PLoS Bir. 2013 Kasım 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Kaynak
Davranış Fizyolojisi Laboratuvarı, İnsan Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Tokyo Metropolitan Üniversitesi, Tokyo, Japonya.
Özet
Fiziksel egzersiz, hipokampal fonksiyonun birçok yönünü geliştirir. Nöronal aktivitenin, nöronal fonksiyonları desteklemenin anahtarı olduğu fikrine paralel olarak, önceki literatür, sürekli olarak akut egzersiz nöbetlerinin, hipokampusta nöronal aktivasyonu uyandırdığını göstermiştir. Tekrarlanan aktive edici uyaranlar, uzun süreli sinir plastisitesine aracılık eden transkripsiyon faktörü ΔFosB'in birikmesine neden olur..
Bu çalışmada, uzun vadeli gönüllü tekerlek çarkının hipokampusta ΔFosB ekspresyonuna yol açtığı hipotezini test ettik ve dorso-ventral eksen boyunca hipokampal alt alanlardaki potansiyel bölgeye özgü etkileri inceledik. Erkek C57BL / 6 fareleri, 4 hafta boyunca bir koşu tekerleği ile ya da tekerleksiz olarak tutuldu. Uzun süreli tekerlek çalışması, ölçülen tüm hipokampal bölgelerde FosB / ΔFosB immünoreaktivitesini önemli ölçüde arttırdı (yani, hem dorsal hem de ventral hipokampüsün DG, CA1 ve CA3 alt alanlarında). Sonuçlar, tekerleğin koşmanın, kortekste bölgeye özgü FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin, hipokampus içindeki FosB / ΔFosB'deki tek tip artışın koşmanın spesifik olmayan bir sonucu olmadığını gösterdiğini doğruladı. Western blot verileri, artmış hipokampal FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin, öncelikle ΔFosB artışından kaynaklandığını göstermiştir. Bu sonuçlar, uzun vadeli fiziksel egzersizin, hipokampüsün tamamında ΔFosB indüksiyonu için güçlü bir tetikleyici olduğunu göstermektedir; bu da egzersizin neden dorsal ve ventral hipokampusa bağlı fonksiyonları iyileştirdiğini açıklar. İlginçtir ki, DG'deki FosB / ΔFosB ifadesinin, çift-korttin-immünoreaktif (yani olgunlaşmamış) nöron sayısı ile pozitif olarak korele olduğunu bulduk.
BFosB'nin egzersize bağlı nörogenezde aracılık ettiği mekanizmalar hala belirsiz olsa da, bu veriler egzersize bağlı nörojenezin en azından aktiviteye bağlı olduğunu gösterir. Birlikte ele alındığında, mevcut sonuçlarımız osFosB’in egzersize bağlı hipokampal plastisitenin düzenlenmesinde rol oynayan yeni bir moleküler hedef olduğunu göstermektedir.
Giriş
Egzersiz, hipokampüsün kemirgenlerde moleküler, yapısal ve fonksiyonel yönleriyle ilgili çeşitli faydalar sağlar [1,2], bazıları insan çalışmaları ile desteklenmiştir.3,4]. Bununla birlikte, hipokampal plastisitede egzersize bağlı değişikliklerin altında yatan mekanizmalar yeterince anlaşılmamıştır. Önceki literatür, egzersizin kemirgenlerde hipokampal nöronal aktivasyona neden olduğunu tutarlı bir şekilde göstermiştir. Geçici nöronal aktivasyonun bir göstergesi olan c-Fos kullanan immünohistokimyasal çalışmalar, hem zorlanmış hem de gönüllü çalışanların, kemirgen hipokampüsünün dentat girusundaki (DG), CA1 ve CA3 alt alanlarında c-Fos ekspresyonunun arttığını göstermiştir.5-7]. Ek olarak, lazer-Doppler akış ölçer (LDF) kullanan önceki bir çalışma, hafif koşu bandının, sıçandaki CA1 alt alanında, nöronal aktivasyonun alternatif bir belirteci olan bölgesel serebral kan akışını (rCBF) arttırdığını göstermiştir.8]. İmmünohistokimyasal çalışmalar, egzersiz durduktan sonra bölgeye özgü ayrıntılı analizler sağlarken, LDF egzersiz sırasında lokalize bir alanda rCBF'nin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Her çalışmanın avantajlarına ve sınırlamalarına rağmen, bu çalışmalar benzer şekilde akut egzersiz nöbetlerinin hipokampal nöronal aktivite üzerindeki etkisini göstermiştir. Bu sonuçlar, uzun süreli düzenli egzersizin, nöronal aktivasyonu tekrar tekrar tetikleyerek hipokampal plastisiteyi teşvik ettiği bir mekanizma önerir [9].
