Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor and Touuates Downstream Signaling (2013)

تعليقات: يبدو أنه يُظهر أن Cdk5 يتسبب في تقليل تنظيم مستقبلات الدوبامين D2. بشكل مثير للدهشة ، يؤدي عامل الترجمة deltafosb إلى إنتاج Cdk5. الخط السفلي يلعب Deltafosb دورًا رئيسيًا في كل من التحسس وإزالة الحساسية

Jeong J، Park YU، Kim DK، Lee S، Kwak Y، et al. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482

ملخص

مستقبل دوبامين D2 (DRD2) هو مستقبل رئيسي يتوسط وظائف الدماغ المرتبطة بالدوبامين مثل المزاج والمكافأة والعاطفة. يعتمد كينيز 5 (Cdk5) المعتمد على السيكلين على كيناز سيرين / ثريونين كينيز موجه نحو البرولين ، والذي تم توريط وظيفته في دائرة مكافآت الدماغ. في هذه الدراسة ، أوضحنا أن بقايا 321 السينية (S321) في الحلقة الثالثة داخل الخلايا من DRD2 (D2i3) هو موقع تنظيمي جديد لـ Cdk5. وقد لوحظ فسفرة Cdk5 المعتمد من S321 في D2i3 في المختبر وأنظمة زراعة الخلايا.

ولاحظنا كذلك أن فسفرة S321 قد أضعفت تعبير سطح D-D2 المحفَّز للمحفِّض وتقليل اقتران البروتين G إلى DRD2. علاوة على ذلك ، تأثر مسار cAMP في النظام المتغاير وفي الثقافات العصبية الأولية من أجنة p35 القاضية على الأرجح بسبب انخفاض النشاط المثبط لـ DRD2. هذه النتائج تشير إلى أن الفسفرة Cdk5 بوساطة S321 يثبط وظيفة DRD2 ، وتوفير آلية تنظيمية جديدة للإشارات الدوبامين.

الأرقام

12

تنويه: Jeong J، Park YU، Kim DK، Lee S، Kwak Y، et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 مستقبلات وتقلل من إشارات اتجاه التيار. PLoS ONE 8 (12): e84482. دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482

رئيس التحرير: جيمس بورتر ، جامعة داكوتا الشمالية ، الولايات المتحدة الأمريكية

تم الاستلام: مايو 20 ، 2013 ، قبلت: تشرين الثاني (نوفمبر) 14 ، 2013 ، نشرت: 31 كانون الأول، 2013

حقوق النشر: © 2013 Jeong et al. هذا هو مقال مفتوح الوصول موزعة وفقا لشروط رخصة المشاع الإبداعي، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط أن يُنسب إلى المؤلف الأصلي والمصدر.

التمويل: تم دعم هذا العمل من خلال المنح (NRF-2012R1A2A2A01012923 و NRF-2012R1A4A1028200) من الحكومة الكورية (MSIP) وتم دعمه أيضًا في إطار برنامج التعاون الدولي الذي تديره مؤسسة NRF الكورية (2012K2A1A2033117) ومعهد أبحاث الدماغ الكوري (KBRI) برنامج البحوث الأساسية من MSIP (2031-415). حصل SKP على جائزة 2004 و 2006 National Alliance for Research for Schophophrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Awards. لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو قرار نشرها أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

المُقدّمة

وتشارك إشارات الدوبامين في وظائف الدماغ المختلفة بما في ذلك التنسيق الحركي ، والتحكم في المزاج وآليات مكافأة [1]. يتم تنفيذ مكون رئيسي من إشارات الدوبامين في الفقاريات بواسطة الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة [سترد] (MSNs) التي تعبر بشكل انتقائي عن مجموعة فرعية من مستقبلات الدوبامين وتتلقى مدخلات الدوبامينية بشكل رئيسي من المنطقة القطبية البطنية (VTA) والأعشاب السوداء (SN) [2]. مستقبلات الدوبامين هي مستقبلات G مقترنة بالبروتين (GPCR) مع سبعة مجالات عبر الغشاء وتتكون من نوعين فرعيين ، D1-like و D2-like المستقبلات ، التي تتوسط الأعمال التبادلية في إشارات الدوبامين [1]. على سبيل المثال ، تعمل مستقبلات الدوبامين D1 الشبيهة (D1 و D5) على تنشيط adenylyl cyclase من خلال Gαs وزيادة مستوى الخلايا داخل cAMP ، ولكن مستقبلات الدوبامين D2 الشبيهة (D2 ، D3 ، D4) تمنع adenylyl cyclase من خلال Gαi وتقليل مستوى الخلايا من cAMP [1], [3].

بين مستقبلات الدوبامين ، فإن مستقبل D2 (DRD2) متورط في الفسيولوجيا المرضية للعديد من الاضطرابات النفسية الكبرى بما في ذلك الفصام والإدمان على المخدرات [4]، مثل أن العديد من العقاقير المضادة للذهان على الأقل تستهدف جزئيا DRD2. من المعروف أيضًا أن نشاط DRD2 يرتبط بشكل جيد بالعواقب السلوكية لعقاقير الإساءة في النماذج الحيوانية [5]. كما تم ربط مضادات الاكتئاب وفعالية مثبت المزاج بالتعديلات في تعبير سطح الخلية لـ DRD2 أو إشارات داخل الخلايا متداخلة بوساطة PKA و ERK و GSK3 [1], [4], [6]. على الرغم من هذه الأدوار المهمة لـ DRD2 في الدماغ ، فإن الآليات التنظيمية التفصيلية التي تمنح عدم التجانس والتعقيد لخصائص DRD2 ليست مفهومة تمامًا.

تشير خطوط الأدلة المتقاربة إلى أن العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة تتضمن الضبط الدقيق لنشاط DRD2. تم الكشف عن glycosylation واسعة النطاق من DRD2 في دراسات وصفية تقارب الصور المبكر [7]كما تم تحديد تشفير السندات ضمن DRD2 كتعديل مهم لربط الربيطة [8]. وعلاوة على ذلك ، تم تحديد مواقع الفسفرة من DRD2 في البداية من قبل المختبر اختبار مع النظائر المشعة ، وتوفير طرق لمختلف المسارات التنظيمية بوساطة kinases المختلفة [9]. في الواقع ، ينظم بروتين كيناز C (PKC) تحرك DRD2 بوساطة من الكالسيوم داخل الخلايا وينظم تفاعل DRD2 مع البروتينات الخلوية [10]. ينظم الفسفرة بواسطة GPCR kinase 2 (GRK2) أنماط إعادة تحفيز الناجم عن DRD2 [11].

الكيناز المعتمد على Cycase 5 (Cdk5) هو كيناز سيرين / ثريونين كينيز موجّها نحو البرولين ، وله نشاط تفضيلي بسبب تعبير خاص بالدماغ عن منشطاته الأساسية ، p35 و p39 [12]. ويشارك Cdk5 في العديد من العمليات العصبية بما في ذلك الهجرة العصبية والإرشاد المحوري ، و Cdk5 و p35 تظهر أعطال الفئران في الطبقات القشرية [13]. في الآونة الأخيرة ، تبين أن الفسفرة من WAVE1 و ephexin بواسطة Cdk5 ينظم التشكل الفقري الشجيري [14]. علاوة على ذلك ، ينظم Cdk5 أيضًا مستويات التعبير السطحي لمستقبل NMDA ، NR2B ، وتيارات NMDA التي تتوسطها NR2A [15], [16]. من الجدير بالذكر أن العديد من الأدلة تشير إلى وجود علاقة حميمة بين Cdk5 ونظام الدوبامين. Cdk5 phosphorylates التيروزين hydroxylase (TH) ، وتنظيم استقراره ، وبالتالي الحفاظ على التوازن الدوبامين [17]. في الخلايا العصبية بعد المشبكية ، عندما يكون الفوسفومبروتين- 75kD (DARPP-32) هو عبارة عن فُسْر T32 من الدوبامين والدوائين المنحنى (DARPP-5) ، فإنه يمكن أن يثبط نشاط PKA وبالتالي يعاكس إشارات PKA الدوبامين بواسطة DRD1. [18]. من المثير للاهتمام ، عندما يتم تعاطي الكوكايين ، وهو ناهض غير مباشر لمستقبلات الدوبامين ، بشكل مزمن في الجرذان ، ترتفع مستويات mRNA والبروتين من Cdk5 في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة [19]. بشكل جماعي ، يبدو أن Cdk5 متورطًا في التكيّف المتشابك الناجم عن الأدوية. في هذه الدراسة ، نظهر تفاعلًا وظيفيًا بين DRD2 و Cdk5 الذي يوسع دور Cdk5 في تشوير الدوبامين.

