PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
ملخص
التغيرات التي يسببها الكوكايين في التعبير الجيني تسبب تغيرات في مورفولوجيا الخلايا العصبية والسلوك الذي قد يكمن وراء إدمان الكوكايين. حددنا دورًا أساسيًا للهيستون 3 9 3 (H9K9) dimethylation و dimysyltransferase lysine G3a في اللدونة الهيكلية والسلوكية المستحثة بالكوكايين. خفضت تعاطي الكوكايين المتكرر المستويات العالمية من dimethylation H9KXNUMX في النواة المتكئة. تيوقد توسط انخفاضه في ميثيل الهيستون من خلال قمع G9a في هذه المنطقة من الدماغ ، والتي كان ينظمها عامل النسخ الناجم عن الكوكايين ΔFosB. باستخدام الطفرات المشروطة ونقل الجينات بواسطة الفيروسي ، وجدنا أن زيادة إفراز G9a زادت من شدة العمود الفقري الشجيري من الخلايا العصبية المتكئة النواة والتفضيل المعزز للكوكايين ، وبالتالي إنشاء دور حاسم لمثانة الهيستون في إجراءات الكوكايين على المدى الطويل.
المُقدّمة
يتصف التعرض المتكرر للكوكايين بالتغيرات المستمرة في التعبير الجيني وتغيير مورفولوجيا الخلايا العصبية داخل النواة المتكئة (NAc) ، وهو مكون أساسي في دوائر المكافأة في الدماغ (1-2). إعادة تشكيل الكروماتين أمر مهم في التغييرات النسخية الشاذة في هذه المنطقة الدماغية التي قد تكمن وراء جوانب إدمان الكوكايين (3-9). تنظيم الكوكايين لهيكل الكروماتين في نتائج NAC ، جزئياً ، من تعديلات مباشرة مستحثة على الكوكايين لآلة إنزيمات الكروماتين ، مما يؤدي إلى تغييرات في أستلة الهيستون والفسفرة (4, 7-9)؛ ومع ذلك ، لم يتم بعد التحقيق في أدوار الإنزيمات التي تتحكم في ميثيل الهيستون.
لقد قام تحليل مؤشّر على مستوى الجينوم مؤخرًا باستخدام مناعي لونين إلى جانب ميكروأرس (ChIP-Chip) بتحديد أنماط متغيرة من هيستون H3 lysine 9 (H3K9) و 27 (H3K27) مثيلة لمروجين معينين للجينات في NAc بعد تعاطي الكوكايين المتكرر (6). لذلك قمنا بترديد العديد من methyltransferases lysine (KMTs) و demethylases (KDMs) المعروفة بالتحكم في H3K9 أو H3K27 methylation (الشكل. 1A). أظهر اثنان فقط من الإنزيمات ، وهما G9a و GLP ، التنظيم التناسلي المستمر 24 بعد ساعات من تعاطي الكوكايين المتكرر ، عندما كان التعبير عن كل من الجينين منخفضًا بشكل كبير. لأن G9a و GLP يحفزان على وجه التحديد dimethylation لـ H3K9 (H3K9me2) ، فإن تناقصها من قبل الكوكايين متناسق مع انخفاض المستويات العالمية لـ H3K9me2 eucromatic الملاحظ في هذه النقطة الزمنية (الشكل. 1B). وعلى النقيض من ذلك ، بقيت المستويات العالمية من الميثيل H3K27 المتغاير الهيموغلوبين دون تغيير بسبب التعرض المتكرر للكوكايين (الشكل S1 في دعم المواد عبر الإنترنت). نظرا لمستويات عالية من النشاط التحفيزي على حد سواء المختبر و في الجسم الحي (10) ، شرعنا في إجراء مزيد من التحقيق في الأهمية الوظيفية للقمع G9a بعد التعرض المتكرر للكوكايين في NAc. تم تخفيض مستويات البروتين G9a ، مثل مستويات الحمض الريبوزي المرسال ، بشكل كبير بعد ساعات من تعاطي الكوكايين المتكرر 24 (الشكل. S2). على الرغم من أن تعبير G9a mRNA تم تخفيضه بواسطة 35٪ في NAc ، أظهر التحليل المناعي الكيميائي انخفاضًا أكثر تواضؤًا في 15٪ في مستويات البروتين G9a ، بما يتفق مع الانخفاض الملاحظ في 21٪ في H3K9me2 بعد تعاطي الكوكايين المتكرر (الشكل. 1B). تم أيضًا تنظيم التعبير عن mRNA في G9a mRNA في منطقة الدماغ هذه بواسطة 20٪ بعد تكرار تعاطي الكوكايين ذاتيًا (الشكل. S3).
لتحديد ما إذا كانت التغييرات في H3K9me2 متشابكة مع تغيرات الجينوم على نطاق واسع في التعبير الجيني في NAc ، استخدمنا تحاليل ميكروأري لفحص ملامح التعبير الجيني الناجمة عن جرعة التحدي من الكوكايين في الحيوانات مع أو بدون تاريخ من التعرض للكوكايين السابق (انظر الملحق قوائم الجينات في الجداول S1 – S3). أظهرت الحيوانات التي تلقت الكوكايين المتكرر زيادة كبيرة في التعبير الجيني بعد 1 بعد تحدي الكوكايين بالمقارنة مع الحيوانات المعالجة بشدة (الشكل. 1C). هذا التعبير الجيني المتزايد لا يزال يحدث استجابة لتحدي الكوكايين بعد أسبوع 1 من الانسحاب من الكوكايين المتكرر. تماشياً مع التقارير السابقة ، أظهرت نسبة صغيرة من الجينات (~ 10٪) استجابات النسخ المحسَّنة غير المحسوبة بعد تعاطي الكوكايين المتكرر (الشكل. 1C. بحيرة جدول S1()5). للتحقيق المباشر في دور G9a downregulation في التعبير الجيني المعزز الذي تمت ملاحظته بعد تعاطي الكوكايين المتكرر ، استقبلت الفئران حقن In-NAc من فيروسات الهربس البسيط (HSV) التي تعبر عن GFP أو G9a وتم علاجها بالمحلول الملحي أو الكوكايين المتكرر لتحديد ما إذا كان G9a overexpression كانت كافية لمنع التعزيز المتكرر للكوكايين في التعبير الجيني. من مجموعة من الجينات المنتقاة عشوائياً 12 التي تعرض مستويات عالية من التعبير بعد الكوكايين المتكرر ، لاحظنا أن G9a قللت بشكل كبير من التعبير المعزز عن 50٪ من هذه الجينات (جدول S4).