Transkripsiyon faktörü spFosB, tam uzunlukta FosB'nin kesilmiş bir ek izoformu olan spesifik beyin bölgelerinde, benzersiz stabilitesi nedeniyle (haftaların yarı ömrü) kademeli olarak biriktiği çeşitli tekrarlanan uyaranlarla tetiklenir.10-12]. Artan sayıda kanıt, ΔFosB seviyelerinin artmasının, belirli uyaranlarla ilişkili uzun süreli nöral ve davranışsal esnekliğe aracılık ettiğini göstermektedir.11,13]. Örneğin, kokain ve morfin gibi suiistimal ilaçların kronik olarak verilmesi genellikle çekirdekte bulunan BFosB ekspresyonunu arttırır, bu ilaçlara karşı artan hassasiyetin altında yatan moleküler mekanizmalardan birini temsil eder. [11,14,15]. SYüksek yağlı diyet ve cinsel tecrübe dahil, diğer ödül uyaranlarına benzer [16,17], lUzun süreli gönüllü tekerlek çalıştırması, sıçan çekirdeğinde bulunan accBuslarda FosB / ΔFosB immünoreaktivitesini arttırdı ve gönüllü çalışmanın kemirgenler için doğal bir ödül olduğunu öne sürdü. [18,19]. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir literatür, fiziksel egzersize tekrar tekrar maruz kalmanın hipokampusta ΔFosB ifadesine neden olup olmadığını incelememiştir. Egzersiz, hipokampustaki nöronal aktivasyonu tetiklediğinden, uzun süreli gönüllü tekerlek çalışmasının da hipokampusta ΔFosB ifadesini indükleyeceğini varsaydık. BFosB'nin hipokampal plastisiteyi düzenlediği kesin mekanizmalar belirsizliğini korurken, araştırmalar eksik olan farelerin FosB gen, hipokampal nörojenezde bozulma ve depresyona benzer davranışta artış olduğunu göstermektedir [20,21]. benNitekim, egzersizin nörogenezi arttırdığı ve antidepresan özelliklere sahip olduğu bilinmektedir. [22-25]. benHipotezimiz doğruysa, osFosB, egzersize bağlı hipokampal plastisiteye aracılık eden yeni bir potansiyel moleküler hedef olacaktır.
Hipokampus uzunlamasına (dorso-ventral) ekseni boyunca anatomik ve fonksiyonel gradyana sahiptir [26]. Dorsal hipokampus mekansal öğrenme ve hafızada önemli bir rol oynar [27,28], ventral hipokampus, tercihli olarak duygusal davranışların düzenlenmesinde rol oynar.29,30]. Ayrıca, çalışmalar fizyolojik uyaranların, hipokampüsün dorsal ve ventral bölümlerinde farklı c-Fos ekspresyon şablonlarını indüklediğini göstermiştir.31-33]. Çünkü egzersiz, hem dorsalı iyileştirir [34-37] ve ventral hipokampusa bağlı fonksiyonlar [24,25,38], uzun süreli gönüllü çalışmanın hipokampusta bölgeye özgü ΔFosB ekspresyonuna neden olup olmadığını incelemek önemlidir.
Bu çalışmanın birincil hipotezi, uzun süreli gönüllü tekerlek çalıştırmasının, fare hipokampüsünde ΔFosB ekspresyonunu indükleyeceği idi. Bu hipotez, dorsal ve ventral hipokampal alt alanlardaki DGB, CA1 ve CA3'ta FosB / ΔFosB immünohistokimyası ile bölgeye özgü indüksiyonu belirlemeye özellikle vurgulandı. Sonuçlar, izoformunu tanımlamak için kullanılan western blotlama ile doğrulandı. FosB Hipokampüste indüklenen gen ürünleri. Ayrıca bölgeye özgü FosB / ΔFosB indüksiyonu için korteksi inceledik, beyindeki uzun süreli egzersizin spesifik olarak artmamış FosB / ΔFosB immünoreaktivitesini arttırma olasılığını dışlamak. Son olarak, FosB / ΔFosB ekspresyonu ile nörogenez arasındaki korelasyon, hipokampal plastisitenin düzenlenmesinde egzersize bağlı ΔFosB indüksiyonunun fonksiyonel etkilerinin araştırılmasında ilk adım olarak araştırıldı.
Malzemeler ve yöntemler
1: Hayvanlar ve etik bildirimi
Yirmi erkek C57BL / 6 faresi (haftalık 8) ticari bir yetiştiriciden (SLC, Shizuoka, Japonya) satın alınmıştır. Deney 1 için on fare, Deney 2 için on fare kullanıldı. Fareler, kontrollü sıcaklık (22-24 ° C) ve ışık (12 / 12-h ışık / karanlık döngüsü, 0500'te yanma) koşullarında tutuldu ve yiyecek ve su sağlandı. ad libitum. Tüm deneysel prosedürler, Tokyo Metropolitan Üniversitesi Hayvan Deneysel Etik Kurulu tarafından onaylandı.
Her deneyde, varışta, fareler rastgele bir kontrol grubuna (Kontrol, n = 5) veya bir koşu grubuna (Runner, n = 5) atandı. İlk hafta boyunca, bütün fareler, ilk iklimlendirme için gruplar halinde (5 fareler / kafesler) standart plastik kafeslerde tutuldu. Daha sonra, Runner fareleri, çalışan bir tekerleğe sahip bir kafeye aktarıldı (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, ABD). Çünkü sosyal izolasyonun hipokampusta egzersize bağlı nörogenezi baskıladığı bilinmektedir [39], Runner fareleri, ilave bir 5 hafta boyunca bir grup (4 fareleri / kafesi) olarak yerleştirildi. Her sabah tekerlek dönüşlerinin sayısı kaydedildi ve vücut ağırlığı (g) haftalık olarak ölçüldü.