مواد وطرق

الأجسام المضادة

أثيرت الأمصال المضادة للأرنب ضد الببتيدات التي تحتوي على الفوسفات سيرين 321 (pS321) من الحلقة الثالثة داخل الخلايا من DRD2 (D2i3). تم استخدام Phospho-peptide ، CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) ، لعمل عمود ببتيد مترافق لتنقية الألفة (20401 ، PIERCE). تم إثراء الجسم المضاد لـ pS321 من خلال نظام تنقية متقارب يتبع إرشادات الشركة المصنعة. تم تخزين الأجسام المضادة للفوسفات النقية في PBS باستخدام 0.1٪ من أزيد الصوديوم و 0.1٪ من الجيلاتين. تم استخدام الأجسام المضادة المضادة للفأر Cdk5 (sc-249) والأجسام المضادة المضادة للأرانب المضادة لـ p35 (sc-820) في النشاف الغربي والكيمياء المناعية لـ Cdk5 / p35. تم استخدام الأجسام المضادة المضادة للـ GFP المضادة للفئران (sc-9996) للتأثير المناعي والنبض الغربي لـ DRD2-GFP. مضاد أرنب مضاد للأجسام المضادة لـ FLAG (sc-807) ، مضاد للأرانب مضاد لـ HA (sc-805) ، مضاد للأجسام المضادة لـ GST (sc-138) ، وأضداد مضادة لـ GAPDH المضادة للفأر (sc- 32293) تم شراؤها من Santa Cruz Biotechnologies.

أشكال حيوانات

كان الفأر بالضربة القاضية p35 هدية لطيفة من الدكتور Katsuhiko Mikoshiba في معهد RIKEN Brain للعلوم في اليابان واستخدمت لثقافة العصبون الأساسي. كانت مجموعات التمهيدي للتشكيل الوراثي 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG و 5′-GCTCTGCTAGACATACTGTAC و 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT كما هو موضح سابقًا [20]. تم استخدام الفئران ICR وفئران سبراجي داولي لإعداد إعداد المحللة في الدماغ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل جامعة بوهانج للعلوم والتكنولوجيا المؤسسية رعاية واستخدام الحيوان لجنة.

البلازميد والبناء

إيزوفورم الإنسان الطويل DRD2 في ناقلة بلازميد EGFP-N1 وتم استخدام الحلقة الخلوية الثالثة من DRD2 (بقايا الأحماض الأمينية 212-373 بما في ذلك بقايا الأحماض الأمينية الإضافية 29 الفريدة من نوع إسدورم DRD2 الطويل) في ناقل pFLAG-CMV-2 البلازميدي. تم إدخال Cdk5 الإنسان في ناقل pcmV-HA البلازميدي وتم إدخال p35 البشري في ناقل plasmid PCDNA 3.1. تم إدخال Cdk5 الإنسان تحت المروج المضخم للخلايا (CMV) جنبا إلى جنب مع p35 الإنسان في ناقل PCDNA 3.1 لجعل بناء تعبير مزدوج (Cdk5 / p35) للكيميولوجية immunocytochemistry ، مستقبل استيعاب الداخلي ، [35S] -GTPγS مقايسة ملزمة ، فحص ملزم الإشعاع و المناعية انزيم كامب.

في المختبر Kinase الفحص

IP مرتبطة المختبر تم إجراء اختبار كيناز على النحو التالي. واحد من عقل الفأر كله كان متخلفا في 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0)، 250 mM NaCl، 5 mM EDTA، 0.1٪ NP-40) بواسطة 20 strokes لمغني Dounce للحصول على ليسين المخ المتجانس . تم تحضين الماكينات على الجليد لمدة 30 دقيقة ، sonicated ، والطرد المركزي في 16,000 × g لـ 10 min. تم معايرة المواد الطافية مع الأجسام المضادة المضادة للأرانب المضادة لـ p35 للحصول على مجمع Cdk5 / p35 نشط. تم خلط Cdk5 / p35 معقدة وتنقية البروتين GST الانصهار مع الأدينوزين 5′-triposphate ، [γ-32P] (NEG-502H ، PerkinElmer) وحضنت في مخزن عازلة kinase (30 mM HEPES (pH 7.2) ، 10 mM MgCl2، 0.2 mM DTT) لـ 1 h عند درجة حرارة الغرفة [18], [21]. تم استخدام مجمع Cdk5 / p25 المنقى (14 – 516 ، Millipore) أيضًا المختبر اختبار كيناز كما هو موضح أعلاه. تمت إضافة المخزن المؤقت لتحميل العينات 2 × إلى خليط التفاعل وغلي في 100 ° C. ثم تم إخضاع العينات إلى SDS-PAGE وتم تقييم الجل المجفف عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي.

الكروماتوغرافيا السائلة (LC) - قياس الطيف (MS) / تحليل MS

تم تحليل البروتين GST-D2i3 المؤتلف بواسطة LC-MS / MS بعد توصيل IP المختبر اختبار كيناز. أجرينا تحديد الببتيد لبيانات LC-MS / MS باستخدام X !! Tandem (الإصدار Dec-01-2008). تم تحويل كل ملف بيانات RAW لأول مرة إلى mzXML باستخدام خط أنابيب trans-proteomic (TPP ؛ الإصدار 4.3). بعد ذلك ، تم فحص MS / MS في mzXMLs المحولة للبحث في قاعدة بيانات UniProt لتسلسل بروتين الفأر (الإصدار 2010_07) بما في ذلك تتابع GST-D2i3 باستخدام X !! Tandem. تم تعيين التسامح على 3 دا للأيونات السلائف و 2 دا للأجزاء المجزأة. تم استخدام خصوصية الإنزيم للتريبسين. واستخدمت خيارات تعديل متغير لالكرباميدوميثيلين السيستين (57.021 دا) ، وأكسدة الميثيونين (15.995 دا) ، والتحلل من الأسباراجين (0.987 دا) وفسفرة السيرين (79.966 دا).

مناعي

تم إجراء Immunoprecipitation على lysates الخلية في عازلة ELB تحلل. تمت إضافة الأجسام المضادة لـ GFP إلى lysates وحضنت لـ 3 h عند 4 ° C. تم تنقيته immunocomplexes باستخدام agarose البروتين- A. تم تحضين الرواسب مع مخزن تحميل العينة SDS لـ 30 min عند 37 ° C ، وتعرض لـ SDS-PAGE و blots الغربية.

فحص GST المنسحبة

تم تحضين 10 ofg من GST المنقى و GST-D2i3 مع lysate الدماغ الفئران ل 1.5 ح في 4 ° C. تم إضافة 30 µL من الجلوتاثيون (GSH) - مكررة Sepharose 4B حبات (17-0756-01 ، GE Healthcare) متوازنة مع العازلة تحلل وحضنت لمزيد من 1 ح. تم جمع الخرز بواسطة الطرد المركزي في 2,000 ×g وشطف مع تحلل العازلة 4 مرة [22], [23]. تم تحليل الرواسب بواسطة النشاف الغربي باستخدام مضادات Cdk5 و anti-p35.

