PSMC5, 'n 19S Proteasomale ATPase, Reguleer Kokaïen Aksie in die Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 Mei 11;10(5):e0126710. doi: 10.1371/journal.pone.0126710. e-versameling 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstract

ΔFosB is 'n stabiele transkripsiefaktor wat ophoop in die nucleus accumbens (NAc), 'n sleuteldeel van die brein se beloningskringloop, in reaksie op chroniese blootstelling aan kokaïen of ander dwelmmiddels. Alhoewel dit bekend is dat ΔFosB met 'n Jun-familielid heterodimeriseer om 'n aktiewe transkripsiefaktorkompleks te vorm, was daar tot op hede nog nie 'n oop verkenning van ander moontlike bindingsvennote vir ΔFosB in die brein nie. Hier, deur gebruik te maak van gis twee-hibriede toetse, identifiseer ons PSMC5 - ook bekend as SUG1, 'n ATPase-bevattende subeenheid van die 19S proteasomale kompleks - as 'n nuwe interaksie proteïen met ΔFosB. Ons verifieer sulke interaksies tussen endogene ΔFosB en PSMC5 in die NAc en demonstreer dat beide proteïene ook komplekse vorm met ander chromatien-regulerende proteïene wat verband hou met geenaktivering. Ons gaan voort om te wys dat chroniese kokaïen kern-, maar nie sitoplasmiese, vlakke van PSMC5 in die NAc verhoog en dat ooruitdrukking van PSMC5 in hierdie breinstreek die bewegingsreaksies op kokaïen bevorder. Saam beskryf hierdie bevindings 'n nuwe meganisme wat bydra tot die aksies van ΔFosB en, vir die eerste keer, PSMC5 impliseer in kokaïen-geïnduseerde molekulêre en gedragsplastisiteit.

aanhaling: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, 'n 19S Proteasomale ATPase, reguleer kokaïenaksie in die Nucleus Accumbens. PLoS EEN 10(5): e0126710. doi:10.1371/journal.pone.0126710

Akademiese redakteur: James Edgar McCutcheon, Universiteit van Leicester, VERENIGD KONINKRIJK

ontvang: Desember 10, 2014; aanvaar: April 7, 2015; Published: Mag 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Dit is 'n ooptoegang-artikel wat onder die bepalings van die Creative Commons Erkenning Lisensie, wat onbeperkte gebruik, verspreiding en voortplanting in enige medium toelaat, mits die oorspronklike skrywer en bron gekrediteer word

Data Beskikbaarheid: Alle relevante data is binne die vraestel.

befondsing: Hierdie werk is ondersteun deur toekennings van die National Institutes of Health, die National Institute on Drug Abuse, en deur die Ishibashi Foundation en die Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI-nommers: 24591735, 26290064, 25116010). Die befondsers het geen rol in studie-ontwerp, data-insameling en -analise, besluit om te publiseer of voorbereiding van die manuskrip gehad nie.

Kompeterende belange: Die outeurs het verklaar dat geen mededingende belange bestaan ​​nie.

Inleiding

ΔFosB, 'n afgeknotte produk van die FosB geen, behoort aan die Fos-familie van transkripsiefaktore, wat ook c-Fos, vollengte FosB, Fra-1 en Fra-2 insluit. ΔFosB, soos ander Fos-proteïene, heterodimeriseer met 'n Jun-familieproteïen - c-Jun, JunB of JunD - om 'n aktiewe AP-1 (aktivatorproteïen-1) transkripsiefaktorkompleks te vorm, wat die uitdrukking van spesifieke teikengene induseer of onderdruk [1,2].

Daar is getoon dat ΔFosB 'n sleutelrol speel in dwelmverslawing [2]. Uniek onder Fos-familieproteïene, versamel dit in nucleus accumbens (NAc) en ander beloningsverwante breinstreke na herhaalde geneesmiddeltoediening as gevolg van sy hoë vlak van stabiliteit [3,4], wat bemiddel word deur die gebrek aan C-terminale degrondomeine en deur fosforilering deur verskeie proteïenkinases [5-7]. Sulke induksie van ΔFosB in die NAc bemiddel verhoogde gedragsreaksies op dwelmmiddels. Dus, ooruitdrukking van ΔFosB in hierdie breinstreek van volwasse diere, hetsy deur gebruik te maak van virale vektore of induseerbare bitransgeniese muise, verhoog 'n dier se sensitiwiteit vir die lokomotoriese aktivering en lonende effekte van kokaïen en opiate sowel as 'n dier se motivering om self toe te dien kokaïen [7-11]. Omgekeerd veroorsaak ooruitdrukking van dominante negatiewe antagoniste van ΔFosB die teenoorgestelde gedragsfenotipes [10-12].

Ons en ander het voorheen bevestig, deur gebruik te maak van gelskuiftoetse, dat JunD en miskien ander Jun-familieproteïene die belangrikste bindingsvennote van ΔFosB in die brein in vivo is [13-15]. Daar was egter tot op hede nog nie 'n oop, onbevooroordeelde evaluering van ΔFosB se bindende vennote in die brein nie. Hier het ons gepoog om nuwe bindingsvennote vir ΔFosB te identifiseer deur gebruik te maak van 'n gis twee-hibriede toets [16,17]. Ons data het aan die lig gebring dat PSMC5, ook bekend as SUG1, 'n robuuste vennoot van ΔFosB beide in vitro en in die NAc in vivo is, waar dit by ΔFosB aansluit as deel van 'n kokaïen-geïnduseerde transkripsie-aktiveringskompleks, wat ook CBP (CREB-bindende proteïen bevat) ) en p300—beide histoon-asetieltransferases (HATs)—asook BRG1 ('n chromatienhermodelleringsproteïen). Ons gaan voort om te wys dat chroniese blootstelling aan kokaïen die kernvlakke van PSMC5, 'n ATPase-bevattende subeenheid van die 19S proteasomale kompleks, in die NAc verander en dat PSMC5 op sy beurt gedragsreaksies op kokaïen beheer.

