35% 'nin sadece D40 reseptörlerini ifade ettiği sonucuna vardığı sonucuna varmıştır. ve ≈2 - 10% hem D15 hem de D1 reseptörlerini birlikte ifade eder. Bu ekspresyon ifadesinin değeri, mRNA'ları izole etmek ve büyütmek için tek striatal nöronların yama-kelepçe analizini RT-PCR teknikleriyle birleştiren dorsal striatum çalışmalarının ima ettiğiyle benzerdir (ep2% enkephalin ve P maddesinin birlikte sentezlenmesi) (42). Mevcut çalışmalarımızın D3, D4 ve D5 reseptörlerinin ekspresyonu sorusuna değinmediği ve yüksek düzeyde D1 reseptörlerini eksprese eden MSN'lerde düşük seviyelerde D2 reseptörlerinin ekspresyonunu veya bunun tersini ifade etmediği belirtilmelidir.
Daha önce yapılan birkaç çalışma, psikostimulan kaynaklı Fos ifadesinin nöronal lokalizasyonunu ve D1 ve D2 reseptörlerinin rolünü incelemiştir (43-45). Bu çalışmalar, Fos ve ΔFosB indüksiyonunun D1 reseptörlerinin aktivasyonuna aracılık ettiği sonucunu destekledi. Bununla birlikte, Fos ekspresyonunun hücresel lokalizasyonu, psikostimulan ilaçların uygulandığı çevresel bağlamdan etkilenir (46, 47). Örneğin, ev kafesinde verilen amfetamin veya kokain, D1 reseptörlerini eksprese eden P-pozitif hücrelerde tercihli olarak hemen erken genleri (Fos dahil) indükler. Buna karşılık, bu ilaçlar, yeni bir ortamda tatbik edildiklerinde hem D1 hem de D2 reseptör içeren MSN'lerde Fos ifadesini indükleyebilir. Mevcut çalışmalarımızda kullanılan protokol, yeni bir ortama maruz kalmayla eşleştirilen ilaç enjeksiyonunu içermiyordu. Bununla birlikte, D2 reseptörü içeren MSN'lerde ΔFosB ifadesinden sorumlu olan bir tür bağlama bağımlı stresi ekarte edemeyiz.
Mevcut sonuçların göze çarpan bir özelliği, artan omurga yoğunluğunun ve BFosB ifadesinin paralel modeliydi. Artmış omurga yoğunluğu ve ΔFosB ifadesi başlangıçta Drd1-EGFP ve Drd2-EGFP ifade eden MSN'lerde ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu değişiklikler sadece D1 reseptörü içeren nöronlarda stabildi. Artmış omurga yoğunluğu ve ΔFosB ekspresyonunun gözlemlenmesi için olası bir açıklama, D2 reseptörü içeren nöronlarda geçici olarak bulunmuş olması, bunun hem D1 hem de D2 dopamin reseptörlerini birlikte eksprese eden MSN'lerin küçük bir kısmında meydana gelmesidir. Dolayısıyla, bu artışların geçici doğası, D2 bağımlı aktivasyonunun D1 bağımlı sinyalleşme yolları üzerindeki antagonistik etkileriyle ilişkilendirilebilir (48). Omurga yoğunluğu ve ΔFosB ifadesindeki değişikliklerin, D2 reseptörüne bağlı sinyal yollarının ΔFosB'nin stabilitesini etkileme kabiliyetini yansıtabilen tersinir olması ilgi çekicidir.
ΔFosB ve omurga yoğunluğunun ifadesinde paralel değişiklikler olduğu gözlemi, ΔFosB'nin NAcc'de D1 reseptörü içeren nöronlardaki dendritik dikenlerin ilk oluşumunda ve müteakip bakımında yer aldığı fikri ile tutarlıdır. BFosB ifadesi, MSN’lerde D1 / DARPP-32 / PP1’e bağımlı sinyal yolu ile kontrol edilir (49). Bazı çalışmalar, ΔFosB’in psikostimulanların ödüllendirici ve lokomotorla harekete geçirici eylemlerinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir.39muhtemelen nörotransmitter reseptörleri, sinyal proteinleri ve nöronal morfolojinin düzenlenmesinde rol oynayan proteinleri içeren çoklu genlerin ekspresyonunu etkileyerek (50). Bununla birlikte, kronik kokainin neden olduğu omurga oluşumunda yer alan spesifik moleküler mekanizmalar şu anda bilinmemektedir. Daha önce yaptığımız çalışmalarda Cdk5 inhibitörü roscovitine bağlı zayıflatılmış kokaine bağlı infüzyonun omurga yoğunluğunda arttığını göstermiştir (51). Ayrıca, Cdk5 ΔFosB için aşağı akış hedef genidir ve kronik kokain tedavisiyle ilişkili telafi edici adaptif değişikliklere dahil edilmiştir (52). Bu nedenle, Cdk5'e bağlı fosforilasyonda değişiklik, kokainin neden olduğu omurga oluşumunun ve / veya omurga stabilitesinin altında yatan makul bir mekanizmadır. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) ve spinophilin (56) Cdk5 için substratlardır ve hepsi omurga morfogenezinin düzenlenmesinde rol oynar (57-60). Bu ve diğer Cdk5 substratlarının dikenlerdeki daha fazla karakterizasyonu umarım omurga oluşumunun psikostimulanlarla düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmalara ışık tutacaktır.
