Physiol Behav. Skrywer manuskrip; beskikbaar in PMC 2012 Oct 24.
Gepubliseer in finale geredigeerde vorm as:
Physiol Behav. 2011 Okt 24; 104 (5): 865-872.
Gepubliseer aanlyn 2011 Mei 24. doi: 10.1016 / j.physbeh.2011.05.018
PMCID: PMC3480195
NIHMSID: NIHMS299784
Abstract
Vorige studies dui daarop dat binge-eet suiker lei tot gedrags- en neurochemiese veranderinge soortgelyk aan dié wat met dwelmverslawing gesien word, insluitende tekens van opiate-like onttrekking. Studies is opkomende wat verskeie neurochemiese en gedragsindekse van verslawing toon wanneer diere 'n vetryke dieet oorleef. Die doel van die huidige studie was om vloeibare en soliede diëte hoog in suiker en vetinhoud te gebruik om te bepaal of opiate-agtige onttrekking gesien word na die binge-verbruik van hierdie diëte in Sprague Dawley-rotte. Beheergroepe is gegee ad libitum Toegang tot die soetvleis of standaard chow. Alle rotte is dan 'n battery van toetse gegee om tekens van opiaatagtige onttrekking te meet, wat somatiese tekens van nood insluit, verhoogde plus-doolhof angs en lokomotoriese hipoaktiwiteit. Naloksoon-neerslae (3 mg / kg) of ontwrigting-geïnduseerde onttrekking is nie waargeneem in rotte wat gehandhaaf word op 'n voedingsvolledige pelletset-soet-dieet, 'n soet, hoë vet dieet aangevul met standaard knaagdier chow of 'n vloeibare soet- vet kos. Verder het liggaamsgewigvermindering tot 85%, wat bekend is om die versterkende effekte van die misbruikmiddel te versterk, nie die naloksoon-neerslagtekens van opiaatagtige onttrekking beïnvloed nie. Dus, in teenstelling met vorige bevindings wat gerapporteer is oor rotte met binge toegang tot 'n sukrose oplossing, toon rotte wat bitter soet-vet-kombinasies eet, geen tekens van opiumagtige onttrekking onder die getoetsde toestande nie. Hierdie data ondersteun die idee dat oormatige verbruik van verskillende voedingstowwe op verskillende maniere geassosieer word met verslawing, en dat die gedrag wat "voedselverslawing" kan kenmerk, ondergaan word, gebaseer op die voedingssamestelling van die verbruikte voedsel.
Inleiding
Neurale stelsels wat voedsel soek en inname motiveer en versterk, is ook onderliggend aan gedrag wat verband hou met dwelmmisbruik [1-5]. Op grond van hierdie neurologiese oorvleueling, is dit voorgestel dat die verbruik van sekere kosse ook tot verslawingsagtige gedrag kan lei [6-8]. Vorige studies uit ons laboratorium en ander dui daarop dat beperkte toegang tot suiker lei tot gedragsveranderinge en veranderinge in dopamien (DA) en opioïdale stelsels wat soortgelyk is, al is dit kleiner in omvang, as dié wat tydens dwelmverslawing gesien is [8].
Van hierdie verslawing-agtige gedrag wat verband hou met bingeverbruik van suiker, is bewyse van opiate-agtige onttrekking van besondere belang. Met behulp van ons laboratoriumdiermodel van binge-suiker, het ons gevind dat wanneer die opioïed-antagonist naloksoon toegedien word, rotte toon somatiese tekens van onttrekking, insluitend tande chattering, teepaw bewing en kopskudding, asook angs op die verhoogde doolhof . Verder word hierdie gedrag gepaard met 'n afname in die vrylating van DA in die nukleusakkapels en 'n toename in die vrystelling van asetielcholien [9], 'n neurochemiese wanbalans wat tydens die onttrekking van verskeie dwelmmiddels gesien is [10, 11]. Gedrags- en neurochemiese tekens van opiaatagtige onttrekking is ook waargeneem sonder die gebruik van naloksoon (dws spontaan) na aanleiding van 'n vinnige in rotte met 'n geskiedenis van sukkelende suiker [12]. Ander het opgemerk dat rotte met 'n geskiedenis van beperkte toegang tot suiker 'n afname in liggaamstemperatuur het as die suiker vir 24 h verwyder is [13] en kan tekens van aggressiewe gedrag toon [14], beide wat ook aanvaarbare aanduidings van onttrekking is. Verder is 'n hoë suiker dieet getoon om tekens van angs en hipofagie te ontlok wat blykbaar bemiddel word deur brein kortikotrofien-vrystelling hormoon stelsels [15].
Ander studies het aspekte van verslawing beoordeel wat mag voorkom as gevolg van ander lekker kos, soos dié wat ryk is in vet of soet-vet-kombinasies. Naloksoon is aangemeld om opiaat-like onttrekkingstekens te produseer by rotte wat 'n kafeteria-dieet gevoer het, wat 'n verskeidenheid vet- en suikerryke kosse bevat [16]. Meer onlangs is daar getoon dat knaagdiere blootgestel aan dieet wat ryk is aan vet, sal betrek word in baie verskillende gedrag wat dui op verslawing [11, 17-19], maar die voorkoms van opiaatagtige onttrekking is nie sistematies bestudeer binne die konteks van ooreet van vet nie, en nie binne die konteks van beperkte toegangskedules nie.
Aangesien vet en suiker opioïde stelsels beïnvloed [3], dat hierdie makronutriënte soms in oormaat verteer word en 'n rol kan speel in vetsug wat verband hou met ooreet [20, 21] en moontlik voedselverslawing [22, 23], was die doel van die huidige studie om vas te stel of opiate-agtige onttrekking gesien word in rotte wat op skedules van beperkte toegang tot die suiker en vet-dieet gehou word, wat aanleiding gegee het tot binge-eet. Op baie maniere is hierdie ontwerp soortgelyk aan die menslike eetvoorwaarde, aangesien die binge episodes in sommige individue dikwels kombinasies van hierdie makronutriënte bevat [20, 21, 24, 25]. Verder ondersoek die huidige studie die effek wat binge-eet van vet-suiker kombinasies kan hê op die uitdrukking van onttrekking wanneer rotte by beide normale en verminderde liggaamsgewigte is aangesien dit bekend is dat 'n lae liggaamsgewig die effekte van dwelms van misbruik [26]. Verder, rotte met 'n lae liggaamsgewig, vrystel meer DA as normale gewigkontroles wanneer binge-eet suiker [27], wat 'n verbeterde lonende effek kan voorstel teen 'n lae liggaamsgewig wat die erns van onttrekking kan beïnvloed.