Materiaal en metodes

Gis twee-hibriede sifting

MaV203-gisselle (Invitrogen Life Technologies) is mede-getransfekteer met pDBLeu wat verskillende fragmente van die ΔFosB-proteïen aandryf, en 'n muisbreinbiblioteek is in pPC86 (Invitrogen Life Technologies) gesubkloneer. Getransformeerde selle is gegroei op SC-medium wat nie leusien, triptofaan en histidien het nie, en wat 10 mM 3-aminotriasool bevat het. Binding tussen FosB-fragmente en 'n kandidaat-vennoot veroorsaak drie verslaggewergene (His3, Ura3, en LacZ), en die induksie maak transformante in staat om te oorleef onder die gekweekte toestande wat gebruik word. Positiewe klone is hertoets met vars pDBLeu-ΔFosB-fragmente deur hertransformasietoetse in MaV203-selle.

Sellyne

Muis Neuro 2A neuroblastoom selle (ATCC) is onderhou in Eagle se minimum essensiële medium (EMEM) (ATCC), aangevul met 10% fetale bees serum (FBS) by 37°C en 5% CO2. Rot 1A-selle was 'n geskenk van Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japan) [18] en onderhou in Dulbecco se MEM (DMEM) (Life Technologies), aangevul met 10% FBS by 37°C en 5% CO2. Transfeksie van selle met plasmied DNA is bewerkstellig met behulp van Effectene (Qiagen) volgens die vervaardiger se instruksies.

PSMC5- en ΔFosB-konstrukte

Verskeie mutante vorms van PSMC5, elke FLAG-gemerk by hul N-terminus, is gegenereer vir gebruik in immunopresipitasie of viraal-gemedieerde geenoordrag eksperimente. Dit het ingesluit: PSMC5-K196M, PSMC5-Δ opgerolde spoeldomein (PSMC5-ΔCC, sonder aminosure 27–68), PSMC5-NT (bestaande uit die N-terminale fragment van die proteïen, aminosure 1–151), en PSMC5 -CT (bestaande uit die C-terminale fragment van die proteïen, 172 aminosure) (sien Fig 1). Ons het ook N-terminale MYC-gemerkte vorms van wildtipe ΔFosB sowel as ΔFosB gebruik met 'n mutasie in sy leucine-rits-domein (mutasie van aminosure 182 tot 205 wat bekend is om heterodimerisasie met Jun-familieproteïene uit te wis [6].

thumbnail
Fig 1. ΔFosB bind in vitro aan PSMC5.

 

A. Skematiese van ΔFosB, ΔFosB-LZM waarin die leucine rits-domein gemuteer is om ΔFosB heterodimerisasie met Jun-proteïene uit te wis, en Δ2ΔFosB wat die eerste 78 aminosure van die ΔFosB N-terminus ontbreek. B. Skematiese van PSMC5, PSMC5-NT wat die eerste 151 aminosure van PSMC5 bevat, PSMC5-CT wat die eerste 235 aminosure van PSMC5 ontbreek, en PSMC5-ΔCC wat nie die opgerolde spoeldomein het nie (aminosure 28–68). . Die AAA-domein stem ooreen met 'n motief, ATPases geassosieer met diverse sellulêre aktiwiteite, teenwoordig in baie ATPases. C. 2.4 μg pcDNA3.1-ΔFosB (bane 1-4) of ΔFosB-LZM (baan 5) is saam met 2.4 μg FLAG-gemerkte PSMC5 of verskeie delesiemutante in Neuro2a-selle getransfekteer. Twee dae na transfeksie is selle gelys en aan immunopresipitasie onderwerp met 'n anti-FLAG-teenliggaam en dan Western gevlek met anti-ΔFosB of anti-FLAG-teenliggaampie. Let daarop dat ΔFosB, maar nie ΔFosB-LZM nie, sterk aan PSMC5 of PSMC5-NT bind, maar nie PSMC5-CT of PSMC5-ΔCC nie. Die data wat in die figuur getoon word, is in drievoud in elk van drie afsonderlike eksperimente herhaal.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

diere

Nege tot 11 weke oue C57BL/6J manlike muise (The Jackson Laboratory) is vir alle eksperimente gebruik. Diere is gehuisves op 'n 12-uur lig-donker siklus met toegang tot kos en water ad libitum en is 1 week voor eksperimentering gewoond. Twee kokaïenbehandelingsregimes is gebruik. Om die biochemiese effekte van kokaïen te bestudeer, is diere 7 daaglikse dosisse kokaïen (20 mg/kg) of sout gegee, en 24 uur na die laaste inspuiting deur onthoofding doodgemaak. Dit is 'n standaard protokol, wat getoon is om talle molekulêre en sellulêre reaksies op die geneesmiddel te produseer [7]. Om die invloed van PSMC5 in nucleus accumbens op gedragsreaksies op kokaïen te bestudeer, het ons 'n onderdrempeldosis van die dwelm (7.5 mg/kg; sien Locomotor sensitization hieronder) gebruik gebaseer op die hipotese dat PSMC5, soos ΔFosB, 'n dier se sensitiwiteit vir kokaïen [8]. Alle diere-eksperimente is deur die Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee by Berg Sinai goedgekeur.

