ملخص
وقد تم الافتراض أن التغير المستحث بالتهاب العمود الفقري للأعصاب المتشعبة على الخلايا العصبية الدوبامينية في النواة المتكئة (NAcc) كان بمثابة استجابة عصبية تكيفية مرتبطة بسلوكيات مسببة للإدمان طويلة الأمد. يتكون NAcc بشكل كبير من مجموعتين فرعيتين متمايزين من الخلايا العصبية الشوكية متوسطة الحجم معربا عن مستويات عالية لمستقبلات الدوبامين D1 أو D2. في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل كثافة العمود الفقري شجيري بعد العلاج كوكين مزمن في D1 متميزة أو D2 الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة الحجم التي تحتوي على D1 في NAcc. هذه الدراسات استخدمت الفئران المعدلة وراثيا التي عبرت EGFP تحت سيطرة إما D2 أو محفز مستقبل D1 (Drd2-EGFP أو Drd28-EGFP). بعد أيام 2 من العلاج بالكوكايين و 1 أيام الانسحاب ، زادت كثافة العمود الفقري في كل من الخلايا العصبية DRd2-EGFP- و Drd1-EGFP إيجابية. ومع ذلك ، تم الحفاظ على الزيادة في كثافة العمود الفقري فقط في الخلايا العصبية إيجابية Drd30-EGFP 1 بعد سحب المخدرات. بشكل ملحوظ ، لوحظ زيادة التعبير ΔFosB أيضا في الخلايا العصبية DRd2-EGFP- و Drd2-EGFP إيجابية بعد أيام 1 من سحب المخدرات ولكن فقط في الخلايا العصبية إيجابية Drd30-EGFP بعد أيام 1 من سحب المخدرات. تشير هذه النتائج إلى أن زيادة كثافة العمود الفقري التي لوحظت بعد المعالجة المزمنة للكوكايين مستقرة فقط في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D1 وأن تعبير ΔFosB يرتبط بتكوين و / أو صيانة العمود الفقري المتشابه في D2 وكذلك الخلايا العصبية المحتوية على DXNUMX في NAcc.
يتألف مسار الدوبامين المسري المتوسط من عصبونات في المنطقة القطبية البطنية التي تعصب النواة المتكئة (NAcc) ، الحديبة الشمية ، قشرة الفص الجبهي ، واللوزة (1) ، في حين أن الخلايا العصبية الدوبامينية nigrostriatal في المادة السوداء (pars compacta) توفر إسقاطا تصاعديا إلى المخطط الظهري (2). ترفع مضادات الذهان تركيزات متشابكة من الدوبامين في NAcc: الكوكايين ، عن طريق منع امتصاص الدوبامين من الشق المشبكي ، والأمفيتامين ، عن طريق تعزيز إطلاق الدوبامين من المحطات العصبية (3-5). يؤدي التكرار المتكرر للمضادات النفسية إلى زيادة الاستجابات السلوكية (الحساسية) للتأثيرات التحفيزية الحادة لهذه الأدوية (6-8). تشير معظم خطوط الأدلة إلى أن التغيرات التكيفية في المنطقة الجزئية البطنية - NAcc dopaminergic system تعد أساسية للتغييرات في اللدونة التي تعتمد على الخبرة والتي تكمن وراء السلوك المستحث بالمخدرات.
بالإضافة إلى الدوبامين ، فإن الجلوتامات مطلوبة لتطوير التوعية السلوكية استجابة لمثيرات نفسية (9, 10). الخلايا العصبية الشوكية متوسطة الحجم (MSN) في المخطط البطني تتلقى توقعات glutamatergic استثارية من قشرة الفص الجبهي التي تتشابك على رؤوس العمود الفقري الشجيري. كما أن MSN هي الهدف الرئيسي للمحاور الدوبامينية التي تتشابك مع أعناق العمود الفقري (1, 11, 12). لذلك ، تمثل العمود الفقري الشجاع في MSNs الحيز الخلوي حيث يتم دمج مفاعل الدوبامين و glutamatergic في البداية.
