Kaynak
Nathan Kline Enstitüsü, Orangeburg, New York, 10962, ABD. [e-posta korumalı]
Özet
Çocuklar ve ergenler, yasadışı olarak veya hiperaktivite olan ve olmayan dikkat eksikliği bozukluğu gibi yaygın nöropsikiyatrik durumların tedavisi için, psikostimulanlara giderek daha fazla maruz kalmaktadır. Daha genç yaş gruplarında psikomotor uyarıcıların yaygın olarak kullanılmasına rağmen, olgunlaşmamış beyindeki bu ajanlara kronik moleküler nöroadaptif tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, psikostimulanların kronik olarak uygulanmasından sonra gösterdik. kokain ve amfetamin, transkripsiyon faktörü DeltaFosB çekirdeğinde accumbens düzenlenir periadolescent fareler ama sonradan veya yetişkinlerde değil fareler. İndüksiyonu DeltaFosB ayrıca sadece kaudat putamenlerinde görülür. periadolescent fareler sonra amfetamin yönetim. Bu sonuçlar, ergen beynindeki, psikostimulan eylemini düzenleyen kritik bir molekülün benzersiz plastikliğini göstermektedir ve bu nöroadaptif değişikliklerin aracılıkta rol oynayabileceğini öne sürmektedir. gelişmiş ergende ergenliğe bağımlılık eğilimi.
Giriş
Psikostimülanlar, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu gibi yaygın çocukluk rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılır. Ayrıca, amfetamin ve kokain de dahil olmak üzere uyarıcıların kötüye kullanımı, ergenlere göre bağımlılık eğilimlerinin artmış olduğuna dair kanıtların bulunduğu bir yaş olan ergenler arasında yaygındır (Estroff ve diğerleri, 1989; Myers ve Anderson, 1991). Gelişimsel olarak düzenlenmiş davranışsal etkileri gösteren verilere rağmen, bu ajanların uygulanması sırasında ortaya çıkan olgunlaşmamış beyindeki moleküler nöroadaptif tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Kokain ve amfetamin, kısmen dopamin D'nin uyarılması yoluyla uzun süreli davranış değişikliklerini etkileyebilir1dorsal striatumda (yani, kaudat putamen) ve ventral striatumda (yani, çekirdek accumbens), ΔFosB dahil transkripsiyon faktörlerinin reseptörleri ve artışları (Chen ve arkadaşları, 1997). Belki protein ürünlerinin stabilizasyonu yoluyla BFosB seviyelerindeki artış, kokaine veya amfetamine kronik olarak maruz kaldıktan sonra birkaç hafta boyunca sürdürülür ve en azından kısmen dopamin sinyal iletim yolu ile düzenlenir (Chen ve arkadaşları, 1997; Nestler ve arkadaşları, 2001).
Genç hayvanların merkezi dopaminerjik sistemi, dopamin D de dahil olmak üzere normal gelişim sırasında değişen kritik molekül seviyelerinin bir sonucu olarak akıdadır.1reseptör DARPP-32 (dopamin ve cAMP ile düzenlenmiş fosfoprotein; Mr 32 kDa) ve cAMP (Ehrlich ve diğerleri, 1990;Teicher ve arkadaşları, 1993; Perrone-Capano ve diğerleri, 1996; Tarazi ve diğerleri, 1999;Andersen, 2002). Bu süre zarfında dopaminerjik nörotransmisyonu artıran psikostimulanlara maruz kalma, bu nedenle ΔFosB ifadesindeki değişiklikler de dahil olmak üzere kantitatif ve / veya kalitatif olarak farklı moleküler tepkilere neden olabilir. Psikostimulanlara kronik maruz kalma sırasında yaşa bağlı nöroadaptif yanıtların olduğu hipotezini test etmek için seri deneylerde üç fare grubu analiz edildi: yetişkinler (enjeksiyonların başlangıcında eski 60 d), periadolesan (enjeksiyonların başlangıcında 33 d), ve kışlama sonrası (enjeksiyon başlangıcında 24 d). Bu, bu üç yaş grubunda, kronik psikostimulanın maruz kalmasına verilen moleküler nöroadaptif yanıtların ilk doğrudan karşılaştırmasıdır. Aynı tedavi paradigmalarından sonra, periadolesan farelerin, hem kokain hem de amfetamine cevap olarak artmış ΔFosB yukarı regülasyonu gösterdiğini gördük.
