Abstract
Psigostimulerende-geïnduceerde verandering van dendritiese stekels op dopaminoceptiewe neurone in nucleus accumbens (NAcc) is voorgestel as 'n adaptiewe neuronale respons wat gekoppel is aan langdurige verslawende gedrag. NAcc bestaan grotendeels uit twee afsonderlike subpopulasies van mediumgroot spinyneurone wat hoë vlakke van dopamien D1 of D2 reseptore uitdruk. In die huidige studie het ons dendritiese ruggraatdigtheid ontleed ná chroniese kokaïenbehandeling in afsonderlike D1- of D2-reseptor-bevattende mediumgroot-spinyneurone in NAcc. Hierdie studies het gebruik gemaak van transgeniese muise wat EGFP uitgedruk het onder die beheer van óf die D1- of D2-reseptorpromotor (Drd1-EGFP of Drd2-EGFP). Na 28 dae van kokaïenbehandeling en 2-dae van onttrekking het ruggraatdigtheid toegeneem in beide Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-positiewe neurone. Die toename in ruggraatdigtheid is egter slegs in Drd1-EGFP-positiewe neurone 30 dae na die onttrekking van geneesmiddels gehandhaaf. Veral, verhoogde ΔFosB-uitdrukking is ook waargeneem in Drd1-EGFP- en Drd2-EGFP-positiewe neurone na 2-dae van onttrekking van geneesmiddels, maar slegs in Drd1-EGFP-positiewe neurone na 30-dae van onttrekking van geneesmiddels. Hierdie resultate dui daarop dat die verhoogde ruggraatdigtheid wat na chroniese kokaïenbehandeling waargeneem word, stabiel is slegs in D1-reseptor-bevattende neurone, en dat ΔFosB-uitdrukking verband hou met die vorming en / of die instandhouding van dendritiese stekels in D1 sowel as D2-reseptorbevattende neurone in NAcc.
Die mesolimbiese dopaminerge pad is saamgestel uit neurone in die ventrale tegmentale area wat die nucleus accumbens (NAcc), olfaktoriese tuberkel, prefrontale korteks en amygdala inneem (1), terwyl nigrostriatale dopaminerge neurone in die substantia nigra (pars compacta) 'n stygende projeksie tot dorsale striatum bied (2). Psigostimulante verhef sinaptiese konsentrasies dopamien in NAcc: kokaïen, deur dopamienopname van die sinaptiese spleet en amfetamien te blokkeer deur dopamien vrystelling van senuweesterminale te bevorder (3-5). Herhaalde, intermitterende toediening van psigostimulante lei tot verhoogde gedragsreaksies (sensitiwiteit) vir die akute stimulerende effekte van hierdie middels (6-8). Die meeste lyne van bewyse dui daarop dat aanpassingsveranderinge in die ventrale tegmentale area-NAcc dopaminerge sisteem sentraal is tot veranderinge in die ervaring-afhanklike plastisiteit wat onderliggend aan dwelmgeïnduceerde gedrag is.
Benewens dopamien word glutamaat benodig vir die ontwikkeling van gedragsensitisering in reaksie op psigostimulante (9, 10). Medium-grootte spiny neurons (MSNs) in ventrale striatum ontvang opwindende glutamatergiese projeksies van prefrontale korteks wat op die kop van dendritiese stekels sinkapteer. MSN's is ook die hoof teiken vir dopaminerge aksone wat op ruggraatnekke sinkapteer (1, 11, 12). Daarom verteenwoordig dendritiese stekels in MSNs die sellulêre kompartement waar dopaminerge en glutamatergiese transmissie aanvanklik geïntegreer word.