مناعية

تم غسل خلايا transkected HEK 293 والخلايا العصبية خطية تربيتها على coverslips مرة واحدة مع المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) وثابتة عن طريق الغمر في الباردة 4 ٪ بارافورمالدهيد / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية في حل المنع (2٪ مصل الحصان و 1٪ Triton X-100 في PBS). تم استخدام أضداد اليكفافلور 647 المضاد للفأر (A20990 ، Invitrogen) و Alexafluor-568-anti-rabugated antibody (A11011 ، Invitrogen) كأجسام مضادة ثانوية. استخدمت Hoechst لتلطيخ النواة. تم الحصول على الصور بواسطة الفحص المجهري البؤري (Olympus، FluoView-1000).

فحص التطرق المستقبلي

24 h بعد إجراء ترنسفكأيشن ، تمت معالجة الخلايا باستخدام 1 µM ​​quinpirole (Q102، Sigma) لـ 30 min و 90 min عند 37 ° C. تم إعادة تعليق الخلايا في 2 mL cold PBS واستخدمت 200 alL aliquots لكل تفاعل. أجريت المعالجات الدوائية في درجة حرارة الغرفة لـ 3 h عند التركيزات التالية ؛ 3 nM [3H] -spiperone (NET-565، PerkinElmer)، 3 µM ​​sulpiride (895، TOCRIS)، 10 µM ​​haloperidol (H1512، Sigma). نافرة من الماء [3تم استخدام H] -spiperone لتسمية إجمالي المستقبلات وأعرب عن استخدام sulpiride hydrophilic ليحل محل غشاء مستقبلات ملزمة [3H] إشارات سببيترون. تم حساب إشارات المستقبل المرتبطة الغشاء عن طريق طرح قيم مستقبلات داخل الخلايا من القيم المستقبلة مجموع أعرب. تم ترشيح الخلايا على مرشح GF / B (Millipore) وغسلها مرات 3 مع مخزن الغسيل (50 mM Tris-HCl (pH 7.4) و 100 mM NaCl). تم تجفيف المرشحات وتم قياس النشاط الإشعاعي المتبقي باستخدام عداد التلألؤ السائل [24].

تحضير غشاء الخلية

تم غسل الخلايا المتجمعة في أطباق الثقافة 100 مم بعد ترنسفكأيشن مع PBS الجليد الباردة وحصادها في العازلة 1 ML HME (25 MM HEPES (pH 7.5) ، 2 MM MgCl2و 1 mM EDTA). تم طرد lysates المتجانس مع 500 × g لـ 15 min وتم بعد ذلك طرد الطاردات باستخدام 36,000 × g لـ 30 min. واستخدمت إعادة تعليق الكريات في المخزن المؤقت HME لإجراء فحوصات.

[35S] -GTPγS ملزم تجليد

تم تحضين كسور الغشاء الخلوي مع 1 µM ​​quinpirole (Q102، Sigma) في مخزن الفحص (25 mM HEPES (pH 7.5)، 1.5 mM MgCl2و 100 mM NaCl و 1 mM EDTA و 0.01 mM GDP) لـ 10 min. [35S] -GTPγتمت إضافة S (NET-030H، PerkinElmer) إلى التركيز النهائي لـ 3 nM في 30 andL وحضنت المزيد من أجل 90 دقيقة. 170 µL من عازلة الثلج البارد (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ، 100 mM NaCl ، 10 mM MgCl2، و 0.1 mM GTP) تمت إضافته لإيقاف التفاعل. تم ترشيح الأغشية على مرشح GF / B (Millipore) وغسلها مرات 3 بغسالة عازلة (50 mM Tris-HCl (pH 7.4) و 100 mM NaCl). تم تجفيف المرشحات وتم قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ [25], [26].

Radioligand ملزم تجليد

تم تحضين أغشية الخلية المحضرة باستخدام 0.01 nM [3H] -spiperone (NET-565، PerkinElmer) وزيادة تركيزات quinpirole (Q102، Sigma) لـ 30 min في مخزن الفحص (25 mM HEPES (pH 7.5)، 1.5 mM MgCl2و 100 mM NaCl و 1 mM EDTA). تم ترشيح الأغشية على مرشح GF / B (Millipore) وغسلها مرات 3 بغسالة عازلة (50 mM Tris-HCl (pH 7.4) و 100 mM NaCl). تم إنهاء التفاعل عن طريق الترشيح السريع من خلال مرشحات GF / C. تم قياس النشاط الإشعاعي المتبقية باستخدام عداد التلألؤ السائل [27]-[29].

كامب انزيم المناعية

تمت معالجة خلايا HEK 293 transfected بـ 10 µM ​​rolipram (R6520، Sigma) لـ 1 h ، ومن ثم تعامل مع 0.1 forM forskolin (F6886 ، Sigma) وزيادة تركيزات quinpirole (Q102 ، Sigma) لـ 30 min. تمت معالجة الخلايا العصبية المخطط الابتدائي المستزرع باستخدام 10 µM ​​rolipram for 1 h ، ومن ثم 1 dM dopamine لـ 1 h [22]. تم تحضير lysates الخلية مع 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وتم الكشف عن مستويات cAMP من قبل مجموعة المناعية إنزيم cAMP (الياقوت Bioscience) بعد تعليمات الشركة المصنعة.

الخلايا العصبية المستزرعة الرئيسية المستزرعة

تم عزل المنطقة المميتة من الدماغ الجنيني للفأر (E15). تم فصل الأنسجة المشبهة في الوسائط الأساسية الدنيا (MEM) (11095 ، Invitrogen) التي تحتوي على التريبسين 0.25٪ (T4549-100 ، Sigma) و 0.1٪ DNase I لـ 6 min عند 37 ° C. تم إعادة تعليق الخلايا في وسائط الطلاء (MEM مع 0.01 M HEPES (pH 7.4) و 10٪ (vol / vol) horse serum (16050-122، GIBCO)). تم زراعة الخلايا العصبية لأيام 7 المختبر (DIV 7) في MEM مع ملحق B27 (17504-044 ، Invitrogen) قبل تطبيقه على immunoassays إنزيم cAMP.

النتائج

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 في حلقة Intracellular الثالثة من DRD2 المختبر

لتحديد ركائز Cdk5 الجديدة ، أجرينا بحثًا منهجيًا باستخدام (S / T) PX (K / H / R) كتسلسل الإجماع الخاص بالتعرف على Cdk5 [30] وحدد DRD2 كمرشح مرشح. يقع تسلسل الإجماع ، بما في ذلك Seren 321 ، في الحلقة الخلوية الثالثة من DRD2 (D2i3) حيث تم إشراك العديد من الآليات التنظيمية [3], [10], [11]. يتم حفظ التسلسل في DRD2 في الفقاريات ، مما يعني أهمية وظيفية للمخلفات (الشكل. 1A).

صورة مصغرة

الشكل 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 في الحلقة الخلوية الثالثة من DRD2 في المختبر.

