Bulunamayan PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Özet
Gen ekspresyonunda kokainin neden olduğu değişiklikler nöronal morfolojide ve kokain bağımlılığının altında yatan davranışlarda değişikliklere neden olur. Kokain kaynaklı yapısal ve davranışsal plastiklikte histon 3 lisin 9 (H3K9) dimetilasyonu ve lisin dimetiltransferaz G9a için önemli bir rol belirledik. Tekrarlanan kokain uygulaması, çekirdek akumbenlerde global H3K9 dimetilasyon seviyelerini düşürmüştür. Thiston metilasyonundaki azalmasına, kokaine bağlı transkripsiyon faktörü caFosB tarafından düzenlenen bu beyin bölgesinde G9a'nın baskılanması aracılık etti. Koşullu mutagenez ve viral aracılı gen aktarımı kullanılarak, G9a aşağı regülasyonunun, dendritik omurga plastisitesinin nöronları uyardığını ve kokainin daha fazla tercih edildiğini ve böylece kokainin uzun süreli etkilerinde histon metilasyonu için çok önemli bir rol oynadığını gördük.
Giriş
Tekrarlanan kokaine maruz kalma, gen ekspresyonunda kalıcı değişiklikler ve beynin ödül devresinin temel bir bileşeni olan nükleus accumbens (NAc) içindeki nöronal morfolojideki değişimlerle karakterize edilir (NAc).1-2). Kromatin remodelingi, bu beyin bölgesindeki kokain bağımlılığı özelliklerinin altını çizebilecek anormal transkripsiyonel değişikliklerde önemlidir. (3-9). NAc'deki kromatin yapısının kokain düzenlemesi, kısmen, kromatin enzimatik makinelerinin doğrudan kokaine bağlı modifikasyonlarından kaynaklanır ve histon asetilasyonu ve fosforilasyonunda değişikliklere neden olur (4, 7-9); Bununla birlikte, histon metilasyonunu kontrol eden enzimlerin rolleri henüz araştırılmamıştır.
Mikrodizilere (ChIP-Chip) birleştirilmiş kromatin imüno-çökeltme kullanan bir genom çapında promotör analizi, değiştirici histon H3 lisin 9 (H3K9) ve 27 (H3KUMN)) metilasyonundaki değiştirilmiş kalıpları tanımladı.6). Bu nedenle H3K9 veya H3K27 metilasyonunu kontrol ettiği bilinen çok sayıda lisin metil transferaz (KMT) ve demetilaz (KDM) belirledik.Şekil 1A). Sadece iki enzim, G9a ve GLP, her iki genin ekspresyonu önemli ölçüde aşağı regüle edildiğinde, tekrarlanan kokain uygulamasından iki saat sonra kalıcı transkripsiyonel düzenleme 24 saatlerini gösterdi.. G9a ve GLP, H3K9 (H3K9me2) 'in dimetilasyonunu spesifik olarak katalize ettiği için, bunların kokain ile indirgenmesi, bu noktada gözlemlenen azalmış global euchromatic H3KUMNUMXmeUMNUMX seviyeleri ile tutarlıdır (Şekil 1B). Buna karşılık, küresel heterokromatik H3K27 metilasyon seviyeleri, tekrarlanan kokaine maruz kalma ile değişmeden kalmıştır (Şekil S1 çevrimiçi materyali desteklemede). Yüksek katalitik aktivite seviyeleri nedeniyle, her ikisi de in vitro ve in vivo (10), NAc'de tekrarlanan kokaine maruz kalmanın ardından G9a baskısının fonksiyonel önemini daha fazla araştırmak için yola çıktık. G9a protein düzeyleri, mRNA seviyeleri gibi, tekrarlanan kokain uygulamasından sonra 24 saatinde önemli ölçüde azalmıştır (Şekil S2). Her ne kadar G9a mRNA ifadesi NAc'de% 35 azalmış olsa da, immünohistokimyasal analiz G15a protein seviyelerinde daha mütevazi bir 9% azalma gösterdi, tekrarlanan kokain uygulamasından sonra H21K3me9 içinde gözlenen 2% azalış ile tutarlıydı (Şekil 1B). G9a mRNA ekspresyonu, aynı zamanda, kendiliğinden tekrar tekrar kokain verilmesini takiben, bu beyin bölgesinde,% 20 ile indirgendi.Şekil S3).
Ökromatik H3K9me2'teki değişikliklerin NAc'de gen ekspresyonundaki genom çapında değişikliklerle korele olup olmadığını saptamak için, önceki kokain maruziyet öyküsü olan veya olmayan hayvanlarda zorlu bir kokain dozu ile indüklenen gen ekspresyon profillerini incelemek için mikroarray analizleri kullandık (bakınız ek koka içindeki gen listeleri Tablolar S1 – S3). Tekrarlanan kokain alan hayvanlar, akut muamele görmüş hayvanlara kıyasla, bir kokain tehdidinden bir saat sonra 1 gen ekspresyonunda çarpıcı şekilde artmıştır (Şekil 1C). Bu artan gen ifadesi, 1 tekrarlanan kokainden çekilme haftasından sonra verilen bir kokain sorununa cevap olarak hala meydana geldi. Önceki raporlarla uyumlu olarak, küçük bir yüzde gen (~% 10), tekrarlanan kokain uygulamasından sonra duyarsızlaştırılmış transkripsiyonel tepkiler gösterdi (Şekil 1C; görmek Tablo S1()5). G9a aşağı regülasyonunun, tekrarlanan kokain sonrası gözlemlenen gelişmiş gen ekspresyonundaki rolünü doğrudan araştırmak için, fareler, G9a aşırı ekspresyonunun yapılıp yapılmadığını belirlemek için GFP veya G9a eksprese edip etmediğini belirlemek için ya GFP veya G12a eksprese eden salin veya tekrarlanan kokain ile tedavi edilmiş Gen ekspresyonunun tekrarlanan kokaine bağlı gelişimini engellemek için yeterliydi. Tekrarlanan kokainin ardından artmış ekspresyon seviyelerini gösteren rastgele seçilen bir 9 kümesi kümesinden, G50a'nın bu genlerin% XNUMX'in arttırılmış ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını gözlemledik (Tablo S4).