Dopamien handel oor twee groot reseptor subfamilies, die D1 subfamilie (D1 en D5 subtipes) en die D2 subfamilie (D2, D3, en D4 subtipes) (13). In dorsale striatum het anatomiese studies getoon dat striatonigrale MSN's hoë vlakke van D1-reseptore bevat (saam met substansie P en dynorfine), terwyl striatopallidale MSNs oorwegend D2-reseptore (saam met enkefalien) uitdruk14-17). Die projeksies van NAcc is meer kompleks as in dorsale striatum, met die dop en kern dele van die NAcc wat na afsonderlike substreke van die ventrale pallidum en na die ventrale tegmentale area en substantia nigra18). AANGESIEN D2-reseptore en enkefalien hoogs uitgedruk word in projeksies op die ventrale pallidum, word D1-reseptore en substansie P ewe verdeel in projeksies na ventrale pallidum- en ventrale tegmentale area (19). Studies van agoniste en antagoniste selektief vir D1- of D2-reseptore het getoon dat beide D1- en D2-reseptore benodig word vir psigostimulerende afhanklike gedragsveranderings (20-25). Die rolle van hierdie reseptore lyk egter anders. Byvoorbeeld, stimulering van D1-reseptore verswak kokaïen soekend geïnduceerde deur kokaïen priming inspuitings en kokaïen verwante omgewing aanwysers, terwyl stimulering van D2 reseptore fasiliteer kokaïen-geïnduceerde herstel26-28).
Die gedragsafwykings wat met psigostimulerende verslawing geassosieer word, is uiters langlewend. Daarom was daar groot belangstelling in die identifisering van langdurige dwelmgeïnduceerde veranderings op molekulêre en strukturele vlak in neuronale bane wat gereguleer word deur dopamien en glutamaat (29-32). Die langtermyn blootstelling aan kokaïen of amfetamien het gevind dat die aantal dendritiese takpunte en ruggraat van MSN's in NAcc33-35). Hierdie strukturele veranderinge het getoon dat dit tot ≈1-3.5 maande na die laaste blootstelling aan geneesmiddels (≈XNUMX-XNUMX) bly30, 35) en is voorgestel om langdurige veranderinge in sinaptiese plastisiteit wat verband hou met blootstelling aan psigostimulante te begryp.
Die doel van die huidige studie was om kokaïen-geïnduceerde strukturele veranderings van dendritiese stekels te ondersoek in subpopulasies van akkumulale MSNs wat D1 of D2-reseptore uitdruk. In hierdie studies het ons bakteriese kunsmatige chromosoom (BAC) transgeniese muise gebruik wat die EGFP onder beheer van die DOPNUMX (Drd1-EGFP) of D1 (Drd2-EGFP) dopamienreseptorpromotor36). Die resultate dui daarop dat hoewel die verhoogde ruggraatdigtheid aanvanklik voorkom in D1-reseptor-bevattende MSNs en D2-reseptor-bevattende MSNs, die veranderde ruggraatdigtheid slegs stabiel is in D1-reseptorbevattende neurone. Daarbenewens vind ons soortgelyke veranderinge in die uitdrukking van die transkripsiefaktor ΔFosB, wat daarop dui dat ΔFosB betrokke kan wees by die vorming en / of instandhouding van dendritiese stekels in D1 sowel as D2-reseptorbevattende neurone in NAcc.
Results
Analise van MSN's in Drd1-EGFP en Drd2-EGFP BAC Transgenic Mice.
Die projeksiepatroon van MSNs van dorsale en ventrale striatum in Drd1-EGFP of Drd2-EGFP BAC transgeniese muise is gekenmerk deur analise van GFP-uitdrukking (36). Die differensiële uitdrukking van GFP in MSNs van dorsale striatum stem in die algemeen ooreen met dié van endogene D1- of D2-reseptore onderskeidelik (36). Ons het die differensiële uitdrukking van GFP in NAcc in Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muise verder ontleed (Fig 1a en b). Alhoewel ≈58% neurone in NAcc GFP in drd1-EGFP-muise uitgedruk (Fig 1a), ≈48% van neurone in NAcc het GFP in drd-2-EGFP-muise uitgedruk (Fig 1b). MSN'e verteenwoordig 90-95% van alle neurone in NAcc12, 37). D1-reseptore word slegs in MSN's uitgedruk, en D2-reseptore word uitgedruk in MSNs en in cholinergiese interneurone, wat 1-3% van striatale neurone verteenwoordig (37). Met inagneming van hierdie faktore, dui die resultate daarop dat, ten minste ≈10-15% van MSNs in NAcc, beide D1- en D2-reseptore sal uitdruk.