(A) محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية تظهر مناطق محمية من DRD2 من مختلف الأنواع (المظللة). يشار إلى موقع phosphorylation Cdk5 المحتمل بالعلامة النجمية. (ب) المرتبطة IP المختبر اختبار كيناز مع البروتينات GST-D2i3 و GST-D2i3 المؤتلف. تم استخدام مجمع Cdk5 / p35 المخصب من مستخلص دماغ الفأر من قبل anti-p35 immunoprecipitation من أجل تفاعلات الكيناز. ويرد autoradiograph من البروتينات phosphorylated جنبا إلى جنب مع تلطيخ الأزرق Coomassie اللامع من نفس الجل. يشير السهم إلى الإشارة المشعة المقابلة لـ GST-D2i3s ورأس السهم المفتوح يشير إلى إشارات إشعاعية من p35. (C) MS / MS الطيف من جزء الببتيد phosphorylated من D2i3. تظهر أنماط التجزئة النظرية تحت الطيف. من بين جميع أيونات الشظايا ، يتم الإشارة إلى أيونات y و b في الأطياف. هم6 و y7 الأيونات تشير بقوة إلى الفسفرة من 321 سيرين. (د) في المختبر اختبار كيناز مع مجمع Cdk5 / GST-p25 المنقى باستخدام البروتينات GST-D2i3 و GST-D2i3 متحولة. تم عرض البروتينات الفسفورية في مصفوفة أوتوماتيكية ، إلى جانب تلوين أزرق Coomassie اللامع. يشير السهم إلى الإشارة المشعة المقابلة GST-D2i3 ورأس السهم المفتوح يشير إلى إشارات إشعاعية من GST-p25.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

لتقييم قدرة Cdk5 إلى phosphorylate D2i3 ، أجرينا اتصال IP المختبر المقايسات كيناز باستخدام مجمع Cdk5 / p35 النشط المخصب من lysate الدماغ الماوس عن طريق p35 immunoprec الأمطار مع البروتينات المؤتلف المنقى GST-D2i3 (الأحماض الأمينية 212 - 373) كما ركائز. لاحظنا إشارات فسفرة في بروتين GST-D2i3 و GST-D2i3 S297A المنقى ، ولكن تم تقليل الإشارة بشكل كبير باستخدام GST-D2i3 S321A (الشكل. 1B). لمزيد من التحقق من فسفرة 321 السينية في GST-D2i3 ، أجرينا تحليل LC-MS / MS للعينات من IP المرتبطة المختبر فحوصات كيناز باستخدام مطياف الكتلة LTQ XL. باستمرار ، تم استعادة phospho- الببتيدات المقابلة للكتلة من الببتيدات 321 الفوسفات سيرين (الشكل. 1C). وبالنظر إلى أن الاستحواذ على البيانات المعتمدة أثناء تحليل LC-MS / MS يميل إلى اكتشاف البروتينات الوفيرة في العينة [31]، هذه البيانات تشير إلى أن بقايا 321 سيرين هو موقع الفسفرة المهيمنة Cdk5 في منطقة D2i3. لإثبات فسفرة مباشرة من 321 سيرين في GST-D2i3 بواسطة Cdk5 ، المختبر تم إجراء اختبار كيناز باستخدام تنقية Cdk5 / GST-p25 مع بروتينات GST-D2i3 المؤتلف المنقى. حددنا إشارة فسفورية مهمة في GST-D2i3 التي كانت غائبة في GST-D2i3 S321A (الشكل. 1D). مع الأخذ في الاعتبار ، تشير هذه النتائج إلى أن مخلفات D2i3 S321 هي هدف تفضيلي للفسفرة المتوسعة بواسطة Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 في الحلقة الثالثة داخل الخلايا من DRD2 في الخلايا

لتحديد الفسفرة من 321 سيرين ، قمنا بجمع الأجسام المضادة الخاصة ل 321 phospho-serine (pS321). عينات من IP مرتبطة المختبر تم تحليل تحليل كيناز بواسطة النشاف الغربي باستخدام الجسم المضاد لـ pS321. أظهرت البقع حلقة مميزة في تفاعل الكيناز الذي كان يعتمد على GST-D2i3 (الشكل. 2A). للتحقق من الفسفرة المحتملة ل 321 السينية في DRD2 بواسطة Cdk5 في الخلايا ، تم تحليل immunoprecopitates مكافحة GFP من خلايا HEK 293 معربا عن DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP مع أو بدون HA-Cdk5 و p35 بواسطة النشاف الغربي باستخدام مضاد GFP و الأجسام المضادة pS321. لوحظ وجود إشارات عصابية مميزة للطاخن بواسطة الأجسام المضادة المضادة للـ GFP والتي يُعزى إليها بسبب وجود ارتباط بالغليكوزيل المفرط لـ DRD2 فقط في وجود DRD2-GFP ، وكشف الأجسام المضادة لـ pS321 عن إشارات DRD2 مماثلة فقط مع تعبير Cdk5 / p35 co (الشكل. 2B) [7]. لمزيد من التحقق من الفسفرة من 321 سيرين بواسطة Cdk5 ، تم إنشاء D2i3 (FLAG-D2i3) وشكل متحولة من D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). تم تحليل FLAG-D2i3 و FLAG-D2i3 S321A مع أو بدون HA-Cdk5 و p35 في خلايا HEK 293 من خلال اختبار تحول الحركة SDS-gel. وقد لوحظ وجود تحول كبير في الحركة قائم على Cdk5 في FLAG-D2i3 ، ولكن ليس من أجل FLAG-D2i3 S321A (الشكل. 2C). قمنا أيضا بتقييم مستوى الفسفرة من DRD2 في Ser321 على التحفيز الناهض. تم تحفيز خلايا HEK 293 التي تعبر عن معقدات DRD2-GFP و Cdk5 / p35 بواسطة quinpirole ، وتم تحليل مضادات المناعة ضد GFP من الخلايا غير المحللة بواسطة النشاف الغربي باستخدام مضادات GFP ومضادات pS321. وجدنا أن فسفرة Cdk5-mediated من DRD2 في Ser321 لم تتأثر بتحفيز ناهض ، والذي يبدو مختلفًا عن phosphorylations GRK-and PKCالشكل. 2D) [32], [33]. معا ، تشير هذه النتائج إلى أن Cdk5 يمكن phosphorylate بقايا 321 serine من DRD2 في البيئة الخلوية.

صورة مصغرة

الشكل 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 في الحلقة الخلوية الثالثة من DRD2 في الخلايا.

تم تحليل الفسفرة Cdk5 بوساطة من 321 سيرين باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة pS321. (أ) عينات من IP مرتبطة المختبر تم تحليل تحليل كيناز باستخدام البروتينات GST-D2i3 بواسطة النشاف الغربي (WB) مع الأجسام المضادة المشار إليها. تشير رؤوس السهم إلى GST-D2i3s. (B) تم التعبير عن DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP مع أو بدون HA-Cdk5 و p35 في خلايا HEK 293. تم تحليل immunoprecipitates مكافحة GFP بواسطة النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP و anti-pS321. يشير القوس إلى إشارات DRD2 ورأس السهم المفتوح يشير إلى إشارات غير محددة من مضادات المناعة المضادة للـ GFP. "٪ input" هو٪ حجم إجمالي lysate لتفاعل IP. وأشارت إشارات Cdk5 الذاتية الضعيفة عن طريق العلامات النجمية. (ج) جيل التنقل التنقل مقايسة. تم تحليل خلايا HEK 293 transfected كما تم تحديدها بواسطة النشاف الغربي. (D) تم علاج الخلايا السرطانية المتعوضة 293 مع الكينبيرول وتم تحليل immunoprecipitates المضادة لل GFP بواسطة النشاف الغربي مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP ومكافحة pS321. يشير رأس السهم المفتوح إلى إشارات غير محددة من مضادات المناعة المضادة للـ GFP.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex و DRD2 مرتبطان ماديًا

فحصنا التفاعل المادي المحتمل بين مجمع Cdk5 / p35 و DRD2 نظرًا لأن العديد من ركائز Cdk5 معروفة بأنها مرتبطة فعليًا بمجمع Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. أولاً ، تم تنفيذ تجربة GST المنسدلة. تم تحضين البروتين GST-D2i3 المؤتلف المنقى مع lysate الدماغ الفئران وتم تحليل رواسب المنسدلة GST لالطخة الغربية. كما هو موضح في الشكل. 3Aتم تحديد Cdk5 و p35 الذاتية في رواسب منسدلة ، مما يشير إلى تفاعل مادي بين DRD2 ومجمع Cdk5 / p35 (الشكل. 3A). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن HA-Cdk5 و p35 في مضادات المناعة المضادة ل GFP من خلات LK HK 293 معربا عن DRD2-GFP و Cdk5 / p35 (الشكل. 3B). بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تحليلات immunocytochemical ولاحظت أن DRD2-GFP و HA-Cdk5 و p35 تظهر إشارات تأليف مشتركة معًا في المنطقة الغشائية لخلايا HEK 293 (الشكل. 3Cالألواح العلوية). نحن أيضا التحقيق في التوطين المشترك DRD2 و Cdk5 / p35 في السياق العصبية. على نحو مستمر ، أظهرت DRD2-GFP أيضًا توطينًا مشتركًا كبيرًا مع Cdk5 الذاتية و p35 في الخلايا العصبية المخططة المستزرعة (DIV7) ، مما يدعم الروابط الوظيفية بين DRD2 و Cdk5 / p35 (الشكل. 3C، لوحات القاع). تشير النتائج إلى أن DRD2 و Cdk5 / p35 يمكن أن يشكلان معقدًا وبالتالي ، يدعمان فكرة أن DRD2 هي ركيزة فسيولوجية لـ Cdk5.

