Cdk5 Fosforilate Dopamien D2 Reseptor en Demp Downstream Signalering (2013)

aanhaling: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 fosforileer dopamien D2-reseptor en verswak stroomaf sein. PLoS EEN 8(12): e84482. doi:10.1371/journal.pone.0084482

Redakteur: James Porter, Universiteit van Noord-Dakota, Verenigde State van Amerika

ontvang: Mei 20, 2013; aanvaar: November 14, 2013; Published: Desember 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong et al. Dit is 'n oop-toegang artikel versprei onder die bepalings van die Creative Commons Erkenning Lisensie, wat onbeperkte gebruik, verspreiding en voortplanting in enige medium toelaat, mits die oorspronklike skrywer en bron gekrediteer word.

befondsing: Hierdie werk is ondersteun deur die toelaes (NRF-2012R1A2A2A01012923 en NRF-2012R1A4A1028200) van die Koreaanse regering (MSIP) en ook ondersteun onder die raamwerk van internasionale samewerkingsprogram wat deur NRF van Korea (2012K2A1A2033117) en die Koreaanse Navorsingsinstituut bestuur word (2031K415A2004A2006) Basiese Navorsingsprogram van MSIP (XNUMX-XNUMX). SKP was 'n ontvanger van die XNUMX en XNUMX Nasionale Alliansie vir Navorsing oor Skisofrenie en Depressie (NARSAD) Young Investigator Awards. Die befondsers het geen rol in studie-ontwerp, data-insameling en -analise, besluit om te publiseer of voorbereiding van die manuskrip gehad nie.

Kompeterende belange: Die outeurs het verklaar dat geen mededingende belange bestaan ​​nie.

Inleiding

Dopamiensein is betrokke by verskeie breinfunksies, insluitend motoriese koördinasie, buibeheer en beloningsmeganismes [1]. 'n Belangrike komponent van dopamiensein by gewerwelde diere word uitgeoefen deur striatale medium stekelrige neurone (MSN'e) wat 'n subset van dopamienreseptore selektief uitdruk en dopaminerge insette ontvang hoofsaaklik vanaf die ventrale tegmentale area (VTA) en substantia nigra (SN)) [2]. Dopamienreseptore is G-proteïengekoppelde reseptore (GPCR) met sewe transmembraandomeine en bestaan ​​uit twee subtipes, D1-agtige en D2-agtige reseptore, wat wederkerige aksies in dopamien sein bemiddel [1]. Byvoorbeeld, dopamien D1-agtige reseptore (D1, D5) aktiveer adenielielsiklase deur G_αs en verhoog die intrasellulêre vlak van cAMP, maar dopamien D2-agtige reseptore (D2, D3, D4) inhibeer adenielielsiklase deur G_αi en verlaag die intrasellulêre vlak van cAMP [1], [3].

Onder dopamienreseptore is die D2-reseptor (DRD2) betrokke by die patofisiologie van verskeie groot psigiatriese versteurings, insluitend skisofrenie en dwelmverslawing [4], sodanig dat baie antipsigotiese middels ten minste gedeeltelik DRD2 teiken. Dit is ook bekend dat DRD2-aktiwiteit goed korreleer met die gedragsgevolge van dwelmmiddels in dieremodelle [5]. Antidepressante en gemoedstabilisator-doeltreffendheid is ook gekoppel aan veranderinge in die seloppervlak-uitdrukking van DRD2 of stroomaf intrasellulêre sein bemiddel deur PKA, ERK en GSK3 [1], [4], [6]. Ten spyte van hierdie kritieke rolle vir DRD2 in die brein, word die gedetailleerde regulatoriese meganismes wat heterogeniteit en kompleksiteit aan DRD2-eienskappe verleen, nie heeltemal verstaan ​​nie.

Konvergerende lyne van bewyse dui daarop dat veelvuldige posttranslasie-modifikasies betrokke is by die fyninstelling van DRD2-aktiwiteit. Uitgebreide glikosilering van DRD2 is in vroeë foto-affiniteit etikettering studies geopenbaar [7], en disulfiedbindingsvorming binne DRD2 is ook geïdentifiseer as 'n belangrike modifikasie vir ligandbinding [8]. Verder is fosforileringsplekke van DRD2 aanvanklik geïdentifiseer deur vitro bepaling met radio-isotope, wat roetes verskaf vir verskeie regulatoriese weë wat deur verskeie kinases bemiddel word [9]. Inderdaad, proteïenkinase C (PKC) reguleer DRD2-gemedieerde mobilisering van intrasellulêre kalsium en moduleer die interaksie van DRD2 met sitoskeletale proteïene [10]. Fosforilering deur GPCR kinase 2 (GRK2) reguleer agonis-geïnduseerde resensitiseringspatrone van DRD2 [11].