G9a ekspresyonunun tekrarlanan kokaine bağlı baskısına aracılık eden yukarı akış transkripsiyonel olaylarını tanımlamak için, hemen erken genin oldukça stabil bir ekleme ürünü olan ΔFosB için olası bir rolü araştırdık. FosB. OsFosB, artan kokain ödülü ile bağlantılı olduğu, kokaine tekrar tekrar maruz kaldıktan sonra NAc'da birikir.11). OsFosB, ilgili hedef gene bağlı olarak transkripsiyonel bir aktivatör veya baskılayıcı olarak işlev görebilir (3, 5, 6, 12). Bitrangenik NSE- kullanımıtTA × tetOP-ΔFosB ΔFosB ekspresyonu, yetişkin hayvanların NAc ve dorsal striatumunda seçici olarak indüklenebilen fareler (13) ΔFosB ifadesinin NAc'de H3K9me2 ve KMT'lerin kokain düzenlemesi üzerindeki etkisini inceledik. ΔFosB aşırı ifadesi, her iki H3K9me2 seviyesini azaltmak için yeterliydi (Şekil 1D) ve G9a ifadesi (Şekil 1E) böylece tekrarlanan kokainin etkilerini taklit eder. Buna karşılık, ΔFosB bu beyin bölgesinde GLP ekspresyonunu azaltmadı ve sırasıyla H39K1 ve H2K3 için temel trimetilleme enzimleri olan SUV9H3 ve EZH27 üzerinde bir etkisi olmadı (Şekil S4). Bu verileri bağımsız bir ΔFosB aşırı ekspresyon sistemi kullanarak doğrulamak için, vahşi tip yetişkin farelere, GFP veya ΔFosB'yi eksprese eden iki taraflı NA-içi Adeno-ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu yapıldı. BFosB'nin viral aracılı aşırı ekspresyonu, bu beyin bölgesinde (G9a ekspresyon seviyelerini düşürmüştür)Şekil 1E).
G9a'nın bu şekilde belirgin ve özel bir şekilde düzenlenmesi, G9a ifadesinin spesifik olarak NAc nöronlarında değiştirilmesinin, kokaine yönelik davranış tepkilerini düzenleyip düzenlemediğini araştırmamıza neden oldu. Yaban tipli fareler, GFP veya G9a'yı eksprese eden HSV vektörlerinin NAc içi enjeksiyonlarını aldı ve daha sonra dolaylı bir ilaç ödülü sağlayan tarafsız bir kokaine şartlandırılmış yer tercihi paradigması kullanılarak analiz edildi. NAc nöronlarında G9a'nın viral aşırı ekspresyonu, davranış testinden sonra doğrulandı (Şekil 2A). G9a aşırı ekspresyonu, GFP'yi aşırı eksprese eden hayvanlara kıyasla kokain tercihini önemli ölçüde azalttı (Şekil 2B) ve NAc’da H3K9me2 seviyelerini arttırdı ()Şekil 2C). G9a'nın (G9aH1093K) katalitik olarak ölü bir mutantının aşırı ifadesi (14) kokain tercihini etkilemedi (Şekil 2B) ve bu beyin bölgesindeki H3K9me2 seviyelerini etkilemedi (Şekil 2C).
G9a'nın kokainin davranışsal etkileri üzerindeki rolünü daha fazla incelemek ve daha spesifik olarak, NAc'da yetişkin G9a'da G9a ekspresyonunun tekrarlanan kokaine bağlı baskısını taklit etmek içinfl / fl fareler14) bir kontrol olarak Cre rekombinaz veya GFP eksprese eden AAV vektörlerinin NAc içi enjeksiyonlarını aldı. NAA'da AX-Cre G9a'nın yıkılması, bu immünohistokimyasal olarak doğrulandı (Şekil S5), kokainin ortam koşullandırma deneylerindeki etkilerini önemli ölçüde arttırmış ve NAc'de H3K9me2 seviyelerini düşürmüştür (Şekil 2D, E). Piyasada satılan bir G9a ve GLP, BIX01294 (15-16), enzim inhibisyonunun benzer şekilde kokaine davranışsal tepkileri etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılmıştır. Nitekim, G9a ve GLP'nin farmakolojik inhibisyonu, kokain tercihini önemli ölçüde arttırmış ve NAc'de H3K9me2'i düşürmüştür (Şekil 2F, G).
Tekrar tekrar kokain verilmesi, NAc orta dikenli nöronlar üzerindeki dendritik dikenlerin yoğunluğunu arttırır (17uyarıcı glutamaterjik sinapslardaki bu nöronlar üzerindeki fonksiyonel değişikliklerle ilişkili bir süreç ()18-19ve ilaca karşı duyarlı davranışsal tepkiler (17, 20). Bu nedenle NAc'de G9a aktivitesinin tekrarlayan kokain tarafından düşürülmesinin, kokainin NAc nöronlarının dendritik omurga yoğunluğunu düzenleme yeteneğine aracılık edebileceğini varsaydık. Bir anti-G9a antikoru ile kromatin immünopresipitasyonunu (ChIP) kullanarak, her biri daha önce kokainle indüklenen dendritik plastisiteye dahil edilmiş olan NAc'de birkaç olası G9a gen hedefi belirledik.Şekil 3A()20-26). Tekrarlanan kokain uygulamasının G9a bağlanmasının yanı sıra H3K9me2 seviyelerini de bu gen promotörlerinde önemli ölçüde azalttığını bulduk (Şekil 3B). Buna karşılık, akut kokain uygulaması, G9a'yı, aynı akut kokain dozundan sonra NAc 9 saatinde gözlemlenen G1a ifadesinin artmasıyla tutarlı bir şekilde, bu aynı gen promotörlerinin bazılarına hızlı bir şekilde aldı.Şekil S6). Her ne kadar spesifik gen promotörlerinde G9a bağlanması, ekspresyonundaki değişikliklerle korele olmasına rağmen, bu tür olayların NAc'deki değişmiş global G9a seviyelerinin değişmesinden ve / veya akutu takiben G9a alımındaki farklılıkların aracılık edip etmediği konusunda belirsizliğini korumaktadır. vs tekrarlanan kokain uygulaması.