2: Deney 1. FosB / ΔFosB ekspresyonu ve hipokampal nörojenezin immünohistokimyasal incelemesi
2.1: Perfüzyon ve doku işleme
Çalışma süresinin son gününden sonraki sabah (0900 – 1100), farelere pentobarbital sodyum ile derin anestezi uygulandı ve transkardiyal olarak soğuk tuzlu su ile perfüze edildi. Beyin hızlı bir şekilde çıkarıldı ve gece boyunca 4 M fosfat tamponlu salinde (PBS, pH 0.1)% 7.4 paraformaldehit içinde sabitlendi. Beyin daha sonra PBS içinde% 30 sukroz içinde dondurulmuş ve daha sonra işlenene kadar dondurulmuştur. Yarımkürenin koronal beyin bölümleri (40 μm), dondurucu bir mikrotom kullanılarak elde edildi ve% 0.01% sodyum azit içeren PBS içerisinde toplandı.
2.2: İmmünohistokimya
FosB / ΔFosB immüno-lekeleme için altıda bir seri kesitler rastgele seçildi. Nörogenezi değerlendirmek için onaylanmış olgunlaşmamış nöronların bir belirteci olan doublecortin'i (DCX) etiketlemek için bitişik bir seri kullanıldı [40,41]. Endojen peroksidaz aktivitesini% 1 H ile söndürdükten sonra2O2 PBS'de serbest yüzer bölümler, 10 saat için PBS'de% 2 normal at serumu içeren bloke edici çözelti ile önceden inkübe edildi. PBS'de durulanmaları takiben, PBS içinde seyreltilmiş tavşan poliklonal pan-FosB antikoru (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD),% 0.5% Triton X-100 ve% 0.5 BSA (PBST) ile seyreltilmiş; -BSA) 24 h, 4 ° C'de. Başka bir bölüm serisi keçi poliklonal anti-DCX antikoru (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) ile 48 ° C'de 4 saat için PBST-BSA içinde inkübe edildi. Kesitler ayrıca uygun bir biyotinlenmiş sekonder antikor (anti-tavşan IgG, 1: 1000, AP182B; anti-keçi IgG, 1: 1000, AP180B, her ikisi de EMD Millipore, Billerica, MA, ABD) ile PBST-BSA içerisinde inkübe edildi. oda sıcaklığında 2 saat için. Kesitler daha sonra üreticinin talimatlarını izleyerek 90 dakika için avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (Vectastain ABC peroksidaz kiti, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, ABD) ile muamele edildi. Antijenler nihayet,% 0.02 H ihtiva eden 3,3 M Tris-HCl (pH 0.1) içinde% 7.6 0.01-diaminobenzidin (DAB) ile görselleştirildi.2O2. FosB / ΔFosB immüno-lekeleme için reaksiyon, nikel amonyum sülfat ile yoğunlaştırıldı. DCX boyama için, hücre çekirdeği Nissl boyama ile zıt edildi. Kesitler jelatin kaplı slaytlara monte edildi ve lameller yerleştirildi.
2.3: Görüntü eşiklemesi kullanılarak FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin ölçülmesi
Bu çalışmada kullanılan pan-FosB antikoru, FosB ve ΔFosB N-terminal bölgesi tarafından paylaşılan bir iç bölgeye karşı yükseltilmiştir, böylece iki izoform arasında ayrım yapamamaktadır. Bu nedenle immün boyanmış yapılar, FosB / ΔFosB immünoreaktif (FosB / ΔFosB-ir) çekirdeği olarak tanımlanmıştır. Tarafsız bir kör niceleme için, slaytlar analizden önce kodlandı. Fare beyni atlası [42], aşağıdaki ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) konumunu belirlemek için kullanıldı: dorsal hipokampusundaki DG (3 bölümleri) granül hücre katmanı (GCL), CA1 (3 bölümleri) piramidal hücre katmanı ve CA3 (2 – 3 bölümleri) (bregma -2.2 mm kapalı); DG (2 bölümleri), CA1 (2 bölümleri) ve CA3 (2 bölümleri) ventral hipokampüste (bregmadan -3.4 mm'ye kadar kapalı) (Şekil 4, ayrıldı). Kaudal bölümler, hipokampüsün hem dorsal hem de ventral kısımlarını içerir, ancak ventral kısım hedeflendi. DG'de, suprapiramidal (DGsp) ve infrapyramidal (DGip) bıçakları ayrı ayrı analiz edildi. Motor korteks (2 – 3 bölümler, bregma'dan -0.6 mm'ye kadar kapalı), somatosensoriyel varil korteks (2 – 3 bölümler, -0.6 mm'ye bregmadan kapalı), görsel korteks (3 bölümlere, -2.9 mm'den kapalı bregma), işitsel korteks (3 bölümleri, bregma'dan -2.9 mm'ye kadar kapalı) ve koku ampulü (3 bölümleri, bregma'dan + 4.3 mm'ye kadar kapalı) da analiz edildi (Şekil 6, ayrıldı).