Immunopresipitasie en Western blotting

Neuro 2A selle is getransfekteer met wildtipe of mutante vorms van PSMC5. Twee dae na transfeksie is selle in PBS gewas, gelys in RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natriumdeoksicholaat, 10 mM natriumbutyraat, protease-inhibeerder cocktail) . Lysate is verdeel en geïnkubeer met óf nie-immune IgG (Sigma) óf anti-FLAG teenliggaampies (Sigma) vir 3 uur by 4°C. Immunopresipitasie is uitgevoer met Proteïen G-krale (Invitrogen) soos beskryf [19]. Kortliks, immuungepresipiteerde proteïene is aan SDS-PAGE onderwerp en geanaliseer deur Western blotting met behulp van anti-FosB/ΔFosB teenliggaampies (selseintegnologie) gebaseer op gepubliseerde protokolle [7]. Vir in vivo proteïenbindingstoetse het ons gesuiwerde kernfraksies van ponsgedissekteerde NAc van muise gebruik na chroniese kokaïenbehandeling (20 mg/kg IP daagliks vir 7 dae, met muise wat 24 uur na die laaste inspuiting gebruik is). Gesamentlike immunopresipitasie van kernfraksies is uitgevoer met behulp van die Nuclear Complex Co-IP kit (Active Motif) volgens die vervaardiger se instruksies. Die volgende teenliggaampies is gebruik: MYC of ß-aktien, Selseintegnologie (Danvers, MA), PSMC5 en histoon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 en BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), en VLAG M2, Sigma.

immunohistochemie

Immunohistochemie is uitgevoer volgens gepubliseerde prosedures [20]. Muise is verdoof en intrakardiaal geperfuseer met 4% paraformaldehied in PBS. Brein is kriobeskerm met 30% sukrose, en dan gevries en by -80°C gestoor tot gebruik. Koronale snitte (40 μm) is op 'n kryostaat gesny en verwerk vir immunohistochemie. Vryswewende snitte is vooraf geïnkubeer in 'n blokkerende buffer wat 0.3% Triton en 3% normale donkieserum bevat het. ΔFosB is opgespoor met behulp van 'n bok poliklonale teenliggaam wat teen die N-terminale gedeelte van die proteïen opgewek is (1/1000 Santa Cruz Biotegnologie). PSMC5 is opgespoor met behulp van 'n konyn poliklonale teenliggaam (1/100 Abcam, Cambridge, MA). Beelde is geneem met 'n konfokale mikroskoop (60x vergroting; Zeiss).

Lokomotoriese sensitisering

Alle muise het daagliks IP-inspuitings van soutoplossing vir 3 dae ontvang om hulle aan die stres van die inspuitings te gewoond. Die volgende dag is muise IP met soutoplossing of 'n onderdrempeldosis kokaïen (7.5 mg/kg; sien onder Diere hierbo) ingespuit en onmiddellik in nuwe bewegingsbokse geplaas. Die bewegingsaktiwiteit van die muise is aangeteken deur gebruik te maak van 'n fotostraalstelsel terwyl ambulante straal vir 30 min breek. Hierdie behandelings is daagliks vir 3 dae herhaal.

Virale gemedieerde geenoordrag

Ons het omvattend gepubliseerde metodes gebruik vir viraal-gemedieerde geenoordrag [7,8,11,19]. Kortliks, uitdrukkingsplasmiede vir PSMC5 of vir verskeie van sy mutante (sien PSMC5- en ΔFosB-konstrukte hierbo) is gesubkloneer in die bisistroniese p1005(+) HSV-plasmied wat GFP uitdruk onder die beheer van die CMV-promotor, en PSMC5 of sy mutante onder dié van die IE4/5-promotor. Onder narkose met ketamien (100 mg/kg)/xilasien (10 mg/kg) is muise in 'n stereotaksiese instrument vir kleindiere geposisioneer, en die kraniale oppervlak is blootgestel. Drie-en-dertig meter spuitnaalde is gebruik om bilateraal 0.5 μl van 'n HSV vektor in die NAc te infuseer teen 'n 10° hoek (AP +1.6; ML +1.5; DV -4.4) teen 'n tempo van 0.1 μl/min. Diere wat HSV-inspuitings ontvang het, is toegelaat om vir 2 dae na die operasie te herstel voor eksperimentering.

Statistiek

ANOVA's en t-toetse van studente is gebruik, gekorrigeer vir veelvuldige vergelykings, met 'n betekenisvolheid op p <0.05.

Results

PSMC5: nuwe bindingsvennoot van ΔFosB

Ons het voorlopige eksperimente uitgevoer om 'n toepaslike fragment van ΔFosB te identifiseer wat as lokaas gedien het in 'n gis twee-hibriede toets sonder om die stelsel te outoaktiveer. Holo-ΔFosB het op sy eie verslaggewergeenaktiwiteit geïnduseer, asook die N-terminale 1-78 aminosuurfragment van die proteïen. 'n N-terminaal afgeknotte ΔFosB (Fig 1A), genaamd Δ2ΔFosB, wat nie die eerste 78 aminosure van die proteïen het nie, het nie hierdie effek gehad nie. Daarom het ons Δ2ΔFosB as die lokaasproteïen gebruik.