G9a'nın NAc'de sayısız plastisite ile ilişkili genleri düzenlemesine dayanarak, tekrarlanan kokain tedavisinin ardından bu beyin bölgesinde G9a ekspresyonunun sürdürülmesinin, kokaine bağlı dendritik omurga oluşumunu bloke etmek için yeterli olup olmadığını doğrudan inceledik. Daha önce NAc'de dendritik omurga indüksiyonunu teşvik ettiği gösterilen bir kokain tedavisi protokolü kullanılması (20) HSV-GFP veya HSV-G9a enjekte edilmiş hayvanlarda omurga yoğunluğunu inceledik. Önceki bulgularla anlaşarak, kokain tedavisini takiben NAc'deki dendritik omurga yoğunluğunda, G9a aşırı ekspresyonu ile tamamen bloke edilen bir etki olarak önemli bir artış gözlemledik (Şekil 3C). Tek başına G9a aşırı ekspresyonu, kokain yokluğunda NAc dendritik omurga yoğunluğunu azaltmak için yeterli değildi. Bu verileri tamamlamak için, G9afl / fl fareler, HSV-Cre'nin NAc içi enjeksiyonlarını ve omurga yoğunluğunu aldı ve kokain yokluğunda HSV-GFP alan hayvanlarla karşılaştırıldı. G9a ekspresyonunun yıkılması, NAc ortamı spiny nöronlarındaki omurga yoğunluğunu anlamlı derecede arttırdı (Şekil 3C).
Tekrarlayan kokainin ardından NAc'de G9a'nın düşürülmesinin ΔFosB aracılık ettiğine dair kanıtlar göz önüne alındığında, bu transkripsiyon faktörünün aynı şekilde NAc dendritik dikenlerin düzenlenmesinde rol alıp almadığını inceledik.. OsFosB daha önce nedensel olarak böyle dendritik plastisite ile bağlantılı olmamasına rağmen, Cdk5 ve NFκB alt birimleri dahil olmak üzere pek çok hedefi (20-23), ve osFosB'nin NAc nöronlarındaki sürekli ifadesi, tekrarlanan kokain tedavisinden sonra artmış dendritik omurga yoğunluğu ile koreledir (27). İlk olarak, G9a ve H3K9me2 ifadesini aşağı doğru düzenleyen kokain yokluğunda bitrangenik farelerde ΔFosB indüksiyonunun bulunduŞekil 1D, E), birçoğunun osFosB’in doğrudan hedefleri olduğu gösterilen birçok plastiklikle ilişkili genlere bağlanan G9a’nın azalması,Şekil 3D()3, 6). Daha sonra NAc'de ΔFosB'nin viral aşırı ekspresyonunun bazal koşullar altında dendritik omurga yoğunluğunu önemli ölçüde arttırdığını gösterdik, Tekrarlanan kokain tatbikini takiben gözlemlenene benzer (Şekil 3E). Tersine, ΔFosB transkripsiyonel aktivitesini antagonize eden baskın bir negatif mutant protein olan unJunD NAc'sinde aşırı ekspresyon, NAc'de tekrarlanan kokainin dendritik omurga oluşumunu arttırma kabiliyetini bloke etti. (Şekil 3C).
OsFosB'nin NAc'de G9a ifadesini düzenlediği ve ΔFosB ve G9a'nın aynı hedef genlerin bazılarını düzenlediği gözlemimiz, ΔFosB ve G9a arasındaki diğer etkileşimleri incelememize neden oldu. Akut kokainden sonra, G9a seviyeleri arttırıldığında, G9a'nın FosB G9a ekspresyonu baskılandığında, tekrarlanan kokainin ardından gen arttırıldı, FosB gen azaldı (Şekil 3A). Tekrarlayan kokain sonrası bu tür G9a bağlanması, c-fos, burada G9a bağlanması tekrarlanan kokainle arttırılır (Şekil S7). Bunun aksine, bunun aksine FosB, c-fos kronik psikostimulanın maruz kalması ile indüklenmez, baskılanır (5). Bitrangenik farelerde osFosB aşırı ekspresyonu, G9a’nın bağlanmasına önemli ölçüde azaltmak için yeterliydi FosB gen (Şekil 3D). Ayrıca, G9a aşırı ekspresyonu, tekrarlanan kokain uygulamasından sonra artan ΔFosB ekspresyonunu azaltmak için yeterliydi (Tablo S4). Bu veriler, G9a'nın başlangıçta ΔFosB indüksiyonunu akut kokain uygulaması ile sınırlandırdığı bir otoregülasyon döngüsü gösterir. Bununla birlikte, ΔFosB, tekrarlanan ilaca maruz kalma ile biriktiğinden, G9a'yı baskılamakta ve böylece kendi ilave indüksiyonunu kuvvetlendirmektedir.