Her ROI'nin dijital görüntüleri (2070 × 1548 piksel), bir CCD kamera (DP-51, Olympus) ve görüntüleme yazılımı (hücreSens, Olympus) ile donatılmış bir optik mikroskop (BX-73, Olympus, Tokyo, Japonya) kullanılarak alınmıştır. objektif lens büyütme hipokampal ROI'ler için 10 × ve kortikal ROI'ler için 4 × idi. Orta ila güçlü FosB / ΔFosB immünoreaktivitesini belirlemek için (Şekil 1D – GÖnceden birkaç bölüm kullanarak, hem görüntü toplama ayarları (ışık yoğunluğu, alan durma boyutu, pozlama süresi ve beyaz dengesi) hem de RGB bileşenlerinin her biri için eşik seviyeleri hipokampal ve kortikal ROI'ler için optimize edilmiştir. Daha sonra optimize edilmiş koşullar altında (1) aşağıdaki analiz yapıldı. ROI'lar düzensiz şekilli bir poligonla seçildi (Şekil 1A, B) (2). FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerini kırmızı renge dönüştüren görüntü eşiklendirildi (Şekil 1C-G) (3). Daha sonra% ROI otomatik olarak şu şekilde hesaplandı:% ROI = (dönüştürülen alan (kırmızı) / toplam ROI alanı) × 100.
Bu görüntü eşikleme analizini doğrulamak için, 20 bölgeleri farklı bölge boyutlarına sahip farklı beyin alanlarından rastgele seçildi. Görüntü eşikleme miktarına ek olarak, seçilen bölgelerdeki FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin sayısı manuel olarak sayıldı ve FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin yoğunluğu FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin sayısı ölçülerek bölünerek elde edildi. alan (mm2).
2.4: Dentat girustaki DCX-ir olgunlaşmamış nöronların miktar tayini
Runner farelerinin DG'sindeki DCX-ir olgunlaşmamış nöronlar bol miktarda ve örtüşüyordu, bu sayede optik bir mikroskop kullanılarak ayrık DCX-ir soma sayısını kesin olarak saymak zorlaştı. Bununla birlikte, önceki bir çalışmada, morfolojik değerlendirme için Sholl analizi, her DCX-ir nöronunun, ortalama olarak, somanın 40 withinm'si içinde ölçülen tek bir dendrite sahip olduğunu gösterdi.43]. Bu nedenle, DCX-ir nöronlarının bölgeye özgü miktar tayini için aşağıdaki orijinal analiz geliştirilmiştir.
- (1) GCL'nin bir görüntüsü, görüntüleme yazılımı ve bir 40 × objektif lensi (2) kullanılarak bir bilgisayar ekranında yansıtıldı. Canlı görüntüde, GCL'nin ortasına bir çizgi parçası (150 ± 0.1 μm) çizildi (Şekil 2) (3). Odak derinliğini değiştirerek, çizgi segmentinin DCX-ir dendritleri geçme sayısı (4) sayılır. ROI'ler (dorsal DGsp, dDGsp; dorsal DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip), FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin analiz edildiği bölgelere karşılık geldi (5). Her ROI'de, bölüm başına 2 – 3 çizgi parçası çizildi ve geçişlerin sayısı fare başına 2-3 bölümlerine göre ortalamalandı. GCL'nin kalınlığı yaklaşık olarak 60 – 80 ism olduğundan, geçişlerin sayısı analiz edilen sınırlı bölge içindeki DCX-i nöronlarının sayısını yansıtmalıdır.
DCX-ir olgunlaşmamış nöronların temsili bir görüntüsü ve DCX-ir dendritlerle geçişlerin sayımı için bir çizgi segmenti (150 ± 0.1 μm) kaplanmıştır.
3. Deney 2. Tekerlek hareketiyle indüklenen FosB / ΔFosB izoformunun tanımlanması
3.1: Perfüzyon ve doku işleme
Ek bir fare kohortu, Deney 1'te yukarıdaki gibi muamele edildi. 4'in haftalarca süren müdahalesinden sonra, fareler derin anestezi altında soğuk salinle transkardiyal olarak perfüze edildi. Hipokampus çabucak diseke edildi ve sıvı azotla donduruldu ve -80 ° C'de saklandı. Her bir farenin hipokampüsü, RIPA tamponunda homojenize edildi (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HC1, pH 7.6,% 1, NP-40, 1,% sodyum deoksikolat,% 0.1, SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, ABD) inhibitörleri (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Almanya). Lizatlar, 15 ° C'de 5000 rpm'de 4 dakika boyunca santrifüjlendi ve süpernatanlar toplandı. Protein konsantrasyonları, bir BCA Protein Test Kiti (#23227, Thermo Scientific, IL, ABD) ile ölçülmüştür.
3.2: Western lekelenmesi
Eşit miktarda protein (30 μg / şerit) bir% 10 poliakrilamid jeli üzerinde elektroforezlendi, sonra bir PVDF zarına (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, ABD) aktarıldı. Spesifik olmayan bağlanma, 1 h için TBN (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5,% 0.1% Tween-20) içinde 3 saat için önceden ön kuluçkalanarak bloke edildi. Membran, yukarıda 1% BSA içeren TBST içinde çözünen immünohistokimya için kullanılan pan-FosB antikoru (1000: 3) ile inkübe edildi. TBST ile yıkamayı takiben, zar, oda sıcaklığında 1 saat için HRP ile konjüge edilmiş anti-tavşan IgG antikoru (TBST içerisinde 5000: 934, NA1, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ile inkübe edildi. TBST ile yıkandıktan sonra protein bantları, Geliştirilmiş Kemilüminesans (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, ABD) ile inkübasyonla görselleştirildi ve Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) kullanılarak yakalandı. Zar daha sonra bir yükleme kontrolü olarak anti-gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) antikoru (# 2275, 1: 5000, TBS-T, Trevigen, MD, ABD) ile yeniden dolduruldu. Protein bantlarının optik yoğunluğu, Image-J kullanılarak ölçüldü ve GAPDH seviyesine normalleştirildi.