Yöntemler
Hayvanlar.
D1 veya D2 dopamin reseptörlerinin kontrolü altında bir EGFP transgenini taşıyan fareler, Gensat BAC transgenik projesi (36). Bu çalışmada kullanılan transgenik fareler haftalık 4-5 idi ve İsviçre-Webster arka planındaydı. Fareler bir 12: 12-h ışık / karanlık döngüsünde tutuldu ve 2-5 gruplarında, yiyecek ve su temin edilebilen ad libitum ile muhafaza edildi. Tüm hayvan protokolleri, Laboratuar Hayvanlarının Bakım ve Kullanımı Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzuna uygun olarak ve Rockefeller Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
İlaç tedavisi.
Kronik kokain tedavisinin (günlük 30 mg / kg, günlük), NAcc'nin hem çekirdeğindeki hem de kabuğundaki sıçandaki omurga yoğunluğunda sağlam bir artış sağladığı, ancak düşük dozda (15 mg / kg) sadece Deniz kabuğu (61). Bu nedenle NAcc'nin her iki bölgesinde yapısal değişiklik yapmak için daha yüksek dozda kokain kullandık. Farelere, 30 ardışık günler için her gün bir enjeksiyon (ip) 5 mg / kg kokain-HCl (veya salin), ardından 2 enjeksiyonsuz günler uygulandı ve bu prosedür, ardışık 4 haftalar boyunca tekrarlandı. Enjeksiyonlar ev kafesinde yapıldı. 2WD veya 30WD, fare beyinleri, DiI etiketleme ve / veya immünohistokimya için işlendi.
Floresan Boya DiI ile Balistik Etiketleme.
Farelere 80 mg / kg sodyum pentobarbital ile anestezi uygulandı ve 5 ml PBS ile transkardiyal olarak perfüze edildi, ardından PBS (40 ml / dak) içinde 4 ml% 20 paraformaldehit ile hızlı perfüzyon yapıldı. Beyinler kafatasından hızlı bir şekilde çıkarıldı ve 4 dakika boyunca% 10 paraformaldehit içine tekrar yerleştirildi. Beyin dilimleri (100 μm), referansta tarif edildiği gibi flüoresan boya Dİ (Moleküler Problar) balistik teslimi ile etiketlendi. 38. Düşük bir deterjan konsantrasyonu ile birleştirilmiş bir DiI etiketleme-immünohistokimya yöntemi geliştirilmiştir. DiI etiketli bölümler, 0.01 dakika boyunca PBS içinde% 100 Triton X-15 ile geçirgenleştirildi ve daha sonra spesifik olmayan etiketlemeyi en aza indirmek için 0.01 dakika boyunca PBS içinde% 100 Triton X-10 ve% 1 normal X keçe serumu içinde 1 h için inkübe edildi. Doku bölümleri daha sonra, oda sıcaklığında 0.01 saat için% 100 normal keçi serumu / 2% Triton X-1 ve anti-GFP antikoru (Abcam, Cambridge, MA) ile inkübe edildi, yıkandı ve bir 1,000: XNUMX FITC- seyreltisi içinde inkübe edildi konjuge sekonder antikor (Moleküler Problar). Kesitler mikroskop lamlarına yerleştirildi ve montaj ortamı ile kapatıldı. Balistik etiketleme yöntemi, dendritik omurga yapısının ayrıntılı analizini mümkün kıldı ve elde edilen sonuçlar, sıçan beyin dilimlerinde Golgi-Cox emprenye yöntemi kullanılarak önceki çalışmalarla nitel ve nicel olarak karşılaştırılabilir (34). Bununla birlikte, önceki çalışmaların aksine, DiI ile boyanmış nöronlarda iki başlı dikenleri nadiren gözlemledik. Bu fark, boyama yöntemlerinin duyarlılığından veya farenin (bu çalışma) sıçan dokusundan (bu çalışma) değişkenliğinden kaynaklanabilir.34).
İmmünohistokimya.