من أجل تحديد الأحداث الإنتساخية الأولية التي تتوسط للقمع الناجم عن الكوكايين المتكرر للتعبير عن G9a ، قمنا بالتحري عن دور محتمل لـ ΔFosB ، وهو منتج لصق مستقر للغاية للجين المبكر المباشر fosB. يتراكم ΔFosB في NAc بعد التعرض المتكرر للكوكايين ، حيث تم ربطه بزيادة مكافئة الكوكايين (11). Δ يمكن أن يعمل ΔFosB إما كمنشط أو مكبّر للنسخ اعتماداً على الجين المستهدف المعني (3, 5, 6, 12). باستخدام NSE-نقل واكتساب التكنولوجيا × tetOP-ΔFosB الفئران ، حيث يمكن تحفيز التعبير ΔFosB بشكل انتقائي في NAc وطبقة الظهرية من الحيوانات البالغة (13) ، درسنا تأثير التعبير ΔFosB على تنظيم الكوكايين من H3K9me2 و KMTs في NAc. كان overFosB overexpression كافية لخفض مستويات كل من H3K9me2 (الشكل. 1D) و تعبير G9a (الشكل. 1E) ، وبالتالي محاكاة آثار الكوكايين المتكرر. على النقيض من ذلك ، لم يقلل ΔFosB من تعبير GLP في هذه المنطقة الدماغية ، ولم يكن له أي تأثير على SUV39H1 و EZH2 ، وهي الأنزيمات الأساسية لتخليق الأكسجين لـ H3K9 و H3K27 ، على التوالي (الشكل. S4). لتأكيد هذه البيانات باستخدام نظام overFosB overexpression مستقل ، تلقى الفئران البرية wildtype الثنائية داخل NAc الحقن من ناقلات الفيروسات المرتبطة Adeno (AAV) معربا عن إما GFP أو ΔFosB. فرط التعبير عن طريق الفيروسية من ΔFosB انخفض مستويات التعبير G9a في هذه المنطقة في الدماغ (الشكل. 1E).
هذا التنظيم الواضح والمحدّد لـ G9a دفعنا إلى التحقق مما إذا كان تغيير تعبير G9a تحديدًا في الخلايا العصبية NAc ينظم الاستجابات السلوكية للكوكايين. تلقت فئران Wildtype الحقن داخل NAc من ناقلات HSV معربا عن GFP أو G9a وتم تحليلها بعد ذلك باستخدام نموذج تفضيل تفضيل كوكايين غير مشروط ، والذي يوفر مقياسًا غير مباشر لمكافأة الدواء. تم تأكيد الإفراط في التعبير الفيروسي من G9a في الخلايا العصبية NAc بعد اختبار السلوكية (الشكل. 2A). G9a overexpression خفضت بشكل كبير تفضيل الكوكايين مقارنة مع الحيوانات Gexpressing overexpressing (الشكل. 2B) ، وزيادة مستويات H3K9me2 في NAc (الشكل. 2C). Overexpression من متحولة ميتة متحركة من G9a (G9aH1093K) (14) لم يؤثر على تفضيل الكوكايين (الشكل. 2B) ولم تؤثر على مستويات H3K9me2 في هذه المنطقة الدماغية (الشكل. 2C).
لمزيد من الدراسة لدور G9a في التأثيرات السلوكية للكوكايين ، وبشكل أكثر تحديدًا لمحاكاة الكبت المتكرر للكوكايين الناتج عن تعبير G9a في NAc ، البالغ G9aفلوريدا / فلوريدا الفئران (14) استلم حقنات داخل NAc من نواقل AAV معربا عن إعادتها من قبل لجنة المساواة العرقية أو GFP كعنصر تحكم. AOC-CR ضربة قاضية من G9a في NAc ، الذي تم تأكيده المناعيالشكل. S5) ، زيادة كبيرة في آثار الكوكايين في تجارب تكييف مكان وانخفاض مستويات H3K9me2 في NAc (الشكل. 2D ، E). مثبط دوائي متوفر تجاريا من G9a و GLP ، BIX01294 (15-16) ، تم استخدامها للتأكد مما إذا كان تثبيط إنزيم يؤثر بالمثل على الاستجابات السلوكية للكوكايين. وبالفعل ، فإن التثبيط الدوائي لـ G9a و GLP زاد بشكل كبير من تفضيل الكوكايين ونقص H3K9me2 في NAc (Fig. 2F، G).