MALZEMELER VE YÖNTEMLER
Hayvanlar ve ilaç yönetimi. Erkek CD-1 fareleri (Charles River Laboratories, Kingston, NY), bir 12 saat ışık / karanlık döngüsü (6: 00 AM ila 6: 00 PM) üzerine yerleştirildi. ad libitumyemek ve suya erişim. Hayvanların enjeksiyon başlamadan önce hayvan odasına en az 10 d sığdırmasına izin verildi. Hayvanlar, tüm enjeksiyonları, hayvanların bulunduğu aynı odada yapan iki araştırmacı tarafından gerçekleştirildi. Tüm hayvanlar, 21 d yaşındayken sütten kesildi. Enjeksiyonlar, 24 (kışlama sonrası), 33 (periadolesan) veya 60 (yetişkin) yaşlarında başladı. Hayvanlar, 20 d: 5 mg / kg kokain (Sigma, St. Louis, MO), 4 mg / kg amfetamin (Sigma) veya günlük 00: 5 ve 00 PM arasında periton içine eşit miktarda salin almıştır. Hayvanlar CO'ya kısa süre maruz kaldıktan sonra başları kesilerek öldürüldü.2 10'te: Son enjeksiyondan sonraki gün 00 AM. Beyinler kafatasından derhal çıkarıldı ve kaudat putamen ve çekirdek akumbenler buz üzerinde hızla diseke edildi. Tüm diseksiyonlar tek bir araştırmacı tarafından koronal beyin dilimlerinden yapıldı ve taze dokulardan donmadan protein ekstraktları hazırlandı. Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitülerine uygun olarak yapıldı. Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı İçin Rehber.
Western blot analizi. Western blot analizleri için, her bir numuneden eşit miktarda protein (kaudat putamen için 40 andg ve çekirdekler için 20 )g), BCA testiyle protein konsantrasyonlarının ölçülmesinden sonra her bir 10% SDS-poliakrilamid jel şeridine yüklenmiştir (Pierce, Rockford, IL). Eşit protein yüklemesi, nitroselüloza transfer edildikten ve / veya anti-aktin antikoru (1: 500; Sigma) ile lekelemeden sonra toplam proteinin Ponceau Red tarafından görselleştirilmesiyle de doğrulandı. BFosB izoformlarını tanıyan Fos ile ilgili antijen (FRA) antiserumu, Dr. M. Iadarola (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) tarafından cömertçe sağlandı ve bir 1: 4000 konsantrasyonunda kullanıldı. Önceki çalışmalar (Chen ve arkadaşları, 1997; Hiroi ve diğerleri, 1997), FRA antiserumunun M-peptid immünojeniyle önceden emilimi dahil, bu antiserumun özgüllüğünü gösterdi. 32: 5'te kullanılan DARPP-1 10,000a monoklonal antikoru, Dr. Hugh Hemmings ve Paul Greengard (Rockefeller Üniversitesi, New York, NY). Dopamin taşıyıcı (DAT) antikoru Chemicon (Temecula, CA). Lekeler, NEN-DuPont (Boston, MA) kemilüminesans sistemi ile reaksiyona sokuldu ve filme maruz bırakıldı. BFosB immünoreaktivitesi için densitometrik değerler, Apple için ScanAnalysis (Biosoft, Ferguson, MO) kullanılarak elde edildi. İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA kullanılarak belirlendi, ardından Post hoc Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi veya eşleşmemiş, iki kuyruklu bir Öğrencinin t Şekil açıklamalarında belirtildiği gibi test edin. İlaç tedavisi deneyleri için, her yaş grubunun analizi ayrı bir leke üzerinde yapıldı ve bu nedenle, her salin grubuna yaş grupları arasında karşılaştırma için keyfi bir şekilde% 100 değeri verildi. Ongeny çalışmaları için tüm yaş gruplarından örnekler tek bir blot üzerinde birlikte analiz edildi.
