PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
Bron
Laboratorium vir Gedragsfisiologie, Nagraadse Skool vir Mensgesondheidswetenskappe, Tokio Metropolitaanse Universiteit, Tokio, Japan.
Abstract
Fisiese oefening verbeter verskeie aspekte van hippocampale funksie. In lyn met die idee dat neuronale aktiwiteit die sleutel tot die bevordering van neuronale funksies is, het vorige literatuur konsekwent getoon dat akute oefeninge neuronale aktivering in die hippokampus veroorsaak. Herhaalde aktiverende stimuli lei tot 'n ophoping van die transkripsiefaktor ΔFosB, wat langtermyn-neurale plastisiteit bemiddel.
In hierdie studie het ons die hipotese getoets dat langtermyn-vrywillige wielrigting ΔFosB-uitdrukking in die hippokampus bewerkstellig, en enige moontlike streekspesifieke effekte binne die hippocampale subvelde langs die dorso-ventrale as ondersoek. Manlike C57BL / 6-muise is gehuisves met of sonder 'n lopende wiel vir 4 weke. Langtermynwiellope het aansienlik toegeneem FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in alle gemeenskappe gemeet aan die hippocampale gebiede (dws in die DG, CA1 en CA3 subvelde van beide die dorsale en ventrale hippokampus). Resultate het bevestig dat wielrigting geïnduceerde streekspesifieke uitdrukking van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die korteks, wat daarop dui dat die eenvormige toename in FosB / ΔFosB binne die hippokampus nie 'n nie-spesifieke gevolg van hardloop is nie. Westerse vlekdata het aangedui dat die verhoogde hippocampale FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit hoofsaaklik toegeskryf is aan verhoogde ΔFosB. Hierdie resultate dui daarop dat langtermyn fisiese oefening 'n kragtige sneller vir ΔFosB induksie in die hele hippokampus is, wat verduidelik waarom oefening beide dorsale en ventrale hippokampus-afhanklike funksies kan verbeter. Interessant genoeg, het ons gevind dat FosB / ΔFosB uitdrukking in die DG positief gekorreleer is met die aantal dubbelkortin-immunoreaktiewe (dws onvolwasse) neurone.
Alhoewel die meganismes waardeur ΔFosB oefengeïnduceerde neurogenese bemiddel, nog steeds onseker is, impliseer hierdie data dat oefengeïnduceerde neurogenese ten minste aktiwiteitsafhanklik is. Saamgestel, dui ons huidige resultate daarop dat ΔFosB 'n nuwe molekulêre teiken is wat betrokke is by die regulering van oefengeïnduceerde hippokampale plastisiteit.
Inleiding
Oefening verleen verskillende voordele op molekulêre, strukturele en funksionele aspekte van die hippokampus in knaagdiere [1,2], waarvan sommige ondersteun is deur menslike studies [3,4]. Die meganismes wat onderliggend is aan die oefen-geïnduseerde veranderinge in hippokampale plastisiteit word egter nie voldoende verstaan nie. Vorige literatuur het konsekwent gedemonstreer dat oefening hippokampale neuronale aktivering in knaagdiere veroorsaak. Immunohistochemiese studies met behulp van c-Fos, 'n merker van oorgangs neuronale aktivering, het getoon dat beide gedwonge en vrywillige lopende toename van die C-Fos-uitdrukking in die dentate gyrus (DG), CA1 en CA3-subvelde van die knaagdierhippokampus [5-7]. Daarbenewens het 'n vorige studie met behulp van laser-Doppler-vloeimetrie (LDF) getoon dat sagte treadmill hardloop streeks serebrale bloedvloei (rCBF), 'n alternatiewe merker van neuronale aktivering, in die CA1-deelveld in rat [8]. Immunohistochemiese studies stel gedetailleerde streekspesifieke ontledings toe nadat oefening opgehou het, terwyl LDF in reële tyd monitering van rCBF in 'n gelokaliseerde area tydens oefening moontlik maak. Ten spyte van die voordele en beperkings van elke studie, het hierdie studies ook 'n effek van akute oefeninge op hippocampale neuronale aktiwiteit getoon. Hierdie resultate dui op 'n meganisme waardeur langtermyn gereelde oefening hippokampale plastisiteit bevorder deur herhaaldelik neuronale aktivering te aktiveer [9].