Analise van Dendritiese Spies in Drd1-EGFP en Drd2-EGFP Mice.
GFP-uitdrukking in die Drd1-EGFP en Drd2-EGFP-muise was nuttig om neuronale selliggame te vlek. Die GFP sein in dendriete en dendritiese stekels was egter te swak om hul analise toe te laat nadat immunostaining met anti-GFP-teenliggame was. Partikel-gemedieerde ballistiese lewering van fluoresserende kleurstowwe is onlangs gebruik om neuronale bevolkings op 'n vinnige en doeltreffende wyse te benoem (38). Hele neurone kan met hierdie tegniek gemerk word, en die metode blyk te wees vergelykbaar met Golgi-Cox-kleuring. Om die dendritiese morfologie van neurone in NAcc te analiseer, was vaste akkumulale snitte gemerk met die lipofiele fluorescentie kleurstof 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindokarbocyanienperchloraat (DiI) deur 'n geengeweer te gebruik. 'N Voorbeeld van 'n DiI-gekleurde MSN word getoon in Fig 1c. Onder die omstandighede wat gebruik is, het ons algemeen gemerkte neurone waargeneem sonder enige oorvleuelende dendriete van ander gemerkte neurone. By hoër vergroting kon gedetailleerde dendritiese morfologie, insluitend dendritiese stekels, waargeneem word (Fig 1d).
Ons het dan 'n kombinasie van DiI-etikettering en immunohistochemie vir GFP gebruik in Drd1-EGFP of Drd2-EGFP transgeniese muise, wat moontlik gemaak is deur 'n lae konsentrasie skoonmaakmiddel vir weefselpermeabilisasie te gebruik (sien Metodes). Deur die noukeurige vergelyking van die DiI-vlek en GFP-uitdrukking in die selliggame van MSN's, kon ons DiI- en GFP-positiewe of DiI-positiewe en GFP-negatiewe neurone in Drd1-EGFP identifiseer (Fig 2a) of Drd2-EGFP (Fig 2b) muise. Vir die volgende studies het ons dendritiese morfologie in slegs DiI- en GFP-positiewe neurone van Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muise ontleed.
Chroniese kokaïenbehandeling lei tot verhoogde ruggraatdigtheid in Accumbal MSNs wat óf Drd1-EGFP of Drd2-EGFP uitdruk.
Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muise is vir vier opeenvolgende weke herhaaldelik met kokaïen (30 mg / kg) of soutgehalte ingespuit (sien Metodes). Twee dae (2WD) of 30WD (30WD) na die laaste geneesmiddelbehandeling is brein verwerk vir DiI-etikettering en immunohistochemie soos hierbo beskryf. 'N vorige studie het berig dat chroniese behandeling met amfetamien verhoogde ruggraatdigtheid op distale, maar nie proximale dendriete van MSN's in NAcc35). Ons het dus ons analise beperk tot distale dendriete (dws dié met tweede- of derde-orde takke), insluitend terminale streke. Wanneer dit by 2WD ontleed is, is ruggraatdigtheid gevind in Drd1-EGFP-positiewe MSNs (128% van soutgroep) (Fig 3a en c) en tot 'n mindere mate in Drd2-EGFP-positiewe neurone (115% van soutgroep) (Fig 3 b en d). Na 30WD is verhoogde ruggraatdigtheid gehandhaaf in Drd1-EGFP-positiewe neurone (118% van soutbeheer) (Fig 3 a en c), maar nie in Drd2-EGFP-positiewe neurone nie (Fig 3 b en d).