Sonuç olarak, NAc'deki histon lizin metilasyonunun kokaine cevap olarak nöronal gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik bir rol oynadığını gösterdik. G9a ve H3K9me2'in, tekrarlanan kokain uygulamasının ardından bastırılması, kısmen, dendritik plastisitenin aberrant formlarını düzenlediği bilinen çok sayıda genin transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla, kokain tercihini arttırır. Bu tür mekanizmalarla düzenlenmekte olan genlerin daha iyi anlaşılması, ilaç bağımlılığının karmaşık biyolojik temelleri hakkındaki bilgilerimizi geliştirecek ve bağımlılık bozukluklarının daha etkili tedavilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Malzemeler ve yöntemler
Hayvanlar ve tedaviler
Aksi belirtilmedikçe, fareler bir 12 saat aydınlık / karanlık döngüsüyle (7: 00 AM ila 7: 00 PM arasındaki farlar açık) bir kolonide kafes başına dört ila beş arasında tutuldu. ad libitum suya ve yiyeceğe erişim. Tüm hayvan protokolleri hem UT Southwestern Tıp Merkezinde hem de Mount Sinai Tıp Fakültesinde IACUC tarafından onaylandı.
Kokain deneyleri için [immünohistokimyasallık, western blotlama, kantitatif PCR (qPCR), mikroarray analizi ve kromatin imüno-çökeltme (ChIP)], 8- ila 10 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar günlük olarak ya 'salin' (7 muamele tuzlu su, ip), 'akut' kokain (6 muamele tuzlu su + bir muamele 20 mg / kg kokain-HCl, ip) ya da 'tekrarlanan' kokain (7 muamele 20 mg / kg) enjeksiyonlarını aldı. kokain-HC1, ip). Fareler, son işlemden sonra 1 saatte veya 24 saatte feda edildi. Mikrodizi çalışmaları için hayvanlar günlük olarak ya 'salin' (15 muamele tuzlu su, ip), 'akut' kokain (14 muamele tuzlu su + 1 muamele 20 mg / kg kokain-HCl, ip), 'tekrarlanan + akut' kokain ( 7 tedavisi tuzlu su + 8 tedavisi 20 mg / kg kokain-HCI, ip) veya 'tekrarlanan yoksunluk + akut' kokain (7 tedavisi 20 mg / kg kokain-HC1 + 7 tedavisi tuzlu su + 1 tedavisi 20 mg / kg kokain-HCI, ip) ve son tedaviden bir saat sonra 1 feda edildi. Davranış deneylerinde, fareler tek bir ameliyat sonrası bekletildi ve aşağıda açıklandığı gibi 10 mg / kg kokain-HCl ile muamele edildi. HSV-GFP ve HSV-G9a-GFP enfeksiyonunun ardından dendritik omurga analizi ve mikrodizi doğrulama için, fareler 'salin' (5 tedavileri salin, ip) veya 'tekrarlanan kokain' (5 tedavileri 20 mg / kg kokain-HCl, ip) ile muamele edildi (3 gün boyunca), bu enjeksiyon protokolünün daha önce Herpes simpleks virüsü (HSV) transgen ekspresyonu (HSV) zaman dilimi içindeki nükleus accumbens (NAc) nöronları üzerindeki omurga yoğunluğunu arttırdığı gösterildiği gibiEk ref S1). Dendritik omurga analizi için kullanılan fareler, son muameleden sonra 4 saatten feda edildi.
NAc nöronları ile sınırlı G9a transkriptinin lokal olarak silinmesini sağlamak için, başka bir yerde detaylı olarak tarif edilen bir kanştınlmış G9a aleli için mutant fareler homozigoz kullandık (S2). Cre'nin indüklediği rekombinasyon, mutasyona uğramış transkriptin saçma sapan çürümesine yol açan 22'ten 25'e çerçeve dışı birleştirme eksonu üretir. C9BL / 57J farelerine tamamen geçmiş çapraz G6a topaklı fareler kullandık. Fareler, 2 ve 7 haftaları arasında GFP veya Cre-GFP ifade eden Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri (serotip 10) ile NAc'ye sterotaksik olarak enjekte edildi. Cre aracılı rekombinasyonun etkinliğini doğrulamak için immünohistokimyasal analiz kullanıldı (bkz. Ek Şekil S5). Ameliyat sonrası günlerde 21 AAV enjekte edilmiş hayvanlar kullandık çünkü G9a floxed farelerde rekombinasyon bu zaman noktasında kararlı ve maksimumdu, yayınlanan raporlarla tutarlıydı (S3-S4). G9a ve overJunD aşırı ekspresyon deneyleri benzer şekilde GFP, vahşi tip G9a-GFP, katalitik olarak ölü G9aH1093K-GFP veya ΔJunD-GFP'yi eksprese eden HSV virüs vektörleri kullanılarak da yapıldı. S2 G9a yapılarının geliştirilmesi ile ilgili detaylar için). HSV aşırı eksprese edici fareler ameliyat sonrası 3 gün kullanıldı, çünkü aşırı ekspresyon immünohistokimya ile gözlemlendiği gibi bu zaman noktasında maksimaldi. HSV ifadesinin geçici doğası ve AAV ifadesinin oldukça daha kararlı doğası nedeniyle, HSV vektörleri hızlı, kısa süreli transgen ifadesi gerektiren deneylerde kullanılırken, AAV vektörleri uzun süreli transgen ifadesi gerektiren deneylerde kullanılmıştır. Her iki vektörün, daha önceki çalışmalarda, afferent veya efferent nöronların herhangi bir enfeksiyonu olmadan, enjekte edilen beyin alanı içindeki sadece nöronal hücre gövdelerini enfekte ettiği gösterilmiştir.
Farmakolojik G9a / GLP inhibitörü BIX01294 (25 ng / usingl) kullanılarak yapılan davranışsal deneyler için fareler, iki subkütan mini pompayla sterotaksik olarak, iki taraflı kanül ile NAc'ye implante edildi. Mini-pompalar, implantasyondan 12 saat önce, ya 0.25 gün boyunca bir aracın (5 hidroksipropil β-siklodekstrin) ya da ilacının sürekli teslimatını (14 ul / saat) başlattı, bu sırada davranış değerlendirmeleri yapıldı.