Materiaal en metodes
Algemene Metodes
Manlike Sprague-Dawley-rotte is van Taconic Farms (Germantown, NY) verkry en is individueel in die Princeton University vivarium gehuisves op 'n omgekeerde 12-h lig: 12-h donker siklus. Die kamer is gehandhaaf by 20 ° ± 1 ° C, en die diere het ad libitum toegang tot water te alle tye en toegang tot standaard laboratorium chow, LabDiet #5001 (PMI Voeding Internasionale, Brentwood, MO; 3.02 kcal / g) soos hieronder beskryf. Alle prosedures is goedgekeur deur die Princeton University Institutional Animal Care and Use Committee. Die dieet en prosedures word opgesom in Tabel 1.
Exp. 1: Naloksoon-geprecipiteerde en spontane opiaatagtige onttrekkingstoetse in rotte wat 'n voedingsvolledige, vet-en-suikerryke dieet gevoer word.
Rats (315-325 g) is verdeel in vier gewiggroepe (n = 10 / groep) en toegewys aan een van die volgende voedingstoestande vir 25-dae: (a) 2-h daaglikse toegang tot soetvet-chow (Navorsing Diets, New Brunswick, NJ, # 12451; 45% vet, 20% proteïen, 35% koolhidraat, 4.7 kcal / g) begin 6 h na die aanvang van die donker siklus, met standaard knaagdier chow beskikbaar slegs vir die ander 22 h per dag; (b) 2-h toegang tot die lekkergoed-chow op Maandae, Woensdae en Vrydae (MWF) met ad libitum toegang tot standaard knaagdier chow gedurende die res van die tyd; (C) ad libitum Soet-vet chow; en (d) ad libitum standaard chow (LabDiet #5001, PMI Nutrition International, Richmond, IN; 10% vet, 20% proteïen, 70% koolhidraat, 3.02 kcal / g). Kos is twee keer per week vervang. Voedselinname is daagliks gemeet (voor en na die 2-h-toegangsperiode, of die ekwivalente tyd vir die ad libitum-fed groepe). Liggaamsgewigte is ook gedurende hierdie tye gemeet op dae 1-7 en dae 18-24 van toegang.
1a. Naloksoon-presipiteerde onttrekkingstoetse
Op dae is 26- en 27-rotte willekeurig toegeken om getoets te word vir tekens van onttrekking. Hierdie toetse is oor 2 dae versprei om te verseker dat die toetse so naby aan die begin van die normale 2-h-toegangsperiode as moontlik vir elke rot uitgevoer is. Om te toets vir somatiese tekens van opiaatagtige onttrekking, is rotte die opioïede antagonist naloksoon (Sigma, St Louis, 3 mg / kg, sc) toegedien. Inspuitings is 6 h toegedien na die aanvang van die donker siklus, wanneer normale voedsel toegang normaalweg begin het. Ratte in die 2-h MWF-groep het gewoonlik 'n 46-h-tydperk van smaaklike chow-ontbering tussen hul toegangsperiodes gedurende die week gehad (hoewel hulle gedurende hierdie tyd standaardkou beskikbaar gehad het) en ook die naweek die lekker eet ontneem is. Om die 46-h-ontberingstydperk te standaardiseer, het ons dus verseker dat alle rotte getoets 46 h gehad het met soet-vet-chow-ontneming. Tien minute na die inspuiting is rotte geplaas in 'n plastiekhok wat gevoer is met Bed-o-Cobs (The Anderson Co., Maumee, OH) en somatiese tekens van onttrekking is vir 5 min deur 'n waarnemer blind vir eksperimentele toestande aangeteken. Voorbeelde van pawbyte, verdedigingsgrawe, nathondskuddes, tande geklets, kopskake, voorkopwring, kooi-kruising en versorging is vir elke rot aangeteken en die totale gevalle van hierdie gedrag is opgesom om 'n algehele onttrekking indeks telling te lewer. , met behulp van 'n metode wat aangepas is van ander verslae [28, 29].
1b. Spontane onttrekkingstoetse
Om vas te stel of onttrekkingsgedrag waargeneem kan word deur bloot die smaaklike dieet te verwyder (dws sonder naloksoon), is die volgende rottes toegang gegee tot slegs standaard knaagdiere vir 3 weke. Toe is die rotte teruggekeer na hul vorige voedingsskedules vir 14 dae. Gedurende die daaropvolgende tydperke van soet-vet-chow-ontbering, is alle diere op standaard knaagdier chow vir 46 h gehandhaaf. Aan die einde van 46 h, wanneer die eksperimentele groep normaalweg toegang tot soetvet-chow kry, word hulle in plaas daarvan getoets vir somatiese tekens van onttrekking.
Exp. 2: Naloksoon-geprecipiteerde en spontane onttrekkingstoetsing by rotte gevoer met standaard knaagdier chow met 'n voedingsvrye onvolledige kos ryk aan suiker en vet.
Hierdie eksperiment het 'n verdere evaluering van opiaat-like onttrekking, die verhoogde plus-doolhof, gebruik om sowel somatiese en angsagtige antwoorde op die onttrekking van smaaklike kos te bepaal. Ratte (350-400 g) is verdeel in drie gewig-ooreenstemde groepe (n = 8 / groep) en gehandhaaf op ad libitum chow en water aangevul met die volgende vir 28 dae: (a) 12-h toegang tot 'n hoë suiker, hoëvet mengsel (4.48 kcal / g; 35.7% vet, 64.3% sukrose; botter, poeiermelksuiker, voorberei in ons laboratorium); (B) ad libitum toegang tot dieselfde suiker en vetmengsel (c) ad libitum chow. Voedsel is twee keer per week vervang, op watter tye diere geweeg is.