صورة مصغرة

الشكل 3. يمكن أن يشكل Cdk5 / p35 معقد مع DRD2.

(A) فحص المنسدلة GST باستخدام بروتين GST-D2i3 المؤتلف مع استخراج الفئران الدماغ. تعرضت رواسب الهبوط إلى GST لتحليل النشاف الغربية. يشير "الخرزة" إلى الترسيب المنسدل بدون بروتينات GST. (ب) Immunoprecipitation من مجمع DRD2 و Cdk5 / p35. تم اختبار IP Anti-GFP من lysates من الخلايا transfected لتحليل النشاف الغربية. يشير القوس إلى إشارات DRD2 ورأس السهم المفتوح يشير إلى إشارات غير محددة من مضادات المناعة المضادة للـ GFP. كما تظهر في الجهة اليمنى صورة مبطنة للمدخلات. (C) تحليلات Immunocytochemical من DRD2 و Cdk5 / p35. كانت خلايا HEK 293 التي تعبر عن DRD2-GFP و Cdk5 / p35 ملطخة بأجسام مضادة لـ Cdk5 و anti-p35 (الألواح العلوية). تم التعبير عن DRD2-GFP بمفرده في الخلايا العصبية المدبّعة المستنبطة وملطخة بأضداد Cdk5 و anti-p35 (الألواح السفلى). استخدمت Hoechst لتلطيخ النواة. شريط مقياس هو 5 µm. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر (Olympus، FluoView-1000).

دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

تآكل الفسفرة Cdk5 بوساطة DRD2 نشاط المستقبل

وقد أفيد بأن الفسفرة تعدل الخصائص الحرجة لـ GPCRs مثل اقتران البروتين G ، واستيعاب المستقبلات ، والتوطين داخل الخلايا ، والارتباط ببروتينات المغير [9], [11], [24]. Aتداخل المستقبِلات المستحثة بالزمن هو عملية تنظيمية حرجة لنقل الإشارة. نحن التحقيق في تعديل Cdk5 بوساطة من DRD2 الاستيعاب. تم تحضين خلايا HEK 293 معربا عن DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP مع أو بدون Cdk5 / p35 مع quinpirole 1 µM ​​للحث على استقراء DRD2 المحفّز للناجِز (الشكل. 4A). [3H] - تم تقليل إشارات سباعي الإشعاع للخلايا المتعادلة DRD2-GFP بشكل كبير في علاج XINUMMO كوانبيرول واستعادتها عند 30 دقيقة. ومن المثير للاهتمام، [3H] - اختزلت أيضًا إشارات سباعي الإشعاع لخلايا DRD2-GFP و Cdk5 / p35 للتعبير في 30 min quinpirole treatment ولكن لم يتم استردادها عند 90 دقيقة (الشكل. 4A، القسم الثاني). من ناحية أخرى، [3H] - تم تقليل إشارات المسافة بين إشارات DRD2 S321A-GFP في 30 دقيقة واستردادها في 90 دقيقة ، بغض النظر عن التعبير المشترك مع Cdk5 / p35. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن DRD2 الداخلي يتدوير مرة أخرى إلى غشاء البلازما على التحفيز ناهض لفترة طويلة [11]. تييبدو أن فسفرة Cdk5-mediated من DRD2 تشارك في عمليات إعادة التحسس بعد استقراء DRD2 الناجم عن الناهضة.

صورة مصغرة

الشكل 4. يضعف الفسفرة Cdk5 بوساطة تعبير سطح DRD2 والتشوير في اتجاه مجرى النهر.

(A) تعبير سطح DRD2 يتم قياسه بواسطة [3H] - اختبار ملزم سبوبيون. تم تحفيز خلايا HEK293 transfected باستخدام quinpirole 1 µM ​​للوقت المحدد وحصادها ، تليها 3 nM [3H] علاج spiperone لمدة 3 ساعات. تم قياس النشاط الإشعاعي وتم حساب إشارات السطح. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± SE (n = 8 ؛ * p <0.05 ، ** p <0.01 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunnett post hoc: قارن جميع الأعمدة مقابل عمود التحكم). (ب) [35S] -GTPγS ملزم الربط. تم تحضير أغشية الخلايا من الخلايا المُعدية كما هو محدد. تم تحضين المستحضرات الغشائية باستخدام 1 µM ​​quinpirole متبوعة بـ 3 nM [35S] -GTPγS لمدة 90 دقيقة. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± SE (n = 8 ؛ * p <0.05 ، ** p <0.01 ، *** p <0.001 ؛ ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Bonferroni اللاحق: قارن جميع أزواج الأعمدة). (C) منافسة Quinpirole [3H] - اختبار ملزم سبوبيون. تم تحضين المستحضرات الغشائية من الخلايا المرقبة مع 0.01 nM [3H] -spiperone وتركيزات متزايدة من quinpirole لمدة 30 دقيقة. تم الحصول على الانحدار غير الخطي بواسطة GraphPad. تشير أشرطة الخطأ إلى يعني ± SE (ن = 3). (د) المقايسات المناعية لإنزيم cAMP في خلايا HEK 293 المنقولة. تمت معالجة الخلايا المنقولة بـ 10 ميكرومتر من رولبرام لمدة ساعة واحدة ، وبعد ذلك تمت معالجتها باستخدام 1 ميكرومتر من فورسكولين وزيادة تركيزات كينبيرول لمدة 0.1 دقيقة. تم الحصول على الانحدار غير الخطي بواسطة GraphPad. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± SE (n = 30 ؛ ** p <4 ؛ ثنائي الطرف t-tests). (E) تم علاج الخلايا العصبية المخططة مثقف من النوع البري وأجنة قاضية p35 (DIV 7) مع 10 µM ​​rolipram ل 1 h متبوعًا بـ 1 µM ​​dopamine لـ 1 h. أشرطة الخطأ تمثل متوسط ​​± SE (n = 4؛ **p<0.01 ؛ ثنائي الذيل t-tests).

دوى: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

قمنا كذلك بتقييم التغير المحتمل لمقترن البروتين G المحفّز للمحفِّض إلى DRD2 المرتبط بالفسفرة Cdk5 باستخدام [35S] -GTPγS ملزم الربط [25], [26]. تم التعبير عن DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP مع أو بدون Cdk5 / p35 في خلايا HEK 293. تم إعداد الأغشية وتحفيزها باستخدام كوانبيرول 1 µM ​​ومزيد من السماح [35S] -GTPγدإ التأسيس. وأظهر DRD2-GFP و Cdk5 / p35 معربا عن غشاء الخلية ضعفًا ملحوظًا [35S] -GTPγS الربط مقارنة لجميع أغشية الخلايا الأخرى (الشكل. 4B). هذه النتائج تشير إلى أن الفسفرة Cdk5 بوساطة أسفل ينظم محفز البروتين G- حفز حفز في DRD2.