Die morfologie van dendritiese stekels is veranderlik in terme van hul lengte en die breedte van die ruggraatkop. Ons het dus dendritiese uitsteeksels geklassifiseer in vier ruggraatklasse (stomp, sampioen, dun en filopodia) by 2WD van kokaïen (data nie getoon nie). Die digtheid van sampioen-tipe (119.7 ± 4.0%, P <0.01) en dun stekels (120.0 ± 3.4%, P <0.01) is verhoog deur kokaïenbehandeling in Drd1-EGFP-positiewe MSN's, terwyl die digtheid van stomp (182.4 ± 21.6%, P <0.05) en sampioenstekels (122.5 ± 5.0%, P <0.01) is verhoog in Drd2-EGFP-positiewe MSN's. Daar was geen beduidende toename in stomp stekels in Drd1-EGFP-positiewe neurone of met dun stekels in Drd2-EGFP-positiewe neurone nie.
Chroniese Kokaïen veroorsaak ΔFosB Expression in Drd1-EGFP- of Drd2-EGFP-Positiewe MSNs in NAcc.
ΔFosB is 'n lid van die Fos-familie van transkripsiefaktore. Terwyl akute toediening van kokaïen 'n vinnige en oorgangsinduksie van verskeie Fos-isoforme in NAcc veroorsaak, herhaal die blootstelling aan kokaïen die vlak van ΔFosB. Daarbenewens bly die toename in ΔFosB-uitdrukking in weke tot maande na die staking van geneesmiddelblootstelling in NAcces, en dit word voorgestel om betrokke te wees by die langdurige regulering van geenuitdrukking selfs nadat die dwelmopname opgehou het (29, 39, 40).
Om die induksie van ΔFosB in NAcc van Drd1-EGFP of Drd2-EGFP-muise na kokaïenbehandeling te ondersoek, het ons FosB- en GFP-uitdrukking deur dubbele etikettering ontleed (Fig 4 en Tabel 1) Die anti-FosB-teenliggaam erken alle vorme van FosB, maar ons aanvaar dat die verhoogde immunostain ΔFosB verteenwoordig (sien Metodes vir verdere bespreking). In sout behandelde muise het 16% van Drd1-EGFP-positiewe neurone en 15% van Drd2-EGFP-positiewe neurone FosB immunoreaktiwiteit met relatief swak intensiteit uitgedruk (Fig 4 a en b en Tabel 1). Herhaalde kokaïenbehandeling gevolg deur 2WD het gelei tot 'n beduidende toename in die aantal Drd1-EGFP-positiewe neurone wat ΔFosB (55% van GFP-positiewe neurone) saamgepers het (Fig 4c en Tabel 1). 'N Kleiner, maar steeds beduidende toename in ΔFosB-uitdrukking is gevind in Drd2-EGFP-positiewe neurone (25% van GFP-positiewe neurone) (Fig 4d en Tabel 1). Soos met die veranderinge in ruggraatdigtheid, is die verhoogde uitdrukking van ΔFosB in Drd1-EGFP-positiewe neurone (46% van GFP-positiewe neurone) in stand gehou, maar nie in Drd2-EGFP-positiewe neurone (15% van GFP-positiewe neurone) na 30WD (Fig 4 e en f en Tabel 1). Let daarop dat die verhoogde ΔFosB uitdrukking waargeneem in Fig 4f is teenwoordig in drd2-EGFP-negatiewe neurone.
Bespreking
Langdurige aanpassings in dopaminerge neurotransmissie word geglo om verslawende gedrag wat met psigostimulerende middels verband hou, te begryp. In die besonder, psigostimulerende-geïnduceerde toenames in dendritiese ruggraatdigtheid van MSN's in NAcc is veronderstel om gekoppel te wees aan herorganisasie van sinaptiese konnektiwiteit (30). Die NAcc bestaan hoofsaaklik uit twee afsonderlike subpopulasies van MSNs wat hoë vlakke van D1 of D2 dopamienreseptore uitdruk. In die huidige studie het ons ruggraatdigtheid in afsonderlike D1- of D2-reseptor-bevattende MSNs in NAcc ontleed ná chroniese kokaïenbehandeling. Die resultate wat verkry is, toon dat alhoewel verhoogde ruggraatdigtheid aanvanklik voorkom in D1-reseptor-bevattende MSNs en D2-reseptor-bevattende MSNs, veranderde ruggraatdigtheid slegs stabiel is in D1-reseptor-bevattende neurone. Daarbenewens vind ons 'n soortgelyke patroon van veranderinge in die uitdrukking van die transkripsiefaktor ΔFosB in D1 en D2 reseptor-bevattende MSNs.