2a. Spontane onttrekkingstoetse
Op dag 28 is alle rotte op 'n dieet van ad libitum standaard knaagdier chow. 24 h en 36 h later word alle rotte getoets vir somatiese tekens van opiaatagtige onttrekking ten einde 'n algehele onttrekkingsindeks te bepaal, soos beskryf in Exp. 1a. Toe, om vir angs te toets, is diere dan individueel vir 5 min in 'n verhewe plus-doolhof geplaas [30]. Die apparaat het vier arms gehad, elke 10 cm wyd by 50 cm lank, en was verhef 60 cm bokant die vloer. Twee teenoorgestelde arms was ingesluit met hoë ondeursigtige mure, terwyl die ander twee arms geen beskermende mure gehad het nie. Die eksperiment is onder rooi lig uitgevoer om die ontwrigting van die rotte se sirkadiese siklus te verminder. Die rotte is in die middel van die doolhof geplaas, met koporiëntasie afgewissel na 'n oop of geslote arm. Elke plus-doolhof verhoor is video-opname gemaak en later aangeteken vir die hoeveelheid tyd spandeer met kop, skouers en voorpote op die ooparm, geslote arm of middelste gedeelte van die doolhof deur 'n waarnemer wat blind is vir die dieet toestand.
2b. Naloksoon-neerslag-onttrekkingstoetse
Na toets in Exp. 2a, alle rotte is teruggekeer na hul toegediende diëte vir 21 dae en dan is naloksoon toegedien (Sigma, St. Louis, 3 mg / kg, sc). Tien minute na inspuiting is rotte waargeneem vir somatiese tekens van onttrekking en verhoogde plus-doolhof angs (soos beskryf in Exp. 2a).
Exp. 3: Naloksoon-presipiteerde opiaat-like onttrekkingstoetse in rotte wat op standaard knaagdierkoek gehou word en met 'n vloeibare kos ryk aan suiker en vet.
Die diëte getoets in Exp. 1 en 2 was solied; ons het daarna 'n vloeibare dieet getoets om die effek van tekstuur te beheer aangesien tekens van opiaatagtige onttrekking in ons diermodel van suiwelverbruik van suiker die gebruik van 'n sukrose-oplossing het [8, 9], en daar is bekende verskille in die effekte wat vaste en vloeibare diëte kan hê op ingestelde gedrag [31, 32]. Ratte (300-375 g) is verdeel in vier gewiggroepe (n = 8 / groep) en onderhou vir 28 dae op ad libitum Chow aangevul met: (a) 12-h toegang tot 'n emulsie van olie, suiker en water (3.4 Kcal / mL, 35% vet, 10% suiker, Mazola® Corn Oil, Sukrose, Kraanwater en 0.6% Emplex, Caravan Ingredients , Lenexa, KS, voorberei in ons laboratorium), en chow; (b) 12-h toegang tot Vanilla Verseker (1.06 Kcal / mL, 30% vet, en 30% suiker, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) en chow; (c) 12-h toegang tot 'n 10% (w / v) sukrose oplossing (0.4 Kcal / mL) en chow, of (d) ad libitum chow. Om die emulsie voor te berei, is water verhit tot 75-80 ° C en by ander bestanddele gevoeg. Die emulsie is op 'n hoë spoed gemeng vir 5 min en dan in 'n ysbad afgekoel totdat dit 20 ° C bereik het. Alle diëte (behalwe standaard chow) was vloeibaar en is aangebied in 'n gegradueerde drinkbuis. Kos is daagliks vervang en diere is weekliks geweeg.
Naloksoon-neerslag-onttrekkingstoetse
Na 28 dae op die toegediende diëte, is rotte naloksoon toegedien (3 mg / kg, sc). Tien minute na die inspuiting is rotte geplaas op die verhewe plus-doolhof, soos beskryf in Exp. 2a. Onmiddellik na 'n 5-min verhoogde plus-doolhof toets, is rotte geplaas in 'n gerekenariseerde, oop veldaktiwiteitskamer onder rooi lig (MED Associates, Georgia, VT, 30.5 cm hoë akriel sywande en 16 infrarooi fotocelle op elk van die drie asse ). Die hele veld was 43.2 cm × 43.2 cm. Elke rat is aanvanklik in die middel van die oop veld geplaas en het 'n 10 min akklimatietydperk gegee voordat die toets begin het [33, 34]. Dan is lokomotoriese aktiwiteit, gedefinieer as infrarooi bundel breek, gemonitor vir 20 min.
Exp. 4: Naloksoon-presipiteerde opiaat-like onttrekkingstoetsing by rotte teen verminderde liggaamsgewig
Om te toets of onttrekkingstekens met 'n verlaagde liggaamsgewig verkry kan word, is gewig-gekombineerde rotte (283-345 g) vir 21 dae gehandhaaf op: (a) 2-h daaglikse toegang tot soetvetskoor (Navorsingsdiëte, New Brunswick, NJ, # 12451, soos gebruik in Exp. 1), begin 6 h na die aanvang van die donker siklus, met standaard knaagdier chow beskikbaar slegs vir die ander 22 h per dag (n = 10) of (b) ad libitum standaard chow met 2 h vir toegang tot die lieflike vetkoor slegs twee dae (dag 2 en dag 22 of 23; Acute Sweet-Fat groep, n = 9). Voedselinname is daagliks by 6 h en 8 h gemeet na die aanvang van die donker siklus; kos is twee keer per week vervang.
4a. Normale liggaamsgewig onttrekking toets
Op dag 22, 6 h in die donker periode, is alle rotte naloksoon toegedien (3 mg / kg, sc). Tien minute na die inspuiting is rotte waargeneem vir somatiese tekens van onttrekking en verhoogde plus-doolhof angs soos beskryf in Exp. 2a.
4b. Verminderde liggaamsmassa-onttrekkingstoetsing
Die 2-h Daaglikse Soetvet-rotte is verlaag tot 85% liggaamsgewig oor 'n 7-dag tydperk deur die daaglikse standaard chow beskikbaarheid te verminder na 'n halfpille (3 g) of een pellet (5 g) en soetvet-chow na 'n halwe korrel (2 g) of een korrel (3.5 g). Die hoeveelheid voedsel wat verskaf is, is aangepas vir elke rot afhangende van die gewigsverlies. Die Akute Soet-Vet-groep is ook gedurende 'n 85-dagperiode tot 7% liggaamsgewig verminder deur daaglikse standaard chow beskikbaarheid te verminder na 1-2 pellets. Rotte in hierdie groep het 2-h toegang tot soetvet-chow vir 'n derde keer op dag 30 of 31. Onttrekkings toetse (somatiese tekens en plus-doolhof) is weer op dag 29 uitgevoer soos beskryf in Exp. 1a en 2a.