SONUÇLAR
Kokain ve amfetamin sonrası ΔFosB'nin indüksiyonu, sadece periadolesan farelerin çekirdeğinde meydana gelir.
BFosB ekspresyonu, 7 d amfetamin veya kokain uygulamasından sonra, sütten kesilmiş, periadolesan ve yetişkin farelerin kaudat putamenlerinin çekirdek akumbens ve kaudat putamenlerinde ölçülmüştür. Çekirdek akümülatörleri, psikostimulanların ödüllendirici etkilerine aracılık etmek için en kritik olduğuna inanılan beyin bölgesidir. OsFosB immünoreaktivitesi (35 kDa), amfetamin kronik uygulamasından sonra periadolesan hayvanların çekirdeğinde bulunan akumbenslerde selektif olarak indüklenmiştir (Şek. 1 A) veya kokain (Şek. 1 B). Aksine, osFosB (35 kDa) seviyeleri, kışlama sonrası veya yetişkin hayvanların çekirdeğinde meydana gelen kabuklarda önemli ölçüde değişmedi (Şek.1 A,B). Kaudat putamenlerinde, periFosB seviyeleri (35 kDa), sadece periadolsan hayvanlarda kronik amfetamin tatbikinden sonra da önemli ölçüde artmıştır (Şek.2 A). Her üç yaş grubu da, kronik kokain uygulamasından sonra kaudat putamenlerde ΔFosB (35 kDa) ekspresyonunda anlamlı artış gösterdi (Şek.2 B). Bununla birlikte, indüksiyonun büyüklüğü, periadolesan hayvanlarda, özellikle de sütten kesmeden sonrakilere kıyasla en büyüktü (Şek. 2 B). Diğer FRA ve Fos izoformları tüm yaş gruplarında değişmedi (veriler gösterilmemiştir).
Çekirdekteki BFosB immünoreaktivitesi, kronik psikostimulanın uygulanmasından sonra toparlanır. CD-1 farelerine, günde 7 (24 gününden başlayarak, XNUMX d için salin, amfetamin veya kokain enjekte edildi)P24; weanling sonrası, gün 33 (P33; periadolescent) veya gün 60 (Yetişkin). Çekirdek akümenlerinde ΔFosB (35 kDa) immünoreaktivite düzeyleri, kronik amfetamin sonrası gösterilmiştir (A) veya kokain (B) yönetim. Tuzlu sudan temsili immünoblots- (S), amfetamin- (A) ve kokain-C) kışma sonrası enjekte edildi (P24), periadolescent (P33) ve yetişkin fareler üst paneller. Alt paneller Bazal ΔFosB ifadesinin ortalama ± SEM yüzdesini gösterir. n Her grup için değerler Barlar. BFosB’de belirgin artışlar sadece periadolesan farelerin çekirdeğinde bulunan Accumbens’te bulunmuştur. *p <0.05; **p <0.01 (Öğrenci t Ölçek; saline ilacı).
Kronik psikostimulan uygulaması sonrası kaudat putamenlerde FOSB immünoreaktivitesi. CD-1 farelerine, günde 7 (24 gününden başlayarak, XNUMX d için salin, amfetamin veya kokain enjekte edildi)P24; weanling sonrası, gün 33 (P33; periadolescent) veya gün 60 (Yetişkin). Kaudat putamenlerde ΔFosB (35 kDa) immünoreaktivite düzeyleri, kronik amfetamin sonrası gösterilmiştir (A) veya kokain (B) yönetim. Tuzlu sudan temsili immünoblots- (S), amfetamin- (A) ve kokain-C) enjekte edilen periadolosanlı fareler (P33) gösterilirüst paneller. Alt paneller Bazal ΔFosB ifadesinin ortalama ± SEM yüzdesini gösterir. n Her grup için değerler Barlar. Sadece periadolesan farelerin kaudat putamenlerinde ΔFosB immünoreaktivitesinde belirgin amfetamin kaynaklı artışlar bulundu (A). Kronik kokain uygulaması, her üç yaş grubunda da ΔFosB’de artış sağlamıştır (B). *p <0.05; **p <0.01 (Öğrenci t Ölçek; saline ilacı).