4: İstatistiksel analiz
Fare vücut ağırlığındaki değişiklikler, iki yönlü tekrarlanan ANOVA ölçümleri (grup x zaman) ile analiz edildi. Gruplar arasındaki istatistiksel farkları belirlemek için eşleştirilmemiş bir t-testi kullanıldı (Kontrol-Runner). FosB / ΔFosB immünoaktivite analizini (manuel sayma - görüntü eşiklemesi) doğrulamak ve DG'de FosB / ΔFosB ekspresyonu seviyesi ile DCX geçişlerinin sayısı arasındaki ilişkiyi incelemek için Pearson korelasyon analizi kullanıldı. Veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu. İstatistiksel anlamlılık için eşik değeri P <0.05.
Sonuçlar
1: Denemelerde vücut ağırlığı ve çalışma mesafesi 1 ve 2
1 ve 2 deneylerinde hem Control hem de Runner farelerin vücut ağırlığındaki değişiklikler bir araya getirilmiş ve gösterilmiştir. Şekil 3. İki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA önemli bir etkileşime işaret etti (grup x zamanı, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) ve grubun ana etkisi F(1, 18) = 6.07, P <0.05), Runner farelerinde önemli ölçüde daha düşük vücut ağırlığına işaret eder. Kafes başına çalışma mesafesi, Tablo 1. Her farenin kesin çalışma mesafesi, farelerin bir arada tutulduğu için belirsiz olmasına rağmen, düzenli gözlemler, bütün farelerin sık sık tekerlek çalıştığını doğruladı. Deney 2'teki Runner fareleri, Deney 1'tekinden daha uzun sürdü, ancak ortalama çalışma mesafesi (m / gün / kafes) her deney boyunca tutarlıydı.
2: Görüntü eşiklemesi kullanılarak FosB / ΔFosB immünoreaktivite miktarının doğrulanması
Görüntü eşiklemesiyle elde edilen FosB / ΔFosB-ir alanı ile manuel sayma ile elde edilen FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin yoğunluğu arasında anlamlı bir ilişki vardı (r = 0.941, P <00001, Şekil 4).
3: Hipokampusta FosB / ΔFosB immünoreaktivitesi
Dorsal ve ventral hipokampal alt alanlardaki FosB / ΔFosB immün boyanmasının temsili görüntüleri Şekil 5. Analiz edilen tüm ROI'lerde Runner farelerinde FosB / ΔFosB immünoreaktivitesi (Şekil 5, sağ) Niteliksel olarak Kontrol farelerinde olduğundan daha yüksek (Şekil 5, merkez). Runner farelerinde, nicel analiz, her iki dorsalde (DGsp: FosB / ΔFosB-ir bölgesinde önemli bir artış olduğunu göstermiştir. P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) ve ventral hipokampal alt alanlar (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Şekil 6).
4: Korteksin FosB / ΔFosB immünoreaktivitesi
Kortikal YG'lerde FosB / ΔFosB immüno lekelemesinin temsili görüntüleri aşağıda gösterilmiştir. Şekil 7. Kantitatif analiz, uzun süreli çalışma ile FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinde bölgeye bağlı değişiklikleri ortaya çıkardı (Şekil 8). Runner farelerinde, FosB / ΔFosB-ir alanı motor kortekste anlamlı derecede yüksekti (P <0.05) ve somatosensoriyel varil korteksi (P <0.05), ancak görsel kortekste değil (P = 0.662) veya koku ampulü (P = 0.523). İşitsel kortekste, FosB / ΔFosB-ir bölgesi, Runner farelerinde artışa yöneldi (P = 0.105).
5: Nörogenez
DCX immüno lekelemenin temsili görüntüleri Şekil 9. Dorsal hipokampusta, Runner farelerinde DCX immünoreaktivitesi (Şekil 9, sağda), Kontrol farelere kıyasla niteliksel olarak daha yüksekti (Şekil 9, ayrıldı). Dorsal hipokampusa kıyasla, ventral hipokampustaki DCX immünoreaktivitesi hem Kontrol hem de Runner farelerinde zayıftı. Runner farelerinde, geçiş sayısı dDGsp’te (P <0.01) ve dDGip (P <0.01; Şekil 10). Ventral hipokampüste, Runner farelerinde geçişlerin sayısının artma eğiliminde olduğu, ancak gruplar arasında anlamlı bir fark olmadığı belirlendi (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Şekil 10).
6: FosB / ΔFosB ifadesi ile nörojenez arasındaki korelasyon
FosB / ΔFosB-ir alanı ve DCX geçişlerinin sayısı arasında bir korelasyon analizi yapıldı (Şekil 11). Her veri seti (örn., Kontrol farelerinde dorsal DGsp) sadece 5 çiftlerinden oluştuğundan, analiz ilk olarak tüm 40 çiftleriyle gerçekleştirildi. Şaşırtıcı bir şekilde, FosB / ΔFosB-ir alanı ile DCX geçişlerinin sayısı arasında anlamlı bir ilişki vardı (r = 0.885, P <0.0001). Ayrıca dorsal DG (r = 0.762, P <0.05) ve ventral DG (r = 0.816, P <0.01) ayrı ayrı analiz edildi.