4c. Normale liggaamsgewig lokomotoriese aktiwiteitstoetsing
Na toetse teen verminderde liggaamsgewig is alle rotte gegee ad libitum Toegang tot standaard chow vir een maand om hulle te laat terugkeer na 'n normale liggaamsgewig vir hul ouderdom. Daarna is alle diere teruggekeer na hul eksperimentele diëte vir 14 dae. Rotte in die Akute Soet-Vet-groep is weer op die veertiende dag van toegang tot die hervat toetsdieet toegang tot die soetvet-chow gegee om te bepaal of gedrag as gevolg van binge-eet of bloot blootstelling aan die dieet te wyte was. Daarna is 6 h na die aanvang van die donker siklus, naloksoon (3 mg / kg, sk) toegedien. Tien minute na die inspuiting is rotte in 'n gerekenariseerde, oop veldaktiwiteitskamer onder rooi lig geplaas, soos beskryf in Exp. 3a. Elke rat is aanvanklik in die middel van die lokomotoriese kamer geplaas, en aktiwiteitstellings is vir 10 min gemeet.
4d. Verminderde liggaamsgewig lokomotoriese aktiwiteitstoetsing
Na Exp. 4c, liggaamsgewigte van alle rotte is weer verminder tot 85% soos hierbo beskryf in die loop van 7 dae. Lokomotoriese aktiwiteitstoetsing is dan uitgevoer soos beskryf in Exp. 3c.
Statistiese analise
Data is geanaliseer met behulp van eenrigting- en tweerigtingontledings van variansie (ANOVA) met na-hoc Newman Keuls of Tukey toetse wanneer toepaslik, of Student se t-toetse. Vir die verhoogde plus-doolhofdata is ooparmaktiwiteit as die totale tyd beskou wat elke rot in die oop arms van die doolhof spandeer het [35]. Lokomotoriese data is eerste ontleed met eenrigting ANOVA vir elke mate van voortbeweging en dan met tweerigting-ANOVA om binne-lokomotoriese maatreëls te vergelyk teen normale en verminderde liggaamsgewig, sowel as tussengroep-maatreëls. Fout aangebied in hierdie manuskrip is standaard fout van die gemiddelde.
Results
Exp. 1: Naloksoon-geprecipiteerde of spontane somatiese tekens van angs is nie waargeneem in rotte wat 'n voedingsvolledige soet-vet-chow gegee het nie.
Inname en liggaamsgewig data
Die inname data vir hierdie rotte is voorheen aangemeld [36]. Om die bevindinge kortliks op te som, het rotte met toegang tot 2-h daaglikse toegang en 2-h MWF toegang tot die voedingsvolledige soet-vet-voedsel in vergelyking met die kontrolegroepe te veel groot hoeveelhede van die smaaklike chow in die 2 h van toegang gebruik. Die liggaamsgewig van hierdie diere het toegeneem as gevolg van groot maaltye en dan afgeneem tussen binge as gevolg van selfbeperkte inname van standaard chow-volgende binge. Ten spyte van hierdie skommelinge in liggaamsgewig het die groep met toegang tot soetvet-chow elke dag aansienlik meer gewig gekry as die kontrolegroep met standaard chow beskikbaar ad libitum. Verder, by die ontleding van gewigstoename oor die duur van die studie was daar 'n verskil tussen groepe (F(3,39) = 7.74, p <0.001), met die diere met daaglikse 2-uur toegang tot die soetvet chow wat meer gewig kry as die standaard kontroles wat met chow gevoer is (108.6 ± 6.2 g versus 75.4 ± 3.8 g, onderskeidelik; p<0.001) en die soetvet-voedsel-gevoed kontroles (88.3 ± 4.9 g; p<0.05). Daarbenewens het die rotte met 2-uur MWF toegang tot die soetvetvoedsel meer gewig opgetel as kontroles wat met chow gevoer is (onderskeidelik 95.0 ± 4.6 g versus 75.4 ± 3.8 g; p
Onttrekkingstoetse
Wanneer naloksoon gegee is, was daar geen verskille in onttrekkingsindeks tellings vir somatiese gedrag wat tussen die groepe aangetoon is nie (F(3, 36) = 2.71, p = ns). Hierdie gedrag sluit in voorwaartse bewing, kooi-kruising, pootbyte en verdedigingsgrawe (p = ns vir elkeen; sien Fig 1). Natskuddes is nie in enige groep waargeneem nie.
Voorvalle van somatiese tekens van onttrekking as gevolg van ontneming van die soetvet-chow word uitgebeeld Fig 2. Daar was geen betekenis tussen groepe tussen die totale onttrekkingsindeks telling nie (F(3, 36) = 2.04, p = ns). Pairwyse vergelykings het geen verskille tussen groepe vir voorbeweeg-bewing, potebyt of defensiewe ontgroening geopenbaar nie (p = ns vir almal). Betekenis is onder groepe gesien in gevalle van kooi-kruising (F(3, 36) = 4.66, p <0.05). Post hoc Tukey toetse het getoon dat 2-h daaglikse toegang rotte aansienlik minder gevalle van kooi kruising vertoon as ad libitum Chow rotte (p <0.01) of ad libitum Soet-vet rotte (p <0.05). Weereens is nat hondeskuddings in geen groep waargeneem nie.
Exp. 2: Naloksoon-geprecipiteerde, spontane somatiese tekens, of spontane tekens van angs in die verhoogde doolhof, is nie waargeneem in rotte wat 'n lieflike vet aanvulling by hul standaard chow gevoer het nie.
Inname en liggaamsgewig data
Diere wat in die 12-h Sweet-Fat + Chow-groep was, het gedurende die eerste uur van die daaglikse toegang meer soetkos geëet in vergelyking met dié diere wat op die ad libitum Soet-vet + Chow dieet (F(2, 21) = 13.16, p <0.001, dag 28 van dieëtstoegang, onderskeidelik 5.6 versus 1.1 g). Op dag 28 van die toegang tot dieet het die 12-uur Sweet-Fat-groep 3.5 ± 0.9 g chow, die ad libitum Soet-vet groep verteer 0.68 ± 0.7 g chow, en die ad libitum Chow groep verbruik 2.3 ± 1.5 g chow in die eerste uur. Ten spyte van die verskille in inname van die soetvet aanvulling en chow, was daar op dag 28 geen statisties betekenisvolle verskil tussen groepe in die totale aantal kalorieë wat oor 'n 24-h periode verbruik is nie (F(2, 22) = 0.62; p = ns; 12-h Soetvet: 82.8 ± 2.6 Kcal, ad libitum Soet-vet: 77.3 ± 7.8 Kcal, ad libitum Chow: 83.2 ± 6.8 Kcal). Op dag 28 was liggaamsgewigte van die rotte nie beduidend anders onder groepe nie (F(2, 23) = 1.87, p = ns). Verder, ontleding van gewig oor die duur van die studie het geen beduidende verskille tussen groepe opgelewer nie (F(2, 21) = 1.31, p = ns).