OsFosB aşırı ekspresyon deneyleri için [western blot, qPCR ve ChIP], erkek bitransgenik NSE-tTA × tetOP-ΔFosB fareler kullanıldı (haftada 10), burada tetrasiklin türevi doksisiklin (8 hafta doksisiklin dışında) yokken hayvanlar, striatal sınırlı kısıtlı yapıcı ekspresyon sergilediler;S5). Bu farelerde osFosB aşırı ekspresyonu qPCR ile doğrulandı. NSE-kullanarak bulguları onaylamak içintTA × tetOP-ΔFosB fareler, yabani tip 8 haftalık C57BL / 6J erkek fareler, GFP veya ΔFosB-GFP'yi eksprese eden AAV vektörleri ile birlikte NAc içi sterotaksik olarak enjekte edildi. Bu durumda AAV vektörleri, ameliyat sonrası 8 haftalarında maksimum ΔFosB ekspresyonunu sağlamak için kullanıldı, viral olarak enfekte olmuş ve bitrangenik ΔFosB aşırı eksprese eden fareler arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlandı. Viral aşın ekspresyonu, ameliyat sonrası 8 haftalarında qPCR kullanılarak doğrulandı (15-ölçer NAc zımbaları enjeksiyon bölgesi altında diseke edildi). QPCR için kullanılmayan aşırı eksprese edici fareler AAV-GFP ve AAV-ΔFosB-GFP, QPCR için kullanılmayan aşırı eksprese edilmiş fareler, tuzlu (14 muameleleri salin, ip) veya tekrarlanan kokain (14 muameleleri 30 mg / kg kokain-HCl, ip) ile muamele-sonrası cerrahi. Nihai işlemden 6 gün sonra, beyinler,% 4 paraformaldehit ile sabitlendi, vibratome kesildi ve dendritik omurga analizi için kullanıldı.
Western blot analizi
14-ölçer NAc zımbaları, bir paslanmaz çelik fare beyin matrisi kullanılarak elde edilen 1 mm koronal bölümlerinden alınmış ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 1 M HEPES lizis tamponu (% 1% SDS) içinde sonikleştirilmiştir. 10-30 Ng toplam protein numuneleri,% 18 SDS jelleri üzerinde elektroforezlendi. Proteinler PVDF membranlarına aktarıldı ve ya anti-H3K9me2 (fare monoklonal, 1: 500), anti-β-tubulin (fare monoklonal, 1: 60,000), anti-toplam histon H3 (1: 5,000), anti-total histon H1: 1000: 3 ile karıştırıldı. anti-GFP (delikli dokularda eşit viral ekspresyonun doğrulanması için kullanılır) (tavşan poliklonal, 27: 3), anti-H1K500me1 (tavşan poliklonal, 60,000: 4) veya anti-aktin antikorları (fare monoklonal, 5: 5) 1 ° C (tüm membranlar% 15,000 sütte veya% XNUMX sığır serum albümini içinde bloke edilmiştir). Membranlar daha sonra peroksidaz etiketli sekonder antikorlarla (XNUMX: XNUMX) inkübe edildi.-1: Kullanılan primer antikora bağlı olarak 60,000) ve bantlar SuperSignal West Dura substratı kullanılarak görselleştirildi. Bantlar, NIH Image J Yazılımı ile ölçüldü ve H3K9me2 bantları, aktin ya da β-tubuline ve eşit yükleme kontrol etmek üzere toplam histon H3'e normalleştirildi. Tekrarlanan kokainin aktin seviyeleri üzerinde etkisi yoktu (Şekil S8) veya toplam histon 3 (Şekil S1) NAc'de. Ayrıca, HSV-G9a-GFP ve HSV-G9aH1093K-GFP enfeksiyonunun, NAc'deki toplam β-tübülin seviyeleri üzerinde etkisi olmamıştır (Şekil S8).
İmmünohistokimya
Fareler öldürücü bir dozda kloral hidrat ile yatıştırıldı ve daha önce tarif edildiği gibi tek veya çift immünohistokimya ile analiz edilmeden önce 4% paraformaldehit ile perfüze edildi (S6). Kısaca, post-sabit beyinler, oda sıcaklığında gece boyunca 30% sukroz içinde inkübe edildi, 35 um'de kesilmeden önce (dendritik omurga analizi için kullanılan beyinler,% 100 sükroz yokluğunda 30 um bölümlerinde bir vibratom üzerinde kesildi). Serbest yüzen NAc bölümleri, 1X PBS ile yıkandı, bloke edildi (% 3 normal eşek serumu,% 0.1 tritonX, 1X PBS) ve daha sonra anti-GFP (tavuk poliklonal, 1: 8000) ve / veya anti-G9a (tavşan poliklonal) ile inkübe edildi , 1: 500) engelleme çözeltisindeki antikorlar. Dendritik dikenler için analiz edilen bölümler, 1: 200'te bir tavşan poliklonal anti-GFP antikoru ile inkübe edildi. Gece boyunca inkübasyonun ardından NAc bölümleri, 3 dakika boyunca 10 dakika boyunca 1X PBS ile yıkandı, ardından 2X saatlerce 3X PBS bloklama çözeltisi içinde Cy1 ve / veya Cy2 floresan bağlı ikincil antikorlarla inkübasyon yapıldı. Morfoloji çalışmaları için kullanılan bölümler gece boyunca oda sıcaklığında ikincil antikorda inkübe edildi. Nükleer eş boyama, 1 dakika boyunca DAPI (1: 50,000) içeren 10X PBS içerisinde inkübe edilerek elde edildi. Kesitler bir kez daha yıkandı, ardından etanol dehidrasyonu ve DPX ile birleştirildi. Tüm bölümler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi.