Hierdie studies het gebruik gemaak van BAC-transgeniese muise wat GFP uitdruk in spesifieke subpopulasies van MSNs onder die beheer van óf die D1- of D2-reseptorpromotor. Daarbenewens het ons 'n dubbel-etikettering metode ontwikkel wat immunohistochemie vir GFP gekombineer het met ballistiese etikettering van neurone wat DiI gebruik. Vorige studies het die Golgi-Cox-metode gebruik om die effek van psigostimulante op ruggraatdigtheid te analiseer (34), en die DiI-metode wat hier gebruik word, het resultate gegee wat kwantitatief vergelykbaar was. Ons het die dubbel-etikettering metode ontwikkel omdat Golgi-kleuring nie verenigbaar is met immunohistochemie nie. Immunostaining vereis gewoonlik weefselpermeabilisasie met skoonmaakmiddels, 'n proses wat tipies tot oplosbaarheid van lipofiele kleurstowwe uit die membraan lei (38). In ons huidige studies het GFP-immunostaining egter nie 'n hoë konsentrasie skoonmaakmiddel benodig vir weefselpermeabilisasie nie en kon dit ook gebruik word in kombinasie met lipofiele kleurmerketikettering. Ons dubbele etikettering metode moet oor die algemeen nuttig wees vir studies van strukturele veranderinge in dendritiese stekels, byvoorbeeld wanneer dit gebruik word vir analise van BAC transgeniese muise lyne waar GFP uitgedruk word in spesifieke populasies van neurone in korteks (36).
Alhoewel dit steeds ietwat omstrede is, word daar geglo dat D1 en D2 reseptore hoofsaaklik anatomies geskei word aan die direkte (striatonigrale) en indirekte (striatopallidale) striatale projeksie neurone onderskeidelik (17, 41). Aanvanklike karakterisering van die lokalisering van GFP in die Drd1-EGFP en Drd2-EGFP-muise was in ooreenstemming met hierdie gevolgtrekking (36). Verder is ons analise van die aantal GFP-positiewe neurone in NAcc van Drd1-EGFP en Drd2-EGFP muise in ooreenstemming met die gevolgtrekking dat ≈50% MSNs slegs D1-reseptore uitdruk, dat ≈35-40% slegs D2-reseptore uitdruk, en dat ≈10-15% beide D1- en D2-reseptore saamdruk. Hierdie waarde van koëpressie is soortgelyk aan dié wat geïmpliseer word deur studies van dorsale striatum wat gekombineerde patch-clamp analise van enkele striatale neurone met RT-PCR tegnieke om mRNAs te isoleer en te versterk (≈17% coexpressie van enkefalien en substansie P) (42). Daar moet kennis geneem word dat ons huidige studies nie die uitdrukking van D3-, D4- en D5-reseptore aanspreek nie, en ook nie die probleem van lae vlakke van uitdrukking van D1-reseptore in MSN's wat hoë vlakke van D2-reseptore uitdruk of andersom aanspreek nie.
Verskeie vorige studies het die neuronale lokalisering van psigostimulerende-geïnduceerde Fos-uitdrukking en die rol van D1- en D2-reseptore ondersoek (43-45). Hierdie studies ondersteun die gevolgtrekking dat Fos en ΔFosB induksie gemedieer word deur aktivering van D1 reseptore. Die sellulêre lokalisering van Fos-uitdrukking word egter beïnvloed deur die omgewingskonteks waarin psigostimulerende middels toegedien word (46, 47). Byvoorbeeld, amfetamien of kokaïen wat in die tuiskas gegee word, veroorsaak onmiddellike vroeë gene (insluitende Fos), veral in substansie P-positiewe selle wat D1-reseptore saamexpresseer. In teenstelling, kan hierdie middels Fos-uitdrukking in beide D1- en D2-reseptor-bevattende MSNs induuseer wanneer dit in 'n nuwe omgewing toegedien word. Die protokol wat in ons huidige studies gebruik word, sluit nie in kombinasie van dwelminspuiting met blootstelling aan 'n nuwe omgewing nie. Ons kan egter nie 'n soort konteks-afhanklike stres uitsluit wat verantwoordelik is vir ΔFosB-uitdrukking in D2-reseptor-bevattende MSNs nie.