Onttrekkingstoetse
Daar was geen statisties beduidende verskille in onttrekkingsindeks tellings aangeteken onder die groepe 24 h (F(2, 23) = 0.24, p = ns; 12-h Soet-vet groep = 11.5 ± 2.6, ad libitum Soet-Vet groep = 13.6 ± 2.6; ad libitum Chow groep = 13.4 ± 1.8) en 36 h (F(2, 23) = 0.17, p = ns; 12-h Soet-vet groep = 11.8 ± 2.6, ad libitum Soet-Vet groep = 12.1 ± 1.4; ad libitum Chow group = 10.5 ± 2.0) nadat die diere van die smaaklike dieet ontneem is. Die indeks-telling sluit in gedrag van versorging, nathondskuddes, kooi-kruising, voorkop-bewing, pawbyte en defensiewe grawe (vir elke paar-wyse vergelyking, p = ns). Geen gevalle van hoofkoppe is op die 24 h en 36 h tydpunte waargeneem nie.
In terme van die verhoogde doolhof, na 24 h van ontneming, was daar 'n statisties betekenisvolle verskil tussen groepe in terme van tyd wat aan die ooparm spandeer is (F(2, 23) = 3.77, p<0.05; 3.1 ± 1.4 s, 20.0 ± 6.0 s en 15.4 ± 4.7 s, ad libitum Soet-vet, 12-h Soetvet en ad libitum Chow onderskeidelik), met die rotte wat gehandhaaf is ad libitum Soet-vet spandeer minder tyd op die ooparm as die 12-h-soet-vet-groep of die ad libitum Chow-groep (p <0.05). Op 36 uur van ontneming is geen effekte gesien in die tyd wat aan die oop arm van die plus doolhof spandeer is nie (F(2, 23) = 0.22, p= ns; 26.3 ± 7.6 s, 30.0 ± 10.0 s en 23.4 ± 7.2 s, ad libitum Soet-vet, 12-h Soetvet en ad libitum Chow onderskeidelik).
Na aanleiding van naloksoon was daar geen statisties betekenisvolle verskil in onttrekkingsindeks nie.F(2, 23) = 0.64, p = ns). Onttrekking indeks tellings was 8.4 ± 2.5 vir die 12-h Sweet-Fat groep, 11.5 ± 2.3 vir die ad libitum Sweet-Fat groep en 11.4 ± 1.7 vir die ad libitum Chow groep. Die indeks telling sluit in gedrag van tande chattering, versorging, kooi kruising, voorkant tremors, pote byt en defensiewe grawe (vir elke paar-wyse vergelyking, p = ns). Geen gevalle van kophake of nathondskote is waargeneem nie.
Exp. 3: Naloksoon-presipiteerde somatiese tekens of tekens van angs in die verhewe plus doolhof is nie waargeneem in rotte wat 'n vloeibare hoë vet, hoë-sukrose-dieet gevoer het nie.
Intake data
Teen die derde week van dieet toegang was daar 'n verskil tussen die groepe in terme van hul eerste uur inname (Suikerolie emulsie = 32% van kcal, Vanilla Verseker = 27% van kcal, en 10% Sukrose = 24% van kcal van die totale daaglikse inname; F(2, 27) = 39.40, p <0.001). Daar was ook 'n statisties beduidende verskil tussen die groepe in terme van hul daaglikse verbruik van standaard knaagdier-chow (F(3, 78) = 22.86, p <0.0001), met die beskikbare diere met smaaklike voedsel wat die inname van standaard knaagdier chow teen dag 28 afneem (23 ± 3 Kcal: suikerolie-emulsie; 30 ± 4 Kcal: Vanielje Verseker; 71 ± 2 Kcal: 10% sukrose ) relatief tot die ad libitum Chow groep (101 ± 4 Kcal). Alhoewel daar 'n verskil was tussen die groepe in die totale daaglikse kalorie-inname (F(3, 27) = 3.50, p <0.05), het opvolg meerdere vergelykings aangedui dat daar geen verskille was waargeneem wanneer elke groep onafhanklik vergelyk is met die kontrole-verbruikende kontrolegroep (101 ± 4 Kcal) p = ns in alle gevalle (118 ± 13 Kcal: Suiker-olie emulsie; 93 ± 11 Kcal: Vanilla Verseker; 85 ± 6 Kcal: 10% Sukrose). Verder was die hoeveelheid werklike sukrose wat verbruik is (in gram) konsekwent oor groepe met elke groep wat 3-4.5 g suiker / daagliks gebruik het, selfs die verskillende diëte gegee (F(2, 20) = 2.32, p = ns). Aan die einde van 4 weke was daar geen verskille in liggaamsgewig onder groepe nie (F(3,31) = 0.25, p = ns). By die ontleding van gewigstoename oor die duur van die studie was daar egter 'n verskil tussen groepe (F(3,31) = 3.67, p <0.05), met die diere wat die suikerolie-emulsie verbruik, meer gewig gekry as die kontroles wat deur Chow gevoer is (onderskeidelik 123 ± 23 g versus 67 ± 6 g, p <0.05).
Onttrekking data
Wanneer die diere met 12-h 10% Sukrose-toegang op die verhoogde plus-doolhof na naloksoon-inspuitings geplaas is, het hulle minder tyd aan die ooparm van die plus-doolhof bestee in vergelyking met Chow-gevoed kontrole (t(9) = 2.58, p <0.05; 52 ± 7 teenoor 75 ± 3 s). Geen ander verskille is onder die groepe opgemerk nie (12-uur Suikerolie-emulsiegroep = 54 ± 11 s op die oop arm; 12-uur Vanilla Verseker groep = 75 ± 3 s op die oop arm). Analise van die oopveld-doolhofgegewens het getoon dat die 12-uur 10% sukrose-groep die bewegingsaktiwiteit verhoog het (F(3, 29) = 3.65, p <0.05) in vergelyking met die ad libitum Chow groep (743 ± 70 en 512 ± 57 ambulante tellings, onderskeidelik). Geen ander verskille is onder die groepe in die oop veld doolhof aangetoon nie (12-h Suiker-olie emulsie = 561 ± 71 ambulante tellings; 12-h Vanilla Verseker groep = 576 ± 58 ambulatoriese tellings).