تعاطي الكوكايين بشكل متكرر يزيد من كثافة العمود الفقري المتشابه على الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة NAc17) ، وهي عملية مرتبطة بالتغيرات الوظيفية في نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic على هذه الخلايا العصبية (18-19) والاستجابات السلوكية الحساسة للدواء (17, 20). وهكذا افترضنا أن خفض نشاط G9a في NAc عن طريق الكوكايين المتكرر قد يتوسط قدرة الكوكايين على تنظيم كثافة العمود الفقري الشجيري لخلايا NAc العصبية. باستخدام كروماتين مناعي (ChIP) مع جسم مضاد لـ G9a ، حددنا العديد من الأهداف الجينية G9a المفترضة في NAc ، والتي كان كل منها متورطًا في اللدونة الشجيرية التي يسببها الكوكايين (الشكل. 3A()20-26). وجدنا أن تناول الكوكايين المتكرر قلل بشكل كبير من ارتباط G9a ، وكذلك بمستويات H3K9me2 ، في هذه المروجين الجيني (الشكل. 3B). وفي المقابل ، قامت إدارة الكوكايين الحادة بتوظيف G9a بسرعة لبعض هذه المروجين الجيني نفسه ، بما يتفق مع زيادة تعبير G9a الذي لوحظ في ساعة NAc 1 بعد تناول جرعة حادة من الكوكايين (الشكل. S6). على الرغم من ارتباط G9a الملزم بمروجين معينين للجينات بالتغييرات في تعبيره ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت مثل هذه الأحداث تتوسطها المستويات العالمية المعدلة من G9a في NAc و / أو بسبب الاختلافات في توظيف G9a بعد التكرار الحاد مقابل تعاطي الكوكايين المتكرر.
بناء على تنظيم G9A للعديد من الجينات المرتبطة باللدونة في NAc ، فحصنا مباشرة ما إذا كان الحفاظ على تعبير G9a في هذه المنطقة الدماغية بعد العلاج المتكرر للكوكايين كافيا لعرقلة تكوين العمود الفقري الشجيري الناجم عن الكوكايين. باستخدام بروتوكول علاج الكوكايين الذي سبق توضيحه لتعزيز تحفيز العمود الفقري الشجيري في NAc (20) ، درسنا كثافة العمود الفقري في الحيوانات التي تم حقنها إما HSV-GFP أو HSV-G9a. بالاتفاق مع النتائج السابقة ، لاحظنا زيادة كبيرة في كثافة العمود الفقري الشجيري في NAc بعد علاج الكوكايين ، وهو التأثير الذي تم منعه بالكامل من خلال overexpression G9a (الشكل. 3C). G9a الإفراط في التعبير وحده لم يكن كافيا لخفض كثافة العمود الفقري شجيري NAc في غياب الكوكايين. لتكملة هذه البيانات ، G9aفلوريدا / فلوريدا حصلت الفئران حقنات داخل -AAc من HSV-CR و تم قياس كثافة العمود الفقري ومقارنة مع الحيوانات التي تتلقى HSV-GFP في غياب الكوكايين. ضربة قاضية للتعبير G9a زيادة كبيرة في كثافة العمود الفقري على الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة NAc (الشكل. 3C).
وبالنظر إلى الأدلة التي تشير إلى أن تنظيم G9a منخفض في NAc بعد تكرار الكوكايين من قبل ΔFosB ، قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كان عامل النسخ هذا مشمولًا بالمثل في تنظيم العمود الفقري المتشابك NAc. على الرغم من أن ΔFosB لم يتم ربطها سابقاً سابقاً بمثل هذه اللدونة الشجيري ، إلا أن العديد من أهدافها ، بما في ذلك Cdk5 ووحدات NFκB ، كانت متورطة (20-23), ويرتبط التعبير المستمر inFOSB في الخلايا العصبية NAc مع زيادة كثافة العمود الفقري الشجيري بعد تكرار العلاج بالكوكايين (27). أولا ، لقد وجدنا أن تحريض ΔFosB في الفئران المحولة للذوبان في غياب الكوكايين ، والتي خفضت G9a وتعديل H3K9me2 (الشكل. 1D ، E) ، انخفض G9a ملزمة للعديد من الجينات ذات الصلة باللدونة ، والتي ثبت أن العديد منها أهداف مباشرة لـ ΔFosB نفسها (الشكل. 3D()3, 6). أظهرنا بعد ذلك أن الإفراط في التعبير الفيروسي لـ ΔFosB في NAc زاد بشكل كبير كثافة العمود الفقري الشجيري تحت الظروف القاعدية ، مماثلة لتلك التي لوحظت بعد تعاطي الكوكايين المتكرر (الشكل. 3E). على العكس من ذلك ، فإن الإفراط في التعبير في NAc لـ ΔJunD ، وهو بروتين متحولة سلبي سائد يعادي نشاط transFosB transcriptional ، قد أعاق قدرة الكوكايين المتكرر على زيادة تكوين العمود الفقري المتشابه في NAc (الشكل. 3C).
ملاحظتنا أن ΔFosB ينظم تعبير G9a في NAc ، وأن ΔFosB و G9a ينظمان بعض الجينات المستهدفة نفسها ، قادنا إلى فحص التفاعلات الأخرى بين ΔFosB و G9a. بعد الكوكايين الحاد ، عندما تم زيادة مستويات G9a ، ملزمة من G9a إلى fosB تم زيادة الجين ، في حين بعد تكرار الكوكايين ، عندما تم إلغاء التعبير G9a ، G9a ملزمة ل fosB تم تخفيض الجين (الشكل. 3A). هذا G9a انخفض ملزمة بعد الكوكايين المتكرر لم يلاحظ ل ج-مكتب الإحصاء الاتحادي، حيث يزداد ارتباط G9a بالكوكايين المتكرر (الشكل. S7). هذا يتفق مع حقيقة أنه ، على عكس fosB, ج-FOS هو المكبوت ، وليس المستحث ، عن طريق التعرض للتهديد المزمنة psychostimulant (5). كان إفراط في الإفراط في إفراز الفئران في الفئران ذات الوزن النتاجي كافياً لخفض ارتباط G9a إلى حد كبير fosb جينة (الشكل. 3D). علاوة على ذلك ، كان إفراز G9a كافيًا للحد من زيادة تعبير ΔFosB بعد تعاطي الكوكايين المتكرر (جدول S4). هذه البيانات تشير إلى حلقة التنظيم الذاتي حيث G9a في البداية تحد من الحث على ΔFosB من قبل إدارة الكوكايين الحاد. ومع ذلك ، نظرًا لأن ΔFOSB يتراكم مع التعرض المتكرر للعقاقير ، فإنه يقمع G9a وبالتالي يزيد من التحريض الإضافي الخاص به.