Die transkripsiefaktor ΔFosB, 'n afgeknotte splytingsisoform van FosB met die volle lengte, word veroorsaak deur verskillende tipes herhaalde stimuli in spesifieke breinstreke waar dit geleidelik akkumuleer weens sy unieke stabiliteit ('n halfleeftyd van weke)10-12]. 'N groeiende bewyse toon dat verhoogde vlakke van ΔFosB mediasie van langdurige neurale en gedragsplastisiteit wat verband hou met spesifieke stimuli [11,13]. Byvoorbeeld, chroniese toediening van dwelmmiddels soos kokaïen en morfien verhoog gewoonlik ΔFosB-uitdrukking in die nucleus accumbens, wat een van die molekulêre meganismes verteenwoordig wat onder meer verhoogde sensitiwiteit vir hierdie middels [11,14,15]. Snabootsend tot ander beloningstimulasies, insluitende hoë vet dieet en seksuele ervaring [16,17], lOnvoltooide vrywillige wiellope het ook FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in rotkern-accumbens toegeneem, wat daarop dui dat vrywillige lopie 'n natuurlike beloning vir knaagdiere is. [18,19]. Maar tot die beste van ons kennis, het geen literatuur ondersoek of herhaalde blootstelling aan fisiese oefening ΔFosB-uitdrukking in die hippokampus veroorsaak nie. Aangesien oefening neuronale aktivering in die hippokampus veroorsaak, het ons veronderstel dat langtermyn-vrywillige wielrigting ook ΔFosB-uitdrukking in die hippokampus sou veroorsaak. Terwyl die presiese meganismes waardeur ΔFosB hippocampale plastisiteit reguleer, onseker bly, het studies getoon dat muise die fosB geen toon verswakte hippocampale neurogenese en verhoogde depressie-agtige gedrag [20,21]. EkNdeed, oefening is bekend om neurogenese te verbeter en antidepressante eienskappe te hê [22-25]. Ekf ons hipotese is korrek, ΔFosB sal 'n nuwe potensiële molekulêre teiken bemiddelende oefening-geïnduceerde hippokampale plastisiteit wees.
Die hippokampus het anatomiese en funksionele gradiënt langs sy longitudinale (dorso-ventrale) as [26]. Die dorsale hippokampus speel 'n sleutelrol in ruimtelike leer en geheue [27,28], terwyl die ventrale hippokampus verkieslik betrokke is by die regulering van emosionele gedrag [29,30]. Verder het studies getoon dat fisiologiese stimuli verskillende patrone van c-Fos-uitdrukking in die dorsale en ventrale gedeeltes van die hippokampus veroorsaak [31-33]. Omdat oefening beide dorsale [34-37] en ventrale hippocampus-afhanklike funksies [24,25,38], is dit belangrik om te ondersoek of langtermyn vrywillige lopie streekspesifieke uitdrukking van ΔFosB in die hippokampus veroorsaak.
Die primêre hipotese van hierdie studie was dat langtermyn-vrywillige wielrigting ΔFosB-uitdrukking in die muishippokampus sou veroorsaak. Hierdie hipotese is ondersoek deur FosB / ΔFosB immunohistochemie in die dorsale en ventrale hippocampale subvelde, DG, CA1 en CA3, met ekstra klem op die identifisering van streekspesifieke induksie. Die resultate is bevestig deur western blotting, wat gebruik is om die isoform van fosB geenprodukte wat in die hippokampus geïnduseer word. Ons het ook die korteks ondersoek vir streekspesifieke FosB / ΔFosB induksie om die moontlikheid uit te sluit dat langtermynoefening nie spesifiek FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die brein verhoog nie. Laastens is die korrelatiewe assosiasie tussen FosB / ΔFosB uitdrukking en neurogenese ondersoek as die eerste stap in die soek na die funksionele implikasies van oefen-geïnduceerde ΔFosB induksie in die regulering van hippokampale plastisiteit.
Materiaal en metodes
1: Diere en etiese stelling
Twintig manlike C57BL / 6 muise (8 weke oud) is van 'n kommersiële teler (SLC, Shizuoka, Japan) gekoop. Tien muise is vir Experiment 1 gebruik, en die ander tien vir Experiment 2. Muise is onder beheerde toestande van temperatuur (22-24 ° C) en lig gehuisves (12 / 12-h lig / donker siklus, lig op by 0500), en was voorsien van voedsel en water. ad libitum. Alle eksperimentele prosedures is goedgekeur deur die Animal Experimentele Etiekkomitee van die Tokyo Metropolitaanse Universiteit.
By elke aankoms is muise willekeurig toegewys aan 'n kontrolegroep (Control, n = 5) of 'n lopende groep (Runner, n = 5). Gedurende die eerste week is alle muise in groepe (5 muise / hok) in standaard plastiekhokke gehuisves vir aanvanklike akklimatisering. Toe is Runner-muise oorgedra in 'n hok wat toegerus is met 'n lopende wiel (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, VSA). Omdat sosiale isolasie bekend is om oefengeïnduceerde neurogenese in die hippokampus te onderdruk [39], Runner muise is gehuisves as 'n groep (5 muise / hok) vir 'n addisionele 4 weke. Die aantal wielrotasies is elke oggend aangeteken en liggaamsgewig (g) is weekliks gemeet.