DAT ve DARPP-32 düzeyleri kronik kokain veya amfetamin sonrası değişmedi
DARPP-32, D de dahil olmak üzere, dopaminerjik ve / veya dopaminosiseptif nöronlar tarafından eksprese edilen birkaç anahtar molekül1 dopamin reseptörü ve DAT, psikostimulanlara akut ve kronik tepkilere katkıda bulunur (Moratalla ve arkadaşları, 1996; Fienberg ve arkadaşları, 1998; Sora ve diğerleri, 1998; Gainetdinov ve diğerleri, 2001). DARPP-32, D verileri1 reseptör ve DAT boşluğu ve DAT yok etme fareleri, seviyeleri, dopaminerjik aktivitenin düzenlenmesi ve psikostimulanlara tepkileri arasında karmaşık bir ilişki olduğunu gösterir. Aslında, coFosB indüksiyonu, kronik kokain alan DARPP-32 null farelerde oluşmaz (Fienberg ve arkadaşları, 1998). Bununla birlikte yetişkin farelerde, 7 d, 20 mg / kg kokaine maruz bırakılması, toplam DARPP-32 seviyelerini değiştirmez (Fienberg ve arkadaşları, 1998). DAT protein regülasyonu, daha önce kronik olarak psikostimülanlara maruz kalan farelerde rapor edilmemişti, ancak bazı türlerde psikostimülanlara maruz kaldıktan sonra dopamin taşıyıcıya bağlanan radyoligand değişiklikleri bildirilmiştir (Letchworth ve arkadaşları, 2001). Burada, üç fareden herhangi birinde kronik psikostimulan uygulamasından sonra bu proteinlerin ekspresyonunun değiştirilip değiştirilmediğini belirlemek için DARPP-32 ve DAT proteini seviyelerini ölçtük. Bulgularımız, üç yaş grubunun hiçbirinde kokain veya amfetamin kronik olarak uygulanmasından sonra tüm kaudat putamen veya çekirdek akumbenlerde toplam DARPP-32 veya DAT seviyelerinde anlamlı bir değişiklik olmadığını göstermektedir (Tablo 1).
Amfetamin ve kokainle muamele edilmiş P32, P24 ve yetişkin farelerde DARPP-33 ve DAT için göreceli densitometri değerleri, kontrol, salin değerlerine göre keyfi bir şekilde% 100 olarak ayarlanmış yetişkin farelerde
Temel seviyelerde ΔFosB gelişimsel olarak düzenlenir
ΔFosB'nin genetiğini inceledik çünkü genetik olarak değiştirilmiş striFosB ifadesinin genetik olarak arttırılmış striFosB ifadesine sahip yetişkin fareler, psikostimulanlara karşı artan bir davranışsal tepkiye sahiptir (Kelz ve diğerleri, 1999). Bazal BFosB seviyelerinin daha genç hayvanlarda, kaudat putamen ve nukleus accumbens'te erişkinlere kıyasla anlamlı derecede düşük olduğunu bulduk (Şek.3 A). DARPP-32 (dahil olmak üzere, dopamin sisteminin fonksiyonel belirteçlerinin seviyeleri)Ehrlich ve diğerleri, 1990), DAT (Perrone-Capano ve diğerleri, 1996) ve dopamin reseptörleri (Teicher ve arkadaşları, 1993; Tarazi ve diğerleri, 1999) ayrıca gelişimsel olarak düzenlenmiştir. CD-1 farelerdeki önceki raporlar, doğum sonrası 32 (P28) gününde striatal DARPP-28'te bir zirveye işaret eder (Ehrlich ve diğerleri, 1990). Sıçan kaudat putamen ve çekirdeğinde accumbens, D1P28'ten P40'e kadar en yüksek reseptör seviyeleri (Teicher ve arkadaşları, 1993; Tarazi ve diğerleri, 1999) ancak benzer çalışmalar farede gerçekleştirilmemiştir. Buna karşılık, burada kaudat putamen ve çekirdek akumbensindeki DAT protein seviyelerinin, doğum sonrası 24 ve yetişkinlik arasında sabit olduğunu bulduk (Şek. 3 B). Böylece, D arasındaki bağıl oranlar1 reseptörler, DAT, DARPP-32 ve ΔFosB yaş grupları arasında farklılık gösterebilir ve potansiyel olarak D farklılığına neden olur1 BFosB indüksiyon derecesini etkileyebilecek reseptör etkinliği.