Om te kyk vir potensiële bindingsvennote, het ons 'n muisbreinbiblioteek gebruik wat in pPC86 gesubkloneer is. Ons het 11 kandidate vir bindende vennote geïdentifiseer. Alhoewel hierdie proteïene ΔFosB se bekende heterodimerisasievennote ingesluit het, c-Jun en JunD (Tabel 1), verreweg die mees algemene kandidaat was PSMC5. Alhoewel dit verbasend was, was dit 'n interessante bevinding, aangesien PSMC5 jare gelede in 'n enkele verslag getoon is om in vitro aan c-Fos te bind [21]. Daar is egter geen vorige verslae van PSMC5-betrokkenheid by kokaïenaksie nie. Nietemin, as gevolg van die sterkte van die PSMC5-sein in die gis-twee-hibriede-toets, het ons besluit om moontlike ΔFosB-PSMC5-interaksies verder te bestudeer.

thumbnail
Tabel 1. Resultate van gis twee-hibriede sifting met Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Eerstens, om die fisiese interaksie tussen ΔFosB en PSMC5 te bevestig, het ons in vitro ko-immunopresipitasie eksperimente uitgevoer. Ons het gevind dat VLAG-gemerkte PSMC5 (Fig 1B), getransfekteer in Neuro 2A-selle, effektief afgetrek ΔFosB (Fig 1C). Tweedens, om die streek in PSMC5 te identifiseer wat verantwoordelik is vir die binding daarvan aan ΔFosB, het ons verskeie FLAG-gemerkte PSMC5 mutante gegenereer (Fig 1B) en herhaal die ko-immunopresipitasie-eksperiment. ΔFosB is effektief afgetrek met die N-terminale 151 aminosure van PSMC5 (PSMC5-NT), maar nie met die C-terminale 172 aminosuurfragment van die proteïen (PSMC5-CT) nie (Fig 1C). PSMC5 wat sy opgerolde spoeldomein (PSMC5-ΔCC) ontbreek, was ook ondoeltreffend in die presipitasie van ΔFosB. Hierdie bevindinge dui daarop dat PSMC5 ΔFosB bind via sy opgerolde spoeldomein (aminosure 27-68). Boonop het FLAG-gemerkte PSMC5 nie 'n mutante vorm van ΔFosB met 'n gemuteerde leucine rits domein (ΔFosB-LZM) presipiteer nie (Fig 1C), wat aandui dat ΔFosB óf PSMC5 deur hierdie domein bind óf, meer waarskynlik, dat ΔFosB heterodimerisasie nodig is vir PSMC5-binding.

PSMC5-ΔFosB-binding in NAc na chroniese kokaïentoediening

Gebaseer op hierdie bevindings in vitro, het ons bestudeer of PSMC5-vlakke in die NAc verander word in reaksie op chroniese kokaïentoediening. Ons het gevind deur subsellulêre fraksionering en Western blotting dat chroniese kokaïen kernvlakke van PSMC5 in hierdie breinstreek verhoog sonder 'n verandering in sitoplasmiese vlakke (Fig 2A). Hierdie effek is nie gesien na enkele dosisse kokaïen nie (data nie getoon nie). Ons het vervolgens die lokalisering van PSMC5 en ΔFosB in NAc ondersoek deur konfokale immunofluoressensiemikroskopie. Ons het muise 24 uur na die laaste herhaalde dosis kokaïen ontleed, 'n tydpunt wanneer ΔFosB die enigste waarneembare is FosB geenproduk (sien Nestler 2008). Ons het sterk PSMC5-immunoreaktiwiteit in die NAc gevind, insluitend 'n sterk kernsein. ~85% van ΔFosB+ kerne is saamgekleur vir PSMC5 (Fig 2B). Daarbenewens het ons mede-immunopresipitasie-eksperimente op NAc-ekstrakte uitgevoer en gevind dat, na chroniese kokaïenbehandeling, ΔFosB effektief afgetrek is deur 'n anti-PSMC5-teenliggaam (Fig 2C). Daarteenoor het ontleding van dwelm-naïewe NAc (na herhaalde soutinspuitings) geen waarneembare ΔFosB-aftrekking aan die lig gebring nie (data nie gewys nie). Hierdie data stem ooreen met ons bevindings in selkultuur en bevestig dat ΔFosB en PSMC5 in die NAc in vivo interaksie het.

thumbnail
Fig 2. PSMC5-regulering in muis NAc.

 

A. Westerse klad van kern- en sitosoliese fraksies van NAc van muise wat daagliks behandel is met soutoplossing of kokaïen (20 mg/kg) vir 7 dae, met diere ontleed 24 uur na die laaste inspuiting. Kokaïen verhoog kern maar nie sitosoliese vlakke van PSMC5 nie. Histoon H3 en ß-aktien, wat nie deur kokaïen aangetas is nie, is as laaikontroles gebruik. Data is gemiddelde ± SEM (n = 8–10/groep, *p<0.05). B. Mede-lokalisering van endogene PSMC5 (groen) en ΔFosB (blou) in NAc van muise wat chronies met kokaïen behandel is soos in AC Kernlisate van muis NAc nadat chroniese kokaïenbehandeling aan immunopresipitasie onderwerp is met anti-PSMC5-teenliggaampies of muis-IgG as kontrole , en dan Western gevlek met anti-FosB/ΔFosB teenliggaampies. Die figuur toon PSMC5-ΔFosB-interaksies in die NAc in vivo. Data in B en C is in drievoud in elk van drie afsonderlike eksperimente herhaal.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 verhoog ΔFosB uitdrukking in vitro

Aangesien PSMC5 'n bekende lid van die proteasoomkompleks is, het ons getoets of dit ΔFosB-vlakke reguleer met behulp van Rat 1A-selle. PSMC5-ooruitdrukking het geen effek op basale vlakke van ΔFosB gehad nie, maar het 'n klein maar beduidende verbetering van ΔFosB-induksie veroorsaak na serumstimulasie van die selle (Fig 3A). 'n Soortgelyke neiging is gesien vir vollengte FosB, maar die effek het nie statistiese betekenisvolheid bereik nie. Omgekeerd, onderdrukking van endogene PSMC5-uitdrukking in Rat 1A-selle, bereik deur die gebruik van siRNA's wat PSMC5 teiken, het nie basale ΔFosB-vlakke beïnvloed nie, maar sterk ΔFosB-induksie deur serumstimulasie geïnhibeer (Fig 3B). Soortgelyke effekte is gesien vir vollengte FosB. Hierdie data dui daarop dat PSMC5 nie die proteasomale afbraak van ΔFosB bevorder nie, soos verwag kan word as 'n kernsubeenheid van die proteasoom, maar eerder nodig is vir maksimale akkumulasie van FosB geenprodukte in vitro, miskien deur die stabilisering van die proteïene.

thumbnail
Fig 3. PSMC5-regulering van FosB/ΔFosB-uitdrukking in Rat 1A-selle.