2: Eksperiment 1. Immunohistochemiese ondersoek van FosB / ΔFosB uitdrukking en hippocampale neurogenese
2.1: Perfusie en weefselverwerking
Die oggend (0900-1100) na die laaste dag van die lopende tydperk, was die muise diep verdovende met pentobarbital natrium en transcardiaal perfuse met koue sout. Die brein is vinnig verwyder en na-vas in 4% paraformaldehied in 0.1 M-fosfaatgebufferde sout (PBS, pH 7.4) oornag. Die brein is dan in 30% sucrose beskerm in PBS en bevries tot verdere verwerking. Koronale breinafdelings (40 μm) van 'n halfrond is verkry deur 'n vries mikrotoom te gebruik en in PBS met 0.01% natriumasied versamel.
2.2: Immunohistochemie
'N Een-in-ses reeks afdelings is lukraak gekies vir FosB / ΔFosB immunostaining. 'N Aanliggende reeks is gebruik vir die etikettering van dubbelkaart (DCX), 'n nasiener van onvolwasse neurone wat gevalideer is vir die assessering van neurogenese [40,41]. Na die uitblus van endogene peroksidase-aktiwiteit met 1% H2O2 In PBS is vry-swewende gedeeltes voorafgekuik met blokkeer oplossing wat 10% normale perd serum in PBS vir 2 h bevat. Na afloop van die spoel in PBS, is gedeeltes geïnkubeer met konyn polyklonale pan-FosB teenliggaampie (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotegnologie, Dallas, TX, VSA) verdun in PBS met 0.5% Triton X-100 en 0.5% BSA -BSA) vir 24 h by 4 ° C. Nog 'n reeks afdelings is geïnkubeer met 'n bok polyklonale anti-DCX teenliggaam (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) in PBST-BSA vir 48 h by 4 ° C. Die dele is verder geïnkubeer met 'n gepaste biotinyleerde sekondêre antilichaam (anti-konyn IgG, 1: 1000, AP182B, anti-bok IgG, 1: 1000, AP180B, beide teenliggame van EMD Millipore, Billerica, MA, VSA) in PBST-BSA vir 2 h by kamertemperatuur. Die afdelings is dan behandel met avidin-biotien-peroksidasekompleks (Vectastain ABC peroxidase kit, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, VSA) vir 90 min volgens die vervaardiger se instruksies. Die antigene is uiteindelik met 0.02% 3,3-diaminobenzidien (DAB) in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) wat 0.01% H2O2. Vir FosB / ΔFosB immunostaining, is die reaksie versterk met nikkelammoniumsulfaat. Vir DCX-kleuring, was selkerns teenstrydig met Nissl-kleuring. Afdelings is op gelatien-bedekte skyfies gemonteer en deksels geplaas.
2.3: Kwantifisering van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit deur gebruik te maak van beelddrempel
Die pan-FosB-teenliggaam wat in hierdie studie gebruik is, is opgewek teen 'n interne streek wat deur FosB en ΔFosB N-terminale gebied gedeel word, sodat dit nie tussen die twee isoforme kan onderskei nie. Daarom is die immunostained strukture beskryf as FosB / ΔFosB immunoreaktiewe (FosB / ΔFosB-ir) kerne. Vir 'n onbevooroordeelde blinde kwantifisering, is skyfies gekodeer voor analise. Die muisbreinatlas [42] is gebruik om die ligging van die volgende belangstellingsgebiede (ROIs) te identifiseer: granulaselaag (GCL) van DG (3 afdelings), piramidale sellaag van CA1 (3 afdelings) en CA3 (2-3 afdelings) in die dorsale hippokampus (gesluit vir -2.2 mm van die bregma); DG (2 afdelings), CA1 (2 afdelings), en CA3 (2 afdelings) in die ventrale hippokampus (gesluit tot -3.4 mm van die bregma) (Figuur 4, links). Die caudale afdelings bevat beide die dorsale en ventrale gedeeltes van die hippokampus, maar die ventrale gedeelte is geteiken. In die DG is suprapyramidale (DGsp) en infrapyramidale (DGip) lemme afsonderlik geanaliseer. Motoriese korteks (2-3-afdelings, gesluit vir -0.6 mm van die bregma), somatosensoriese vatkorteks (2-3-afdelings, gesluit vir -0.6 mm van die bregma), visuele korteks (3-afdelings, gesluit tot -2.9 mm van die bregma), ouditiewe korteks (3-afdelings, gesluit vir -2.9 mm van die bregma) en olfaktoriese gloeilamp (3 afdelings, gesluit tot + 4.3 mm van die bregma) is ook ontleed (Figuur 6, links).