يعمل الدوبامين على فئتين فرعيتين مستقبليتين رئيسيتين ، وفصيلة D1 الفرعية (D1 و D5 subtpes) وفصيلة D2 (D2 و D3 و D4) (13). في المخطط الظهاري ، أظهرت الدراسات التشريحية أن الـ MSN striatonigral تحتوي على مستويات عالية من مستقبلات D1 (مع المادة P و dynorphin) ، في حين أن الـ Mss striallopallidal تعرب في الغالب عن مستقبلات D2 (مع enkephalin) (14-17). تكون الإسقاطات من NAcc أكثر تعقيدًا من المخطط الظهري ، مع وجود الغلاف والأجزاء الأساسية من NAcc اللذان يبرزان إلى مناطق فرعية متميزة من الشظية البطنية وإلى المنطقة القطبية البطنية والمادة السوداء (18). في حين يتم التعبير عن مستقبلات D2 و enkephalin بدرجة كبيرة في الإسقاطات إلى الشَّحْلِ البَطْنِيّ ، توجد مستقبلات D1 والمحتوى P بشكل متساوٍ في الإسقاطات إلى الشظية البطنية ومنطقة tegmental البطنية (19). أوضحت الدراسات التي أجريت على ناهضات ومضادات انتقائية لمستقبلات D1 أو D2 أن مستقبلات D1 و D2 مطلوبة للتغيرات السلوكية المعتمدة على التهابات نفسية (20-25). ومع ذلك ، فإن أدوار هذه المستقبلات تبدو مختلفة. على سبيل المثال ، يؤدي تحفيز مستقبلات D1 إلى تخفيف طلب الكوكايين المستحث بواسطة الحقن الأولي للكوكايين والمنبهات البيئية المرتبطة بالكوكايين ، في حين أن تحفيز مستقبلات D2 ييسر إعادة تنشيط الكوكايين (26-28).
إن التشوهات السلوكية المرتبطة بإدمان التهابات نفسية طويلة الأمد. لذلك ، كان هناك اهتمام كبير في تحديد التغيرات التي يسببها المخدرات طويلة الأمد على المستوى الجزيئي والبنيوي في الدوائر العصبية التي ينظمها الدوبامين والغلوتامات (29-32). ومن الجدير بالذكر أن التعرض الطويل الأمد للكوكايين أو الأمفيتامين قد وجد أنه يزيد من عدد نقاط الشوارد الجذعية والأشواك الخاصة بـ MSN في NAcc (33-35). وقد ثبت أن هذه التغييرات الهيكلية تستمر لمدة تصل إلى ≈1-3.5 أشهر بعد التعرض الأخير للمخدرات (30, 35) واقترح أن يكون وراء التعديلات طويلة الأمد في اللدونة متشابك المرتبطة التعرض للتهريب.
كان الهدف من الدراسة الحالية هو دراسة التغيرات الهيكلية الناجمة عن الكوكايين في العمود الفقري الشجيري في المجموعات الفرعية من تراكمات MSN التي تعبر إما عن مستقبلات D1 أو D2. في هذه الدراسات ، استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا الصبغي البكتيري (BAC) التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة محفز مستقبلات الدوبامين D1 (Drd1-EGFP) أو D2 (Drd2-EGFP)36). تشير النتائج إلى أنه على الرغم من أن زيادة كثافة العمود الفقري تحدث في البداية في الـ D1 المحتوية على مستقبلات MSN و D2 المحتوية على مستقبلات MSN ، فإن كثافة العمود الفقري المعدلة مستقرة فقط في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D1. علاوة على ذلك ، نجد تغيرات مماثلة في التعبير عن عامل النسخ ΔFosB ، مما يوحي بأن ΔFosB قد تكون متورطة في تكوين و / أو صيانة العمود الفقري المتشابه في D1 وكذلك الخلايا العصبية المحتوية على مستقبلات D2 في NAcc.
النتائج
تحليل من MSNs في Drd1-EGFP و Drd2-EGFP BAC الفيروسية المعدلة وراثيا.
نمط الإسقاط من MSNs من الظهري والمخاطي البطني في Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP BAC الفئران المعدلة وراثيا وقد وصفت من خلال تحليل التعبير GFP (36). يتطابق التعبير التفاضلي لـ GFP في MSNs من المخطط الظهري بشكل عام مع مستقبلات D1 أو D2 الذاتية ، على التوالي (36). قمنا أيضا تحليل التعبير التفاضلي من GFP في NAcc في الفئران Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP (التين 1a و b). على الرغم من أن ‰ ˆ 58٪ من الخلايا العصبية في NAcc أعرب عن GFP في الفئران Drd1-EGFP (التين 1a) ، ‰ ˆ 48 ٪ من الخلايا العصبية في NAcc أعرب عن GFP في الفئران Drd-2-EGFP (التين 1b). تمثل MSNs 90â € "95٪ من جميع الخلايا العصبية في NAcc (12, 37). يتم التعبير عن مستقبلات D1 فقط في MSN ، ويتم التعبير عن مستقبلات D2 في MSNs وفي interneurons cholinergic ، والتي تمثل 1â € "3٪ من الخلايا العصبية المخططه (37). مع أخذ هذه العوامل في الاعتبار ، تشير النتائج إلى أن الحد الأدنى ، "10" ، من المرجح أن يعبر 15٪ من MSN في NAcc عن مستقبلات D1 و D2 على الأرجح.