Siklienafhanklike kinase 5 (Cdk5) is 'n proliengerigte serien/treonienkinase wat voorkeuraktiwiteit het as gevolg van breinspesifieke uitdrukking van sy noodsaaklike aktiveerders, p35 en p39 [12]. Cdk5 is betrokke by verskeie neuronale prosesse, insluitend neuronale migrasie en aksonleiding, en Cdk5 en p35 nulmuise toon defekte in kortikale gelaagdheid [13]. Onlangs is getoon dat fosforilering van WAVE1 en efeksien deur Cdk5 dendritiese ruggraatmorfogenese reguleer [14]. Verder reguleer Cdk5 ook oppervlakuitdrukkingsvlakke van die NMDA-reseptor-, NR2B- en NR2A-gemedieerde NMDA-strome [15], [16]. Dit is opmerklik dat verskeie bewyse 'n intieme verhouding tussen Cdk5 en die dopamienstelsel voorstel. Cdk5 fosforileer tirosienhidroksilase (TH), reguleer die stabiliteit daarvan en handhaaf dus dopaminerge homeostase [17]. In postsinaptiese neurone, wanneer die T75-residu van dopamien en sikliese-AMP-gereguleerde fosfoproteïen-32kD (DARPP-32) deur Cdk5 gefosforileer word, kan dit PKA-aktiwiteit inhibeer en dus dopamien DRD1-gemedieerde PKA-sein antagoniseer [18]. Interessant genoeg, wanneer kokaïen, 'n indirekte agonis van dopamienreseptore, chronies in rotte toegedien word, verhoog mRNA en proteïenvlakke van Cdk5 in medium stekelige neurone [19]. Gesamentlik blyk Cdk5 betrokke te wees by dwelm-geïnduseerde sinaptiese aanpassings. In hierdie studie toon ons 'n funksionele interaksie van DRD2 en Cdk5 wat die rol van Cdk5 in dopamiensein verder uitbrei.

Materiaal en metodes

teenliggaampies

Anti-konynserums is opgewek teen peptiede wat fosfo-serien 321 (pS321) van die derde intrasellulêre lus van DRD2 (D2i3) bevat het. Fosfo-peptied, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), is gebruik om 'n peptied-gekonjugeerde kolom vir affiniteitsuiwering te maak (20401, PIERCE). Anti-pS321-teenliggaampies is verryk deur 'n affiniteitsuiweringstelsel na aanleiding van die vervaardiger se instruksies. Gesuiwerde fosfo-teenliggaampies is in PBS met 0.1% natriumasied en 0.1% gelatien gestoor. Anti-muis anti-Cdk5 teenliggaampies (sc-249) en anti-konyn anti-p35 teenliggaampies (sc-820) is gebruik vir die Western blotting en immunositochemie van Cdk5/p35. Anti-muis anti-GFP teenliggaampies (sc-9996) is gebruik vir die immunopresipitasie en Western blotting van DRD2-GFP. Anti-konyn-anti-FLAG-teenliggaampies (sc-807), anti-konyn-anti-HA-teenliggaampies (sc-805), anti-muis-anti-GST-teenliggaampies (sc-138), en anti-muis-anti-GAPDH-teenliggaampies (sc- 32293) is by Santa Cruz Biotechnologies gekoop.

diere

Die p35-uitklopmuis was 'n vriendelike geskenk van dr. Katsuhiko Mikoshiba by RIKEN Brain Science Institute in Japan en gebruik vir primêre neuronkultuur. Primer-stelle vir genotipering was 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC en 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT soos voorheen beskryf [20]. ICR muise en Sprague Dawley rotte is gebruik vir breinlisaat voorbereiding. Alle diereprosedures is deur die Pohang Universiteit van Wetenskap en Tegnologie se Institusionele Dieresorg- en Gebruikskomitee goedgekeur.

Plasmiedkonstrukte

Menslike DRD2 lang isovorm in 'n EGFP-N1 plasmiedvektor en die derde intrasellulêre lus van DRD2 (212–373 aminosuurreste insluitend die 29 addisionele aminosuurreste uniek aan DRD2 lang isovorm) in 'n pFLAG-CMV-2 plasmiedvektor is gebruik. Menslike Cdk5 is in 'n pCMV-HA plasmiedvektor ingevoeg en menslike p35 is in 'n pcDNA 3.1 plasmiedvektor ingevoeg. Menslike Cdk5 is ingevoeg onder 'n sitomegalovirus (CMV) promotor saam met menslike p35 in 'n pcDNA 3.1 vektor om 'n dubbele uitdrukking konstruk (Cdk5/p35) te maak vir immunositochemie, reseptor internalisering toets, [³⁵S]-GTP_γS-bindingstoets, radioligand-bindingstoets en cAMP-ensiem-immunotoets.

In Vitro Kinase-toets

IP-gekoppel vitro kinase-toets is soos volg uitgevoer. Een hele muisbrein is gelys in 3 mL eritrosiete-lisisbuffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) deur 20 hale van 'n Dounce-homogeniseerder om gehomogeniseerde breinlisate te kry . Die lysate is vir 30 minute op ys geïnkubeer, gesoniceer en teen 16,000 XNUMX × sentrifugeer g vir 10 min. Die supernatante is geïmmunopresipiteer met anti-konyn anti-p35 teenliggaampies om 'n aktiewe Cdk5/p35 kompleks te verkry. Cdk5/p35-kompleks en gesuiwerde GST-fusieproteïen is gemeng met adenosien 5'-triposfaat, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) en geïnkubeer in kinasebuffer (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) vir 1 uur by kamertemperatuur [18], [21]. Gesuiwerde Cdk5/p25-kompleks (14–516, Millipore) is ook gebruik vir vitro kinase-toets soos hierbo beskryf. Die 2x monsterlaaibuffer is by die reaksiemengsel gevoeg en by 100°C gekook. Die monsters is dan aan SDS-PAGE onderwerp en die gedroogde jel is deur outoradiografie geassesseer.