Digitale beelde (2070 × 1548 pixels) van elke ROI is geneem met behulp van 'n optiese mikroskoop (BX-51, Olympus, Tokio, Japan) toegerus met 'n CCD-kamera (DP-73, Olympus) en beeldsoftware (cellSens, Olympus). objektiewe lens vergroting was 10 × vir hippocampal ROIs en 4 × vir kortikale ROIs. Ten einde gematigde-tot-sterk FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit te identifiseer (Figuur 1D-G), met behulp van verskeie afdelings van vooraf, het beide beeldvervaardigingsinstellings (ligintensiteit, grootte van veldstop, blootstellingstyd en witbalans) en drempelvlakke vir elk van die RGB-komponente geoptimaliseer vir hippokampale en kortikale ROI's. Die volgende analise is dan uitgevoer onder die geoptimaliseerde toestande (1). ROI's is gekies deur 'n onreëlmatige gevormde veelhoek (Figuur 1A, B) (2). Die beeld is gedrempel, wat die FosB / ΔFosB-ir-kerne omskep het na 'n rooi kleur (Figuur 1C-G) (3). Die% ROI is dan outomaties soos volg bereken:% ROI = (omgeskakel area (in rooi) / totale ROI area) × 100.
Om hierdie beelddrempel-analise te bevestig, is 20-streke lukraak gekies uit verskillende breingebiede met verskillende streeksgroottes. Benewens die beelddrempelkwantifisering, is die aantal FosB / ΔFosB-ir-kerne in die geselekteerde streke getel en die digtheid van FosB / ΔFosB-ir-kerne is verkry deur die aantal FosB / ΔFosB-ir-kerne deur die gemeet oppervlakte (mm2).
2.4: Kwantifisering van DCX-ir onvolwasse neurone in die dentate gyrus
Die DCX-ir onvolwasse neurone in die DG van Runner-muise was oorvloedig en oorvleuelend, wat dit moeilik maak om die diskrete aantal DCX-ir soma met behulp van 'n optiese mikroskoop akkuraat te tel. In 'n vorige studie het Sholl-analise vir morfologiese evaluering egter getoon dat elke DCX-ir-neuron gemiddeld 'n enkele dendriet het as gemeet binne 40 μm van die soma [43]. Daarom is die volgende oorspronklike analise ontwikkel om streekspesifieke kwantifisering van DCX-ir-neurone moontlik te maak.
- (1) 'n Beeld van die GCL is geprojekteer op 'n rekenaarskerm met behulp van beeldsoftware en 'n 40 × objektiewe lens (2). Op die lewendige prentjie is 'n lynsegment (150 ± 0.1 μm) langs die middel van die GCL getrek (Figuur 2) (3). Deur die fokusdiepte te verander, is die aantal kere wat die lynstuk gekruis het DCX-ir dendriete (4) getel. Die ROI's (dorsale DGsp, dDGsp; dorsale DGip, dDGip; ventral DGsp, vDGsp; ventral DGip, vDGip) het ooreenstem met die gebiede waar FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit geanaliseer is (5). In elke ROI is 2-3 lynsegmente per afdeling geteken en die aantal kruisings is gemiddeld oor 2-3-afdelings per muis. Omdat die dikte van die GCL ongeveer 60-80 μm is, moet die aantal kruisings die aantal DCX-ir-neurone binne die beperkte gebied ontleed weerspieël.
'N verteenwoordigende beeld van DCX-ir onvolwasse neurone en 'n lynsegment (150 ± 0.1 μm) oorgetrek vir die aantal kruisings met DCX-ir dendriete.
3. Eksperiment 2. Identifikasie van die FosB / ΔFosB isoform geïnduceerd deur die wielbewerking
3.1: Perfusie en weefselverwerking
'N Bykomende kohort muise is behandel soos hierbo in Experiment 1. Na 4 weke van lopende ingryping, is die muise transcardiaal geperfuseer met koue sout onder die narkose. Die hippokampus is vinnig ontkies en gevries met vloeibare stikstof, en gestoor by -80 ° C. Die hippocampi van elke muis is gehomogeniseer in RIPA buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikoat, 0.1% SDS, # 8990, Thermo Scientific, IL, VSA) wat protease bevat inhibeerders (Complete Mini, Roche, Manheim, Duitsland). Die lysates is gesentrifugeer vir 15 min by 5000 rpm by 4 ° C en supernatante is versamel. Proteïen konsentrasies is gemeet met 'n BCA Proteïen Assay kit (# 23227, Thermo Scientific, IL, VSA).
3.2: Western blotting
Gelyke hoeveelhede proteïene (30 μg / laan) is op 'n 10% poliakrylamidegel geproforeer, dan oorgedra na 'n PVDF-membraan (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, VSA). Nie-spesifieke bindings is geblokkeer deur die membraan voor 1 h in TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) met 3% BSA vooraf te inkubineer. Die membraan is geïnkubeer met die pan-FosB-teenliggaam (1: 1000) wat hierbo gebruik word vir immunohistochemie, opgelos in TBST wat 3% BSA bevat. Na wassing met TBST, is die membraan geïnkubeer met HRP-gekonjugeerde anti-konyn IgG teenliggaampie (1: 5000 in TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, VK) vir 1 h by kamertemperatuur. Na spoel met TBST, is proteïenbande gevisualiseer deur inkubasie met Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, VSA) en gevang met behulp van 'n Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, VK). Die membraan is dan as 'n laaibeheer met anti-glyseraldehied-3-fosfaat dehidrogenase (GAPDH) antilichaam (# 2275, 1: 5000 in TBS-T, Trevigen, MD, VSA) gereproduseer. Die optiese digtheid van die proteïenbande is gekwantifiseer met behulp van Image-J en genormaliseer tot die vlak van GAPDH.