تحليل العمود الفقري شجيري في Drd1-EGFP و Drd2-EGFP الفئران.
كان التعبير GFP في الفئران Drd1-EGFP و Drd2-EGFP مفيد لصبغ خلايا الخلايا العصبية. ومع ذلك ، كانت إشارة GFP في التشعبات والأشواك شجيري ضعيفة للغاية للسماح تحليلها بعد immunostaining مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP. استُخدِمَ تسليم بلوري للأصباغ الفلورية عبر تفاعلات جسيمية مؤخرًا لتسمية المجموعات العصبية بطريقة سريعة وفعالة (38). يمكن تسمية الخلايا العصبية بأكملها باستخدام هذه التقنية ، ويبدو أن طريقة مماثلة ل Golgiâ € "كوكس تلطيخ. لتحليل مورفولوجيا شجيرية من الخلايا العصبية في NAcc ، وصفت شرائح التراكمية الثابتة مع صبغة مضان محبة للدهون 1,1 â € ²-diotadecyl-3,3,3 â € ² ، 3 â € ²- tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) باستخدام بندقية الجينات. يظهر مثال على MSN ملطخة بالصبغة التين 1c. في ظل الظروف المستخدمة ، لاحظنا عموما الخلايا العصبية المسمى دون أي تغصنات متداخلة من الخلايا العصبية المسمى الأخرى. عند التكبير الأعلى ، يمكن ملاحظة مورفولوجيا شجيرية مفصلة ، بما في ذلك العمود الفقري الشجيري (التين 1d).
استخدمنا بعد ذلك مجموعة من بطاقات تعريف الهوية والكيمياء المناعية لـ GFP سواء في الفئران المعدلة وراثيا Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP ، والتي أصبحت ممكنة باستخدام تركيز منخفض للمنظف من أجل permeabilization الأنسجة (انظر طرق). من خلال المقارنة الحذرة للتعبير عن صبغة الذواقة والتعبير GFP في الأجسام الخلوية لـ MSN ، استطعنا تحديد الخلايا العصبية الإيجابية و GFP-positive أو DiI-positive و GFP-negative في DRd1-EGFP (التين 2a) أو Drd2-EGFP (التين 2b) الفئران. للدراسات التالية ، قمنا بتحليل مورفولوجيا شجيري فقط في الخلايا العصبية إيجابية DiI- و GFP من الفئران Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP.
نتائج معالجة الكوكايين المزمنة في زيادة كثافة العمود الفقري في أكواد MSN التي تعبر إما عن Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP.
تم حقن Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP بشكل متكرر مع الكوكايين (30 ملغ / كغ) أو المالحة لمدة أربعة أسابيع متتالية (انظر طرق). يومين (2WD) أو 30 أيام (30WD) بعد آخر علاج من تعاطي المخدرات ، تمت معالجة العقول من أجل وضع علامة تعريف الهوية و immunohistochemistry كما هو موضح أعلاه. ذكرت دراسة سابقة أن العلاج المزمن بالأمفيتامين يزيد من كثافة العمود الفقري على التشعبات البعيدة ولكن غير القريبة من MSN في NAcc (35). لذلك ، قمنا بتحليل تحليلنا إلى التشعبات البعيدة (أي تلك التي لها فروع من المرتبة الثانية أو الثالثة) ، بما في ذلك المناطق الطرفية. عند تحليلها في 2WD ، تم العثور على كثافة العمود الفقري للزيادة في MSNs إيجابية DRd1-EGFP (128 ٪ من المجموعة المالحة) (التين 3a و c) وبدرجة أقل في الخلايا العصبية إيجابية Drd2-EGFP (115 ٪ من المجموعة المالحة) (التين 3 b و d). بعد 30WD ، تم الحفاظ على زيادة كثافة العمود الفقري في الخلايا العصبية إيجابية Drd1-EGFP (118 ٪ من التحكم المالحة) (التين 3 a و c) ولكن ليس في الخلايا العصبية إيجابية Drd2-EGFP (التين 3 b و d).