RNA izolasyonu ve qPCR
İki taraflı 14 kalibreli NAc zımbalar Trizol içinde homojenleştirildi ve üreticinin talimatlarına göre işlendi. RNA, RNAesy Micro kolonları ile saflaştırıldı ve spektroskopi, RNA 260/280 ve 260/230 oranlarının> 1.8 olduğunu doğruladı. RNA daha sonra bir Bio-Rad iScript Kiti kullanılarak ters transkribe edildi. cDNA, SYBR Green kullanılarak qPCR ile ölçüldü. Her reaksiyon, iki veya üç kez gerçekleştirildi ve daha önce açıklandığı gibi, normalizasyon kontrolü olarak gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kullanılarak ΔΔCt yöntemi izlenerek analiz edildi (S7). Görmek ek Tablo S5 mRNA primer dizileri için.
DNA mikroarray analizi
Mikrodizi çalışması için dört grup (grup başına 3 bağımsız biyolojik kopyaları) kullanıldı, toplam 12 mikrodizileri. Son kokain enjeksiyonunu takip eden 1 saat, hayvanlar hızla kesildi ve beyinleri çıkarıldı ve buza kondu. NAc diseksiyonu, bir 15-gauge iğne zımbası kullanılarak alınmış ve RNA ekstrakte edilene kadar kuru buz üzerinde hızlı bir şekilde dondurulmuştur. Bilateral zımbalar, kopya başına dört hayvandan toplandı ve grup başına toplam 12 fareleri toplandı. RNA izolasyonu, mikro dizi işlemesi ve veri analizi daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (S8). Kısaca, RNA yukarıda açıklandığı gibi izole edilmiş ve saflaştırılmış ve Agilent's Bioanalyzer kullanılarak kalite açısından kontrol edilmiştir. Illumina MouseWG-6 v2.0 dizilerine ters transkripsiyon, amplifikasyon, etiketleme ve hibridizasyon, UT Southwestern'in mikrodizi çekirdeği tarafından standart prosedürler kullanılarak gerçekleştirildi. Ham veriler, arka planda çıkarıldı ve Beadstudio yazılımı kullanılarak nicel olarak normalize edildi. Normalleştirilmiş veriler, GeneSpring yazılımı kullanılarak analiz edildi ve genelistler, p <1.3 katı olmayan bir p değeri kesimi ile birleştirilmiş 0.05 katlık bir değişim kesiminin anlamlılık kriterleri kullanılarak oluşturuldu.
Birkaç nedenden dolayı bu verilere yüksek derecede güven duyuyoruz. İlk olarak, tüm hayvanlar aynı koşullar altında aynı anda ele alındı, tedavi edildi ve öldürüldü. Ayrıca, tüm RNA ve dizi işlemleri aynı anda yapıldı. İkinci olarak, dizi örnekleri başına üçlü diziler yaptık ve çoklu hayvanları bir araya topladık, böylece bireysel değişkenlikten kaynaklanan farkları en aza indirdik ve istatistiksel gücü arttırdık (S9). Üçüncüsü, çalışmamız için kullanılan veri analizi kriterleri MicroArray Kalite Kontrol projesi tarafından önerilmektedir, çünkü bu kriterler yüksek düzeyde siteler arası yeniden üretilebilirlik ve platformlar arası ve platform içi yeniden üretilebilirlik sağlamak için doğrulanmıştır (S10-S11).
Viral vektörlerin yapımı
Viral vektör yerleştirme boyutu kısıtlamaları nedeniyle, ya vahşi tip G9a (G9a) ya da katalitik olarak ölü G9a (G9aH1093K) için kodlama dizileri, primer olarak GGP'nin (preküa) GGP'sinin (promot) altında G2PA'sı (GUMA'sı) 'nin altına sokuldu. yerleştirme boyutu, ~ 1005 kb idi, bu, AAV-9 vektörleri için maksimum yerleştirme boyutunu aşar). IE3.96 / 2 promotörü G4a ifadesini çalıştırır. Fragmentler, Klenow ile muamele edilmiş PmeI ve EcoRI ile sindirilmiş G5a (pcDNA9'dan) ve EcoRI ile sindirildikten sonra CIP ile muamele edilmiş P1005 + ile künt uç ligasyonları yoluyla bicistronic p9 + HSV plazmidine klonlandı. HSV-ΔJunD-GFP'nin üretimi için, EcoRI kısıtlama bölgeleriyle çevrili ΔJunD kodlama dizisi, EcoRI sitesini içeren primer oligonükleotitler kullanılarak PCR ile üretildi. PCR ürünü daha sonra p3.1 + vektörünün EcoRI bölgesine bağlandı. NAc nöronlarında Cre rekombinazın lokal ekspresyonu, tarif edildiği gibi bir AAV vektörü kullanılarak viral aracılı gen iletimi ile sağlandı (S12). GFP veya Cre'nin GFP'nin bir N-terminal füzyonu, bir ekleme donör alıcı sekansı ve poliadenilasyon sinyaline sahip bir CMV promotörü içeren bir rekombinant AAV-2 vektörüne alt klonlandı. Tüm vektör girişleri dideoksi dizilimi ile doğrulandı. Viral vektörler daha önce tarif edildiği gibi üçlü transfeksiyon, yardımcı içermeyen bir yöntem kullanılarak üretildi (S13). Saflaştırılmış virüs, −80 ° C'de saklandı. Viral kalitesi, HEK293 hücrelerinde değerlendirilen bulaşıcı titre ile değerlendirildi. AAV-ΔFosB-GFP virüsleri de benzer şekilde hazırlandı. HSV-Cre için Cre ifadesi, Cre ifadesini en aza indirmek ve nöronal toksisiteyi önlemek için, IE4 / 5 promotörünün aksine, bir IRES promotörü tarafından tahrik edildi (bakınız S14 viral yapı için). Tüm durumlarda, her ikisinin de aşırı viral ekspresyonu doğrulandı in vitro ve in vivo qPCR yoluyla virüsler ameliyat sonrası NAc kısıtlı ekspresyon göstermesi için immünohistokimyasal olarak doğrulandı.