بالإضافة إلى ذلك ، منافسة quinpirole3تم إجراء اختبار H - -spiperone ملزم للتحقيق في أي تغيير محتمل في تقارب agonist في DRD2 بواسطة الفسفرة Cdk5 بوساطة. الربط التنافسي [3H] - تم قياس -spiperone عند العلاج من زيادة تركيزات quinpirole إلى إعداد الغشاء من transfected. تنافس ملزمة من quinpirole و [3H] - سبكترون في DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP قاموا بعمل logk مماثلi القيم (−9.789 لـ DRD2-GFP ؛ −9.691 لـ DRD2 S321A-GFP) ، مما يشير إلى أن تقارب اللفظ إلى DRD2 لم يتأثر بشكل ملحوظ بالفسفرة التوسعية Cdk5 في DRD2 (الشكل. 4C).

تعمل فسفرة Cdk5 بوساطة Down-regulates على مسار الإشارات DRD2-CAMP

بعد ذلك ، فحصنا ما إذا كان تعديل DRD2 بواسطة Cdk5 يؤثر على مسارات تأشير مجرى النهر. قمنا بمراقبة تثبيط الـ DRD2 بوساطة إنتاج cAMP المحفّز forskolin بواسطة adenylyl cyclase في الخلايا معربا عن DRD2-GFP و DRD2 S321A-GFP باستخدام مناعة إنزيم cAMP. أظهرت خلايا التعبير DRD2 انخفاض مستويات cAMP استجابة للكوينبيرول بطريقة تعتمد على الجرعة. من اللافت للنظر ، أن التعبير المشترك عن Cdk5 / p35 قد قلل بشكل كبير من تثبيط الحد الأقصى لتشكيل cAMP (صورة 4D ، اللوحة اليمنى). من ناحية أخرى ، في خلايا التعبير DRD2 S321A-GFP ، تم منع تكوينات cAMP بشكل فعال كرد فعل على علاج quinpirole بغض النظر عن تعبير Cdk5 / p35 (صورة 4D ، اللوحة اليمنى). هذه النتائج تشير إلى أن الفسفرة Cdk5 بوساطة DRD2 يضعف النشاط التثبيطي من DRD2 على مسار إشارة cAMP المصب. وللتأكيد بشكل أكبر على الظاهرة في إطار أكثر ملائمة من الناحية الفسيولوجية ، استخدمنا الخلايا العصبية الأولية المستزرعة من أجنة بالضربة القاضية ناقص في p35 ، وهو منشط أساسي Cdk5. تم علاج الخلايا العصبية المخطط الابتدائي مثقف مع الدوبامين 1 µM ​​وتحليلها من قبل المناعية انزيم كامبر. عرضت الخلايا العصبية من الفئران بالضربة القاضية p35 انخفاض مستويات cAMP مقارنة مع الخلايا العصبية من النوع البري عندما حفز مع الدوبامين (الشكل. 4E). تيمعًا ، توصلنا إلى نتيجة مفادها أن فسفرة Cdk5 بوساطة DRD2 تؤدي إلى انخفاض في درجة التثبيط في مسار cAMP الذي تمارسه DRD2.

مناقشة

حددنا DRD2 كركيزة رواية من Cdk5. يبدو أن الفسفرة تنخفض من مستوى تعبير سطح DRD2 من خلال التأثير على مصير DRD2 بعد استيعاب المستقبِل وبالتالي تقليل DRD2 Giمسار camp و cakep. نظرًا لوجود S321 من بقايا الفسفرة على حد سواء في الأشكال الإسوية الطويلة والقصيرة لـ DRD2 ، فقد تكون الآلية المقترحة في هذه الدراسة هي النمط العام للتنظيم في تشوير DRD2 بوساطة.

لم يُنظر إلى DRD2 في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة فقط كنوع رئيسي من مستقبلات الدوبامين ، ولكن تم التعرف عليه أيضًا لقابليته للتغيرات في التوافر استجابةً للمؤثرات البيئية. تم دراسة التحسس و إعادة التحسس بواسطة DRD2 على نطاق واسع [11], [24]. على وجه الخصوص ، أظهر عدد من الدراسات أن آثار التعرض النفسي المزمنة مثل الكوكايين والأمفيتامين ، والتي ترفع المستوى خارج الخلية من الدوبامين في المشبك المخطط ، مصحوبة بتغيرات ديناميكية في DRD2 postynaptically [36]. في الواقع ، من المعروف أن مستخدمي الكوكايين المزمنين قد خفضوا مستويات DRD2 في منطقة المخطط ، ويوضح توافر DRD2 في النواة المتكئة (NAcc) وجود ارتباط سلبي مع سلوكيات البحث عن المخدرات وتعزيزها في الفئران والرئيسيات [37]-[39]. تشير هذه النتائج إلى أن وظيفة DRD2 شديدة التأثر بالتنظيم التعويضي أو التعويضي استجابة للمحفزات المختلفة بما في ذلك التعرض المزمن للأدوية. تظهر نتائجنا أن بقايا S321 في الحلقة الثالثة داخل الخلايا من DRD2 يمكن أن يتم فسفوريلتها بواسطة Cdk5 ، مما يؤدي إلى انخفاض في التأثير المثبط لـ DRD2 على مسار cAMP. يقترح هذا التفاعل آلية تنظيمية جديدة مرتبطة بـ Cdk5 في الخلايا العصبية dopaminoceptive التي قد تكون مرتبطة بالطبيعة الديناميكية لتوافر سطح DRD2.

تجدر الإشارة إلى أنه من المعروف أن Cdk5 ليكون عنصرا رئيسيا في التوسط للتغيرات التكيفية في البيئة العصبية. على سبيل المثال ، تعد التغيرات الهيكلية والوظيفية للأشواك التغصنية في العصبونات في الدائرة الحوفية إحدى نتائج التعرض النفسي المتكرر. [40]. هذه التغيرات مصحوبة بتغيرات جزيئية مختلفة بما في ذلك تحريض بروتين ربط عنصر استجابة cAMP (CREB) و ΔFosB ، وعوامل النسخ التي تحمل تنظيمًا مستمرًا استجابةً لإدارة الكوكايين المزمن. [41], [42]. الأهم من ذلك ، Cdk5 هو الهدف من ΔFosB [19], تم الإبلاغ عن العديد من المكونات المهمة في ديناميكيات العمود الفقري الشجيري ، مثل PSD-95 ، و kinase المنشط p21 (PAK) ، β-catenin ، و spinophilin ، كركائز Cdk5 [43]-[46]. باستمرار ، التلاعب الجيني أو الدوائي لنشاط Cdk5 يستثير تغيرات في تشعب العمود الفقري الشجيري والاستجابات السلوكية للكوكايين ، مما يدل على أدوار حاسمة لـ Cdk5 في التغيرات الجزيئية والمورفولوجية لدوائر الدوبامين المسيرية. [47], [48]. تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن DRD2 هدفًا جديدًا لـ Cdk5 يوفر رؤية إضافية للتغيرات التكيفية لنظام الدوبامين استجابةً لتعرضات الدواء المزمنة بسبب التوسّع اللاحق لـ Cdk5 Δ FosB قد يؤدي إلى زيادة منشط في عملية فسفرة DRD2 . علاوة على ذلك ، من المعروف أن DRD2 تؤثر على العديد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك تنظيم مسارات cAMP و MAP kinase وأحداث النسخ التحويلي [42], [49]. وبالتالي ، فإن النتائج في هذه الدراسة قد لا تصور فقط تنظيم مباشر لـ DRD2 بواسطة Cdk5 ولكنها توفر أيضًا فكرة جديدة حول الاستجابات التكيفية لنظام الدوبامين للتعرض المزمن للعقاقير.

الكاتب الاشتراكات

تصور وتصميم التجارب: JJ YUP DH SKP. نفذت التجارب: JJ YUP DKK YK. قام بتحليل البيانات: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. تساهم الكواشف / المواد / أدوات التحليل: YHS. كتبت الورقة: JJ SKP.