 

A. Rot 1A selle is getransfekteer met 4 μg PSMC5 of kontrole DNA. PSMC5-ooruitdrukking het geen effek gehad op basale uitdrukkingsvlakke van FosB- of ΔFosB-proteïen soos bepaal deur Western blotting nie, maar het 'n klein maar beduidende toename in die induksie van ΔFosB deur serumstimulasie (F(2,21) = 9.75, p = 0.001) geproduseer. B. Rot 1A selle is getransfekteer met 5 pmol van een van twee siRNAs of deurmekaar RNA (kontrole). Beide siRNAs het effektief PSMC5 proteïenvlakke verlaag in vergelyking met kontrole toestande (siRNA #1, 23 ± 5% van kontrole; siRNA #2, 18 ± 6%; p<0.05; n = 4). PSMC5-afslag het geen effek op basale vlakke van FosB of ΔFosB gehad nie, maar het die induksie van beide FosB en ΔFosB deur serumstimulasie verswak (FosB: F(2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F(2,6) = 22.83. , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB en PSMC5 vorm komplekse met CBP, p300 en BRG1 in NAc

Om die transkripsiemeganismes waarmee PSMC5 ΔFosB-funksie kan beïnvloed beter te verstaan, het ons moontlike bykomende bindingsvennote vir die twee proteïene in die NAc ondersoek onder chroniese kokaïen-behandelde toestande. Daar is een verslag dat PSMC5 aan CBP bind - 'n HAT - en histoon H3 asetilering by die MHC-II proksimale promotor in HeLa-selle verhoog [22]. Boonop vertoon muise wat 'n tekort aan CBP het verminderde gedragsensitiwiteit vir kokaïen sowel as verminderde histoon-asetilering by die FosB promotor [23]. Ons het dus getoets of PSMC5 met ΔFosB kan bind as deel van komplekse wat ook CBP en miskien ander transkripsionele aktiveerders bevat.

Ons het eers getoon dat ΔFosB beide CBP en p300, 'n verwante HAT, effektief in Neuro2A-selle afgetrek het (Fig 4A). In teenstelling hiermee het die leucine rits mutant vorm van ΔFosB, soos verwag, nie hierdie aktiwiteit vertoon nie. Net so het PSMC5 effektief CBP en p300 afgetrek (Fig 4B). Interessant genoeg is hierdie effek ook gesien vir PSMC5-ΔCC, wat nie ΔFosB afgetrek het nie, wat aandui dat PSMC5 interaksie het met CBP en p300 via ander domeine van die proteïen en onafhanklik van die binding daarvan aan ΔFosB.

thumbnail
Fig 4. ΔFosB en PSMC5 interaksie met CBP, p300 en BRG1 in vitro en in vivo.

 

A. Neuro2A-selle is getransfekteer met 2.4 μg MYC-gemerkte ΔFosB of MYC-gemerkte ΔFosB-LZM. Selekstrakte is geïmmunopresipiteer met anti-CBP of anti-p300 teenliggaampies, en presipitate is Western geskrap met dieselfde teenliggaam of met anti-MYC teenliggaampies. Beide CBP en p300 interaksie met ΔFosB en sulke interaksies vereis 'n ongeskonde leucine rits. B. Neuro2A-selle is getransfekteer met 2.4 μg FLAG-gemerkte PSMC5 of FLAG-gemerkte PSMC5-ΔCC. Selekstrakte is geïmmunopresipiteer met anti-CBP of anti-p300 teenliggaampies, en presipitate is Western geskrap met dieselfde teenliggaam of met anti-FLAG teenliggaampies. Beide CBP en p300 interaksie met PSMC5 en sulke interaksies vereis nie die CC-domein nie. C. Kernlisate van muis NAc na chroniese kokaïenbehandeling is aan immunopresipitasie onderwerp met anti-CBP of anti-p300 teenliggaampies. Daaropvolgende Western blotting van resulterende neerslae met anti-FosB/ΔFosB teenliggaampies het endogene interaksies tussen ΔFosB en CBP/p300 getoon. D. Porties van dieselfde kernlisate is onderwerp aan immunopresipitasie met anti-BRG1 of anti-PSMC5 teenliggaampies, gevolg deur Western blotting van presipitate met anti-FosB/ΔFosB of anti-BRG1 teenliggaampie. Die resultate toon endogene interaksies tussen ΔFosB en BRG1, en BRG1 en PSMC5. E. Skematiese illustrasie van transkripsionele aktiveringskompleks saamgestel uit ΔFosB:JunD heterodimere wat interaksie het met CBP/p300, BRG1 en PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Om te bevestig dat hierdie interaksies ook in vivo voorkom, het ons kokaïen chronies toegedien om ΔFosB- en kern-PSMC5-vlakke te induseer, en dan immunopresipiteerde NAc-ekstrakte met anti-CBP of anti-p300 teenliggaampies. In ooreenstemming met ons selkultuurdata het immunopresipitasie van CBP of van p300 ΔFosB effektief afgetrek (Fig 4C). Ons het getoets of BRG1, 'n kernsubeenheid van die SWI-SNF-chromatienhermodelleringskompleks, ook aan ΔFosB en PSMC5 kan bind, gebaseer op ons vroeëre bevinding dat BRG1 na sekere ΔFosB-teikengene gewerf word in ooreenstemming met hul aktivering in NAc na chroniese kokaïen [24]. Ons het gevind dat immunopresipitasie van BRG1 ΔFosB in NAc-ekstrakte afgetrek het, en dat immunopresipitasie van PSMC5 eweneens endogene BRG1 saamgepresipiteer het (Fig 4D). Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat ΔFosB-PSMC5 komplekse in NAc vorm wat ook CBP/p300 en BRG1 insluit (Fig 4E).