4: Statistiese analise
Veranderinge in die liggaamsgewig van die muis is geanaliseer deur twee-rigting herhaalde maatstawwe ANOVA (groep × tyd). 'N Ongepaarde t-toets is gebruik om statistiese verskille tussen groepe te bepaal (Control vs Runner). Pearson se korrelasie-analise is gebruik om die FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteitsanalise (manuele telling teen beelddrempel) te bekragtig, en om die verband tussen die vlak van FosB / ΔFosB uitdrukking en die aantal DCX-kruisings in die DG te ondersoek. Data is aangebied as gemiddelde ± SEM. Die drumpel vir statistiese betekenis is vasgestel op P <0.05.
Results
1: Liggaamsgewig en loopafstand in eksperimente 1 en 2
Veranderinge in liggaamsgewig van beide Beheer- en Runner-muise in eksperimente 1 en 2 word saamgevoeg en getoon in Figuur 3. Tweerigting herhaalde maatreëls ANOVA het 'n beduidende interaksie aangedui (groep × tyd, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) en die hoofeffek van die groep F(1, 18) = 6.07, P <0.05), wat 'n aansienlike laer liggaamsgewig by Runner-muise aandui. Die loopafstand per hok word in getoon Tabel 1. Alhoewel die presiese loopafstand van elke muis onseker was omdat die muise saam gehuisves is, het gereelde waarneming bevestig dat alle muise gereeld wielrigting uitgevoer het. Die Runner-muise in Experiment 2 het langer gevaar as dié in Experiment 1, maar die gemiddelde loopafstand (m / dag / hok) was konsekwent tydens elke eksperiment.
2: Validasie van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit kwantifisering met behulp van beeld drempel
Daar was 'n beduidende korrelasie tussen FosB / ΔFosB-ir gebied verkry deur beelddrempel en digtheid van FosB / ΔFosB-ir-kerne verkry deur manuele telling (r = 0.941, P <00001, Figuur 4).
3: FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die hippokampus
Verteenwoordigende beelde van FosB / ΔFosB immunostaining in die dorsale en ventrale hippocampale subvelde is getoon in Figuur 5. In al die ROI'e wat ontleed is, het FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in Runner-muise (Figuur 5, regs) was kwalitatief hoër as dié in Control muise (Figuur 5, sentrum). In Runner-muise het kwantitatiewe analise 'n beduidende toename in FosB / ΔFosB-ir gebied in beide die dorsale (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) en die ventrale hippokampale subvelde (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Figuur 6).
4: FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die korteks
Verteenwoordigende beelde van FosB / ΔFosB immunostaining in die kortikale ROIs word getoon in Figuur 7. Kwantitatiewe analise onthul streekafhanklike veranderinge in FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit met langtermynloop (Figuur 8). In Runner-muise was die FosB / ΔFosB-ir area aansienlik hoër in die motoriese korteks (P <0.05) en die somatosensoriese korteks (P <0.05), maar nie in die visuele korteks nie (P = 0.662) of die olfaktoriese gloeilamp (P = 0.523). In die ouditiewe korteks het FosB / ΔFosB-ir gebied geneig tot 'n toename in Runner muise (P = 0.105).
5: Neurogenese
Verteenwoordigende beelde van DCX immunostaining word getoon in Figuur 9. In die dorsale hippokampus, DCX immunoreaktiwiteit in Runner muise (Figuur 9, regs) was kwalitatief hoër in vergelyking met Beheermuise (Figuur 9, links). In vergelyking met die dorsale hippokampus, was DCX-immunoreaktiwiteit in die ventrale hippokampus swakker in Beheer- en Runner-muise. In Runner-muise was die aantal kruisings aansienlik hoër in die dDGsp (P <0.01) en dDGip (P <0.01; Figuur 10). In die ventrale hippokampus was die aantal kruisings in Runner-muise geneig om te verhoog, maar daar was geen beduidende verskille tussen groepe (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Figuur 10).
6: Korrelasie tussen FosB / ΔFosB uitdrukking en neurogenese
'N Korrelasie-analise is uitgevoer tussen die FosB / ΔFosB-ir area en die aantal DCX kruisings (Figuur 11). Omdat elke datastel (bv. Dorsale DGsp in Kontrolemuise) slegs uit 5-pare bestaan, is die analise eers uitgevoer met alle 40-pare. Opvallend was daar 'n beduidende verband tussen die FosB / ΔFosB-ir area en die aantal DCX kruisings (r = 0.885, P <0.0001). Daarbenewens is 'n beduidende korrelasie ook geïdentifiseer toe die dorsale DG (r = 0.762, P <0.05) en die ventrale DG (r = 0.816, P <0.01) is afsonderlik ontleed.