Vloeistofchromatografie (LC)-Massaspektrometrie (MS)/MS-analise

Die rekombinante GST-D2i3-proteïen is ontleed deur LC-MS/MS na aanleiding van IP-gekoppelde vitro kinase-toets. Ons het peptied-identifikasie van LC-MS/MS-data uitgevoer met behulp van X!!Tandem (weergawe Des-01-2008). Elke RAW-datalêer is eers omgeskakel na mzXML met behulp van die trans-proteomiese pyplyn (TPP; weergawe 4.3). MS/MS-skanderings in die omgeskakelde mzXML's is dan onderwerp aan soektog teen die UniProt muisproteïenvolgordedatabasis (vrystelling 2010_07) insluitend GST-D2i3-volgorde deur gebruik te maak van X!!Tandem. Die toleransie is gestel op 3 Da vir voorloper-ione en 2 Da vir fragment-ione. Ensiemspesifisiteit vir tripsien is gebruik. Veranderlike modifikasie-opsies is gebruik vir die karbamidometilering van sisteïen (57.021 Da), die oksidasie van metionien (15.995 Da), die hidrolise van asparagien (0.987 Da) en die fosforilering van serien (79.966 Da).

Immunopresipitasie

Immunopresipitasie is uitgevoer op sellisate in ELB lisis buffer. Anti-GFP-teenliggaampies is by die lysate gevoeg en vir 3 uur by 4°C geïnkubeer. Immunokomplekse is gesuiwer deur gebruik te maak van proteïen-A agarose. Die presipitate is geïnkubeer met SDS monster laai buffer vir 30 min by 37°C, en onderwerp aan SDS-PAGE en Western blots.

GST-aftrektoets

10 µg gesuiwerde GST en GST-D2i3 is vir 1.5 uur by 4°C met rotbrein-lisaat geïnkubeer. 30 µL glutathione (GSH)-gekonjugeerde Sepharose 4B-krale (17-0756-01, GE Healthcare) wat met lisisbuffer geëquilibreer is, is bygevoeg en vir bykomende 1 uur geïnkubeer. Krale is versamel deur sentrifugering by 2,000 XNUMX ×g en 4 keer met lysisbuffer afgespoel [22], [23]. Presipitate is ontleed deur Western blotting met behulp van anti-Cdk5 en anti-p35 teenliggaampies.

immunositochemiese

Getransfekteerde HEK 293-selle en striatale neurone wat op dekstrokies gekweek is, is een keer met fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS) gewas en gefixeer deur onderdompeling in koue 4% paraformaldehied/PBS vir 30 min. Primêre teenliggaampies is verdun in die blokkeeroplossing (2% perdeserum en 1% Triton X-100 in PBS). Alexafluor-647-gekonjugeerde anti-muis-teenliggaampies (A20990, Invitrogen) en Alexafluor-568-gekonjugeerde anti-konyn-teenliggaampies (A11011, Invitrogen) is as sekondêre teenliggaampies gebruik. Hoechst is gebruik vir kernkleuring. Beelde is verkry deur konfokale mikroskopie (Olympus, FluoView-1000).

Reseptor-internalisasie-toets

24 uur na transfeksie is selle behandel met 1 µM kinpirool (Q102, Sigma) vir 30 min en 90 min by 37°C. Selle is hersuspendeer in 2 ml koue PBS en 200 µL hoeveelhede is vir elke reaksie gebruik. Geneesmiddelbehandelings is vir 3 uur by kamertemperatuur uitgevoer by die volgende konsentrasies; 3 nM [³H]-spiperoon (NET-565, PerkinElmer), 3 µM sulfiried (895, TOCRIS), 10 µM haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobies [³H]-spiperoon is gebruik om totale uitgedrukte reseptore te merk en hidrofiliese sulfiried is gebruik om membraneuse reseptor-gebonde te vervang [³H]-spiperoon seine. Membraan-geassosieerde reseptor seine is bereken deur intrasellulêre reseptor waardes af te trek van die totale uitgedrukte reseptor waardes. Selle is op 'n GF/B (Millipore) filter gefiltreer en 3 keer gewas met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters is uitgedroog en oorblywende radioaktiwiteit is gemeet met behulp van 'n vloeistofscintillasieteller [24].

Sel Membraan Voorbereiding

Samevloeiende selle in 100 mm-kultuurskottels na transfeksie is met yskoue PBS gewas en in 1 mL HME-buffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl) geoes₂, 1 mM EDTA). Gehomogeniseerde lysate is gesentrifugeer met 500×g vir 15 min en die supernatante is daarna gesentrifugeer met 36,000×g vir 30 min. Korrels wat in HME buffer hersuspendeer is, is vir toetse gebruik.

[³⁵S]-GTP_γS Bindingstoets

Selmembraanfraksies is vooraf geïnkubeer met 1 µM kinpirool (Q102, Sigma) in die toetsbuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0.01 mM BBP) vir 10 min. [³⁵S]-GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) is bygevoeg tot die finale konsentrasie van 3 nM in 30 µL en verder geïnkubeer vir 90 min. 170 µL yskoue buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, en 0.1 mM GTP) is bygevoeg om die reaksie te stop. Membrane is op 'n GF/B filter (Millipore) gefiltreer en 3 keer gewas met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filters is gedroog en radioaktiwiteit is gemeet met behulp van die skitterteller [25], [26].