مراجع حسابات

  1. 1. Missale C، Nash SR، Robinson SW، Jaber M، Caron MG (1998) Dopamine receptors: from structure to function. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Wise RA (2002) دارة مكافأة الدماغ: رؤى من الحوافز غير المرغوبة. Neuron 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. عرض المادة
  4. مجلات / NCBI
  5. الباحث العلمي من Google
  6. عرض المادة
  7. مجلات / NCBI
  8. الباحث العلمي من Google
  9. عرض المادة
  10. مجلات / NCBI
  11. الباحث العلمي من Google
  12. عرض المادة
  13. مجلات / NCBI
  14. الباحث العلمي من Google
  15. عرض المادة
  16. مجلات / NCBI
  17. الباحث العلمي من Google
  18. عرض المادة
  19. مجلات / NCBI
  20. الباحث العلمي من Google
  21. عرض المادة
  22. مجلات / NCBI
  23. الباحث العلمي من Google
  24. عرض المادة
  25. مجلات / NCBI
  26. الباحث العلمي من Google
  27. عرض المادة
  28. مجلات / NCBI
  29. الباحث العلمي من Google
  30. عرض المادة
  31. مجلات / NCBI
  32. الباحث العلمي من Google
  33. عرض المادة
  34. مجلات / NCBI
  35. الباحث العلمي من Google
  36. عرض المادة
  37. مجلات / NCBI
  38. الباحث العلمي من Google
  39. عرض المادة
  40. مجلات / NCBI
  41. الباحث العلمي من Google
  42. عرض المادة
  43. مجلات / NCBI
  44. الباحث العلمي من Google
  45. عرض المادة
  46. مجلات / NCBI
  47. الباحث العلمي من Google
  48. عرض المادة
  49. مجلات / NCBI
  50. الباحث العلمي من Google
  51. عرض المادة
  52. مجلات / NCBI
  53. الباحث العلمي من Google
  54. عرض المادة
  55. مجلات / NCBI
  56. الباحث العلمي من Google
  57. عرض المادة
  58. مجلات / NCBI
  59. الباحث العلمي من Google
  60. عرض المادة
  61. مجلات / NCBI
  62. الباحث العلمي من Google
  63. عرض المادة
  64. مجلات / NCBI
  65. الباحث العلمي من Google
  66. عرض المادة
  67. مجلات / NCBI
  68. الباحث العلمي من Google
  69. عرض المادة
  70. مجلات / NCBI
  71. الباحث العلمي من Google
  72. عرض المادة
  73. مجلات / NCBI
  74. الباحث العلمي من Google
  75. عرض المادة
  76. مجلات / NCBI
  77. الباحث العلمي من Google
  78. عرض المادة
  79. مجلات / NCBI
  80. الباحث العلمي من Google
  81. عرض المادة
  82. مجلات / NCBI
  83. الباحث العلمي من Google
  84. عرض المادة
  85. مجلات / NCBI
  86. الباحث العلمي من Google
  87. عرض المادة
  88. مجلات / NCBI
  89. الباحث العلمي من Google
  90. عرض المادة
  91. مجلات / NCBI
  92. الباحث العلمي من Google
  93. عرض المادة
  94. مجلات / NCBI
  95. الباحث العلمي من Google
  96. عرض المادة
  97. مجلات / NCBI
  98. الباحث العلمي من Google
  99. عرض المادة
  100. مجلات / NCBI
  101. الباحث العلمي من Google
  102. عرض المادة
  103. مجلات / NCBI
  104. الباحث العلمي من Google
  105. عرض المادة
  106. مجلات / NCBI
  107. الباحث العلمي من Google
  108. عرض المادة
  109. مجلات / NCBI
  110. الباحث العلمي من Google
  111. عرض المادة
  112. مجلات / NCBI
  113. الباحث العلمي من Google
  114. عرض المادة
  115. مجلات / NCBI
  116. الباحث العلمي من Google
  117. عرض المادة
  118. مجلات / NCBI
  119. الباحث العلمي من Google
  120. عرض المادة
  121. مجلات / NCBI
  122. الباحث العلمي من Google
  123. عرض المادة
  124. مجلات / NCBI
  125. الباحث العلمي من Google
  126. عرض المادة
  127. مجلات / NCBI
  128. الباحث العلمي من Google
  129. عرض المادة
  130. مجلات / NCBI
  131. الباحث العلمي من Google
  132. عرض المادة
  133. مجلات / NCBI
  134. الباحث العلمي من Google
  135. عرض المادة
  136. مجلات / NCBI
  137. الباحث العلمي من Google
  138. عرض المادة
  139. مجلات / NCBI
  140. الباحث العلمي من Google
  141. عرض المادة
  142. مجلات / NCBI
  143. الباحث العلمي من Google
  144. 3. Neve KA، Seamans JK، Trantham-Davidson H (2004) Dopamine receptor signaling. J Recept Signal Transduct Res 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S، Shaltiel G، Mann L، Shamir A، Dean B، et al. (2008) المشاركة المحتملة لمكونات تشوير مستقبلات الدوبامين D2 في الفيزيولوجيا المرضية لمرض الشيزوفرينيا. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197 – 205. دوى: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB، Negus SS، Mello NK، Patel S، Bristow L، et al. (2002) دور مستقبلات الدوبامين D2 الشبيهة في تعاطي الكوكايين الذاتي: دراسات مع فئران متحولة لمستقبلات D2 ومضادات مستقبلات D2 الجديدة. J Neurosci 22: 2977 – 2988.
  147. 6. Lee S، Jeong J، Park YU، Kwak Y، Lee SA، et al. (2012) يعمل Valproate على تغيير إشارة الدوبامين بالترافق مع تعبير تعبير البروتين Par-4. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS، Elazar Z، Fuchs S (1995) glycosylation التفاضلي والاتجار داخل الخلايا للأيسوفيات الطويلة والقصيرة لمستقبل الدوبامين D2. J Biol Chem 270: 29819 – 29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Reader TA، Molina-Holgado E، Lima L، Boulianne S، Dewar KM (1992) Specific [3H] raclopride binding to neostriatal dopamine D2 receptors: role of disulfide and sulfhydryl groups. Neurochem Res 17: 749 – 759. دوى: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY، O'Dowd BF، Caron M، Dennis M، Brann MR، et al. (1994) Phosphorylation و palmitoylation لمستقبل الدوبامين D2L البشري في خلايا Sf9. J Neurochem 63: 1589 – 1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M، Bermak JC، Wang ZW، Zhou QY (2000) Modulation of dopamine D (2) receptor signaling by actin-binding protein (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446 – 452.
  152. 11. Cho D، Zheng M، Min C، Ma L، Kurose H، et al. (2010) التهييء الناجم عن التحرض والفسفرة المستقبلة توسط حساسية مستقبلات الدوبامين D (2). Mol Endocrinol 24: 574 – 586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. تساي LH ، Delalle الأول ، Caviness VS Jr ، Chae T ، Harlow E (1994) p35 هو وحدة تنظيمية محددة العصبية من كيناز 5 تعتمد على السيكلين. Nature 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R، Tsai LH (2001) عقد من CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749 – 759. دوى: 10.1038 / 35096019
  155. 14. فو AK ، آي بي نيويورك (2007) يعتمد كيناز 5 يعتمد على Cycase خارج الخلية العظة إلى الهيكل الخلوي actin خلال تطور العمود الفقري شجيري. Cell Adh Migr 1: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J، Liu S، Fu Y، Wang JH، Lu Y (2003) Cdk5 activation induces hippocampal CA1 cell death by phosphorylating NMDA receptors مباشرة. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. دوى: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S، Edelmann L، Liu J، Crandall JE، Morabito MA (2008) Cdk5 ينظم فسفرة التيروزين 1472 NR2B والتعبير السطحي لمستقبلات NMDA. J Neurosci 28: 415 – 424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY ، تساي LH (2004) تعتمد على Cycase 5 Cyclin phosphorylates سيرين 31 من هيدروكسيلاز التيروزين وينظم استقراره. J Biol Chem 279: 54487 – 54493. دوى: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA، Snyder GL، Nishi A، Yan Z، Meijer L، et al. (1999) ينظم الفسفرة من DARPP-32 بواسطة Cdk5 إشارات الدوبامين في الخلايا العصبية. Nature 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA، Chen J، Taylor JR، Svenningsson P، Nishi A، et al. (2001) ينظم البروتين العصبي Cdk5 آثار التعرض المزمن للكوكايين. Nature 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T، Ogawa M، Veeranna، Hirasawa M، Longenecker G، et al. (2001) مساهمات التآزر من كيناز XCUMX / p5 تعتمد على cycin و / RLin / Dab35 إلى وضع الخلايا العصبية القشرية في الدماغ الفئران النامية. Proc Natl Acad Sci USA 1: 98 – 2764. doi: 2769 / pnas.10.1073