'N Merkwaardige kenmerk van die huidige resultate was die parallelle patroon van verhoogde ruggraatdigtheid en ΔFosB-uitdrukking. Verhoogde ruggraatdigtheid en ΔFosB-uitdrukking het aanvanklik plaasgevind in MSNs wat Drd1-EGFP en Drd2-EGFP uitdruk. Hierdie veranderinge was egter slegs stabiel in D1-reseptor-bevattende neurone. Een moontlike verduideliking vir die waarneming dat verhoogde ruggraatdigtheid en ΔFosB-uitdrukking is, is oorgedra in D2-reseptorbevattende neurone, is dat dit plaasgevind het in die klein fraksie van MSNs wat beide D1- en D2-dopamienreseptore met mekaar saamdruk. Die oorgangsaard van hierdie toenames kan dus geassosieer word met antagonistiese effekte van D2-reseptoraktivering op D1-afhanklike seinweë48). Dit is van belang dat die veranderinge in ruggraatdigtheid en ΔFosB-uitdrukking omkeerbaar was, wat die vermoë van D2-reseptor afhanklike seinweë kan weerspieël om die stabiliteit van ΔFosB te beïnvloed.
Die waarneming dat daar parallelle veranderinge in die uitdrukking van ΔFosB en ruggraatdigtheid is, stem ooreen met die idee dat ΔFosB betrokke is by die aanvanklike vorming en die daaropvolgende instandhouding van dendritiese stekels in D1-reseptorbevattende neurone in NAcc. Uitdrukking van ΔFosB word beheer deur die D1 / DARPP-32 / PP1-afhanklike seinweg in MSNs (49). Verskeie studies het getoon dat ΔFosB 'n belangrike rol speel in die lonende en lokomotoriese aktiverende aksies van psigostimulante (39), waarskynlik deur die uitdrukking van veelvoudige gene wat neurotransmitterreseptore, seinproteïene, en proteïene betrokke in regulering van neuronale morfologie beïnvloed (50). Die spesifieke molekulêre meganismes betrokke by chroniese kokaïen-geïnduceerde ruggraatvorming is egter nie bekend nie. Ons vorige studies het getoon dat intraaccumbal infusie van die Cdk5 inhibitor roscovitine verswakte kokaïen-geïnduceerde toenames in ruggraatdigtheid (51). Verder is Cdk5 'n stroomafwaartse teikengen vir ΔFosB en is betrokke by kompenserende adaptiewe veranderinge wat verband hou met chroniese kokaïenbehandeling (52). Daarom is verandering in Cdk5-afhanklike fosforilering 'n waarskynlike meganisme wat onderliggend is aan kokaïen-geïnduceerde ruggraatvorming en / of ruggraatstabiliteit. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), en spinofilien (56) is substrate vir Cdk5 en is almal betrokke by regulering van rugmorfogenese (57-60). Verdere karakterisering van hierdie en ander Cdk5 substraten in stekels sal hopelik lig werp op die meganismes betrokke by regulering van ruggraatvorming deur psigostimulante.
Metodes
Diere.
Muise wat 'n EGFP transgen onder die beheer van óf die D1- of D2-dopamienreseptore het, is gegenereer deur die transgeniese projek Gensat BAC (36). Die transgeniese muise wat in hierdie studie gebruik is, was 4-5 weke oud en was op 'n Switserse-Webster agtergrond. Muise is in 'n 12: 12-h lig / donker siklus gehandhaaf en in groepe 2-5 gehuisves met voedsel en water beskikbaar ad libitum. Alle dierprotokolle was in ooreenstemming met die Nasionale Instituut van Gesondheidsgids vir die Sorg en Gebruik van Laboratoriumdiere en is goedgekeur deur die Rockefeller Universiteit Institusionele Diereversorgings- en -gebruikskomitee.