7: Identifikasie van die FosB / ΔFosB isoform geïnduceerd deur langtermyn hardloop
Ten slotte, om die isoform van fosB geenprodukte wat in die hippokampus geïnduceer is in reaksie op langtermyn hardloop, is die hippocampi van 'n addisionele kohort muise onderworpe aan westerse blotting met dieselfde Pan-FosB-teenliggaampie. Veelvuldige bande van 35-37 kDa, wat gemodifiseerde isoforme van ΔFosB [44], was aansienlik toegeneem in Runner versus Control muise (Figuur 12, P <0.01). Aan die ander kant was die 48 kDa FosB-isoform in geen van beide groepe opspoorbaar nie. 'N Ander band wat effens sigbaar is bo 25 kDa, verteenwoordig waarskynlik die Δ2ΔFosB isoform (27 kDa). Daar was twee ander bande, bo 50 kDa en 37 kDa, wat waarskynlik vanweë nie-spesifieke binding was. Wanneer dit gekwantifiseer is, is daar geen verskille in hierdie nie-ΔFosB-bande tussen groepe gevind nie (data word nie getoon nie).
Bespreking
Samevattend het die huidige studie die eerste keer 'n immunohistochemiese analise uitgevoer om 1 te ondersoek) of langtermyn-vrywillige wielrigting FosB / ΔFosB-uitdrukking in die hippokampus veroorsaak; en 2) of 'n streekspesifieke respons langs sy dorso-ventrale as bestaan.
Vier weke van vrywillige wielrigting het 'n beduidende toename in FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in al die hippokampale streke ontleed (dws die DG, CA1 en CA3-subvelde van beide die dorsale en ventrale gedeeltes van die hippokampus). Ons het bevestig dat die 35-37kDa ΔFosB isoform die hoofvak was fosB geenproduk opbou in reaksie op langtermyn hardloop. Hierdie resultate ondersteun duidelik die hipotese dat langtermyn gereelde oefening 'n kragtige sneller vir ΔFosB induksie regdeur die hippokampus is, en dat die induksie daarvan 'n nuwe molekulêre meganisme kan wees waardeur oefening verskeie tipes dorsale en / of ventrale hippokampusafhanklike funksies beïnvloed.
1: Validasie en beperkings van die kwantifisering van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit deur gebruik te maak van beelddrempel
'N Beelddrempingstegniek, wyd gebruik in immunohistochemiese studies om die aantal teikenselle te tel en vir die evaluering van selmorfologie, is in hierdie studie aangeneem vir streekspesifieke kwantifisering van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit [15,45,46]. 'N Beduidende korrelasie tussen die vlakke van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit gekwantifiseer deur beelddrempel en manuele telling is getoon (Figuur 4). Aangesien digtheid en oorvleueling egter die aantal FosB / ΔFosB-ir-kerne in baie digte gebiede nie kon tel nie, impliseer die getoonde korrelasie slegs die akkuraatheid van die beelddrempelmetode wanneer die FosB / ΔFosB-ir-gebiede <~ 40% van die totale ROI verteenwoordig gebied. Daarom is noukeurige interpretasie nodig vir FosB / ΔFosB-ir gebiede> 40% van die totale ROI area.
In die besonder, in die DG van Runner muise (Figuur 4), FosB / ΔFosB uitdrukking is grootliks veroorsaak deur die wiel hardloop en die meeste van die FosB / ΔFosB-ir-kerne oorvleuel. In hierdie gebiede lei verhoogde induksie van FosB / ΔFosB uitdrukking tot 'n groter onderskatting van die vlak van uitdrukking, ongeag die kwantifiseringsmetode wat gebruik word (beeld drempel of manuele telling). Ten spyte van die risiko van onderskatting, is dit egter belangrik om daarop te let dat die huidige studie suksesvol bewys het dat beduidende toenames in FosB / ΔFosB-ir gebied in die DG van Runner-muise is. Dit dui daarop dat die metodologiese beperkings ons bevindinge nie in gevaar stel nie. In plaas daarvan verhoog die potensiële onderskatting die betroubaarheid van die bevinding dat langtermynlope FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die hippokampus verhoog het.