مورفولوجية العمود الفقري dendritic متغير من حيث طول وعرض رأس العمود الفقري. لذلك قمنا بتصنيف نتوءات شجيرية في أربع طبقات من العمود الفقري (قصير ، فطر ، رقيق ، و Filopodia) في 2WD من الكوكايين (لا تظهر البيانات). كثافة نوع الفطر (119.7 Â ± 4.0٪ ، P <0.01) والعمود الفقري الرفيع (120.0 ± 3.4٪ ، P تمت زيادة <0.01) عن طريق علاج الكوكايين في MSNs إيجابي Drd1-EGFP ، في حين أن كثافة قصيرة (182.4 ± 21.6٪ ، P <0.05) وأشواك الفطر (122.5 ± 5.0٪ ، P <0.01) في MSNs إيجابية Drd2-EGFP. لم تكن هناك زيادة كبيرة في العمود الفقري القصير في الخلايا العصبية الإيجابية Drd1-EGFP أو العمود الفقري الرقيق في الخلايا العصبية الإيجابية Drd2-EGFP.
Chronic Cocaine Induces Î “FosB Expression in Drd1-EGFP- or Drd2-EGFP-Positive MSNs in NAcc.
Î "FosB هو عضو في عائلة Fos لعوامل النسخ. في حين أن تناول الكوكايين الحاد يؤدي إلى تحريض سريع وعابر للعديد من الأشكال الإسوية الفوس في NAcc ، فإن التعرض المتكرر للكوكايين يزيد من مستوى Î “FosB. علاوة على ذلك ، تستمر الزيادة في التعبير F FosB في NAcc لأسابيع إلى شهور بعد التوقف عن التعرض للمخدرات ، وقد اقترح أن تشارك في تنظيم طويل الأمد للتعبير الجيني ، حتى بعد توقف تناول الدواء (29, 39, 40).
لفحص تحريض Î FOSB في NAcc من الفئران Drd1-EGFP أو Drd2-EGFP بعد العلاج بالكوكايين ، قمنا بتحليل تعبير FosB و GFP عن طريق وضع العلامات المزدوجة (التين 4 و الجدول 1) الجسم المضاد لـ FosB يتعرف على جميع أشكال FosB ، لكننا نفترض أن زيادة immunostain تمثل Î FosB (انظر طرق لمزيد من المناقشة). في الفئران المعالجة بالمحلول ، 16٪ من الخلايا العصبية إيجابية Drd1-EGFP و 15٪ من الخلايا العصبية إيجابية Drd2-EGFP أعرب عن FosB immunoreactivity مع كثافة ضعيفة نسبيا (التين 4 a و b و الجدول 1). أدى تعاطي الكوكايين المتكرر يليه 2WD إلى زيادة معنوية في عدد الخلايا العصبية الإيجابية Drd1-EGFP التي تتضافر Î "FosB (55٪ من الخلايا العصبية الإيجابية في GFP) (التين 4c و الجدول 1). تم العثور على زيادة أصغر ، ولكن لا تزال كبيرة في Î "التعبير FosB في الخلايا العصبية إيجابية Drd2-EGFP (25 ٪ من الخلايا العصبية إيجابية GFP) (التين 4d و الجدول 1). كما هو الحال مع التغيرات في كثافة العمود الفقري ، تم الحفاظ على زيادة التعبير عن Î “FosB في الخلايا العصبية إيجابية Drd1-EGFP (46 ٪ من الخلايا العصبية إيجابية GFP) ولكن ليس في الخلايا العصبية إيجابية Drd2-EGFP (15 ٪ من الخلايا العصبية إيجابية GFP ) بعد 30WD (التين 4 e و f و الجدول 1). لاحظ أن زيادة التعبير F FosB لوحظ في التين 4f موجود في الخلايا العصبية السالبة Drd2-EGFP.
مناقشة
ويعتقد أن التكيفات طويلة الأمد في العصبية الدوبامينية تكمن وراء السلوكيات الإدمانية المرتبطة العقاقير psychostimulant. على وجه الخصوص ، تم الافتراض بأن الزيادة التي حدثت بفعل التهابات نفسية في كثافة العمود الفقري الشجيري لـ MSN في NAcc قد تم ربطها بإعادة تنظيم الربط التشابكي (30). يتكون NAcc بشكل كبير من مجموعتين فرعيتين متميزتين من MSNs معربا عن مستويات عالية من مستقبلات الدوبامين D1 أو D2. في هذه الدراسة ، قمنا بتحليل كثافة العمود الفقري في D1 D2 أو D1 المحتوية على مستقبلات في NAcc بعد المعالجة المزمنة للكوكايين. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أنه على الرغم من أن زيادة كثافة العمود الفقري تحدث في البداية في الـ D2 المحتوية على مستقبلات MSN و D1 المحتوية على مستقبلات MSN ، فإن كثافة العمود الفقري المعدلة تكون مستقرة فقط في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D1. علاوة على ذلك ، نجد نمطًا مماثلاً من التغييرات في تعبير عامل النسخ ΔFosB في D2 و DXNUMX المحتوية على مستقبلات MSN.