Radioligand-bindingstoets

Voorbereide selmembrane is geïnkubeer met 0.01 nM [³H]-spiperoon (NET-565, PerkinElmer) en toenemende konsentrasies kinpirool (Q102, Sigma) vir 30 minute in die toetsbuffer (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrane is op 'n GF/B filter (Millipore) gefiltreer en 3 keer gewas met wasbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Die reaksie is beëindig deur vinnige filtrasie deur GF/C filters. Residuele radioaktiwiteit is gemeet deur gebruik te maak van 'n vloeistofscintillasieteller [27]-[29].

cAMP Ensiem Immunoassay

Getransfekteerde HEK 293-selle is voorbehandel met 10 µM rolipram (R6520, Sigma) vir 1 uur, en dan behandel met 0.1 µM forskolien (F6886, Sigma) en toenemende konsentrasies kinpirool (Q102, Sigma) vir 30 min. Primêre gekweekte striatale neurone is behandel met 10 µM rolipram vir 1 uur, en dan 1 µM dopamien vir 1 uur [22]. Sellisate is voorberei met 0.1 M HCl en cAMP-vlakke is opgespoor deur 'n cAMP-ensiem-immunotoetsstel (Sapphire Bioscience) na aanleiding van die vervaardiger se instruksies.

Primêre Gekultiveerde Striatale Neuron

Striatale area is geïsoleer van die muis embrioniese brein (E15). Gedissosieerde weefsel is gedissosieer in minimale essensiële media (MEM) (11095, Invitrogen) wat 0.25% tripsien (T4549-100, Sigma) en 0.1% DNase I vir 6 min by 37°C bevat. Selle is weer gesuspendeer in die plateringsmedia (MEM met 0.01 M HEPES (pH 7.4) en 10% (vol/vol) perdeserum (16050-122, GIBCO)). Neurone is vir 7 dae gekweek vitro (DIV 7) in MEM met B27-aanvulling (17504-044, Invitrogen) voordat dit op cAMP-ensiem-immunotoetse toegepas word.

Results

Cdk5 fosforileer Serine 321 in die derde intrasellulêre lus van DRD2 vitro

Om nuwe Cdk5-substrate te identifiseer, het ons 'n sistematiese soektog uitgevoer met behulp van (S/T)PX(K/H/R) as die Cdk5-herkenningskonsensusreekse [30] en DRD2 as 'n kandidaatsubstraat geïdentifiseer. Die konsensusvolgorde, insluitend serien 321, is geleë in die derde intrasellulêre lus van DRD2 (D2i3) waar verskeie regulatoriese meganismes geïmpliseer is [3], [10], [11]. Die volgorde word evolusionêr bewaar in DRD2 in vertebrate, wat 'n funksionele belangrikheid van die oorblyfsel (Fig. 1A).

Download:      

• PPT

  PowerPoint-skyfie

• PNG

  groter prentjie (2.08MB)

• TIFF

  oorspronklike beeld (4.36MB)

Figuur 1. Cdk5 fosforileer serien 321 in die derde intrasellulêre lus van DRD2 in vitro.

(A) Aminosuurvolgorde-belyning wat behoue ​​streke van die DRD2 van verskeie spesies (geskadu) toon. Die potensiële Cdk5-fosforileringsplek word deur 'n asterisk aangedui. (B) IP-gekoppel vitro kinase-toets met rekombinante GST-D2i3 en GST-D2i3 mutante proteïene. Cdk5/p35-kompleks verryk vanaf muisbrein-ekstrak deur anti-p35-immunopresipitasie is vir kinase-reaksies gebruik. 'n Outoradiografie van gefosforileerde proteïene word saam met Coomassie briljante blou kleuring van dieselfde jel getoon. Pylpunt dui radioaktiewe sein aan wat ooreenstem met GST-D2i3s en oop pylpunt dui radioaktiewe seine vanaf p35 aan. (C) MS/MS-spektrum van die gefosforileerde peptiedfragment van D2i3. Die teoretiese fragmentasiepatrone word onder die spektrum getoon. Onder al die fragmentione word die opgespoorde y- en b-ione in die spektrum aangedui. Die y₆ en y₇ ione dui sterk op die fosforilering van serien 321. (D) In vitro kinase-toets met gesuiwerde Cdk5/GST-p25-kompleks deur gebruik te maak van GST-D2i3 en GST-D2i3 mutante proteïene. Gefosforileerde proteïene is in 'n outoradiograaf getoon, saam met Coomassie briljante blou kleuring. Pylpunt dui radioaktiewe sein aan wat ooreenstem met GST-D2i3 en oop pylpunt dui radioaktiewe seine van GST-p25 aan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Om die kapasiteit van Cdk5 om D2i3 te fosforileer te bepaal, het ons IP-gekoppel uitgevoer vitro kinase-toetse met behulp van 'n aktiewe Cdk5/p35-kompleks verryk uit muisbrein-lisaat deur p35-immunopresipitasie met gesuiwerde rekombinante GST-D2i3 (aminosuurreste 212-373) proteïene as die substrate. Ons het fosforileringsseine in die gesuiwerde GST-D2i3 en GST-D2i3 S297A proteïene waargeneem, maar die sein is aansienlik verminder deur gebruik te maak van GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Om fosforilering van serien 321 in die GST-D2i3 verder te verifieer, het ons LC-MS/MS-analise van die monsters van IP-gekoppelde uitgevoer vitro kinase-toetse met behulp van LTQ XL massaspektrometrie. Konsekwent is fosfo-peptiede wat ooreenstem met die massa van fosfo-serien 321 peptiede herwin (Fig. 1C). As in ag geneem word dat die data-afhanklike verkryging tydens LC-MS/MS-analise geneig is om oorvloedige proteïene in die monster op te spoor [31], dui hierdie data daarop dat die serien 321-residu die dominante fosforileringsplek van Cdk5 in die D2i3-streek is. Om direkte fosforilering van serien 321 in die GST-D2i3 deur Cdk5 te bewys, vitro kinase-toets met behulp van gesuiwerde Cdk5/GST-p25-kompleks met gesuiwerde rekombinante GST-D2i3-proteïene is uitgevoer. Ons het 'n beduidende fosforileringssein in die GST-D2i3 geïdentifiseer wat afwesig was in die GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Saamgevat dui hierdie resultate aan dat die D2i3 S321-residu 'n voorkeurteiken vir Cdk5-gemedieerde fosforilering is.