7: Uzun süreli çalışmaların neden olduğu FosB / ΔFosB izoformunun tanımlanması
Sonunda, isoform tanımlamak için FosB Uzun süreli çalışmalara yanıt olarak hipokampüste indüklenen gen ürünleri, ek bir fare kohortundan gelen hipokampi, aynı pan-FosB antikoru kullanılarak batı lekelenmesine maruz bırakıldı. ΔFosB ['un değiştirilmiş izoformlarını temsil eden çoklu 35 – 37 kDa bantları44], Runner ve Control farelerinde (Farelere karşı anlamlı derecede artmışŞekil 12, P <0.01). Öte yandan, 48 kDa FosB izoformu her iki grupta da tespit edilemezdi. 25 kDa'nın üzerinde zayıf bir şekilde görülebilen başka bir bant muhtemelen Δ2ΔFosB izoformunu (27 kDa) temsil etmektedir. 50 kDa'nın üzerinde ve 37 kDa'nın üzerinde iki bant daha vardı, bunlar büyük olasılıkla spesifik olmayan bağlanma nedeniyle idi. Miktar belirlendiğinde, gruplar arasında bu ΔFosB olmayan bantlarda hiçbir fark bulunmadı (veriler gösterilmemiştir).
Tartışma
Özet olarak, bu çalışma ilk önce 1'in incelenmesi için bir immünohistokimyasal analiz gerçekleştirmiştir.) Uzun süreli gönüllü tekerleklerin çalışmasının hipokampusta FosB / ΔFosB ekspresyonunu indükleyip tetiklemediği; ve 2) dorso-ventral ekseni boyunca bölgeye özgü bir cevabın olup olmadığı.
Dört haftalık gönüllü tekerlek çalışması, analiz edilen tüm hipokampal bölgelerde FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinde anlamlı bir artışa neden oldu (yani, hipokampüsün hem dorsal hem de ventral bölümlerinin DG, CA1 ve CA3 alt alanları). 35 – 37kDa ΔFosB izoformunun ana olduğunu onayladık FosB Uzun süreli çalışmaya cevap olarak biriken gen ürünü. Bu sonuçlar, uzun süreli düzenli egzersizin, hipokampus boyunca ΔFosB indüksiyonu için güçlü bir tetikleyici olduğu ve bunun endüksiyonunun, egzersizin çeşitli dorsal ve / veya ventral hipokampusa bağlı fonksiyon tiplerini etkilediği yeni bir moleküler mekanizma olabileceği hipotezini açıkça desteklemektedir.
1: Görüntü eşiklemesi kullanılarak FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin miktarının belirlenmesi ve sınırlandırılması
Hedef hücre sayısını saymak ve hücre morfolojisini değerlendirmek için immünohistokimyasal çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir görüntü eşleştirme tekniği, bu çalışmada FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin bölgeye özgü miktarının belirlenmesi için kabul edildi [15,45,46]. Görüntü eşiklemesi ve manuel sayma ile ölçülen FosB / ΔFosB immünoreaktivite düzeyleri arasında anlamlı bir ilişki olduğu gösterilmiştir (Şekil 4). Bununla birlikte, yoğunluk ve örtüşme, oldukça yoğun alanlarda FosB / ΔFosB-ir çekirdek sayısının sayılmasını engellediğinden, gösterilen korelasyon yalnızca FosB / ΔFosB-ir alanları toplam ROI'nin <~% 40'ını temsil ettiğinde görüntü eşikleme yönteminin doğruluğunu ifade eder. alan. Bu nedenle, FosB / ΔFosB-ir alanları toplam ROI alanının>% 40'ı için dikkatli yorumlama gereklidir.
Özellikle, Runner farelerinin DG'sinde (Şekil 4), FosB / ΔFosB ifadesi tekerlekler tarafından büyük ölçüde uyarıldı ve FosB / ΔFosB-ir çekirdeklerinin çoğu üst üste bindi. Bu alanlarda, artan FosB / ΔFosB ifadesinin indüksiyonu, kullanılan miktar tayin yönteminden (resim eşikleme veya manuel sayma) bağımsız olarak ifade seviyesinin daha düşük bir tahminine neden olur. Bununla birlikte, hafife alınma riskine rağmen, bu çalışmanın, Runner farelerin DG'sinde FosB / ΔFosB-ir bölgesinde önemli bir artış gösterdiğini başarıyla not etmek önemlidir. Bu, metodolojik sınırlamaların bulgularımızdan ödün vermediğini göstermektedir. Bunun yerine, potansiyel küçümseme, uzun vadeli koşuların hipokampüsteki FosB / ΔFosB immünoreaktivitesini arttırdığı bulgusunun güvenilirliğini arttırır.