Dwelm Behandeling.
Chroniese kokaïenbehandeling (30 mg / kg, daagliks) is gerapporteer om 'n robuuste toename in die ruggraatdigtheid van MSNs in beide die kern en dop van NAcc vanaf die rat te lewer, maar 'n laer dosis (15 mg / kg) die dop (61). Ons het dus die hoër dosis kokaïen gebruik om strukturele modifikasie in beide dele van die NAcc te veroorsaak. Muise het elke dag vir 30 opeenvolgende dae een inspuiting (ip) van 5 mg / kg kokaïen-HCl (of sout) ontvang, gevolg deur 2 inspuitvrye dae, en hierdie prosedure is vir 4 opeenvolgende weke herhaal. Inspuitings is in die huishok uitgevoer. 2WD of 30WD, muis brein is verwerk vir DiI etikettering en / of immunohistochemistry.
Ballistiese Etikettering Met Die Fluorescent Dye DiI.
Muise is narkotiseerd met 80 mg / kg natriumpentobarbital en transsorteer met 5 ml PBS, gevolg deur vinnige perfusie met 40 ml 4% paraformaldehied in PBS (20 ml / min). Brein is vinnig uit die skedel verwyder en in 4% paraformaldehied vir 10 min vasgemaak. Breinskywe (100 μm) is gemerk deur ballistiese aflewering van fluoresserende kleurstof DiI (Molekulêre Probes) soos beskryf in ref. 38. 'N Gekombineerde DiI-etikettering-immunohistochemie metode is ontwikkel met 'n lae konsentrasie skoonmaakmiddel. DiI-gemerkte afdelings is deur 0.01% Triton X-100 in PBS vir 15 min gegeurbaar en daarna geïnkubeer in 0.01% Triton X-100 en 10% normale boksserum in PBS vir 1 h om nie-spesifieke etikettering te verminder. Weefselafdelings is dan geïnkubeer met 1% normale boksserum / 0.01% Triton X-100 en anti-GFP antilichaam (Abcam, Cambridge, MA) vir 2 h by kamertemperatuur, gewas en geïnkubeer in 'n 1: 1,000 verdunning van FITC- gekonjugeerde sekondêre antilichaam (Molekulêre Probes). Afdelings is op mikroskoopskyfies geplaas en met die monteermedium gedek. Die ballistiese etiketteringsmetode het gedetailleerde analise van dendritiese ruggraatstruktuur toegelaat, en die resultate wat verkry is, was kwalitatief en kwantitatief vergelykbaar met vorige studies deur die Golgi-Cox-impregnasiemetode in ratbreinskywe te gebruik (34). In teenstelling met vorige studies het ons egter selde tweesnitige stekels in DiI-gekleurde neurone waargeneem. Hierdie verskil kan veroorsaak word deur die sensitiwiteit van kleurmetodes of veranderlikheid van muis (hierdie studie) teenoor rotweefsel34).
Immunohistochemie.