Cdk5 fosforileer Serine 321 in die derde intrasellulêre lus van DRD2 in selle

Om die fosforilering van serien 321 te identifiseer, het ons teenliggaampies spesifiek vir fosfo-serien 321 (pS321) opgewek. Monsters van die IP-gekoppelde vitro kinase-toets is ontleed deur Western blotting met behulp van anti-pS321-teenliggaampies. Blots het 'n duidelike band in die kinase reaksie getoon wat afhanklik was van GST-D2i3 (Fig. 2A). Om die potensiële fosforilering van serien 321 in DRD2 deur Cdk5 in selle te verifieer, is anti-GFP-immunopresipitate van HEK 293-selle wat DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP met of sonder HA-Cdk5 en p35 uitdruk, ontleed deur Western blotting met behulp van anti-GFP en anti-pS321 teenliggaampies. Kenmerkende uitgesmeerde bandseine deur anti-GFP-teenliggaampies wat bekend is as gevolg van oormatige glikosilering van DRD2, word slegs in die teenwoordigheid van DRD2-GFP waargeneem, en anti-pS321-teenliggaampies het soortgelyke DRD2-seine slegs met Cdk5/p35-ko-uitdrukking opgespoor (Fig. 2B) [7]. Om die fosforilering van serien 321 deur Cdk5 verder te verifieer, is D2i3 (FLAG-D2i3) en mutante vorm van D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) gegenereer. FLAG-D2i3 en FLAG-D2i3 S321A uitgedruk met of sonder HA-Cdk5 en p35 in HEK 293 selle is geanaliseer deur 'n SDS-gel mobiliteit verskuiwing toets. 'n Beduidende Cdk5-afhanklike mobiliteitsverskuiwing is waargeneem vir FLAG-D2i3, maar nie vir FLAG-D2i3 S321A nie (Fig. 2C). Ons het ook die fosforileringsvlak van DRD2 by Ser321 na agonisstimulasie beoordeel. HEK 293-selle wat DRD2-GFP en Cdk5/p35-kompleks uitdruk, is deur kinpirool gestimuleer, en anti-GFP-immunopresipitate van die selliste is geanaliseer deur Western blotting met behulp van anti-GFP en anti-pS321 teenliggaampies. Ons het gevind dat Cdk5-gemedieerde fosforilering van DRD2 by Ser321 nie deur agonistiese stimulasie beïnvloed is nie, wat anders lyk as GRK- en PKC-gemedieerde fosforilerings (Fig. 2D) [32], [33]. Saam dui hierdie resultate aan dat Cdk5 die serien 321-residu van DRD2 in die sellulêre omgewing kan fosforileer.

Download:      

• PPT

  PowerPoint-skyfie

• PNG

  groter prentjie (1.92MB)

• TIFF

  oorspronklike beeld (3.5MB)

Figuur 2. Cdk5 fosforileer serien 321 in die derde intrasellulêre lus van DRD2 in selle.

Cdk5-gemedieerde fosforilering van serien 321 is geanaliseer met behulp van anti-pS321 teenliggaampies. (A) Monsters van IP-gekoppelde vitro kinase-toets met behulp van GST-D2i3-proteïene is ontleed deur Western blotting (WB) met aangeduide teenliggaampies. Pylpunte dui GST-D2i3s aan. (B) DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP is uitgedruk met of sonder HA-Cdk5 en p35 in HEK 293 selle. Anti-GFP immunopresipitate is ontleed deur Western blotting met behulp van anti-GFP en anti-pS321 teenliggaampies. Die hakie dui DRD2-seine aan en oop pylpunt dui nie-spesifieke seine van die anti-GFP-immunopresipitate aan. '% inset' is % volume van die totale lysaat vir 'n IP-reaksie. Swak endogene Cdk5 seine is deur sterretjies aangedui. (C) Gel mobiliteit verskuiwing toets. HEK 293-selle wat getransfekteer is soos aangedui, is deur Western blotting ontleed. (D) Getransfekteerde HEK 293 selle is behandel met kinpirool en anti-GFP immunopresipitate is ontleed deur Western blotting met anti-GFP en anti-pS321 teenliggaampies. Oop pylpunt dui nie-spesifieke seine van anti-GFP immunopresipitate aan.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5/p35 Complex en DRD2 is fisies geassosieer