استخدمت هذه الدراسات استخدام الفئران المعدلة وراثيا BAC التي تعبر عن GFP في مجموعات فرعية محددة من MSN تحت سيطرة إما D1 أو D2 مستقبلات المروج. وعلاوة على ذلك ، قمنا بتطوير طريقة وضع العلامات المزدوجة التي تجمع بين immunohistochemistry ل GFP مع وضع العلامات الباليستية من الخلايا العصبية باستخدام DiI. استخدمت الدراسات السابقة طريقة Golgi – Cox لتحليل تأثير المثيرات النفسية على كثافة العمود الفقري (34) ، وأعطت طريقة تحديد الهوية الشخصية المستخدمة هنا نتائج قابلة للمقارنة من الناحية الكمية. قمنا بتطوير طريقة وضع العلامات المزدوجة لأن تلطيخ جولجي غير متوافق مع الكيمياء المناعية. عادة ما يتطلب Immunostaining يتطلب permeabilization الأنسجة مع المنظفات ، وهي عملية تؤدي عادة إلى solubilization الأصباغ المحبة للدهون من الغشاء (38). ومع ذلك ، في دراستنا الحالية ، لم تستدعي immunostaining GFP تركيزا كبيرا من المنظفات لنفاذية permeabilization ، وبالتالي يمكن استخدامها بالتزامن مع العلامات صبغة المحبة للدهون. يجب أن تكون طريقة وضع العلامات المزدوجة مفيدة بشكل عام لدراسات التغيرات الهيكلية في العمود الفقري المتشابه ، على سبيل المثال عند استخدامها لتحليل خطوط الفئران المعدلة وراثيا BAC حيث يعبر عن GFP في مجموعات محددة من العصبونات في القشرة (36).
على الرغم من أنه لا يزال مثيرا للجدل إلى حد ما ، إلا أنه يعتقد أن مستقبلات D1 و D2 مفصولة بشكل تشريحي إلى الخلايا العصبية الإسقاطية المباشرة (striataigral) وغير المباشرة (striatopallidal) ، على التوالي (17, 41). كان التوصيف المبدئي لتوطين GFP في فئران Drd1-EGFP و Drd2-EGFP متسقًا مع هذا الاستنتاج (36). علاوة على ذلك ، فإن تحليلنا لعدد الخلايا العصبية الإيجابية في GFP في NAcc من فئران Drd1-EGFP و Drd2-EGFP يتطابق مع الاستنتاج بأن ≈50٪ من MSNs تعبر عن مستقبلات D1 فقط ، والتي تعبر ≈35 – 40٪ عن مستقبلات D2 فقط ، وأن ≈10 – 15٪ coexpress مستقبلات D1 و D2. هذه القيمة من coexpression تشبه تلك التي تنطوي عليها الدراسات من المخطط الظهري أن الجمع بين تحليل التصحيح-المشبك من الخلايا العصبية المفرد واحد مع تقنيات RT-PCR لعزل وتضخيم mRNAs (co17 ٪ coexpression من enkephalin والمحتوى P) (42). تجدر الإشارة إلى أن دراساتنا الحالية لا تتناول مسألة التعبير عن مستقبلات D3 و D4 و D5 ، كما أنها لا تتناول مشكلة انخفاض مستويات التعبير لمستقبلات D1 في MSN التي تعبر عن مستويات عالية لمستقبلات D2 أو العكس.
قامت العديد من الدراسات السابقة بفحص التوطين العصبي لتعبير Fos المستحث بالتهاب نفسية ودور مستقبلات D1 و D2 (43-45). دعمت تلك الدراسات الاستنتاج بأن تحريض Fos و ΔFosB يتم توسطه من خلال تفعيل مستقبلات D1. ومع ذلك ، فإن التوطين الخلوي لتعبير Fos يتأثر بالسياق البيئي الذي تدار فيه العقاقير ذات المفعول النفسي psyhostimulant.46, 47). على سبيل المثال ، يحفز الأمفيتامين أو الكوكايين الموجود في القفص المنزلي الجينات المبكرة الفورية (بما في ذلك فوس) بشكل تفضيلي في الخلايا الإيجابية للخلايا P التي تربط مستقبلات D1. في المقابل ، يمكن لهذه الأدوية إحداث تعبير Fos في كل من D1 و D2 المحتوية على مستقبلات MSN عند إعطائها في بيئة جديدة. لم يتضمن البروتوكول المستخدم في دراساتنا الحالية إقران حقن المخدرات بالتعرض لبيئة جديدة. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد نوع من الإجهاد المعتمد على السياق المسئول عن تعبير ΔFosB في الـ MSNs المحتوية على مستقبلات D2.