Exp. 4: Naloksoon-presipiteerde somatiese tekens of tekens van angs in die verhewe plus doolhof in soetvet-bingeing rotte is nie gesien wanneer verminder tot 85% liggaamsgewig
Inname en liggaamsgewig data
Met die tweede week van soet-vet-toegang het rotte in die 2-h Daily Sweet-Fat-groep 'n oormatige aantal kalorieë in die 2 h gebruik om toegang tot soetvet-chow (66.8% van totale daaglikse inname) te verkry, wat konsekwent is Met ons vorige verslag gebruik hierdie model [36] en stel binge eetgedrag voor. Die akute soet-vet-groep het 24.6 ± 12.5 kcal op dag 2 en 48.1 ± 14.1 kcal op dag 22 of 23 van die soetvetpellets verteer. By normale liggaamsgewig het herhaalde maatstawwe ANOVA (met 'n Greenhouse-Geisser-regstelling) 'n beduidende groep × tydinteraksie getoon (F(1.63, 27.70) = 21.28, p <0.001). Post-hoc-toetse het aansienlik swaarder liggaamsgewig vir die 2-uur Daily Sweet-Fat-groep getoon in vergelyking met die Akute Sweet-vet-groep (dag 8: t(1, 17) = 2.28, p <0.05, dag 12: t(1, 17) = 2.63, p <0.05, en dag 16: t(1, 17) = 2.94, p <0.01). Verder, toe gewigstoename gedurende die eerste 16 dae geanaliseer is, is gevind dat die rotte in die 2-uur daaglikse soetvetgroep aansienlik meer gewig opgetel het as die akute soetvetgroep (81.0 ± 4.1 g teenoor 45.3 ± 4.5 g, onderskeidelik; F(1, 18) = 33.83, p <0.001). Wanneer diere se liggaamsgewig verminder, is monsters gepaar ttoetse het aangedui dat die liggaamsgewigte van beide groepe statisties aansienlik verminder is (t(9) = 25.50, p <0.001 en t(8) = 19.93, p <0.001, 2-uur Sweet-Fat Chow en Acute Sweet-fat Chow, onderskeidelik).
Onttrekking data
By normale gewig het die enigste waargenome verskil tussen groepe aan die lig gebring dat die 2-h Daaglikse Soetvet-rotte aansienlik minder gevalle van kooi-kruising vergeleke met die akute soetvet rotte (2.3 ± 0.4 vs. 4.5 ± 0.9 onderskeidelik toon; F(1, 16) = 5.54, p <0.05; Fig 3). Geen verskille is egter in die algehele onttrekkingsindeks gesien nie (2-h Daaglikse Soetvet: 9.4 ± 1.2; Akute Soetvet: 12.5 ± 2.0; F(1, 16) = 2.00, p = ns). Dit sluit in maatreëls van grapgedrag, kopskudding, versorging en grootmaak (p = ns vir elkeen). Geen rotte vertoon enige gevalle van tande nie.
Teen verminderde liggaamsmassa was daar geen statisties beduidende verskille tussen die groepe in gevalle van somatiese tekens van onttrekking nie, soos gesien deur die indeks telling (F(1, 16) = 0.49, p = ns). Onttrekking indeks tellings was 13.0 ± 3.2 in die Acute Sweet-Fat groep vs 10.8 ± 1.2 in die 2-h Daily Sweet-fat groep. Die indeks telling sluit in gedrag van tande chattering, grootmaak, versorging, kooi kruising, teepaw bewing, pote byt en graaf gedrag. Geen gevalle van koppe is waargeneem nie.
In die verhoogde plus-doolhof toets het die tyd wat op die ooparm spandeer is, nie voor die gewigvermindering per groep verskil nie (2-h Daaglikse Soetvetgroep: 22.4 ± 7.7 s; Akute Soet-vet Chow-groep: 17.4 ± 11.5 s; F(1, 16) = 0.14, p = ns) of na gewigsvermindering (2-h Daaglikse Soetvetgroep: 22.4 s ± 7.0 s; Akute Soetvetgroep: 16.5 ± 7.8 s; F(1, 16) = 0.32, p = ns). In die lokomotoriese aktiwiteitstoetsing, by normale en verminderde liggaamsgewig, was daar geen beduidende verskille tussen 2-h Daaglikse Soetvet-rotte en Akute Zoetvet-rotte in terme van lokomotoriese aktiwiteit (Fig 4).
Wanneer teen 'n verminderde liggaamsgewig, ongeag die groep, al die rotte meer aktief was (F(1, 16) = 7.13, p <0.05, Fig 4) en spandeer meer tyd in die sentrum (F(1, 16) = 11.83, p <0.005; 2-uur daaglikse soetvet: 12.0 ± 1.7 min teen verminderde liggaamsgewig, teenoor 9.6 ± 1.6 min by normale gewig; Akute soetvet: 12.8 ± 3.2 min by verminderde liggaamsgewig versus 8.8 ± 2.2 min by normale liggaamsgewig) van die lokomotoriese aktiwiteitskamer in vergelyking met hul gedrag teen normale liggaamsgewig, maar daar was geen wisselwerking tussen liggaamsgewig en groep nie.
Bespreking
Op grond van die bevindings van hierdie vier eksperimente, het rotte wat 'n smaaklike kos bevat wat beide vet en suiker bevat, nie betekenisvolle aanduidings van naloksoon-presipiteerde of spontane opiaatagtige onttrekking getoon nie. Gegewe vorige bevindings dat rotte binge eet suiker toon tekens van naloksoon-presipitêre onttrekking [9] (wat ook hier in Exp. 3 gerepliseer is), het ons verwag dat naloksoon-ingespuitte rotte met beperkte toegang tot 'n versoete, vetryke dieet toon soortgelyke tekens van onttrekking. Die insluiting van vet in die dieet kan egter inmeng met die uitdrukking van onttrekkingstekens. Hierdie bevindings suggereer dus dat opiate-agtige onttrekking nie waargeneem word as gevolg van binge-eet van alle smaaklike diëte, spesifiek dié wat ryk is in vet, wat soos suiker bekend is om effekte op breinopioïdale stelsels uit te oefen. Dus, die opkoms van die opiate-agtige onttrekkingstekens wat gesien word as gevolg van binge-eet, blyk makrovoedingstowwe te wees.