Ons het die potensiële fisiese interaksie tussen die Cdk5/p35-kompleks en DRD2 ondersoek omdat dit bekend is dat baie Cdk5-substrate fisies met Cdk5/p35-kompleks geassosieer word. [23], [34], [35]. Eerstens is die GST-aftrek-eksperiment uitgevoer. Gesuiwerde rekombinante GST-D2i3-proteïen is met rotbrein-lisaat geïnkubeer en GST-aftrek-presipitate is vir Western blotting ontleed. Soos getoon in Fig. 3A, is endogene Cdk5 en p35 in die aftrek-presipitate geïdentifiseer, wat 'n fisiese interaksie tussen DRD2 en die Cdk5/p35-kompleks aandui (Fig. 3A). Verder, HA-Cdk5 en p35 is opgespoor in die anti-GFP immunopresipitate van HEK 293 sellistate wat DRD2-GFP en Cdk5/p35 uitdruk (Fig. 3B). Daarbenewens het ons immunositochemiese ontledings uitgevoer en waargeneem dat DRD2-GFP, HA-Cdk5 en p35 beduidende ko-lokalisering seine toon by die membraneuse area van HEK 293 selle (Fig. 3C, boonste panele). Ons het ook ko-lokalisering van DRD2 en Cdk5/p35 in die neuronale konteks ondersoek. Konsekwent het DRD2-GFP ook beduidende ko-lokalisering met endogene Cdk5 en p35 in die gekweekte striatale neurone (DIV7) getoon, wat funksionele skakels tussen DRD2 en Cdk5/p35 verder ondersteun (Fig. 3C, onderste panele). Die resultate dui aan dat DRD2 en Cdk5/p35 'n kompleks kan vorm en ondersteun dus die idee dat DRD2 'n fisiologiese substraat van Cdk5 is.

Download:      

• PPT

  PowerPoint-skyfie

• PNG

  groter prentjie (3.91MB)

• TIFF

  oorspronklike beeld (5.35MB)

Figuur 3. Cdk5/p35 kan 'n kompleks met DRD2 vorm.

(A) GST-aftrektoets met behulp van gesuiwerde rekombinante GST-D2i3-proteïen met rotbrein-ekstrak. GST-aftrekneerslae is aan Western blotting-ontledings onderwerp. 'Krale' dui op die aftrek-neerslag sonder GST-proteïene. (B) Immunopresipitasie van DRD2 en Cdk5/p35 kompleks. Anti-GFP IP van lysate van getransfekteerde selle is aan Western blotting ontledings onderwerp. Die hakie dui DRD2-seine aan en oop pylpunt dui nie-spesifieke seine van die anti-GFP-immunopresipitate aan. 'n Oorbeligte klad vir insette word ook regs getoon. (C) Immunositochemiese ontledings van DRD2 en Cdk5/p35. HEK 293-selle wat DRD2-GFP en Cdk5/p35 uitdruk, is gekleur met anti-Cdk5 en anti-p35 teenliggaampies (Boonste panele). DRD2-GFP is alleen uitgedruk in die gekweekte striatale neurone en gekleur met anti-Cdk5 en anti-p35 teenliggaampies (Laer panele). Hoechst is gebruik vir kernkleuring. Die skaalbalk is 5 µm. Alle beelde is verkry met behulp van konfokale mikroskopie (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-gemedieerde fosforilering van DRD2 verswak reseptoraktiwiteit

Daar is gerapporteer dat fosforilering kritiese eienskappe van GPCRs moduleer soos G-proteïenkoppeling, reseptor-internalisasie, intrasellulêre lokalisering en assosiasie met modulatorproteïene [9], [11], [24]. Diegonist-geïnduseerde reseptor internalisering is 'n kritieke regulatoriese proses van seintransduksie. Ons het Cdk5-gemedieerde modulasie van DRD2-internalisasie ondersoek. HEK 293-selle wat DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP met of sonder Cdk5/p35 uitdruk, is met 1 µM kinpirool geïnkubeer om agonis-gestimuleerde DRD2-internalisasie te veroorsaak (Fig. 4A). [³H]-spiperoon seine van DRD2-GFP uitdrukkende selle is aansienlik verminder by 30 min kinpirool behandeling en herstel na 90 min. Interessant genoeg, [³H]-spiperoon seine van DRD2-GFP en Cdk5/p35 uitdrukkende selle is ook verminder met 30 min kinpirool behandeling, maar nie herstel na 90 min nie (Fig. 4A, tweede afdeling). Aan die ander kant, [³H]-spiperoon seine van DRD2 S321A-GFP uitdrukkende selle is verminder op 30 min en herstel op 90 min, ongeag die mede-uitdrukking met Cdk5/p35. Vorige studies het getoon dat die geïnternaliseerde DRD2 terug na die plasmamembraan herwin na langdurige agonisstimulasie [11]. TDit blyk dus dat Cdk5-gemedieerde fosforilering van DRD2 betrokke is by die resensitiseringsprosesse na agonis-geïnduseerde DRD2 internalisering.

Download:      

• PPT

  PowerPoint-skyfie

• PNG

  groter prentjie (387KB)

• TIFF

  oorspronklike beeld (1.31MB)

Figuur 4. Cdk5-gemedieerde fosforilering verswak DRD2 oppervlak uitdrukking en stroomaf sein.