Stereotaksik cerrahi
Ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (10 mg / kg) anestezisi altında, fareler küçük hayvan stereotaksik bir alete yerleştirildi ve kranial yüzey ortaya çıkarıldı. Otuz üç gauge şırınga iğnesi, 0.5 ul virüsünü bir 10 ° açıyla (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) bir 0.1 ul / dak hızında NAc'ye akıtmak için kullanıldı. HSV enjeksiyonları alan hayvanların ameliyattan sonra 2 gün boyunca iyileşmesine izin verilirken, AAV vektörleri alan davranış testi için kullanılan fareler, şartlandırmaya tabi tutulmadan önce 20 gün boyunca iyileşmeye bırakıldı. Bu zamanlar, iki vektör için maksimal viral aracılı transgen ekspresyon periyotları ile tutarlıdır. BIX01294 infüzyonları için, iki mini pompanın her biri, farenin sırtına deri altından yerleştirildi. Kanül yerleşimleri, NAc'nin üzerinde iki küçük kraniyal delik açarak ve kanülün bregmadan (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4) verilmesiyle sağlandı. Yerlere koyma işlemine başlamadan önce farelerin, ameliyattan 4 ila 5 günlerinde, aşağıda tarif edildiği gibi kokaine kadar iyileşmeleri sağlandı.
Koşullu yer tercihi
Yer değiştirme prosedürü, daha önce tarif edildiği gibi, aşağıdaki modifikasyonlarla yapıldı (S7). Kısaca, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP veya HSV-GFP'nin NAc içi infüzyonlarından 1093 gün sonra fareler, üç farklı ortamdan oluşan şartlandırma odalarına yerleştirildi. İki koşullandırma bölmesinden biri için önemli tercih gösteren fareler, çalışmadan çıkarıldı (tüm hayvanların <% 10'u). Koşullandırma grupları daha sonra hala var olabilecek herhangi bir oda önyargısını ayarlamak için dengelendi. Sonraki günlerde hayvanlara tuzlu su enjekte edildi ve öğleden sonra 30 dakika boyunca bir odaya kapatıldı ve daha sonra kokain (10 mg / kg, ip) enjekte edildi ve akşam 30 dakika süreyle diğer odaya 2 gün (iki salin ve iki kokain çifti). Test gününde, fareler 20 dakika süreyle işlem görmeden aparat içine geri yerleştirildi ve hangi tarafı tercih ettiklerini değerlendirmek için test edildi. Uyuşturucu tedavisinin etkililiğini sağlamak için kokaine lokomotor tepkiler, kokainle eşleştirilmiş odalarda ışın kırılması yoluyla değerlendirildi. AAV ve BIX01294 CPP deneyleri için, biraz değiştirilmiş bir protokol kullanıldı. Hayvanlara tekrar salin veya kokain (10 mg / kg, ip) enjekte edildi ve 30 dakikalık seanslar için belirli odalara kapatıldı, ancak bunun yerine sadece günde bir kez 4 gün şartlandırıldı, ardından 5. günde test yapıldı (hayvanlar şartlandırıldı akşam ve şartlandırma tedavileri değiştirildi). Tüm gruplar için, saline yanıt olarak taban çizgisi hareketliliği, hareketin viral veya inhibitör tedavisinden etkilenmediğinden emin olmak için değerlendirildi.
İntravenöz kokain kendi kendine yönetimi
Deney başında 230-250 g ağırlığında erkek ergen Long-Evans fareleri elde edildi. Nem ve sıcaklık kontrollü bir ortamda, tersine çevrilmiş bir 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde (9: 00 am'de yanar) yerleştirilmişlerdir. ad libitum yemek ve suya erişim. Sıçanların yeni ortamlarında ısınmasına izin verildi ve denemenin başlamasından önceki 1 haftasında günlük olarak tutuldu. Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüsünün Laboratuar Hayvanlarının Bakım ve Kullanım Kılavuzuna uygun olarak yapıldı ve Sina Dağı Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı. Lokomotor davranışını ölçmek için kendi kendine uygulama ekipmanı kızılötesi ışınlarla donatıldı. Kendi kendine uygulama daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (S15-S16) izofluran (% 2.4-2.7) anestezi altında sağ juguler vene implante edilen kateterler ile. Kateterler, 0.1 U heparin ve ampisilin (10 mg / kg) içeren 50 ml salin solüsyonu ile yıkandı. Ameliyattan bir haftalık iyileşmenin ardından, ışık / karanlık döngüsünün karanlık fazında kendi kendine uygulama eğitimi başladı. Hayvanların kokaine (3 mg / kg / infüzyon) sabit oranlı-0.75 (FR1) takviye programı altında günde 1 saat erişmesine izin verildi, burada 1 aktif kaldıraca basma tek bir ilaç infüzyonuyla sonuçlandı. Sıçanlar kokain alımını 6 gün sonra stabilize etti (yanıt oranında 15 ardışık günde <% 3 değişiklik, güçlendirilmiş kaldıraca yanıt veren en az% 75). Son kendi kendine uygulama seansından 24 saat sonra, sıçanların başları hızla kesildi, beyinleri hızla çıkarıldı ve RNA izolasyonu ve qPCR için işlendi.