2: Uniforme Induksie van ΔFosB binne die hippokampus deur langtermynlop
Die hippokampus het anatomiese en funksionele gradiënte langs sy lengteas [26], dus vir die huidige studie is FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die dorsale en ventrale gedeeltes van die hippokampus apart geanaliseer. Die data het getoon dat die FosB / ΔFosB-uitdrukking op 'n eenvormige verhoogde toename in alle hippocampale ROI's gemeet is. Hierdie uniforme induksie van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit kan nie spesifiek veroorsaak word deur sistemiese metaboliese veranderinge wat verband hou met langtermyn hardloop. Dit is egter belangrik om daarop te let dat daar streek-spesifieke toenames van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit in die korteks was. Hierdie resultaat word ondersteun deur onlangse bevindings wat toon dat 'n akute baan van trapmeul hardloop streeks serebrale bloedvloei in die hippokampus verhoog, maar nie in die olfaktoriese gloeilamp [8]. Verder, Rhodes et al. (2003) het getoon dat 7-dae van vrywillige wielstroom-geïnduceerde c-Fos-uitdrukking in die DG en CA2 / 3 van die hippokampus (CA1 nie gemeet is nie) en in die sensoriese korteks, maar nie in die visuele korteks nie [47]. Saamgestel, dui hierdie studies aan dat 'n eenvormige induksie van FosB / ΔFosB-uitdrukking in die hippokampus nie 'n nie-spesifieke gevolg van langtermynloop is nie. Interessant genoeg, Hawley et al. onlangs berig dat chroniese onvoorspelbare stres FosB / ΔFosB uitdrukking in die dorsale verhoog, maar nie in die ventrale, DG van die rathippokampus nie [48]. Met verdere ondersoek sal die afsonderlike patrone van FosB / ΔFosB induksie soos dié wat deur oefening of stres verkry word, voortgesette insigte voorsien in die stimulusafhanklike impakte op die hippokampus.
Die primêre pan-FosB-teenliggaam wat in hierdie studie gebruik word, is bekend om alle isoforme van FosB proteïene te herken. By Western blotting analise het ons gevind dat die enigste isoforme wat na die langtermyn in die hippokampus toegeneem het, die gewysigde isoforme van ΔFosB (35-37 kDa) was, die enigste stabiele isoforme onder Fos-familieproteïene [11]. Hierdie bevinding is in ooreenstemming met vorige werk met behulp van pan-Fos-antiliggaam om te demonstreer dat 35-37 kDa ΔFosB die oorheersende Fos-familieproteïen in chroniese stres in die frontale korteks geïnduseer is [44]. Dus, die toename in hippocampale FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit wat hierdeur veroorsaak word deur langtermyn hardloop weerspieël waarskynlik die vlak van ΔFosB.
Minder is bekend oor streekspesifieke effekte van oefening op molekulêre en strukturele aspekte van die hippokampus. Verskeie gedragstudies dui egter op 'n groot potensiaal vir oefen-geïnduseerde verbeteringe in beide die dorsale en ventrale hippocampale funksies. Oefening is gedemonstreer om ruimtelike leer en geheue te verbeter [34-38] en ruimtelike en kontekstuele verwerking hang hoofsaaklik af van die dorsale hippokampus [27,28]. Daarenteen is oefening ook bekend om anxiolitiese en antidepressante eienskappe uit te oefen [24,25,38] en hierdie emosionele response word hoofsaaklik deur die ventrale hippokampus gereguleer [29,30]. Die uniforme induksie van ΔFosB deur langtermyn lopies wat in hierdie studie gesien is, dui daarop dat 'n vorm van neuroplastiese veranderinge dwarsdeur die hele hippokampus plaasgevind het. Dit sal verduidelik waarom oefening beide dorsale en ventrale hippocampus-afhanklike funksies kan beïnvloed.
3: Streek-spesifieke analise van oefen-geïnduseerde neurogenese
'N Funksionele dissosiasie van neurogenese tussen die dorsale en ventrale hippokampus ontvang ook toenemende aandag [49]. In hierdie studie, gebruik maak van die morfologiese eienskappe van DCX-ir onvolwasse neurone [43], het ons die aantal snypunte tussen DCX-ir dendriete getel en 'n lynstuk geteken langs die middel van die GCL. Hierdie meting verskaf nie die totale aantal DCX-ir-neurone in die DG nie, maar dit het streekspesifieke kwantifisering moontlik gemaak vir die uitvoer van 'n korrelasie-analise met FosB / ΔFosB ekspressie data (sien hieronder). Na langtermyn hardloop het die aantal DCX-ir neurone aansienlik toegeneem in die dorsale, maar nie die ventrale, DG nie. Dit suggereer dat oefening die neurogenese meer opvallend in die dorsale kan stimuleer in vergelyking met die ventrale gedeelte van die DG. Vorige studies het egter teenstrydige resultate getoon waarin wielverloop verhoogde neurogenese in beide die dorsale en ventrale DG [50,51]. In die huidige studie het die aantal DCX-ir-oorkruisings in die ventrale DG geneig om met hardloop te verhoog, alhoewel die klein steekproefgrootte (5-muise per groep) die vermoë sou kon beperk om 'n statisties betekenisvolle verskil tussen groepe op te spoor. Daarom is dit waarskynlik voortydig om die moontlikheid uit te sluit dat vrywillige wiellope die ventrale hippokampale neurogenese kan stimuleer. Verdere gedetailleerde studies is nodig om die streekspesifisiteit van oefengeïnduceerde neurogenese te verstaan rakende sy multistep-proses (sel proliferasie, differensiasie, migrasie en oorlewing).