Die verslawende eienskappe van diets hoog in vet en suiker
In vorige resensies het ons die bevindinge van ons laboratorium en die opsomming opgesom, wat daarop dui dat beperkte toegang tot suiker kan lei tot verskeie gedrags- en neurochemiese tekens van verslawing by rotte, insluitend opiate-agtige onttrekking [8, 37]. Daar is studies gedoen met diermodelle wat daarop dui dat toegang tot 'n vetryke dieet ook tekens van verslawing kan veroorsaak [16]. Corwin se groep het 'n toename in progressiewe-verhouding reageer in rotte binge-eet vet, wat daarop dui dat verbeterde motivering [38]. Bale en kollegas wys dat muise wat gehandhaaf word op 'n hoë vet of hoë koolhidraat dieet en dan toegang tot die kos geweier het, sal 'n aversive stimulus (voetskok) verduur om die verlangde kos te verkry [11]. Na 'n akute onttrekkingsperiode, toon die muise met toegang tot 'n hoë vet dieet tekens van angs sowel as 'n verminderde uitdrukking van kortikotropien-vrystelling in die sentrale kern van die amygdala. McGee en kollegas het egter geen tekens van angs of verbeterde motivering opgemerk nie, met behulp van 'n progressiewe verhoudingskedule wat gevolg is van die beperkte daaglikse toegang tot 'n versoete groentekorting, soortgelyk aan die dieet wat ons in Exp gebruik het. 2 [17]. Gesamentlik, hierdie studies dui daarop dat sekere spesifieke tekens van verslawing verkry kan word wanneer diere 'n vetbevattende dieet aangebied word, maar die resultate is kompleks en kan beïnvloed word deur faktore soos dieetsamestelling, liggaamsgewig en toegangskedule.
Makrovoedingspesifisiteit, Vorm en Beskikbaarheid as Faktore in Goeie Voedsel Intrekking
Die huidige studies het 'n verskeidenheid hoë vet-diëte ingesluit, insluitend 'n paar wat voedingsvol is, soortgelyk aan 'n "ete." Ander was aanvullings tot 'n standaard chow dieet, soortgelyk aan 'n "snack food", wat algemeen gebruik word tydens binge episodes [25]. Diëte is ook gevarieer in tekstuur, van die pellete dieet in Exp. 1, die semi-soliede dieetaanvulling in Exp. 2 en die vloeibare dieet in Exp. 3. Die vloeibare diëte is gebruik as gevolg van die voorheen geïdentifiseerde verband tussen oormatige verbruik van vloeibare dieet en daaropvolgende gewigstoename [31, 32]. Ook omdat ons vorige studies toon tekens van opiate-agtige onttrekking as gevolg van sukrose-toegang, het 'n sukrose-oplossing gebruik (hier in Exp. 3 herpliseer waar diere wat suiwrose eet, minder tyd spandeer op die ooparm van die plus-doolhof en tekens van onttrekking getoon het geïnduseerde hiperaktiwiteit in die oop veld doolhof). Ons het 'n vloeibare vet getoets om te sien of die vorm van die kos 'n effek kan hê van die uitdrukking van onttrekkingsverwante gedrag. Toegang tot 'n vetryke vloeistof het egter nie tekens van onttrekking neerslagtig nie. Uit hierdie verskeidenheid van dieettekstuur en -vorm kom ons tot die gevolgtrekking dat, ongeag die tipe vetryke voedsel of vorm waarin dit gegee word, die huidige eksperimente nie duidelike tekens toon van opiaatagtige onttrekking by diere met binge-toegang tot vet nie.
Nog 'n manipulasie wat in hierdie studie in ag geneem is, was toegangsperiode. Sommige van die rotte het 12-h daaglikse toegang tot die smaaklike dieet gegee, terwyl ander 2-h toegang op 'n daaglikse of intermitterende skedule ontvang het. Albei soorte beperkte toegang het getoon dat binge-eetgedrag afbreek [8, 39]. Binge verbruik het getoon dat veranderinge in die brein beloning stelsels, veral die dopamien stelsel, in beide mense veroorsaak [40] en in rotmodelle, wat soortgelyk is aan die effekte wat met sekere dwelmmiddels gesien word [8]. Alhoewel hierdie toegangskedules getoon is om te lei tot binge-eet, wat in die huidige eksperimente bevestig is, het geen van die toegangsperiodes wat getoets is, tot opioïedagtige tekens van onttrekking as gevolg van vet gelei nie.
Interpretasie van postiewe bevindinge in die huidige eksperimente
Terwyl algehele data dui daarop dat tekens van opiaat-like onttrekking nie voorkom wanneer rotte beperkte toegang tot 'n vetbevattende smaaklike voedsel aangebied word nie, was daar positiewe bevindinge in die huidige stel eksperimente wat bespreking regverdig. In Exp. 1, na 46 h van ontneming van 'n soetvet-chow, het rotte wat voorheen 2 h toegang gehad het, minder gevalle van koorkruising getoon in vergelyking met ad libitum gevoed kontrole (standaard knaagdier chow of hoë vet, soet knaagdier chow). Hipotaktiwiteit is opgemerk tydens die onttrekking van kokaïen by knaagdiere [41]. Daar is egter geen tekens van opiate-agtige onttrekking in die ander toetse wat op hierdie groep uitgevoer is nie, soos die somatiese maatreëls van onttrekking.
In Exp. 2, na 24 h van ontneming diere met ad libitum Toegang tot die soetvet dieet het afgeneem tyd spandeer op die oop arm van die verhoog plus doolhof. Hierdie bevinding is interessant, aangesien dit daarop dui dat 'n groep met ad libitum Toegang tot die lekker kos het 'n verandering in gedrag getoon wat met onttrekking verband hou. Wanneer dit egter by 36 h getoets is, was die effek nie meer duidelik nie. Dit kan wees as gevolg van die feit dat daar 'n spesifieke tydskerm is waarin spontane tekens van angs na vore kom, en daardie tydperk het verloop teen die volgende assesseringstyd. Of dit kan voorstel dat herhaaldelike gebruik van die verhoogde doolhof die prestasie op die toets verander het. Terwyl sommige studies dui daarop dat herhaalde blootstelling aan die verhoogde plus doolhof nie die uitslag van die toets beïnvloed nie [42, 43], ander rapporteer 'n habituation effek [44-47]. In die huidige stel studies is daar meestal geen verskille tussen groepe in angs waargeneem, wat moontlik geen verskille in verband met herhaalde blootstelling aandui nie. Maar die positiewe met ad libitum-voete diere in Exp. 2 moet oorweeg word binne die konteks van die herhaalde gebruik van hierdie toets.