في الختام ، لقد أثبتنا أن الميثيل هيستون ليزين في NAc ينخرط بشكل حاسم في تنظيم التعبير الجيني العصبوني استجابة للكوكايين. إن كبت G9a و H3K9me2 بعد تعاطي الكوكايين المتكرر يعزز تفضيل الكوكايين ، جزئياً ، من خلال التنشيط النسخي للعديد من الجينات المعروفة بتنظيم أشكال شاذة من اللدونة الشجيري. إن اكتساب فهم أفضل للجينات التي يتم تنظيمها من خلال هذه الآليات سيحسن معرفتنا بالأساس البيولوجي المعقد لإدمان المخدرات ويمكن أن يساعد في تطوير علاجات أكثر فعالية للاضطرابات الإدمانية.
مواد وطرق
الحيوانات والعلاجات
ما لم ينص على خلاف ذلك ، كانت تؤوي الفئران أربعة إلى خمسة في قفص في مستعمرة مع دورة ساعة / الظلام 12 ساعة (أضواء على من 7: 00 AM إلى 7: 00 PM) في درجة حرارة ثابتة (23 ° C) مع libitum الإعلانية الوصول إلى الماء والغذاء. تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل IACUC في كل من مركز UT الجنوبية الغربية الطبي ومدرسة جبل سيناء للطب.
للتجارب الكوكايين [immunohistochemitry ، النشاف الغربي ، PCR الكمي (qPCR) ، تحليل ميكروأري و immunoprecipitation (ChIP)] ، تم استخدام 8- إلى 10-old-old ذكر C57BL / 6J الفئران. تلقت الحيوانات الحقن اليومي إما "المالحة" (علاجات 7 المالحة ، ip) ، الكوكايين "الحاد" (علاجات 6 المالحة + علاج واحد 20 mg / kg cocaine-HCl ، ip) أو الكوكايين "المتكرر" (علاجات 7 20 mg / kg الكوكايين ، حمض الهيدروكلوريك ، IP). تمت التضحية بالفئران في أي ساعة 1 أو ساعة 24 بعد العلاج النهائي. بالنسبة لدراسات ميكروأري ، عولجت الحيوانات يومياً إما بـ "المالحة" (معاملات 15 المالحة ، ip) ، الكوكايين "الحاد" (علاجات 14 المالحة + المعالجة 1 20 mg / kg cocaine-HCl ، ip) ، "الكوكب المتكرر + الحاد" 7 يعالج المحاليل الملحية + علاجات 8 20 mg / kg cocaine-HCl، ip) أو "الكوكتيل المتكرر + الحاد" الكوكايين (علاجات 7 20 mg / kg cocaine-HCl + 7 treatment saline + 1 challenge treatment 20 mg / kg cocaine-HCl، IP) وتمت التضحية بعد 1 ساعة بعد العلاج النهائي. في التجارب السلوكية ، تم إيواء الفئران في مرحلة ما بعد الجراحة وتم علاجها باستخدام 10 mg / kg cocaine-HCl ، ip كما هو موضح أدناه. من أجل تحليل العمود الفقري الشجيري والتحقق من صحة الميكروي بعد إصابتي HSV-GFP و HSV-G9a-GFP ، تمت معالجة الفئران باستخدام "المالحة" (معاملات 5 المالحة ، ip) أو "الكوكايين المتكرر" (علاجات 5 20 mg / kg cocaine-HCl ، ip على مدار أيام 3 ، حيث أن بروتوكول الحقن هذا قد تم إثباته سابقًا لزيادة كثافة العمود الفقري على الخلايا العصبية المتكئة في النواة (NAc) ضمن الإطار الزمني لتعبير فيروس الهربس البسيط (HSV) transgene (المرجع التكميلي S1). تمت التضحية الفئران المستخدمة لتحليل العمود الفقري شجيري 4 ساعات بعد العلاج الأخير.
للحث على الحذف المحلي للنسخة G9a المقيدة إلى الخلايا العصبية NAc ، استخدمنا الفئران متحولة متماثلة اللواقح لأليل G9a floxed ، والتي تم وصفها بالتفصيل في مكان آخر (S2). ينتج اتحاد recombination المستحث بالكريسين exon 22 إلى 25 خارج الربط مما يؤدي إلى تحلل بوساطة غير منطقية من النسخة المتحولة. استخدمنا G9a الفئران floxed التي تم backcrossed بالكامل إلى C57BL / 6J الفئران. تم حقن الفئران في حمض الهيدروكلوريك (NAc) مع ناقلات الفيروسات المرتبطة بـ Adeno (النمط المصلي 2) معربا عن GFP أو Cre-GFP بين عمر 7 و 10 أسابيع. تم استخدام التحليل المناعي الكيميائي للتحقق من كفاءة إعادة التركيب بوساطة كري (انظر التكملة التوضيحية S5). استخدمنا AAV حقن الحيوانات بعد 21 أيام ما بعد الجراحة لأن إعادة التركيب في الفئران العائمة G9a كان مستقرا وأقصى حد في هذه النقطة الزمنية ، بما يتفق مع التقارير المنشورة (S3-S4). تم إجراء تجارب G9a و overJunD overexpression بشكل مشابه باستخدام متجهات فيروس HSV معربًا عن GFP ، wildtype G9a-GFP ، G9aH1093K-GFP أو GXNUMXaHXNUMXK GFP أو ΔJunD-GFP S2 للحصول على تفاصيل تتعلق بتكوين بنيات G9a). تم استخدام الفئران overVpressing HSV أيام 3 بعد الجراحة حيث كان overexpression القصوى في هذه النقطة الزمنية ، كما لوحظ عبر immunohistochemistry. نظرًا للطبيعة العابرة لتعبير HSV ، والطبيعة الأكثر استقرارًا بشكل كبير للتعبير AAV ، تم استخدام نواقل HSV في التجارب التي تتطلب تعبيراً سريعًا وقصير المدى للتحوير ، في حين استخدمت نواقل AAV في التجارب التي تتطلب فترات ممتدة من التعبير عن التحوير. وقد تم عرض كل من النواقل ، في دراسات سابقة واسعة النطاق ، لتصيب فقط أجسام الخلايا العصبية داخل منطقة الدماغ المحقونة ، دون أي عدوى من الخلايا العصبية الداخلة أو الخارجة.