Hayvanlar anestezi uygulanmış ve yukarıda anlatıldığı gibi perfüze edilmiştir. Beyin çıkarıldı ve gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde saklandı. Beyinler, kriyoproteksiyon için PBS çözeltisinde% 30 sukroz içerisine aktarıldı. Koronal bölümler (12 μm) dondurucu bir mikrotom (Leica) üzerinde kesildi ve sonra immünohistokimya için işlendi. Beyin bölümleri daha sonra 0.3 dakika boyunca PBS içinde% 100 Triton X-15 içinde geçirgenleştirildi ve iki kez PBS içinde durulandı. Kesitler, 10 ° C'de 1 h için PBS'deki% 37 normal keçi serumu içinde önceden inkübe edildi, birincil antikorlara (PBS'de% 1 normal keçi serumu içinde seyreltildi) bir gece boyunca 4 ° C'de kuluçkalandı ve daha sonra PBS içinde durulandı ve sekonder ile kuluçkalandı. 1 ° C'de 37 h için antikorlar. Aşağıdaki antikorlar kullanıldı: tavşan anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biyoteknoloji), fare anti-NeuN (Chemicon), tavşan anti-GFP, FITC-konjüge anti-tavşan IgG ve rodamin konjuge anti-fare IgG (Moleküler Problar). Üçlü etiketleme için (BFosB, NeuN ve GFP), beyin bölümleri önce anti-pan FosB antikoru ve anti-NeuN antikoru ile immüno-lekelendi ve daha sonra sekonder antikorlarla (rhodamine konjuge anti-tavşan IgG ve siyan-konjuge anti-fare IgG ile inkübe edildi) ). Çift lekeli beyin bölümleri ayrıca Zenon etiketleme teknolojisi (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes) kullanılarak GFP immüno lekelenmesi için işlendi. Anti-pan-FosB antikoru, FosB'nin N terminusuna yükseltildi ve ΔFosB ve tam uzunlukta FosB'yi tanıdı (62). BFosB'nin FosB ya da Fos ile ilgili olmayan diğer antijenlerin, kronik kokain tedavisinden sonra kararlı bir şekilde eksprese edildiğini gösteren önceki çalışmalara dayanarak, immünoreaktivitedeki uzun süreli artışların osFosB'nin stabil ekspresyonunu temsil ettiğini varsayıyoruz. Bununla birlikte, salinle tedavi edilmiş farelerde gözlemlenen immünoreaktif FosB sinyalinin kimliği bilinmemektedir. İstatistiksel analiz Tablo 1 öğrencinin kullandı t testi.
Dendritik Omurga Analizi.
NAcc'deki bireysel MSN'ler, çeşitli kriterlere dayanarak omurga analizi için seçildi. (i) Farklı hücrelerden gelen işlemlerin karıştırılmaması için diğer etiketli hücrelerle üst üste binme veya hiç çakışma olmadı. (iiEn az üç primer dendritin analiz için kullanılacak hücrelerin görünmesi gerekiyordu. (iii) Distal dendritler (terminal dendritler veya terminal dendrite yakın) incelendi. NAcc'nin hem çekirdeğindeki hem de kabuğundaki MSN'lerden dendritler analiz edildi. Seyrek dikenli MSN'leri (dikenli tip II) gözlemlememize rağmen, sadece yoğun şekilde dikenli MSN'leri (dikenli tip I) analiz ettik. Omurga yoğunluğunu hesaplamak için, bir yağ daldırma lensi (x 20) ile eş odaklı bir mikroskop (Zeiss LSM 510) kullanılarak bir dendrit uzunluğu (> 40 um uzunluğunda) izlendi. Dendritlerin tüm görüntüleri farklı z dendritik dikenlerin morfolojisini incelemek için seviyeleri (0.5 – 1 depthm derinlik aralıkları). Tüm ölçümler metamorph görüntü analiz yazılımı (Universal Imaging, Downingtown, PA) ile yapıldı. İstatistiksel analiz Kolmogorov Smirnov testini kullandı.
Dendritlerden çıkan çıkıntılar, referanslarda açıklandığı gibi uzunluklarına göre dört tipte sınıflandırılmıştır. 63 ve 64. Kısa çıkıntılar olarak da adlandırılan Sınıf 1 çıkıntılar <0.5 μm uzunluğundaydı, büyük bir omurga başından yoksundu ve bir boynu yokmuş gibi görünüyordu; 2. sınıf veya mantar biçimli dikenler, 0.5 ila 1.25 um uzunluğundaydı ve kısa boyun ve büyük omurga başı ile karakterize edildi; sınıf 3 veya ince dikenler 1.25 ile 3.0 μm arasında değişiyordu ve küçük başlı uzun omurga boyunlarına sahipti; sınıf 4 veya filopodiyal uzantılar, ayırt edilebilir bir omurga başından yoksun uzun ipliksi çıkıntılardı.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Halk Sağlığı Hizmeti Hibe DA10044 (PG ve ACN'ye) ve Simons Vakfı, Peter J. Sharp Vakfı, Picower Vakfı ve FM Kirby Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Kısaltmalar
- NACC
- çekirdek accumbens
- MSN
- orta boylu dikenli nöron
- BAC
- bakteriyel yapay kromozom
- Drd1
- dopamin reseptörü D1 destekleyici güdümlü
- Drd2
- dopamin reseptörü D2 destekleyici güdümlü
- DII
- 1,1′-diotadesil-3,3,3 ′, 3′-tetrametilindokarbosiyanin perklorat
- 2WD
- Son ilaç tedavisinden sonraki 2 gün
- 30WD
- Son ilaç tedavisinden sonraki 30 gün.
Referanslar
;