Die rol van liggaamsgewig in die uitdrukking van tekens van verslawing
In die huidige studie het ons die veranderlikes van binge-eet en liggaamsgewig beoordeel. Albei het getoon dat hulle bydra tot verslawingagtige tekens. Ander groepe het getoon dat wanneer rottes beperkte toegang tot 'n soet, sjokolade-dieet kry, word hulle vetsugtig en word dit as gevolg van angsverwante gedrag aangetoon wanneer toegang geweier word van die lekker kos [15]. Ons vorige studies toon onttrekkingsagtige gedrag in diere wat op intermitterende sukrose gehou word, teen normale gewig. Ander bevindings het ook getoon dat vetsugtige diere met ad libitum of beperkte toegang tot 'n kafeteria-styl dieet toon tekorte in mesolimbiese dopamien neurotransmissie [18, 48], maar diere met beperkte toegang (dws binge toegang) wat nie as vetsugtig geklassifiseer is nie, toon nie-gereguleerde dopamien 2 reseptore. Dit onderstreep die idee dat die vetsug self kan lei tot veranderinge in die breinbeloningstelsel [18]. Aan die ander kant, studies van mense met binge eating disorder dui daarop dat binge eet, onafhanklik van vetsug, veroorsaak dat die mesolimbiese DA-stelsels [40], en beklemtoon dus die belangrikheid van die bestudering van die spesifieke veranderlikes van ooreet en vetsug, beide saam en onafhanklik. In die huidige koerant het ons nie die tekens van opiate-agtige onttrekking waargeneem in rotte wat oorgewig geword het op 'n vetryke kos (Exp.1) nie. Aangesien vorige studies dui daarop dat vetsug verslawende veranderings in die brein kan neerslaan, wat moontlik opiaatagtige onttrekkingstekens insluit, kan dit moontlik wees om verskillende (dws nie-opiaatverwante) tekens van onttrekking in hierdie rotte.
In Exp. 4 het ons die effek van verminderde liggaamsgewig op die opkoms van onttrekkingstekens beoordeel. Ratte met voedselbeskermingsgeskiedenis verkry kokaïen-selfadministrasie vinniger as in vergelyking met beheermaatreëls [49], en gewigsvermindering is getoon om die effekte van dwelmbeloning te verbeter [26]. Die vermindering van die gewig se liggaamsgewigte lei tot 'n vermindering van DA vlakke in die NAc tot 33% van basislynvlakke [50, 51]. Ons het voorheen bevind dat wanneer die liggaamsgewig van rotte met 'n geskiedenis van sukkelende suiker tot 85% verminder word, word DA-vrylating as gevolg van suiker verder verhoog [27]. Om hierdie redes het ons veronderstel dat die vermindering van die gewig se liggaamsgewigte die uitdrukking van tekens van onttrekking kan verbeter. Maar in Exp. 4, naloksoon-presipiteerde tekens van onttrekking is nie waargeneem toe rotte na 85% van hul normale liggaamsmassa beroof is nie.
As 'n ekstra mate van angs, het ons die lokomotoriese aktiwiteit beoordeel. Verhoogde lokomotoriese aktiwiteit word geassosieer met onttrekking van geneesmiddels [52-54], en is gevind in Exp. 3 in rotte wat suiker eet, maar nie in rotte met beperkte toegang tot vet nie. Verder, in Exp. 4, was daar geen beduidende verskil tussen rotte wat vet eet en beheer rotte in terme van voortbeweging, hetsy by normale of verminderde liggaamsgewig.
Gevolgtrekking
Rotte wat gehandhaaf word op 'n bieëndieet wat ryk is aan suiker en vet, het nie tekens van opiaatagtige onttrekking getoon wanneer oorgewig, normale gewig of ondergewig met behulp van beide vaste en vloeibare vorms van die dieet nie. Hierdie resultate kontrasteer met vorige bevindings van hierdie laboratorium, en ander, wat opiaat-onttrekkingsagtige gedrag aandui by rotte wat suiker eet. Die huidige bevindinge ondersteun die idee dat tekens van verslawing as gevolg van ooreetbare smaaklike voedsel nutriënspesifieke kan wees, onderstreep die belangrikheid van verdere ondersoek na die differensiële effekte wat ooreet van spesifieke voedingstowwe op breinbeloningsisteme kan hê.
Navorsingshoogtepunte
- Studies toon neurochemiese en gedragsindekse van verslawing wanneer diere 'n vetryke dieet oorleef.
- Naloksoon-presipitêre onttrekking is nie by rotte gesien nie en het 'n verskeidenheid hoë vet, soetdiëte geëet.
- Deprivasie-geïnduseerde onttrekking is nie by rotte gesien nie en het 'n verskeidenheid hoë vet-soetdiëte geëet.
- Liggaamsgewigvermindering, wat bekend is om die versterkende effekte van substans van mishandeling te versterk, het nie naloksoon-presipiteerde tekens van opiaatagtige onttrekking beïnvloed nie.
- Ratte wat binge eet, eet soet-vet-kombinasies, toon geen tekens van opiaatagtige onttrekking onder die omstandighede wat gebruik word nie.
Erkennings
Die navorsing is ondersteun deur die USPHS-toekenning AA-12882 (BGH) en DK-079793 en die National Eating Disorders Foundation (NMA).
voetnote
Disclaimer van die uitgewer: Hierdie is 'n PDF-lêer van 'n ongeredigeerde manuskrip wat aanvaar is vir publikasie. As 'n diens aan ons kliënte voorsien ons hierdie vroeë weergawe van die manuskrip. Die manuskrip sal kopieëring, tikwerk en hersiening van die gevolglike bewys ondergaan voordat dit in sy finale citable vorm gepubliseer word. Let asseblief daarop dat tydens die produksieproses foute ontdek kan word wat die inhoud kan beïnvloed, en alle wettige disklaimers wat van toepassing is op die tydskrif betrekking het.
Verwysings
;