  162. 21. Morabito MA، Sheng M، Tsai LH (2004) Cycin-dependent kinase 5 phosphorylates المجال N-terminal من بروتين الكثافة بعد المشبكي PSD-95 في الخلايا العصبية. J Neurosci 24: 865 – 876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK، Nguyen MD، Fischer A، Luke MP، Affar el B، et al. (2005) يربط Par-4 إشارات الدوبامين والاكتئاب. الخلية 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M، Smith DS، Ayala R، Peng J، Ko J، et al. (2000) NUDEL هي رواية Cdk5 جديدة ترتبط بـ LIS1 و dynein السيتوبلازمي. Neuron 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM، Valenzano KJ، Robinson SR، Yao WD، Barak LS، et al. (2001) التنظيم التفاضلي لمستقبلات الدوبامين D2 و D3 بواسطة كينازات مستقبلات البروتين المرتبط بالبروتين G والكيوتازات بيتا. J Biol Chem 276: 37409 – 37414. دوى: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M، Bofill-Cardona E، Milligan G، Freissmuth M، Nanoff C (1998) uncuepling disotic of A1 adenosine and D2 dopamine receptors by suramin and didemethylated suramin (NF037). Mol Pharmacol 53: 808 – 818.
  167. 26. Bofill-Cardona E، Kudlacek O، Yang Q، Ahorn H، Freissmuth M، et al. (2000) يعمل تجليد الكودودينولين على مستقبل D2-dopamine على تقليل التشويش المستقبلي عن طريق إيقاف مفتاح تنشيط البروتين G. J Biol Chem 275: 32672 – 32680. دوى: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. قائمة SJ ، Seeman P (1981) تحليل مكونات مستقبلات الدوبامين والسيروتونين [3H] ملزمة spiperone لدماغ الفئران. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B، Strange PG (1998) ناهض العمل عند D2 (طويلة) مستقبلات الدوبامين: ligand binding and functional assays. Br J Pharmacol 124: 978 – 984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P، Tallerico T، Ko F (2003) الدوبامين يزيح [3H] دومبيريدون من مواقع عالية الألفة لمستقبل الدوبامين D2 ، ولكن ليس [3H] raclopride أو [3H] spiperone في وسط متساوي التوتر: الآثار المترتبة على التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني البشري. Synapse 49: 209 – 215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC، Cantley LC، Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Proteome-wide predictions of cell signaling interactions using short sequence motifs. الأحماض النووية الدقة 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H، Sadygov RG، Yates JR 3rd (2004) A model for random takingpling and estimation of protein protein lundance in shotgun proteomics. Anal Chem 76: 4193 – 4201. دوى: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K، Haga T، Lameh J، Sadee W (1999) عزل مستقبلات الدوبامين D2 يعتمد على coexpression من كينازات مستقبلات بروتين G-coupled 2 أو 5. Eur J Biochem 260: 112 – 119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y، Sibley DR (2004) بروتين كيناز C يتوسط الفسفرة ، إزالة التحسس والاتجار في مستقبلات الدوبامين D2. J Biol Chem 279: 49533 – 49541. دوى: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS، Lee RH، Cheung AY، Yeung PK، Chung SK، et al. (2011) مطلوب فسفرة Cdk5 بوساطة من endophilin B1 لالالتهام الذاتي المستحث في نماذج من مرض باركنسون. Nat Cell Biol 13: 568 – 579. دوى: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S، Lau KF، McLoughlin DM، Brownlees J، Ackerley S، et al. (2001) يربط p35 / cdk5 و phosphorylates beta-catenin وينظم تفاعل بيتا - كاتنين / بريسينلين - 1. Eur J Neurosci 13: 241 – 247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ، Ritz MC، Boja JW (1991) The dopamine presothesis of the reinforcing properties of cocaine. اتجاهات Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND، Fowler JS، Wolf AP، Schlyer D، Shiue CY، et al. (1990) آثار تعاطي الكوكايين المزمن على مستقبلات الدوبامين بعد المشبكي. Am J Psychiatry 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW، Fryer TD، Brichard L، Robinson ES، Theobald DE، et al. (2007) Nucleus accumbens تتنبأ مستقبلات D2 / 3 بالاندفاع في السعة وتعزيز الكوكايين. العلوم 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA، Morgan D، Gage HD، Nader SH، Calhoun TL، et al. (2006) PET التصوير من مستقبلات الدوبامين D2 خلال الإدارة الذاتية الذاتية للكوكايين في القرود. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. دوى: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE، Kolb B (1997) التعديلات الهيكلية المستمرة في النواة المتكئة والخلايا العصبية القشرة الجبهية المنتجة بواسطة تجربة سابقة مع الأمفيتامين. J Neurosci 17: 8491 – 8497.
  182. 41. روبنسون TE ، Kolb B (1999) تغيير في شكل التشعبات من العمود الفقري والشعور العمود الفقري في النواة المتكئة والقشرة الجبهية الأمامية بعد العلاج المتكرر مع الأمفيتامين أو الكوكايين. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA، Nestler EJ (2003) Regulation of gene expression and cocaine reward by CREB and DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. دوى: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J، Yan Z، Ferreira A، Tomizawa K، Liauw JA، et al. (2000) ينظم Spinophilin تشكيل وظيفة من العمود الفقري شجيري. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O، Murphy TH (2001) النقل النمطي للكتل ما بعد المشبك الكثافة - 95 والارتباط مع سلائف العمود الفقري مستقرة خلال التطور المبكر للخلايا العصبية القشرية. J Neurosci 21: 9325 – 9333.
  186. 45. Murase S، Mosser E، Schuman EM (2002) يعمل استقطاب الاستقطاب على دفع بيتا Catenin إلى أشواك عصبية تعزز التغيرات في البنية والوظائف المشبكية. Neuron 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML، Choi SY، Rao BS، Jung HY، Lee HK، et al. (2004) مورفولوجيا متشابكة القشرية المتبدلة وضعف الذاكرة توحيد في الفئران المعدلة وراثيا السالب PB forebrain-previn محددة. Neuron 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR، Quinn JJ، Zhong P، Hawasli AH، DiLeone RJ، et al. (2007) Cdk5 ينظم مكافأة الكوكايين ، التحفيز ، استثارة الخلايا العصبية المخطط. J Neurosci 27: 12967 – 12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA، Richer E، Benkovic SA، Hayashi K، Kansy JW، et al. (2008) يتسبب عدم انتظام الخلايا Cdk5 في إبطال المفعول في تغيير الاستجابات الحركية للكوكايين ، والتعلم الحركي ، والشكل المتشابه. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561 – 18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S، Obrietan K، Storm DR (1999) إجراء اتصالات جديدة: دور إشارات kinase في ERK / MAP في اللدونة العصبية. Neuron 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3