بالنسبة للتجارب السلوكية التي تستخدم مثبط G9a / GLP الدوائية ، BIX01294 (25 ng / μl) ، تم زرع الفئران بطريقة sterotaxically مع اثنين من مضخات صغيرة تحت الجلد ، وكذلك قنية دليل ثنائي ، في NAc. تم تنشيط المضخات المصغرة 12 قبل ساعات من عملية الزرع لبدء التسليم المستمر (0.25 ميكرولتر / ساعة) من أي من المركبات (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) أو المخدرات للأيام 14 ، وخلال ذلك تم إجراء التقييمات السلوكية.
لتجارب overfricion ΔFosB [النشاف الغربي ، qPCR ، و ChIP] ، ذكر NSE-نقل واكتساب التكنولوجيا × tetop-ΔFosB تم استخدام الفئران (10 الأسبوع الماضي) ، حيث في غياب الدوكسيسيكلين المشتقة التتراسيكلين (أسابيع 8 قبالة الدوكسيسيكلين) ، عرضت الحيوانات تعبير قوي مقيد تشكيلية من ΔFosB (S5). تم تأكيد overFosB overexpression في هذه الفئران عن طريق qPCR. لتأكيد النتائج باستخدام NSE-نقل واكتساب التكنولوجيا × tetop-ΔFosB الفئران ، wildtype 8- أسبوع C57BL / 6J من الفئران الذكور تم حقن steracaxically داخل NAc مع ناقلات AAV معربا عن إما GFP أو ΔFosB-GFP. تم استخدام نواقل AAV ، في هذه الحالة ، لضمان التعبير الأقصى لـ ΔFosB في أسابيع ما بعد الجراحة لـ 8 ، مما يسمح بمقارنة مباشرة بين فئران FOSB المرتفعة المصابة بالفيروسات والمتحورة. تم تأكيد الإفراط في التعبير عن الفيروسات باستخدام qPCR في 8 أسابيع بعد الجراحة (تم تشريح اللكمات 15-gauge NAc تحت موقع الحقن). تم التعامل مع AAV-GFP و AAV-ΔFosB-GFP overexpressing الفئران التي لم تكن تستخدم ل qPCR مع المالحة (14 العلاجات المالحة ، الملكية الفكرية) أو الكوكايين المتكرر (14 العلاجات 30 ملغم / كغ من الكوكايين ، HCl ، IP) ابتداء من أسابيع 6 بعد العملية الجراحية. أيام 4 بعد العلاج النهائي ، تم إصلاح العقول مع 4 ٪ بارافورمالدهيد ، مقسمة على vibratome وتستخدم لتحليل العمود الفقري شجيري.
تحليل لطخة غربية
تم أخذ اللكمات NNc قياس 14 من 1 مم المقاطع الاكليلية التي تم الحصول عليها باستخدام مصفوفة الدماغ الماوس الفولاذ المقاوم للصدأ وكانت sonicated في 1 M HEPES تحلل العازلة (1 ٪ SDS) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز. 10-تم أخذ عينات من عينات 30 μg من البروتين الكلي في جل 18٪ SDS. تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF وحضنت بمضاد H3K9me2 (أحادي النسيلة الماوس ، 1: 500) ، anti-β-tubulin (فأرة النسيلة أحادية النسيلة ، 1: 60,000) ، ومكافحة الهيستون H3 (أرنب متعدد النسيلة ، 1: 5,000) ، anti-GFP (يستخدم للتحقق من التعبير الفيروسي المتساوي في الأنسجة المثقبة) (أرنب متعدد النواة ، 1: 1000) ، ومضاد H3K27me3 (أرنب متعدد النترات ، 1: 500) أو الأجسام المضادة لمكافحة الأكتين (أحادي الماوس ، 1: 60,000) طوال الليل في 4 ° C (تم حظر جميع الأغشية في حليب 5٪ أو زلال المصل 5٪ البقري). تم تحضين الأغشية بعد ذلك باستخدام أجسام مضادة ثانوية تحمل اسم البيروكسيديز (1: 15,000-1: 60,000 اعتمادًا على الجسم المضاد الأساسي المستخدم) وتم تصوير العصابات باستخدام طبقة SuperSignal West Dura. تم قياس النطاقات باستخدام NIH Image J Software ، وتم تطبيع النطاقات H3K9me2 إما إلى الأكتين أو β-tubulin وإلى مجموع هيستون H3 للتحكم في التحميل المتساوي. الكوكايين المتكرر لم يكن له تأثير على مستويات الأكتين (الشكل. S8) أو مجموع هيستون 3 (الشكل. S1) في NAc. علاوة على ذلك ، لم يكن لعدوى HSV-G9a-GFP و HSV-G9aH1093K-GFP أي تأثير على المستويات الكلية لـ β-tubulin في NAc (الشكل. S8).