(A) DRD2 oppervlak uitdrukking gemeet deur [³H]-spiperoon bindingstoets. Getransfekteerde HEK293-selle is gestimuleer met 1 µM kinpirool vir die aangeduide tyd en geoes, gevolg deur 3 nM [³H]-spiperoon behandeling vir 3 uur. Radioaktiwiteit is gemeet en oppervlakseine is bereken. Foutstawe verteenwoordig gemiddelde ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01; Eenrigting ANOVA met Dunnett post hoc-toets: vergelyk alle kolomme vs. kontrolekolom). (B) [³⁵S]-GTP_γS bindingstoets. Selmembrane is voorberei uit die selle wat getransfekteer is soos aangedui. Membraanpreparate is geïnkubeer met 1 µM kinpirool gevolg deur 3 nM [³⁵S]-GTP_γS vir 90 min. Foutstawe verteenwoordig gemiddelde ± SE (n = 8; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; Eenrigting ANOVA met Bonferroni post hoc toets: vergelyk alle pare kolomme). (C) Kinpirool-mededingende [³H]-spiperoon bindingstoets. Membraanpreparate van getransfekteerde selle is geïnkubeer met 0.01 nM [³H]-spiperoon en toenemende konsentrasies kinpirool vir 30 min. Nie-lineêre regressie is verkry deur GraphPad. Foutstawe dui gemiddelde ± SE aan (n = 3). (D) cAMP-ensiem-immunotoetse in getransfekteerde HEK 293-selle. Getransfekteerde selle is voorbehandel met 10 µM rolipram vir 1 uur, en daarna saam met 0.1 µM forskolien en toenemende konsentrasies kinpirool vir 30 min. Nie-lineêre regressie is verkry deur GraphPad. Foutstawe verteenwoordig gemiddelde ± SE (n = 4; **p<0.01; tweekantig t-toetse). (E) Gekweekte striatale neurone van wilde tipe en p35 uitklop-embrio's (DIV 7) is behandel met 10 µM rolipram vir 1 uur gevolg deur 1 µM dopamien vir 1 uur. Foutstawe verteenwoordig gemiddelde ± SE (n = 4; **p<0.01; tweestert t-toetse).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Ons het verder 'n potensiële verandering van agonis-gestimuleerde G-proteïenkoppeling aan DRD2 geëvalueer wat verband hou met Cdk5-gemedieerde fosforilering deur gebruik te maak van [³⁵S]-GTP_γS bindingstoets [25], [26]. DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP met of sonder Cdk5/p35 is in HEK 293 selle uitgedruk. Membrane is voorberei en gestimuleer met 1 µM kinpirool en verder toegelaat [³⁵S]-GTP_γS inlywing. DRD2-GFP en Cdk5/p35 uitdrukkende selmembraan het aansienlik verswak getoon [³⁵S]-GTP_γS-binding in vergelyking met al die ander selmembrane (Fig. 4B). Hierdie resultate dui aan dat Cdk5-gemedieerde fosforilering agonis-gestimuleerde G-proteïenbinding by DRD2 afreguleer.

Daarbenewens, kinpirool-mededingende [³H]-spiperoon bindingstoetse is uitgevoer om enige potensiële verandering in agonis-affiniteit by DRD2 deur Cdk5-gemedieerde fosforilering te ondersoek. Mededingende binding van [³H]-spiperoon na behandeling van toenemende konsentrasies kinpirool na die membraanpreparaat vanaf getransfekteerde is gemeet. Mededingende binding van kinpirool en [³H]-spiperoon by DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP het soortgelyke logK gemaak_i waardes (-9.789 vir DRD2-GFP; -9.691 vir DRD2 S321A-GFP), wat aandui dat die affiniteit van ligand vir DRD2 nie beduidend beïnvloed word deur Cdk5-gemedieerde fosforilering by DRD2 nie (Fig. 4C).

Cdk5-gemedieerde fosforilering reguleer die DRD2-cAMP seinpad af

Vervolgens het ons ondersoek ingestel of die wysiging van DRD2 deur Cdk5 stroomaf seinpaaie beïnvloed. Ons het DRD2-gemedieerde inhibisie van forskolien-gestimuleerde cAMP-produksie deur adenielsiklase gemonitor in die selle wat DRD2-GFP en DRD2 S321A-GFP uitdruk met behulp van cAMP-ensiem-immunotoets. DRD2-uitdrukkingselle het verlaagde cAMP-vlakke getoon in reaksie op kinpirool op 'n dosisafhanklike wyse. Opmerklik, mede-uitdrukking van Cdk5/p35 het die maksimum inhibisie van cAMP-vorming aansienlik verminder (Fig. 4D, linkerpaneel). Aan die ander kant, in die DRD2 S321A-GFP-uitdrukkingselle, is die cAMP-formasies effektief geïnhibeer in reaksie op kinpiroolbehandeling, ongeag die uitdrukking van Cdk5/p35 (Fig. 4D, regterpaneel). Hierdie resultate dui aan dat Cdk5-gemedieerde fosforilering van DRD2 die inhiberende aktiwiteit van DRD2 op die stroomaf cAMP seinpad verswak. Om die verskynsels in 'n meer fisiologies relevante omgewing verder te bevestig, het ons gebruik gemaak van primêre gekweekte neurone van uitklop-embrio's wat tekort is aan p35, 'n noodsaaklike Cdk5-aktiveerder. Primêre gekweekte striatale neurone is behandel met 1 µM dopamien en geanaliseer deur cAMP ensiem immunoassay. Neurone van p35-uitklopmuise het verminderde cAMP-vlakke getoon in vergelyking met wildtipe neurone wanneer dit met dopamien gestimuleer word (Fig. 4E). Tsaam, het ons tot die gevolgtrekking gekom dat Cdk5-gemedieerde fosforilering van DRD2 lei tot 'n afname in die inhiberende toon op die cAMP-pad wat deur DRD2 uitgeoefen word.