كانت إحدى السمات البارزة للنتائج الحالية هي النمط المتوازي لزيادة كثافة العمود الفقري والتعبير ΔFosB. زيادة كثافة العمود الفقري والتعبير ΔFosB وقعت في البداية في MSNs معربا عن Drd1-EGFP و Drd2-EGFP. ومع ذلك ، كانت هذه التغييرات مستقرة فقط في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D1. أحد التفسيرات المحتملة للملاحظة القائلة بأن زيادة كثافة العمود الفقري وتعبير ΔFosB تم العثور عليهما بشكل عابر في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D2 ، وهو أن هذا حدث في الجزء الصغير من الـ MSNs الذي يربط كل من مستقبلات الدوبامين D1 و D2. وبالتالي ، قد تكون الطبيعة العابرة لهذه الزيادات مرتبطة بالتأثيرات المضادة لتفعيل مستقبلات D2 على مسارات التشوير المعتمدة على D1 (48). ومن المثير للاهتمام أن التغييرات في كثافة العمود الفقري وتعبير ΔFosB يمكن عكسها ، مما قد يعكس قدرة مسارات التشوير المعتمد على مستقبل D2 على التأثير على استقرار ΔFosB.
الملاحظة أن هناك تغييرات موازية في التعبير عن ΔFosB وكثافة العمود الفقري تتفق مع فكرة أن ΔFosB تشارك في التكوين الأولي والصيانة اللاحقة لأشواك شجيري في الخلايا العصبية التي تحتوي على مستقبلات D1 في NAcc. يتم التحكم في التعبير عن ΔFosB بمسار تشوير D1 / DARPP-32 / PP1 المعتمد في MSN (49). أظهرت العديد من الدراسات أن ΔFosB تلعب دوراً مهماً في الأعمال الجراحية المحفِّزة للحركة الحركية للمثيرات النفسية (39) من المرجح أن تؤثر على التعبير عن جينات متعددة تتضمن مستقبلات عصبية ، وبروتينات إشارات ، وبروتينات تشارك في تنظيم مورفولوجيا الخلايا العصبية50). ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية المحددة المشاركة في تكوين العمود الفقري الناجم عن الكوكايين المزمن ليست معروفة في الوقت الحالي. وقد أظهرت دراساتنا السابقة أن ضخ Intraaccumbal من Cdk5 المانع roscovitine الزيادات التي يسببها الكوكايين في كثافة العمود الفقري (51). وعلاوة على ذلك ، فإن Cdk5 هو جين مستهدف في اتجاه مجرى الهواء لـ ΔFosB وقد تم توريطه في التغييرات التكيفية التعويضية المرتبطة بمعالجة الكوكايين المزمن (52). لذلك ، فإن التغيير في الفسفرة المعتمد على Cdk5 هو آلية معقولة لتكوين العمود الفقري الناجم عن الكوكايين و / أو استقرار العمود الفقري. PAK (53)، β-catenin (54) ، PSD-95 (55) ، و spinophilin (56) هي ركائز ل Cdk5 وجميع تشارك في تنظيم التشكل العمود الفقري (57-60). نأمل أن يسلط المزيد من توصيف هذه الركائز الأخرى في العمود الفقري Cdk5 الضوء على الآليات المتضمنة في تنظيم تشكيل العمود الفقري من قبل المثيرات النفسية.
طرق
الحيوانات.
تم إنشاء الفئران التي تحمل EGGGG transgene تحت سيطرة إما D1 أو D2 مستقبلات الدوبامين من المشروع المعدّل جينسان BAC (36). كانت الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة أسابيع 4 - 5 وكانوا على خلفية Swiss-Webster. تم الحفاظ على الفئران في 12: دورة الضوء / الظلام 12-h وتضم في مجموعات من 2-5 مع الغذاء والماء المتاحة. كانت جميع بروتوكولات الحيوانات متوافقة مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتم اعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي بجامعة روكفلر.
العلاج من الإدمان.