المناعية
تم تخدير الفئران بجرعة قاتلة من هيدرات الكلورال و perfused مع بارافورمالدهيد 4 ٪ قبل أن يتم تحليلها من قبل immunohistochemistry مفردة أو مزدوجة كما هو موضح سابقا (S6). باختصار ، تم تحضين أدمغة ما بعد التثبيت في درجة حرارة الغرفة طوال الليل في السكروز 30٪ قبل أن يتم تجزئتها في 35 μm (تم تجزيء العقول المستخدمة لتحليل العمود الفقري الشجيري على vibratome في أقسام 100 μm في غياب 30٪ سكروز). تم غسل أقسام NAc الحرة العائمة مع 1X PBS ، منعت (3٪ مصل حمار عادي ، 0.1٪ tritonX ، 1X PBS) وحضنت بعد ذلك مع مضادات GFP (polyclonal الدجاج ، 1: 8000) و / أو Anti-G9a (polyclonal أرنب ، 1: 500) الأجسام المضادة في منع الحل. تم تحضين الأقسام التي تم تحليلها للأشواك التغصنية باستخدام أضداد الأرانب المضادة للـ GFP للأرنب في 1: 200. بعد الحضانة الليلية ، تم شطف أقسام NAc مرات 3 لدقائق 10 مع 1X PBS ، متبوعًا بالتحضين مع الأجسام المضادة الثانوية المضاعفة ذات الفلورسنت Cy2 و / أو Cy3 في حل حجب 1X PBS لساعات 2. تم تحضين الأقسام المستخدمة للدراسات المورفولوجية في الأجسام المضادة الثانوية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تم تحقيق التلوين النووي المشترك من خلال احتضان المقاطع في 1X PBS التي تحتوي على DAPI (1: 50,000) لدقائق 10. تم غسلها مرة أخرى المقاطع ، تليها الجفاف الايثانول ويتصاعد مع DPX. تم تصوير جميع المقاطع باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.
عزل الحمض النووي الريبي و qPCR
تم تجانس اللكمات الثنائية NAc قياس 14 في Trizol ومعالجتها وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة RNAesy Micro وأكد التحليل الطيفي أن حصص RNA 260/280 و 260/230 كانت> 1.8. تم بعد ذلك نسخ RNA باستخدام Bio-Rad iScript Kit. تم قياس كمية (كدنا) بواسطة qPCR باستخدام SYBR Green. تم تشغيل كل تفاعل في نسختين أو ثلاث نسخ وتحليله باتباع طريقة ΔΔCt كما هو موصوف سابقًا باستخدام نازعة هيدروجين glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) كعنصر تحكم تطبيع (S7). نرى جدول تكميلي S5 لتسلسل التمهيدي مرنا.
تحليل الحمض النووي ميكروأري
تم استخدام أربع مجموعات (3 متماثلة بيولوجية مستقلة لكل مجموعة) لدراسة ميكروأري ، مجموعها ميكروأرس 12. ساعة 1 بعد الحقنة الأخيرة للكوكايين ، تم قطع رأس الحيوانات بسرعة وتمت إزالة العقول ووضعها على الجليد. تم أخذ التشريح من NAc باستخدام لكمة إبرة 15-gauge وتم تجميدها بسرعة على الثلج الجاف حتى تم استخراج الحمض النووي الريبي. تم تجميع اللكمات الثنائية من أربعة حيوانات لكل نسخة متماثلة ، بإجمالي فئران 12 لكل مجموعة. تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي ، معالجة microarray ، وتحليل البيانات كما هو موضح سابقا (S8). باختصار ، تم عزل RNA وتنقيته كما هو موضح أعلاه وتم فحص جودته باستخدام Agilent's Bioanalyzer. تم إجراء النسخ العكسي والتضخيم ووضع العلامات والتهجين لمصفوفات Illumina MouseWG-6 v2.0 باستخدام الإجراءات القياسية بواسطة ميكروأري الأساسية في UT Southwestern. تم طرح البيانات الأولية في الخلفية وطبيعتها باستخدام برنامج Beadstudio. تم تحليل البيانات الطبيعية باستخدام برنامج GeneSpring وتم إنشاء قوائم الجينات باستخدام معايير أهمية لقطع تغيير بمقدار 1.3 ضعفًا مقترنًا بقطع قيمة p غير صارمة تبلغ p <0.05.
نحافظ على درجة عالية من الثقة في هذه البيانات لعدة أسباب. أولاً ، تم التعامل مع جميع الحيوانات ومعالجتها وقتلها في نفس الوقت ، تحت نفس الظروف. كذلك ، تم إجراء كل معالجة الرنا والمعالج في نفس الوقت. ثانيًا ، أجرينا صفائف ثلاثية وتجمّع العديد من الحيوانات في كل عينة صفيف ، وبالتالي تقليل الاختلافات بسبب التباين الفردي وزيادة القوة الإحصائية (S9). ثالثًا ، يتم التوصية بمعايير تحليل البيانات المستخدمة في دراستنا من قِبل مشروع مراقبة جودة MicroArray ، حيث تم التحقق من صحة هذه المعايير لتوفير درجة عالية من الاستنساخ بين المواقع واستنساخ inter-and inteddedplatform (S10-S11).