2: Hipokampus içinde ΔFosB'nin uzun süreli çalışma ile tek tip indüksiyonu
Hipokampüsün boyuna ekseni boyunca anatomik ve fonksiyonel gradyanları vardır [26], bu nedenle bu çalışma için, hipokampüsün dorsal ve ventral bölümlerinde FosB / ΔFosB immünoreaktivitesi ayrı ayrı analiz edildi. Veriler, uzun süreli çalışmanın düzenli olarak, ölçülen tüm hipokampal YG'lerde FosB / ΔFosB ifadesini arttırdığını göstermiştir. FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin bu homojen indüksiyonu, uzun süreli çalışma ile ilişkili sistemik metabolik değişikliklerden spesifik olarak kaynaklanmayabilir. Bununla birlikte, kortekste bölgeye özgü FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinde bir artış olduğunu not etmek önemlidir. Bu sonuç, koşu bandı akut bir koşu akışının hipokampüste bölgesel serebral kan akımını arttırdığını ancak koku giderici ampulde olmadığını gösteren son bulgular ile desteklenmiştir [8]. Ayrıca, Rhodes ve ark. (2003), gönüllü tekerlek kullanan 7 günlerinin, hipokampusun DG ve CA2 / 3'inde (CA1 ölçülmedi) ve duyusal korteks içinde c-Fos ekspresyonuna neden olduğunu gösterdi, ancak görsel kortekste [847]. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar hipokampüste FosB / ΔFosB ifadesinin tek tip indüksiyonunun uzun süreli çalışmanın spesifik olmayan bir sonucu olmadığını göstermektedir. İlginç şekilde, Hawley ve ark. Kısa süre önce, kronik öngörülemeyen stresin, dorsalde FosB / ΔFosB ekspresyonunu arttırdığını, ancak sıçan hipokampüsünün DG'sinin ventralde olmadığını bildirdiğini [48]. Daha fazla araştırma ile, egzersiz veya stres ile ortaya çıkanlar gibi FosB / ΔFosB indüksiyonunun farklı desenleri, hipokampus üzerindeki uyarıcıya bağlı etkilere dair sürekli içgörü sağlayacaktır.
Bu çalışmada kullanılan birincil pan-FosB antikorunun, FosB proteinlerinin tüm izoformlarını tanıdığı bilinmektedir. Western blot analizi üzerine, uzun süreli koşudan sonra hipokampüste artan tek izoformların, Fos ailesi proteinleri arasındaki tek stabil izoform olan ΔFosB (35 – 37 kDa) 'nın değiştirilmiş izoformları olduğunu bulduk [[]11]. Bu bulgu, 35 – 37 kDa ΔFosB'nin, kronik stres ile ön kortekste indüklenen baskın Fos ailesi proteini olduğunu göstermek için pan-Fos antikorunu kullanan önceki çalışmalara uygundur [44]. Bu nedenle, uzun süreli koşuların neden olduğu hipokampal FosB / ΔFosB immünoreaktivitesindeki artış, büyük olasılıkla ΔFosB seviyesini yansıtmaktadır.
Egzersizin bölgeye özgü etkileri ile hipokampüsün moleküler ve yapısal yönleri hakkında daha az şey bilinmektedir. Bununla birlikte, sayısız davranışsal çalışma, hem dorsal hem de ventral hipokampal fonksiyonlarda egzersize bağlı gelişmeler için büyük bir potansiyel olduğunu göstermektedir. Mekansal öğrenmeyi ve hafızayı iyileştirmek için egzersiz yapıldığı gösterilmiştir [34-38] ve mekansal ve bağlamsal işlem esas olarak dorsal hipokampusa [bağlıdır27,28]. Buna karşın, egzersizin aynı zamanda anksiyolitik ve antidepresan özellikler gösterdiği de bilinmektedir [24,25,38] ve bu duygusal tepkiler ağırlıklı olarak ventral hipokampus tarafından düzenlenir [29,30]. Bu çalışmada görülen longFosB'nin uzun süreli çalışmayla homojen olarak uyarılması, tüm hipokampus boyunca bir çeşit nöroplastik değişiklik meydana geldiğini göstermektedir. Bu, egzersizin neden hem dorsal hem de ventral hipokampusa bağlı fonksiyonları etkileyebileceğini açıklar.
3: Bölgeye özgü egzersize bağlı nörojenez analizi
Dorsal ve ventral hipokampus arasında nörojenezin fonksiyonel ayrışması da giderek daha fazla dikkat çekmektedir [49]. Bu çalışmada, DCX-ir olgunlaşmamış nöronların morfolojik özelliklerinden yararlanarak [43], DCX-ir dendritler ve GCL'nin ortasına çizilen bir çizgi parçası arasındaki kesişme sayısını saydık. Bu ölçüm, DG'deki toplam DCX-ir nöron sayısını sağlamadı, ancak FosB / ΔFosB ekspresyon verileri ile korelasyon analizi yapmak için gerekli bölgeye özgü nicelemeyi sağladı (aşağıya bakınız). Uzun süreli çalışmanın ardından, DCX-ir nöronlarının sayısı dorsalde belirgin şekilde artmış, ancak ventral DG'de artış göstermiştir. Bu, egzersizin DG'nin ventral kısmına kıyasla dorsalde nörogenezi daha çarpıcı şekilde uyarabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, dorsal ve ventral DG'de tekerleğin çalışmasının nörogeneziyi arttırdığı çelişkili sonuçlar bildirmiştir [50,51]. Bu çalışmada, ventral DG'deki DCX-ir geçişlerinin sayısı koşma ile artma eğilimindeydi, ancak küçük örneklem büyüklüğü (grup başına 5 fareler) gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark tespit etme yeteneğini sınırlamış olabilir. Bu nedenle, gönüllü tekerleğin çalışmasının ventral hipokampal nörogenezi uyaran olasılığını ekarte etmek olasıdır. Çok aşamalı süreçle (hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve hayatta kalma) ilgili egzersize nörojenezin bölgeye özgülüğünü anlamak için daha ayrıntılı çalışmalar gereklidir.