Kromatin immüno-çökeltme (ChIP)
Taze NAc zımbaları formaldehit çapraz bağlanmış ve daha önce tarif edildiği gibi ChIP için hazırlanmıştır (S17-S18) küçük değişikliklerle. Kısaca, hayvan başına 4 14-gauge NAc zımbaları (numune başına havuzlanmış 5 hayvanlar) toplandı,% 1 formaldehit ile çapraz bağlandı ve 2 ° C'deki dondurmadan önce 80 M glisin ile söndürüldü. Numune sonikasyonundan önceki 1 günü, koyun anti-tavşan / faresi (çökelme antikoruna bağlı olarak) IgG manyetik boncukları, uygun manyetik boncukların, anti-G9a (tavşan poliklonal ChIP sınıfı) veya anti-H3K9me2 (fare monoklonal ChIP sınıfı) ile inkübe edilmesi suretiyle hazırlandı. 4 ° C'de gece boyunca blok çözelti içerisinde sabit dönüş altında antikorlar. Doku sonasyonu ve kromatin kayması daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (S17). Sonikasyonun ardından eşit konsantrasyonlarda kromatin yeni tüplere aktarıldı ve nihai ürünlerin% 5'i 'giriş' kontrolleri olarak kullanıldı. Konjuge boncuk / antikor karışımlarının iyice yıkanmasından ve süspanse edilmesinden sonra, her bir kromatin örneğine eşit hacimlerde antikor / boncuk karışımları (~ 7.5yg antikor / numune) ilave edildi ve 16 ° C'de sabit rotasyon altında ~ 4 saat boyunca inkübe edildi. Örnekler ayrıca yıkandı ve bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak DNA saflaştırılmasından önce gece boyunca 65 ° C'de çapraz bağlandı. DNA saflaştırmasının ardından, numuneler qPCR'ye tabi tutuldu ve daha önce tarif edildiği gibi uygun 'giriş' kontrollerine normalleştirildi (S17). Bir sinyal poliklonal anti-IgG antikoru kullanan normal fare IgG immünopresipitasyonları, sinyal amplifikasyonunun uygun zenginleştirilmesini kontrol etmek için de yapıldı. Adenin fosforibosiltransferaz (APRT), kokain ve ΔFosB aşırı ekspresyon deneyleri için negatif kontrol olarak kullanıldı. Görmek Ek Tablo S5 promotör primer dizileri için.
Dendritik omurga analizi
G9a'nın in vivo nöronal morfolojinin düzenlenmesindeki rolünü incelemek için, daha önce aşağıdaki modifikasyonlarla açıklanan yöntemleri kullandık (S1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP'nin enjeksiyonundan üç gün sonra (bütün virüsler vahşi tip C57Bl / 6J farelerinde kullanıldı) veya HSV-Cre-GFP'de (G9a'da kullanıldı)fl / fl fareler), viral ekspresyon maksimum olduğunda, fareler perfüze edildi, beyinler donduruldu ve daha sonra bir vibratome üzerinde 100 um'de kesildi. Kesitler daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi GFP'ye karşı bir antikor kullanılarak immüno-lekelendi (bkz. Immunohistochemistry). G9a aşırı ekspresyonunun ve nakavtın omurga sayıları üzerindeki etkilerini ve ayrıca ΔJunD aşırı ekspresyonunun etkisini değerlendirmek için, GFP-eksprese eden NAc ortamından en az 1 ofm sekonder dendrit başına nöron başına yaklaşık 2-299 nörit üzerindeki diken sayısını ölçtük dikenli nöronlar (MSN). MSN'lerin NAc'deki diğer nöronal popülasyonlardan morfolojik olarak farklı olduğu ve bunun yanı sıra HSV'nin öncelikle bu beyin bölgesinde DARPP-32 eksprese eden nöronları enfekte ettiğini gösteren önceki raporlar göz önüne alındığında (S19), MSN’lerin bu çalışmalarda özel olarak değerlendirildiğinden eminiz. Her hayvan için, her grup için (6 grupları) 8 – 3 hayvandaki ~ 4 – 7 nöronları inceledik, ardından istatistiksel analiz için her hayvan için ortalama bir değer elde edildi. ΔFosB aşırı ekspresyonunun NAc omurga yoğunluğu üzerindeki etkilerini incelemek için tasarlanan deneyler, AAV vektörlerinin GFP veya ΔFosB-GFP'yi uzun süre boyunca (8 haftaları) ifade etmek için kullanılması dışında, yukarıda tarif edilene benzer şekilde yapıldı. Tüm HSV görüntüleri, bir 100X yağa batırma hedefi olan bir konfokal mikroskop kullanılarak yakalandı (AAV görüntüleri, bir 63X yağa daldırma hedefi ile yakalandı). Görüntüler, 1 isteğe bağlı ünitesinde ayarlanan iğne deliği ve bir 1024 × 1024 çerçeve boyutuyla elde edildi. Dendritik uzunluk, NIH Image J yazılımı kullanılarak ölçülmüş ve slaytlar deneysel taramadan önce kodlandığından, omurga sayıları birincil deneyci tarafından kör sayılmıştır. 10 μm dendrit başına düşen ortalama diken sayısı hesaplandı.
istatistiksel analiz
Koşullu yer tercihi ve dendritik omurga analizleri için ikiden fazla grupla anlamlılığı belirlemek için bir ve iki yönlü ANOVA'lar uygulandı. Student'in t testleri, GPCNUMXa'da HSV-GFP ile HSV-Cre'yi karşılaştıran qPCR, western blot, dendritik omurga analizi dahil diğer karşılaştırmalar için kullanılmıştır.fl / fl fareler, mikrodizi analizleri (yukarıya bakın) ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri. İlaç tedavisi ve virüsün önemli ana etkilerinin doğrulanması ile ΔFosB aşırı ekspresyonundan sonra dendritik omurga yoğunluğunun iki yönlü ANOVA analizinin ardından planlanan öğrenci t testleri kullanıldı. Şekil göstergelerinde yer alan tüm değerler ortalama ± SEM'i temsil eder (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). İçin detaylı istatistiksel analizler Şekil. 1-3 Ana metinde: İstatistikleri içeren ayrıntılı şekil efsaneleri verilmiştir.
Dipnotlar
Yazının içinde yer alan hiçbir materyalin başlıklı olmadığını doğrularım. Kokain kaynaklı Plastisitede Histon Metiltransferaz G9a'nın Temel Rolü İnternette de dahil olmak üzere başka bir yerde daha önce yayınlanmış ya da başka yerlerde incelenmiştir.
Hayvanların kullanımıyla ilgili tüm çalışmalar, hem University of Texas Güneybatı Tıp Merkezi'nde hem de Mount Sinai Tıp Fakültesindeki kurumsal ve IACUC kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
Referanslar ve Notlar
;