بناء ناقلات فيروسية
بسبب قيود حجم إدخال ناقلات الفيروس ، تم تسميتها بتسلسل الترميز لأي نوع wildtype G9a (G9a) أو G9a الميتة (G9aH1093K) بشكل حيادي في pxNUMX + HSV plasmid معربا عن GFP تحت سيطرة المروج البشري المبكر للفيروس المضخم للخلايا (CMV) (G1005a كان حجم الإدراج ~ 9 كيلو بايت ، والذي يتجاوز الحد الأقصى لحجم الإدراج لنواقل AAV-3.96). يقوم المروج IE2 / 4 بتشغيل تعبير G5a. تم تقسيم الأجزاء إلى subcloned إلى picNumX + HSV plasmid عبر عمليات ربط حادة مع Klenow المعاملة PmeI و EcoRI هضمت G9a (من pcDNA1005) و CIP المعاملة p9 + التالية الهضم EcoRI. لإنتاج HSV-ΔJunD-GFP ، تم توليد تسلسل تشفير ΔJunD محاط بمواقع تقييد EcoRI بواسطة PCR باستخدام oligonucleotides أولي يحتوي على موقع EcoRI. ثم تم ربط منتج PCR في موقع EcoRI الخاص بـ p3.1 + vector. تم تحقيق تعبير محلي عن إعادة تكوين الكلور في الخلايا العصبية في NAc عن طريق توصيل الجينات بواسطة الفيروسية باستخدام ناقل AAV كما هو موصوف (S12). تم ملء GFP أو N-terminal N-terminal من GFP إلى كريل إلى متجدد AAV-2 متجه يحتوي على مُحَوِّل CMV مع تسلسل متقبل المتبرع بالتلامس وإشارة poladenylelation. تم تأكيد كل إدخال ناقلات بواسطة تسلسل dideoxy. تم إنتاج ناقلات فيروسية باستخدام طريقة ترنسفكأيشن ثلاثية ، مساعد خالية ، كما هو موضح سابقا (S13). تم تخزين فيروس تنقية في −80 درجة مئوية. تم تقييم الجودة الفيروسية من خلال العدوى المعدية التي تم تقييمها في خلايا HEK293. تم إعداد فيروسات AAV-ΔFosB-GFP بالمثل. بالنسبة لـ HSV-Cre ، كان تعبير Cre هو الدافع من قبل مُرشِح IRES ، على عكس مُعزز IE4 / 5 ، من أجل تقليل تعبير الـ Cre ومنع السمية العصبية (انظر S14 للبناء الفيروسي). في جميع الحالات ، تم التحقق من الإفراط في التعبير عن الفيروسات ، سواء المختبر و في الجسم الحي ، عبر qPCR ، وتم تأكيد فيروسات immunohistochemically لعرض التعبير المقيدة NAc بعد الجراحة.
الجراحة التجسيمية
في ظل الكيتامين (100 ملغ / كغ) / زيلازين (10 ملغ / كغ) التخدير ، تم وضع الفئران في أداة التجسيمي الحيوانات الصغيرة ، وتعرض سطح الجمجمة. تم استخدام ثلاثة وثلاثين إبرة حقنة قياسية لإدخال 0.5 ميكرولتر من الفيروس في NAc بزاوية 10 (AP + 1.6؛ ML + 1.5؛ DV - 4.4) بمعدل 0.1 μl / min. تم السماح للحيوانات التي تلقت حقن HSV بالشفاء خلال الأيام 2 بعد الجراحة ، في حين تم السماح للفئران المستخدمة في الاختبارات السلوكية التي تستقبل نواقل AAV بالتعافي لمدة 20 قبل تعرضها لمكيفات المكان. تتوافق هذه الأوقات مع فترات التعبير الحدودي المرتبط بوساطة الفيروسي كحد أقصى للمتحركين. لضخ BIX01294 ، تم وضع كل من اثنين من المضخات الصغيرة تحت الجلد على ظهر الماوس. تم تحقيق مواضع Cannulae من خلال حفر فتحتين صغيرتين في الجمجمة فوق NAc ، وبتوصيل الكانيولا من bregma (AP + 1.5؛ ML + 1.0؛ DV - 5.4). تم السماح للفئران بالتعافي من الجراحة ل 4 إلى 5 أيام قبل البدء في إجراء تكييف مكان الكوكايين كما هو موضح أدناه.
تفضيل المكان المشروط
تم إجراء إجراء تكييف المكان كما هو موضح سابقًا ، مع التعديلات التالية (S7). باختصار ، بعد 3 أيام من الحقن داخل NAc لـ HSV-G9a-GFP أو HSV-G9aH1093K-GFP أو HSV-GFP ، تم وضع الفئران في غرف التكييف ، والتي تتكون من ثلاث بيئات متميزة. تم استبعاد الفئران التي أظهرت تفضيلًا كبيرًا لأي من غرفتي التكييف من الدراسة (<10٪ من جميع الحيوانات). ثم تم موازنة مجموعات التكييف للتكيف مع أي تحيز للغرفة قد لا يزال موجودًا. في الأيام اللاحقة ، تم حقن الحيوانات بمحلول ملحي وحصرها في غرفة واحدة بعد الظهر لمدة 30 دقيقة ثم حقنها بالكوكايين (10 مجم / كجم ، IP) وحُصرت لمدة 30 دقيقة في الغرفة الأخرى في المساء لمدة يومين (يومين) ملحي واثنين من الكوكايين). في يوم الاختبار ، تم إعادة الفئران إلى الجهاز دون علاج لمدة 2 دقيقة واختبارها لتقييم الجانب الذي تفضله. تم تقييم الاستجابات الحركية للكوكايين عبر فواصل الحزمة في غرف الكوكايين المزدوجة لضمان فعالية العلاج من تعاطي المخدرات. بالنسبة لتجارب AAV و BIX20 CPP ، تم استخدام بروتوكول معدل قليلاً. تم حقن الحيوانات مرة أخرى إما بمحلول ملحي أو كوكايين (01294 مجم / كجم ، IP) وحُصرت في غرف محددة لمدة 10 دقيقة ، ولكن بدلاً من ذلك تم تكييفها مرة واحدة يوميًا لمدة 30 أيام ، يليها الاختبار في اليوم الخامس (تم تكييف الحيوانات في المساء وتناوبت علاجات التكييف). بالنسبة لجميع المجموعات ، تم تقييم الحركة الأساسية استجابة للمحلول الملحي للتأكد من أن الحركة لم تتأثر بالعلاج الفيروسي أو المثبط.