Diere is narkose en perfuse soos hierbo beskryf. Brein is verwyder en gestoor oornag in 4% paraformaldehied by 4 ° C. Brein is oorgedra na 30% sukrose in PBS oplossing vir krioebeskerming. Koronale dele (12 μm) is op 'n vries mikrotoom (Leica) gesny en dan vir immunohistochemie verwerk. Breinafdelings is dan in 0.3% Triton X-100 in PBS vir 15 min geskep en twee keer in PBS gespoel. Die afdelings is voorgekom in 10% normale boksserum in PBS vir 1 h by 37 ° C, blootgestel aan primêre teenliggaampies (verdun in 1% normale boksserum in PBS) oornag by 4 ° C, en dan gesuiwer in PBS en geïnkubeer met sekondêre teenliggaampies vir 1 h by 37 ° C. Die volgende teenliggaampies is gebruik: konyn anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz-biotegnologie), muis anti-NeuN (Chemicon), konyn anti-GFP, FITC-gekonjugeerde anti-konyn IgG, en rhodamien- gekonjugeerde anti-muis IgG (Molekulêre Probes). Vir drievoudige etikettering (ΔFosB, NeuN en GFP), is breinafdelings eerste immuunbevestig met anti-pan FosB teenliggaampie en anti-NeuN teenliggaam en dan geïnkubeer met sekondêre teenliggaampies (rhodamien-gekonjugeerde anti-konyn IgG en siaan-gekonjugeerde anti-muis IgG ). Dubbelkleurige breinafdelings is verder verwerk vir GFP immunostaining met behulp van Zenon-etiketteringstegnologie (Zenon Alexa Fluor 488, Molekulêre Probes). Die anti-pan-FosB-teenliggaam is na die N-terminus van FosB verhoog en herken ΔFosB en volle lengte FosB (62). Gebaseer op vorige studies wat getoon het dat ΔFosB, maar nie FosB of ander Fos-verwante antigene stabiel uitgedruk word na chroniese kokaïenbehandeling nie, aanvaar ons dat die langdurige toenames in immunoreaktiwiteit stabiele uitdrukking van ΔFosB verteenwoordig. Die identiteit van die immunoreaktiewe FosB sein waargeneem in sout behandelde muise is egter onbekend. Statistiese analise in Tabel 1 gebruik die student se t toets.
Dendritiese ruggraatanalise.
Individuele MSN's in die NAcc is gekies vir ruggraatanalise gebaseer op verskeie kriteria. (i) Daar was min of geen oorvleueling met ander gemerkte selle om te verseker dat prosesse uit verskillende selle nie verwar sou word nie. (ii) Ten minste drie primêre dendriete moes sigbaar wees vir selle wat vir analise gebruik moet word. (iii) Distale dendriete (terminale dendriete of naby die terminale dendriet) is ondersoek. Dendriete van beide MSN's in die kern en dop van die NAcc is geanaliseer. Alhoewel ons ylgerigte MSN's (stekelrige tipe II) waargeneem het, het ons slegs diggestopte MSN's (stekelrige tipe I) ontleed. Om die ruggraatdigtheid te bereken, is 'n lengte van dendriet (> 20 μm lank) opgespoor deur 'n konfokale mikroskoop (Zeiss LSM 510) met 'n olie-onderdompelingslens (× 40) te gebruik. Alle foto's van dendriete is op verskillende maniere geneem z vlakke (0.5-1 μm diepte intervalle) om die morfologie van dendritiese stekels te ondersoek. Alle metings is gemaak met metamorf beeldanalise sagteware (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistiese analise gebruik die Kolmogorov-Smirnov toets.
Uitsteeksels van dendriete is in vier tipes geklassifiseer op grond van hul lengte soos in refs beskryf. 63 en 64. Klasse 1-uitsteeksels, ook stomp uitsteeksels genoem, was <0.5 μm lank, het nie 'n groot ruggraatkop nie, en dit het gelyk of hulle nie 'n nek het nie; klas 2, of sampioenvormige stekels, was tussen 0.5 en 1.25 μm lank en is gekenmerk deur 'n kort nek en 'n groot ruggraatkop; klas 3, of dun stekels, het gewissel tussen 1.25 en 3.0 μm en het langwerpige ruggraatnekke met klein koppe; klas 4, oftewel filopodiale uitbreidings, was lang draadagtige uitsteeksels wat nie 'n waarneembare ruggraatkop gehad het nie.
Erkennings
Hierdie werk is ondersteun deur die Verenigde State Openbare Gesondheidsdiens Grant DA10044 (aan PG en ACN) en deur The Simons Foundation, die Peter J. Sharp Foundation, die Picower Foundation, en die FM Kirby Foundation.
Afkortings
- Noord Atlantiese vennootskappe Raad
- kern accumbens
- MSN
- mediumgroot, spiny neuron
- BAC
- bakteriese kunsmatige chromosoom
- Drd1
- dopamienreseptor D1 promotor-gedrewe
- Drd2
- dopamienreseptor D2 promotor-gedrewe
- DII
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindokarbosianienperchloraat
- 2WD
- 2 dae na laaste dwelm behandeling
- 30WD
- 30 dae na laaste dwelm behandeling.
Verwysings
;