تم الإبلاغ عن المعالجة المزمنة للكوكايين (30 mg / kg ، يومياً) لزيادة قوية في كثافة العمود الفقري لـ MSN في كل من القلب وقشرة NAcc من الفئران ، لكن زيادة الجرعة (15 mg / kg) زادت من كثافة العمود الفقري فقط القذيفة (61). ولذلك استخدمنا جرعة أعلى من الكوكايين للحث على التعديل الهيكلي في كلا جانبي NAcc. تلقت الفئران حقنة واحدة (ip) من 30 mg / kg cocaine-HCl (أو المالحة) كل يوم للأيام المتتالية 5 ، تليها أيام 2 بدون حقن ، وتكرر هذا الإجراء لأسابيع متتالية 4. أجريت الحقن في القفص المنزلي. 2WD أو 30WD ، تمت معالجة أدمغة الفأرة من أجل وضع علامة تعريف الهوية و / أو المناعية.
البالستية وصفها مع صبغة الفلورسنت دي.
تم تخدير الفئران باستخدام 80 mg / kg pentobarbital و perfused transcardially مع 5 ml من PBS ، تليها نضح سريع مع 40 مل من 4٪ بارفورمالدهيد في PBS (20 ml / min). تمت إزالة العقول بسرعة من الجمجمة وبعد postfixed في 4 ٪ بارافورمالدهيد ل 10 دقيقة. تم وسم شرائح الدماغ (100 μm) بتسليم باليستي لصبغة الفلورسنت DiI (مجسات جزيئية) كما هو موضح في المرجع. 38. تم تطوير طريقة مجتمعة للـ DiI-immunohistochemistry مع تركيز منخفض للمنظفات. تم تصنيف الأقسام المصنفة حسب علامة التعريف الشخصية (DI) مع 0.01٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة ثم تم تحضينها في 0.01٪ Triton X-100 و 10٪ من ماعز الماعز العادي في PBS لـ 1 h لتقليل تصنيف غير محدد. تم تحضين أقسام الأنسجة بعد ذلك باستخدام 1٪ مصل الماعز الطبيعي / 0.01٪ Triton X-100 والجسم المضاد لـ GFP (Abcam، Cambridge، MA) لـ 2 h عند درجة حرارة الغرفة ، وغسلها واحتضانها في 1: 1,000 dilution of FITC- الأجسام المضادة الثانوية المترافقة (مجسات جزيئية). تم وضع أقسام على شرائح المجهر و coverslipped مع المتوسطة المتزايدة. سمحت طريقة وضع العلامات البالستية بتحليل مفصل لبنية العمود الفقري الشجيري ، وكانت النتائج التي تم الحصول عليها مماثلة من الناحية النوعية والكمية مع الدراسات السابقة باستخدام طريقة إشباع غولجي-كوكس في شرائح دماغ الفئران (34). ومع ذلك ، وعلى النقيض من الدراسات السابقة ، نادرا ما لاحظنا أشواك ذات رأسين في الخلايا العصبية المصبوغة. قد يحدث هذا الاختلاف بسبب حساسية طرق التلوين أو تقلبات الماوس (هذه الدراسة) مقابل نسيج الفئران (34).
المناعية.
تم تخدير الحيوانات و perfused كما هو موضح أعلاه. تمت إزالة العقول وتخزينها بين عشية وضحاها في 4٪ بارافورمالدهيد في 4 ° C. تم نقل العقول إلى السكروز 30 ٪ في الحل PBS ل cryoprotection. تم قطع المقاطع التاجية (12 μm) على مشراح مجمد (لايكا) ثم معالجتها للكيمياء المناعية. ثم تم permeabilized أقسام الدماغ في 0.3٪ Triton X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة وشطفها مرتين في برنامج تلفزيوني. تم إقحام المقاطع في 10٪ من مصل الماعز العادي في PBS لـ 1 h عند 37 ° C ، المعرضين للأجسام المضادة الأولية (المخفف في 1٪ من مصل الماعز العادي في PBS) خلال الليل عند 4 ° C ، ثم شطف في PBS وحضنت مع الثانوية الأجسام المضادة لـ 1 h عند 37 ° C. تم استخدام الأجسام المضادة التالية: الأرانب anti-pan-FosB (SC-48، 1: 500؛ Santa Cruz Biotechnology)، الماوس anti-NeuN (Chemicon)، أرنب anti-GFP، FITC-anti-rabbit IgG، and rhodamine- مترافق مضاد للفأر IgG (مجسات جزيئية). من أجل وضع العلامات الثلاثية (ΔFosB ، NeuN ، و GFP) ، تمت معايرة أقسام الدماغ مع الجسم المضاد FosB المضاد للعمود والجسم المضاد لـ NeuN وبعد ذلك حضنت مع الأجسام المضادة الثانوية (مضادات الأوردة المضادة للالتهاب rhodamine ومتلازمة الماوس المضادة للفأر IgG ). تمت معالجة المزيد من أقسام الدماغ مزدوجة الملون من أجل المناعية GFP باستخدام تكنولوجيا العلامات زينون (Zenon Alexa Fluor 488 ، تحقيقات الجزيئية). تم رفع الأجسام المضادة لـ Pan-Pan-FosB إلى النهاية N لـ FosB ويتعرف على FOSB و FosB بطول كامل (62). استنادًا إلى دراسات سابقة أظهرت أن ΔFOSB ولكن ليس FosB أو مستضدات أخرى ذات صلة بـ Fos يتم التعبير عنها بشكل ثابت بعد المعالجة المزمنة للكوكايين ، فإننا نفترض أن الزيادات طويلة الأمد في المناعة immunoreactivity تمثل تعبيرًا مستقرًا لـ ΔFosB. ومع ذلك ، فإن هوية إشارة FosB immunoreactive الملاحظة في الفئران المعالجة بالملح غير معروفة. التحليل الإحصائي في الجدول 1 استخدم الطالب t الاختبار.