PSMC5-ooruitdrukking verhoog lokomotoriese reaksies op kokaïen

Die prominente binding van PSMC5 met ΔFosB in NAc het ons aangespoor om te ondersoek of toenemende PSMC5-vlakke in hierdie breinstreek gedragsreaksies op kokaïen reguleer. Ons het 'n Herpes Simplex Virus (HSV) vektor gegenereer wat óf wildtipe PSMC5 óf een van sy mutante ooruitdruk en die vektore in NAc in vivo bekragtig (Fig 5A). Viraal-gemedieerde uitdrukking van PSMC5 oorheers in die selkern (Fig 5B). Muise wat wilde-tipe PSMC5 ooruitdruk, het nie veranderde reaksies op aanvanklike dosisse kokaïen getoon nie, maar het verhoogde lokomotoriese aktivering vertoon in reaksie op herhaalde kokaïen dosisse in vergelyking met GFP-uitdrukking kontrole muise. In teenstelling hiermee het muise wat 'n mutante vorm van PSMC5 wat nie sy opgerolde spoeldomein (PSMC5-ΔCC) het nie, nie hierdie effek getoon nie (Fig 5B). Interessant genoeg het ooruitdrukking van PSMC5-K196M, wat nie die ATPase-aktiwiteit van die wildtipe proteïen het nie, ook kokaïen se lokomotoriese reaksies versterk.

thumbnail
Fig 5. PSMC5-ooruitdrukking in NAc verhoog lokomotoriese reaksies op kokaïen.

 

A. Verteenwoordigende HSV-gemedieerde transgeenuitdrukking in mediale NAc. AC, anterior kommissuur. NAc-kern- en dopsubstreke word op die figuur aangeteken. B. Verteenwoordigende hoër vergrotings (60x) van immunohistochemiese kleuring van PSMC5 in NAc-neurone na HSV-PSMC5-inspuiting wat toon dat die proteïen oorwegend kernagtig is soos gemerk deur DAPI-kleuring. C. Muise het bilaterale HSV-inspuitings in NAc ontvang, gevolg deur daaglikse IP-inspuitings van onderdrempel dosisse kokaïen (7.5 mg/kg). Lokomotoriese reaksies word getoon in reaksie op die eerste en laaste van 3 daaglikse dosisse van die geneesmiddel. Ooruitdrukking van PSMC5 of PSMC5-K196M verhoog lokomotoriese reaksies op herhaalde kokaïen, 'n effek wat nie met PSMC5-ΔCC gesien word nie. Daar was geen betekenisvolle effek van die transgene op lokomotoriese reaksies op aanvanklike kokaïendosisse nie. ANOVA F(3,125) = 4.163, *p<0.05 volgens Dunnett se posthoc-toets.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Bespreking

Die resultate van die huidige studie onthul 'n nuwe meganisme waardeur ΔFosB sy effekte op die brein bemiddel en 'n nuwe meganisme betrokke by kokaïenaksie. Deur gebruik te maak van 'n onbevooroordeelde benadering, 'n gis twee-hibriede toets, het ons PSMC5 geïdentifiseer as 'n nuwe bindingsvennoot vir ΔFosB. Ons het hierdie bevinding beide in gekweekte selle in vitro en in die NAc in vivo bekragtig deur robuuste PSMC5-ΔFosB-binding te demonstreer. Wat belangrik is, is dat kernvlakke van PSMC5 in NAc geïnduseer word deur chroniese kokaïentoediening. Ons het verder getoon dat PSMC5-ΔFosB-binding plaasvind in samewerking met verskeie ander transkripsionele aktivatorproteïene, naamlik CBP en p300 (twee HAT's) en BRG1 ('n sleutelbestanddeel van SWI-SNF-chromatienhermodelleringskomplekse). Saam ondersteun ons bevindinge die hipotese dat PSMC5 deel is van die transkripsionele aktiveringskompleks wat gewerf word na ten minste sekere ΔFosB-geïnduseerde gene tydens 'n kursus van chroniese kokaïentoediening (Fig 4E). In ooreenstemming met hierdie hipotese is die bykomende bevinding dat ooruitdrukking van PSMC5 in NAc, soos die ooruitdrukking van ΔFosB self, gedragsreaksies op kokaïen bevorder. Dit sal interessant wees in toekomstige studies om hierdie in vivo waarnemings op te volg met karakterisering van PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 interaksies deur gebruik te maak van in vitro verslaggewer toetse.

Die betrokkenheid van PSMC5 by kokaïenaksie is heeltemal nuut. Aanvanklik geïdentifiseer as 'n lid van 'n groot familie van ATPases wat die proteasoom uitmaak, is getoon dat PSMC5 oor die jare met verskeie transkripsiefaktore interaksie het, insluitend c-Fos, p53, kernhormoonreseptore en bestanddele van die basale transkripsiekompleks [25], maar min funksionele studies is oor die jare uitgevoer [26]. Die bes gevestigde aksie daarvan is om die aktiwiteit van MYC-transkripsiefaktore in gekweekte selle te bevorder [27]. Die implikasie van PSMC5 in transkripsiemeganismes het 'n potensiële rol vir ubiquitination-proteasomale aktiwiteit in die regulering van geentranskripsie voorgestel, maar die betrokkenheid van PSMC5 in sulke regulering bly tot dusver feitlik ongetoets [28,29].