4: Funksionele implikasies van oefen-geïnduseerde ΔFosB induksie vir die regulering van hippocampale plastisiteit
Ten slotte, as die eerste stap in die herkenning van die funksionele implikasies van oefen-geïnduseerde ΔFosB induksie in die hippokampus, het ons die verhouding van FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit na DCX-ir-kruisings ondersoek in beide die dorsale en ventrale DG en 'n beduidende positiewe korrelasie tussen die twee veranderlikes. Alhoewel die presiese meganismes waardeur ΔFosB oefeninggeïnduceerde neurogenese reguleer, onseker bly, het 'n onlangse studie bewys dat fosB-nou muise, wat nie FosB, ΔFosB, en Δ2ΔFosB het nie (al die fosB produkte), tekortkominge in basale hippokampale neurogenese vertoon, insluitende verminderde proliferasie van neuronale vooraanselle, verhoogde ektopiese migrasie van pasgebore neurone en abnormale DG strukture [20]. Hierdie veranderinge is egter nie waargeneem nie fosB(d / d) muise, wat FosB ontbreek, maar nie ΔFosB / Δ2ΔFosB nie. Interessant genoeg, in fosBNie-muise, uitdrukking van sommige neurogenese-verwante gene, insluitend Vgf (VGF senuwee groeifaktor induceerbaar) en Gal (Galanin prepropeptide) was downregulated [20]. Aangesien VGF en GAL sekretoriese molekules is, is een voorstel wat belofte bevat, van mening dat neurone wat ΔFosB uitdruk, neurogenese kan reguleer deur outokriene / parakriene aktiwiteit [20].
Daarbenewens moet daarop gelet word dat die gebied waar ΔFosB geïnduceerd word deur ruimtelike oorvleueling te hardloop met die gebied waar neurogene aktiwiteit hoog is. Hierdie bevinding dui daarop dat oefengeïnduceerde neurogenese op die minimum aktiwiteitsafhanklike is. Neuronale aktivering is die sleutel tot die handhawing en verbetering van sentrale senuweestelselfunksie [9], deur middel van meganismes wat uitdrukking en vrystelling van brein-afgeleide neurotrofe faktor (BDNF) insluit [52,53], opname van seruminsulien-agtige groeifaktor-1 (IGF-1) deur die bloedbreinversperring [54,55], onderdrukking van apoptose [56], en regulering van mitochondriese motiliteit [57]. Die huidige studie dui daarop dat langtermynoefening herhaalde neuronale aktivering veroorsaak het, wat voorkom in die verhoogde ΔFosB-uitdrukking, wat bydra tot die verbetering van hippokampale plastisiteit, moontlik deur middel van hierdie meervoudige meganismes wat hierbo beskryf word.
Die huidige studie het slegs oefengeïnduceerde neurogenese en sy assosiasie met FosB / ΔFosB-uitdrukking in die DG beoordeel. FosB / ΔFosB immunoreaktiwiteit is egter ook in die CA1- en CA3-subvelde geïnduceerd. Terwyl verdere studies vereis word om meer begrip te verkry van die funksionele rolle van oefen-geïnduseerde ΔFosB-uitdrukking binne hierdie subvelde, bied vorige literatuur 'n belowende moontlikheid. Guan et al. (2011) het getoon dat spesifieke ablasie van die siklienafhanklike kinase 5 (Cdk5) in die CA1- of CA3-piramidale neurone verswakte geheuekonsolidasie of -herwinning onderskeidelik [58]. Interessant genoeg is die Cdk5 die stroomafwaartse teiken van ΔFosB [59] en is betrokke by die regulering van sinaptiese plastisiteit [60]. Daarom kan oefen-geïnduseerde ΔFosB-uitdrukking betrokke wees by die regulering van sinaptiese plastisiteit deur Cdk5-aktivering in die CA1- en CA3-subvelde.
Gevolgtrekking
Alhoewel akute oefeninge bekend was om die uitdrukking van onmiddellike vroeë gene-proteïene in die hippokampus te veroorsaak, bied die huidige studie die eerste bewyse dat langtermyn-gereelde oefening die ΔFosB-uitdrukking aansienlik in die hele hippokampus veroorsaak. steis eenvormige induksie van ΔFosB ondersteun die huidige begrip dat oefening 'n effektiewe nie-farmakologiese intervensie is wat verskeie hippokampfunksies kan verbeter. Saam met die beduidende korrelasie tussen FosB / ΔFosB uitdrukking en neurogenese, is hierdie data uiters uitdagend en dui die behoefte aan verdere studies aan wat die rol van ΔFosB uiteensit om die effekte van oefening op hippocampale funksie, insluitend neurogenese, te mediasie.
Befondsingsverklaring
Verwysings
;