Bespreking

Ons het DRD2 geïdentifiseer as 'n nuwe substraat van Cdk5. Dit blyk dat die fosforilering DRD2-oppervlakuitdrukking afreguleer deur die lot van DRD2 na reseptor-internalisasie te beïnvloed en sodoende DRD2 G te verminder_i-koppeling en stroomaf cAMP pad. Aangesien die fosforileringsresidu S321 beide in DRD2 lang en kort isovorme bestaan, kan die meganisme wat in hierdie studie voorgestel word 'n algemene wyse van regulering in DRD2-gemedieerde sein wees.

DRD2 in medium stekelrige neurone is nie net as 'n belangrike dopamienreseptor subtipe beskou nie, maar is ook erken vir sy vatbaarheid vir veranderinge in beskikbaarheid in reaksie op omgewingstimuli. Agonis-geïnduseerde desensibilisering en hersensibilisering van DRD2 is omvattend bestudeer [11], [24]. In die besonder, 'n aantal studies het getoon dat die effekte van chroniese psigostimulerende blootstelling, soos kokaïen en amfetamien, wat die ekstrasellulêre vlak van dopamien in die striatale sinaps verhoog, gepaard gaan met dinamiese veranderinge van DRD2 postsinapties [36]. Dit is inderdaad bekend dat chroniese kokaïengebruikers DRD2-vlakke in die striatale area verlaag het, en DRD2-beskikbaarheid in die nucleus accumbens (NAcc) toon 'n negatiewe korrelasie met die dwelmsoek- en versterkingsgedrag by muise en primate [37]-[39]. Hierdie bevindinge dui daarop dat die funksionaliteit van DRD2 hoogs vatbaar is vir aanpasbare of kompenserende regulering in reaksie op verskeie stimuli, insluitend chroniese geneesmiddelblootstelling. Ons resultate toon dat die S321-residu in die derde intrasellulêre lus van DRD2 deur Cdk5 gefosforileer kan word, wat lei tot 'n afname in inhiberende invloed van DRD2 op die cAMP-weg. Hierdie interaksie stel 'n nuwe regulatoriese meganisme voor wat verband hou met Cdk5 in dopaminoseptiewe neurone wat gekoppel kan word aan die dinamiese aard van DRD2 oppervlak beskikbaarheid.

Daar moet kennis geneem word dat Cdk5 bekend is as 'n sleutelkomponent in die bemiddeling van adaptiewe veranderinge van die neuronale omgewing. Byvoorbeeld, strukturele en funksionele veranderinge van dendritiese stekels in die neurone van die limbiese kring is een van die gevolge van herhaalde psigostimulerende blootstelling [40]. Hierdie veranderinge gaan gepaard met verskeie molekulêre veranderinge, insluitend die induksie van cAMP-reaksie element-bindende proteïen (CREB) en ΔFosB, transkripsiefaktore wat 'n blywende opregulering toon in reaksie op chroniese kokaïentoediening [41], [42]. Wat belangrik is, is dat Cdk5 'n teiken van ΔFosB is [19], en baie kritieke komponente betrokke by dendritiese ruggraatdinamika, soos PSD-95, p21-geaktiveerde kinase (PAK), β-catenin en spinofilien, is as Cdk5-substrate gerapporteer [43]-[46]. Genetiese of farmakologiese manipulasies van Cdk5-aktiwiteit veroorsaak konsekwent veranderinge van dendritiese ruggraatmorfologie en gedragsreaksies op kokaïen, wat kritieke rolle vir Cdk5 in die molekulêre en morfologiese veranderinge van mesolimbiese dopamienkringe impliseer. [47], [48]. Ons resultate wat toon dat DRD2 'n nuwe teiken van Cdk5 is, bied bykomende insig in die aanpasbare veranderinge van die dopamienstelsel in reaksie op chroniese geneesmiddelblootstellings as gevolg van die daaropvolgende ΔFosB-gemedieerde opregulering van Cdk5 kan 'n toniese toename in die fosforilering van DRD2 veroorsaak. . Boonop is dit bekend dat DRD2 talle sellulêre prosesse beïnvloed, insluitend regulering van cAMP- en MAP-kinase-weë en stroomaf transkripsionele gebeure [42], [49]. Die bevindinge in hierdie studie kan dus nie net 'n direkte regulering van DRD2 deur Cdk5 uitbeeld nie, maar bied ook 'n nuwe insig in die aanpasbare reaksies van dopamienstelsel op chroniese dwelmblootstelling.

Skrywer Bydraes

Het die eksperimente bedink en ontwerp: JJ YUP DH SKP. Het die eksperimente uitgevoer: JJ YUP DKK YK. Ontleed die data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Bygedrae reagense/materiale/analise-instrumente: YHS. Het die vraestel geskryf: JJ SKP.