Baie min is bekend oor PSMC5-funksie in die brein. 'n Vorige studie het wydverspreide uitdrukking van PSMC5 mRNA deur die brein getoon [30], maar die funksionele aktiwiteit daarvan het nie bestudeer nie. Ons bevindinge lei nou tot verdere ondersoeke van hierdie interessante proteïen om die rol daarvan in die regulering van geentranskripsie en die verband daarvan met ubiquitination-proteasomale funksie in die brein beter te verstaan. Die binding van PSMC5 aan ΔFosB word bemiddel deur PSMC5 se opgerolde spoeldomein. Boonop benodig die vermoë van PSMC5 om lokomotoriese reaksies op kokaïen te bevorder, terwyl dit die opgerolde spoeldomein vereis, nie die ATPase-aktiwiteit wat intrinsiek aan die proteïen is nie. Hierdie resultate skep die moontlikheid dat, ten minste in ons stelsel, die hoofaktiwiteit van PSMC5 bemiddel kan word deur die binding daarvan aan ΔFosB en ander transkripsionele regulatoriese proteïene en nie deur sy proteasomale verwante aktiwiteit per se nie. Verdere werk is nodig om hierdie en alternatiewe moontlikhede direk te toets. Die hipotese dat viraal-gemedieerde ooruitdrukking van PSMC5 lokomotoriese reaksies op kokaïen verhoog het via interaksies met ΔFosB, is aanneemlik, ten spyte van die gebruik van 'n 3-dag kokaïenbehandelingsregime, omdat dit bekend is dat aansienlike vlakke van ΔFosB binne hierdie tydraamwerk in die brein ophoop [3].

Die huidige bevindinge staaf verder die nut van die gebruik van onbevooroordeelde, oop-einde eksperimentele benaderings in die bestudering van die molekulêre basis van breinregulering. Ons aanvanklike aandag aan PSMC5 was uitsluitlik gebaseer op die prominente binding daarvan aan ΔFosB in 'n gis twee-hibriede toets, maar dit blyk 'n belangrike komponent te wees van transkripsieveranderinge wat in NAc gewerf word deur herhaalde kokaïentoediening. 'n Beter begrip van die gedetailleerde meganismes waardeur kernvlakke van PSMC5 deur kokaïen geïnduseer word en op sy beurt waardeur PSMC5 dan bydra tot kokaïen-geïnduseerde transkripsionele aktiveringskomplekse is die fokus van huidige ondersoeke. Intussen het ons gis twee-hibriede toets verskeie addisionele vermoedelike bindingsvennote van ΔFosB (Tabel 1) wat ook nou direkte ondersoek in kokaïenmodelle regverdig. Saam dra hierdie werk by tot 'n toenemende begrip van die komplekse molekulêre meganismes waardeur kokaïen NAc-funksie verander.

Erkennings

Hierdie werk is ondersteun deur toelaes van die Nasionale Instituut vir Dwelmmisbruik, en deur die Ishibashi-stigting en die Japanse Vereniging vir die Bevordering van Wetenskap (KAKENHI-nommers: 24591735, 26290064, 25116010).

Skrywer Bydraes

Het die eksperimente bedink en ontwerp: YHO YNO EJN. Het die eksperimente uitgevoer: YHO YNO PJK RN. Ontleed die data: YHO YNO EJN. Bygedrae reagense/materiale/analise-instrumente: TN MO OY AN RN TT. Het die vraestel geskryf: YHO EJN.