تحليل العمود الفقري شجيري.
تم اختيار الأفراد MSN في NAcc لتحليل العمود الفقري على أساس عدة معايير. (iكان هناك حد أدنى أو لا يوجد تداخل مع الخلايا المسمى الأخرى لضمان عدم الخلط بين العمليات من الخلايا المختلفة. (ii) يجب أن تكون هناك ثلاثة أنواع من التشعبات الأولية على الأقل مرئية للخلايا لاستخدامها في التحليل. (ثالثا) تم فحص التشعبات البعيدة (التشعبات الطرفية أو بالقرب من التغصنات الطرفية). تم تحليل التشعبات من كل من MSNs في قلب وقشرة NAcc. على الرغم من أننا لاحظنا MSNs قليلة الشوكة (النوع الشوكي II) ، فقد قمنا بتحليل MSNs بكثافة فقط (النوع الشوكي الأول). لحساب كثافة العمود الفقري ، تم تتبع طول التغصنات (> 20 ميكرومتر) باستخدام مجهر متحد البؤر (زايس LSM 510) مع عدسة غمر بالزيت (× 40). تم التقاط جميع صور التشعبات بشكل مختلف z مستويات (0.5 - 1 intervm عمق فترات) لدراسة مورفولوجية العمود الفقري شجيري. تم إجراء جميع القياسات باستخدام برمجيات تحليل الصور المتحولة (Universal Imaging، Downingtown، PA). استخدم التحليل الإحصائي اختبار Kolmogorov – Smirnov.
تم تصنيف النتوءات من التشعبات إلى أربعة أنواع على أساس طولها كما هو موضح في الحكام. 63 و 64. كانت نتوءات الفئة 1 ، والتي تسمى أيضًا النتوءات القصيرة ، يبلغ طولها أقل من 0.5 ميكرومتر ، ويفتقر إلى رأس العمود الفقري الكبير ، ولا يبدو أن لها رقبة ؛ الفئة 2 ، أو أشواك على شكل عيش الغراب ، يتراوح طولها بين 0.5 و 1.25 ميكرون وتتميز برقبة قصيرة ورأس فقري كبير ؛ الفئة 3 ، أو الأشواك الرفيعة ، تتراوح بين 1.25 و 3.0 ميكرومتر ولها أعناق طويلة في العمود الفقري برؤوس صغيرة ؛ الفئة 4 ، أو الامتدادات الخيطية ، عبارة عن نتوءات خيطية طويلة تفتقر إلى رأس العمود الفقري الواضح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قِبل دائرة الصحة العامة الأمريكية (Grant DA10044) (إلى PG و ACN) ومؤسسة The Simons Foundation ومؤسسة Peter J. Sharp Foundation ومؤسسة Picower Foundation ومؤسسة FM Kirby Foundation.
الاختصارات
- تحقق نموا مطردا
- النواة المتكئة
- MSN
- الخلايا العصبية الشوكية متوسطة الحجم
- BAC
- كروموسوم اصطناعي بكتيري
- Drd1
- مستقبلات الدوبامين D1 المروج يحركها
- Drd2
- مستقبلات الدوبامين D2 المروج يحركها
- صلاح الغيدان
- 1,1′-diotadecyl-3,3,3 ′، 3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
- 2WD
- 2 أيام بعد آخر علاج من تعاطي المخدرات
- 30WD
- 30 أيام بعد آخر علاج من تعاطي المخدرات.
مراجع حسابات
;