4: Hipokampal plastisitenin düzenlenmesi için egzersize bağlı ΔFosB indüksiyonunun fonksiyonel etkileri
Son olarak, hipokampusta egzersizle indüklenen ΔFosB indüksiyonunun fonksiyonel etkilerini tanımanın ilk adımı olarak, FosB / ΔFosB immünoreaktivitesinin hem dorsal hem de ventral DG'deki DCX-ir geçişleriyle olan ilişkisini inceledik ve arasında anlamlı bir pozitif korelasyon tespit ettik. iki değişken. BFosB’in egzersize bağlı nörogenezi düzenleyen kesin mekanizmaların belirsiz kalmasına rağmen, son zamanlarda yapılan bir çalışma FosB-FosB, ΔFosB ve Δ2ΔFosB eksikliği olan boş fareler FosB ürünler), nöronal progenitör hücrelerin proliferasyonunun azalması, yenidoğan nöronlarının ektopik göçünün artması ve anormal DG yapılarının dahil olduğu, bazal hipokampal nörogenezde eksiklikler ortaya çıkardı.20]. Ancak, bu değişiklikler gözlenmedi FosB(Eğer D / D) FosB'siz ancak ΔFosB / Δ2ΔFosB olmayan fareler. İlginçtir ki FosB-null fareler, aşağıdakiler de dahil olmak üzere bazı nörogenez ile ilgili genlerin ekspresyonu VGF (VGF sinir büyüme faktörü indüklenebilir) ve gal (Galanin prepropeptid) aşağı regüle edildi [20]. VGF ve GAL salgılayıcı moleküller oldukları için holdsFosB ifade eden nöronların otokrin / parakrin aktivitesiyle nörogenezi düzenleyebileceğini vaat eden bir öneri [120].
Ek olarak, ΔFosB'nin nörojenik aktivitenin yüksek olduğu bölge ile uzamsal olarak üst üste binmesiyle indüklendiği bölgenin belirtildiği belirtilmelidir. Bu bulgu, egzersizle indüklenen nörojenezin asgari aktiviteye bağlı olduğunu göstermektedir. Nöronal aktivasyon, merkezi sinir sistemi fonksiyonunu korumak ve geliştirmek için anahtardır [9], beyin kaynaklı nörotrofik faktörün (BDNF) ekspresyonu ve salınımını içeren mekanizmalar yoluyla [52,53], kan-beyin bariyeri yoluyla serum insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1) alımı [54,55], apoptozun baskılanması [56] ve mitokondriyal hareketliliğin düzenlenmesi [57]. Bu nedenle, bu çalışma, uzun süreli egzersizin, potansiyel olarak yukarıda açıklanan bu çoklu mekanizmalar yoluyla hipokampal plastisitenin arttırılmasına katkıda bulunan artmış ΔFosB ifadesinde belirgin olan, tekrarlanan nöronal aktivasyonu tetiklediğini ortaya koymaktadır.
Bu çalışma sadece egzersize bağlı nörogenezi ve DG'deki FosB / ΔFosB ekspresyonu ile ilişkisini değerlendirmiştir. Bununla birlikte, FosB / ΔFosB immünoreaktivitesi, CA1 ve CA3 alt alanlarında da indüklenmiştir. Bu alt alanlardaki egzersizle indüklenen ΔFosB ifadesinin işlevsel rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için daha ileri çalışmalar gerekli olsa da, önceki literatür umut verici bir olasılık sunar. Guan ve diğ. (2011), sırasıyla CA5 veya CA5 piramidal nöronlardaki sikline bağımlı kinaz 1'in (Cdk3) spesifik ablasyonunun, sırasıyla hafıza konsolidasyonunu veya alımını bozduğunu göstermiştir [58]. İlginçtir, Cdk5, ΔFosB ['un aşağı akış hedefidir.59] ve sinaptik plastisitenin düzenlenmesine katılmaktadır [60]. Bu nedenle, egzersize bağlı ΔFosB ifadesi, CA5 ve CA1 alt alanlarında Cdk3 aktivasyonu ile sinaptik plastisitenin düzenlenmesiyle ilgili olabilir.
Sonuç
Akut egzersiz nöbetlerinin, hipokampustaki erken erken gen proteinlerinin ekspresyonunu indüklediği bilinmesine rağmen, bu çalışma, uzun süreli düzenli egzersizin hipokampüsteki BFosB ekspresyonunu önemli ölçüde indüklediğine dair ilk kanıtı sağlar. thBFosB'nin tek tip indüksiyonu, egzersizin çoklu hipokampal fonksiyonları iyileştirebilecek etkin bir farmakolojik olmayan müdahale olduğu şeklindeki mevcut anlayışı desteklemektedir. FosB / ΔFosB ekspresyonu ve nörojenez arasındaki anlamlı korelasyon ile birlikte, bu veriler kışkırtıcıdır ve genFosB'nin egzersizin nörojenez de dahil olmak üzere hipokampal fonksiyon üzerindeki etkilerine aracılık etmedeki rolünü belirten ileri çalışmalara ihtiyaç olduğunu göstermektedir.
Finansman Beyanı
Referanslar
;