Verwysings

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Onmiddellik-vroeë gene: tien jaar later. Tendense Neurosci 18: 66–67. pmid:7537412 doi: 10.1016/0166-2236(95)80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripsionele meganismes van verslawing: rol van deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245–3255. doi: 10.1098/rstb.2008.0067. pmid:18640924
  3. Bekyk artikel
  4. PubMed / Ncbi
  5. Google Scholar
  6. Bekyk artikel
  7. PubMed / Ncbi
  8. Google Scholar
  9. Bekyk artikel
  10. PubMed / Ncbi
  11. Google Scholar
  12. Bekyk artikel
  13. PubMed / Ncbi
  14. Google Scholar
  15. Bekyk artikel
  16. PubMed / Ncbi
  17. Google Scholar
  18. Bekyk artikel
  19. PubMed / Ncbi
  20. Google Scholar
  21. Bekyk artikel
  22. PubMed / Ncbi
  23. Google Scholar
  24. Bekyk artikel
  25. PubMed / Ncbi
  26. Google Scholar
  27. Bekyk artikel
  28. PubMed / Ncbi
  29. Google Scholar
  30. Bekyk artikel
  31. PubMed / Ncbi
  32. Google Scholar
  33. Bekyk artikel
  34. PubMed / Ncbi
  35. Google Scholar
  36. Bekyk artikel
  37. PubMed / Ncbi
  38. Google Scholar
  39. Bekyk artikel
  40. PubMed / Ncbi
  41. Google Scholar
  42. Bekyk artikel
  43. PubMed / Ncbi
  44. Google Scholar
  45. Bekyk artikel
  46. PubMed / Ncbi
  47. Google Scholar
  48. Bekyk artikel
  49. PubMed / Ncbi
  50. Google Scholar
  51. Bekyk artikel
  52. PubMed / Ncbi
  53. Google Scholar
  54. Bekyk artikel
  55. PubMed / Ncbi
  56. Google Scholar
  57. Bekyk artikel
  58. PubMed / Ncbi
  59. Google Scholar
  60. Bekyk artikel
  61. PubMed / Ncbi
  62. Google Scholar
  63. Bekyk artikel
  64. PubMed / Ncbi
  65. Google Scholar
  66. Bekyk artikel
  67. PubMed / Ncbi
  68. Google Scholar
  69. Bekyk artikel
  70. PubMed / Ncbi
  71. Google Scholar
  72. Bekyk artikel
  73. PubMed / Ncbi
  74. Google Scholar
  75. Bekyk artikel
  76. PubMed / Ncbi
  77. Google Scholar
  78. Bekyk artikel
  79. PubMed / Ncbi
  80. Google Scholar
  81. Bekyk artikel
  82. PubMed / Ncbi
  83. Google Scholar
  84. Bekyk artikel
  85. PubMed / Ncbi
  86. Google Scholar
  87. Bekyk artikel
  88. PubMed / Ncbi
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Induksie van 'n langdurige AP-1-kompleks wat saamgestel is uit veranderde Fos-agtige proteïene in die brein deur chroniese kokaïen en ander chroniese behandelings. Neuron 13: 1235–1244. pmid:7946359 doi: 10.1016/0896-6273(94)90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutant muise: Verlies van chroniese kokaïen induksie van Fos-verwante proteïene en verhoogde sensitiwiteit vir kokaïen se psigomotoriese en lonende effekte. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid:9294222 doi: 10.1073/pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulering van ΔFosB-stabiliteit deur fosforilering. J Neurosci 26: 5131–5142. pmid:16687504 doi: 10.1523/jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Afwesigheid van gekonserveerde C-terminale degron-domein dra by tot ΔFosB se unieke stabiliteit. Eur J Neurosci 25: 3009–3019. pmid:17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. (2013) Gedrags- en strukturele reaksies op chroniese kokaïen vereis 'n toevoerlus wat ΔFosB en CaMKII in die nucleus accumbens-dop betrek. J Neurosci 33: 4295–4307 doi: 10.1523/JNEUROSCI.5192-12.2013. pmid:23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Uitdrukking van die transkripsiefaktor ΔFosB in die brein beheer sensitiwiteit vir kokaïen. Nature 401: 272–276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB verhoog aansporing vir kokaïen. J Neurosci 23: 2488–2493. pmid:12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulering van geenuitdrukking en kokaïenbeloning deur CREB en DFosB. Nat Neurosci 11: 1208–1215. pmid:14566342 doi: 10.1038/nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: 'n noodsaaklike rol vir ΔFosB in die nucleus accumbens in morfienaksie. Nature Neurosci 9: 205–211. pmid:16415864 doi: 10.1038/nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Induseerbare, breinstreek-spesifieke uitdrukking van 'n dominante negatiewe mutant van c-Jun in transgeniese muise verminder sensitiwiteit vir kokaïen. Brain Res 970: 73–86. pmid:12706249 doi: 10.1016/s0006-8993(03)02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulering van delta FosB en FosB-agtige proteïene deur elektrokonvulsiewe aanvalle en kokaïenbehandelings. Mol Pharmacol 48: 880–889. pmid:7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Noodsaaklike rol van die fosB-geen in molekulêre, sellulêre en gedragsaksies van elektrokonvulsiewe aanvalle. J Neurosci 18: 6952–6962. pmid:9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonisme gaan gepaard met aanhoudende uitdrukking van 'n D-FosB-agtige proteïen in dopaminerge weë. Mol Brain Res 53: 41–52. pmid:9473580 doi: 10.1016/s0169-328x(97)00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Omskakeling van 'n eukariotiese transkripsie-inhibeerder in 'n aktiveerder. Sel 55: 443–446. pmid:3180218 doi: 10.1016/0092-8674(88)90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Die twee-hibriede stelsel: 'n metode om gene te identifiseer en te kloon vir proteïene wat interaksie het met 'n proteïen van belang. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578–9582. pmid:1946372 doi: 10.1073/pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferatiewe aktivering van rustige Rat-1A-selle deur delta FosB. Mol Cell Biol 13:4157–4166. pmid:8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Noodsaaklike rol van poli (ADP-ribosyl) asie in kokaïenaksie. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005–2010. doi: 10.1073/pnas.1319703111. pmid:24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Afsonderlike patrone van ΔFosB-induksie in die brein deur dwelmmiddels. Sinaps 62: 358–369. doi: 10.1002/syn.20500. pmid:18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Soogdier Sug1 en c-Fos in die kern 26S proteasoom. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236–8240. pmid:8710853 doi: 10.1073/pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regulering van asetilering by die belangrikste histoversoenbaarheidskompleks klas II proksimale promotor deur die 19S proteasomale ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837–5850. doi: 10.1128/MCB.00535-08. pmid:18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) CREB-bindende proteïen beheer reaksie op kokaïen deur histone te asetileer by die fosB-promotor in die muisstriatum. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186–19191. pmid:16380431 doi: 10.1073/pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Chromatien-hermodellering is 'n sleutelmeganisme onderliggend aan kokaïen-geïnduseerde plastisiteit in striatum. Neuron 48: 303–314. pmid:16242410 doi: 10.1016/j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dubbele funksies vir transkripsionele reguleerders: mite of werklikheid. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002/(sici)1097-4644(1999)75:32+<32::aid-jcb5>3.0.co;2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Regulerende subeenheid interaksies van die 26S proteasoom, 'n komplekse probleem. Tendense Biochem Sci 25:83–88. pmid:10664589 doi: 10.1016/s0968-0004(99)01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implikasie van die ubiquitin / proteasoom stelsel in myc-gereguleerde transkripsie. Selsiklus 2–5: 403–407. doi: 10.4161/cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin en proteasome in transkripsie. Annu Rev Biochem 81: 177–201. doi: 10.1146/annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Die proteasoom: 'n nutsmiddel vir transkripsie? Curr Op Genet Dev 16: 197–202. pmid:16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifikasie van 'n filogeneties bewaarde Sug1 CAD familielid wat differensieel uitgedruk word in die muis senustelsel. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002/(sici)1097-4695(199712)33:7<877::aid-neu2>3.0.co;2-5