BFosB ve DAT’ın gelişimsel ifadesi. A, CDFosB (35 – 37 kDa) kaudat putamen ve nükleustaki immünoreaktivite, naif CD-1 farelerinin yaşının bir fonksiyonu olarak çökmesine neden olur. Temsilci immünoblotlar üst paneller.Alt paneller gösteri, grup başına üç farenin ± SEM'ini gösterir. *p <0.05, yetişkin ve P24; #p <0.05, yetişkin ve P36 (Tukey'nin ANOVA'dan sonra çoklu karşılaştırma testi). BKaudat putamen ve çekirdekte DAT immünoreaktivitesinin Densitometrik değerleri, yaşın bir fonksiyonu olarak naif CD-1 fareler için accumbens. DAT seviyeleri üç yaş grubu arasında farklılık göstermedi.
TARTIŞMA
Psikomotor uyarıcıların davranışsal etkileri yaşa bağlıdır. Yasadışı madde kullanımı arttığında, bağımlılık eğilimleri ergenlikte en yüksektir (Estroff ve diğerleri, 1989; Myers ve Anderson, 1991). Aslında, küçük çocuklar psikostimulanlara maruz kaldıklarında sıklıkla disforik hale gelirler, oysa ergenler ve yetişkinler öfori yaşarlar (Rapoport ve diğerleri, 1980). Kemirgen modellerinde, bazı çalışmalar periadolesan hayvanların bazal aktivite seviyelerinin daha yüksek olduğunu göstermektedir (Mızrak ve Fren, 1983) ve daha genç ve yaşlı hayvanlara göre psikostimulanlara verilen tepkiler değişmiştir. Bu nedenle, zayıflayan ve yetişkin hayvanlara göre akut düşük doz psikostimulanların uygulanmasına yanıt olarak daha az lokomotor stimülasyonu ve yenilik sergilerler ancak yüksek doz tedavisinden sonra artan hiperaktivite gösterirler. Kronik uygulamada, kokaine bağlı harekete duyarlılık, yetişkinlere göre periadolosan sıçanlarda daha yüksektir, oysa stereotipe duyarlılık daha düşüktür. Ayrıca, mikrodiyaliz verileri, periadolesan ve yetişkin sıçanlar arasında, amfetamin kaynaklı dopamin salınımına karşı duyarlılık açısından farklılıklar ortaya çıkarmıştır (Laviola ve arkadaşları, 1995; Adriani ve diğerleri, 1998; Adriani ve Laviola, 2000;Laviola ve arkadaşları, 2001). Bununla birlikte, ergen sıçanlarında metilfenidat verildikten sonra kokaine uzun vadeli reaktivite konusunda çelişkili çalışmalar bulunmaktadır (Brandon ve diğerleri, 2001; Andersen ve diğerleri, 2002). Bu son iki rapor, farklı deneysel paradigmalar kullanıldığında yapılan çalışmaların karşılaştırılmasındaki zorluğu vurgulamaktadır. Daha genç hayvanlarda yapılan davranış çalışmalarını karşılaştırma girişimleri, farklı tür ve suşların kullanılmasıyla daha da karıştırılmaktadır.
Fare, psikostimulanların kullanımı ve kötüye kullanılması çalışmasında giderek daha önemli bir hayvan modeli haline geliyor ve bu, faredeki veya başka herhangi bir tek türdeki üç farklı gelişim çağında moleküler nöroadaptif yanıtların ilk sistematik analizi. Tedavi paradigmalarımızı türettiğimiz önceki çalışmalar, kronik kokain ve amfetamin uygulamasından sonra vahşi tip yetişkin sıçanların izole dorsal ve ventral striatumunda ΔFosB'de bir artış göstermiştir (Hope ve diğerleri, 1994; Nye ve diğerleri, 1995; Turgeon ve diğerleri, 1997) ancak kronik kokainden sonra sadece kombine dorsal ve ventral striatum veya vahşi tip yetişkin farelerin izole dorsal striatumunda (Fienberg ve arkadaşları, 1998; Zachariou ve arkadaşları, 2001).
Şimdi, weanling, periadolescent ve yetişkin farelerde psikostimulan kaynaklı ΔFosB'de uzamsal ve kantitatif bir fark gösterdik. Periadolosanlı hayvanlarda erişkinlere ve post-kışlamalara kıyasla artmış bir tepkinin gözlemlenmesi, tepkinin kokain ve amfetaminle tedavi edilmiş farelerde benzer olması gerçeğiyle kuvvetlendirilir. Psikostimülanlar kokain ve amfetamin, hem sinaptik dopamini hem de serotonin ve norepinefrini arttırır, ancak farklı mekanizmalar ile. Kokain, dopamin, serotonin ve norepinefrin için plazmalemma taşıyıcılarına bağlanır ve presinaptik terminallere geri alımlarını inhibe eder. Buna karşılık, amfetamin, bu vericilerin salınımını teşvik eder. Nükleustaki ΔFosB'nin indüklenmesi, uyarıcı uygulamasının 7 d'sinden sonra sadece periadolesan yaş grubunun akümülatörleridir ve kaudat putamende ΔFosB'nin göreceli olarak artmış indüksiyonu, daha önce belirtilmiş olan artmış psikostimülanları kötüye kullanma eğiliminin nedeni olabilir. yaş grubu (Estroff ve diğerleri, 1989; Myers ve Anderson, 1991) ve gen ifadesinde, yaş grupları arasında farklılık gösteren diğer uzun vadeli değişiklikler (Andersen ve diğerleri, 2002). Ayrıca, bu farklılıklar, ΔFosB'nin kendisi de dahil olmak üzere, kilit molekül seviyelerindeki gelişimsel değişiklikler ile doğal olarak düzenlenebilir. Yaş grupları arasında bazal ΔFosB seviyelerindeki farklılıkların potansiyel etkileri, sıçan suşları arasındaki farklar için önerilenlere benzerdir (Haile ve diğerleri, 2001). Aslında, benzer gerginlik farklılıklarının yerli fareler arasında bulunacağını tahmin ediyoruz. Aynı zamanda, farklı yaştaki farelerin, beynin çekirdeğin akümülatörleri dışındaki bölgelerinde farklı moleküler adaptasyonlar göstermesi de mümkündür. Ana molekül seviyelerinde genetik olarak değiştirilmiş değişikliklere ve eş zamanlı davranış gözlemlerine sahip periadolesan fareler kullanılarak yapılan ek analiz bu hipotezleri daha da test edecektir.
Dipnotlar
- Alınan Nisan 8, 2002.
- Düzeltme alındı Ağustos 6, 2002.
- Kabul edilen Ağustos 8, 2002.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme Hibe NS41871 Enstitüsü (MEE ve DAÜ) ve Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Hibe P30-DA13429 (DAÜ) tarafından desteklenmiştir.
Yazışmalar, Thomas Jefferson Üniversitesi, Curtis 310, 1025 Walnut Sokağı, Philadelphia, PA 19107, Dr. Michelle E. Ehrlich'e yönelik olmalıdır. E-posta: [e-posta korumalı].
- Telif Hakkı © 2002 Sinirbilim Derneği
;