الحقن الذاتي للكوكايين عن طريق الحقن
تم الحصول على فئران المراهقين لونغ إيفانز ، وزنها 230 - 250 ز في بداية التجربة. تم إيواءها في بيئة تتحكم فيها الرطوبة ودرجة الحرارة على دورة ضوء / داكن عكسيًا في ساعة 12 (تضيء المصابيح في 9: 00 am) مع libitum الإعلانية الحصول على الطعام والماء. سمح للجرذان بالتأقلم في بيئتهم الجديدة وتم التعامل معها يوميًا في الأسبوع 1 قبل بدء التجربة. وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعهد الوطني للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام حيوان جبل سيناء. تم تجهيز معدات الإدارة الذاتية مع الأشعة تحت الحمراء لقياس السلوك الحركي. الإدارة الذاتية نفذت كما هو موضح سابقا (S15-S16) مع قسطرة مزروعة في الوريد الوداجي الأيمن تحت تخدير الأيزوفلورين (2.4-2.7٪). تم شطف القسطرة بـ 0.1 مل من محلول ملحي يحتوي على 10 يو هيبارين وأمبيسلين (50 مجم / كجم). بعد أسبوع واحد من التعافي من الجراحة ، بدأ التدريب على الإدارة الذاتية خلال المرحلة المظلمة من دورة الضوء / الظلام. سُمح للحيوانات بالوصول اليومي إلى الكوكايين لمدة 3 ساعات (0.75 مجم / كجم / تسريب) وفقًا لجدول التعزيز بنسبة ثابتة -1 (FR1) ، حيث أدى ضغط ذراع واحد نشط إلى ضخ واحد من الدواء. استقرت الجرذان في تناول الكوكايين بعد 1 أيام (<6٪ اختلاف في معدل الاستجابة على مدى 15 أيام متتالية ، مع استجابة 3٪ على الأقل على الرافعة المعززة). بعد 75 ساعة من جلسة الإدارة الذاتية النهائية ، تم قطع رأس الفئران بسرعة ، وإزالة الأدمغة بسرعة ومعالجتها لعزل الحمض النووي الريبي و qPCR.
مناعي لونين (ChIP)
كانت لكمات NAc الطازجة عبارة عن رابط متصل بالفورمالدهيد وأعدت لشرائح Chip كما هو موضح سابقًا (S17-S18) مع تعديلات طفيفة. باختصار ، تم جمع اللكمات 4 14-gauge NAc لكل حيوان (حيوانات 5 المجمعة لكل عيّنة) ، مرتبطًا مع 1٪ فورمالدهايد ومطفأ بـ 2 M glycine قبل التجميد عند −80 ° C. يوم 1 السابق لأخذ صوتنة للأصوات ، والأغنام المضادة للأرانب / الفأر (اعتمادا على الأجسام المضادة لهطول الأمطار) تم إعداد حبات IgG المغناطيسية من خلال احتضان حبات مغناطيسية مناسبة إما مع G9a المضادة (الصف Chips polyclonal أرنب) أو anti-H3K9me2 (درجة الرقاقة أحادية النسيلة الفأر) الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية تحت دوران مستمر في حل كتلة. تم إجراء قطع صوتية للنيون وقص الكروماتين كما تم وصفه سابقا (S17). بعد الصوتنة ، تم نقل تركيزات متساوية من الكروماتين إلى أنابيب جديدة وتم حفظ ~ 5٪ من المنتجات النهائية لتكون بمثابة ضوابط 'المدخلات'. بعد الغسل الكامل وإعادة تركيب الخلائط / الأجسام المضادة المترافقة ، تمت إضافة كميات متساوية من مضادات الأجسام المضادة / الخرز (~ 7.5 antg الأجسام المضادة / العينات) لكل عينة من الكروماتين وحضنت لمدة 10 ساعات 16 تحت دوران ثابت عند 4 ° C. تم غسل المزيد من العينات وعكس ربطها عبر 65 ° C خلال الليل قبل تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية PCR. بعد تنقية الحمض النووي ، تم إخضاع العينات لـ qPCR وتم تطبيعها إلى ضوابط "الإدخال" المناسبة كما هو موضح سابقًا (S17). وأجريت أيضا الفحوص المناعية IgG الفئران العادية باستخدام الأجسام المضادة المضاد IgG الفئران للسيطرة على لالإثراء المناسب لتضخيم إشارة. تم استخدام فوسفوريبوزيل ترانسفيراز الأدينين (APRT) كعنصر تحكم سلبي لتجارب الكوكايين وفوسبريبوسول. نرى الجدول التكميلي S5 للمتسلسل التمهيدي المروج.
تحليل العمود الفقري شجيري
لدراسة دور G9a في تنظيم مورفولوجيا الخلايا العصبية في الجسم الحي ، استخدمنا الطرق التي سبق وصفها مع التعديلات التالية (S1). بعد ثلاثة أيام من حقن HSV-GFP ، HSV-G9a-GFP ، HSV-ΔJunD-GFP (تم استخدام جميع الفيروسات في فئران wildtype C57Bl / 6J) أو HSV-Cre-GFP (المستخدم في G9aفلوريدا / فلوريدا الفئران) ، عندما كان التعبير الفيروسي الأقصى ، تم perfused الفئران ، تم cryoprotected العقول ومقطعة في وقت لاحق في 100 μm على vibratome. ثم تم حجب الأقسام باستخدام جسم مضاد ضد GFP كما هو موضح أعلاه (انظر المناعية). لتقييم آثار G9a overexpression و knockout على أرقام العمود الفقري ، بالإضافة إلى تأثير overJDD overexpression ، قمنا بقياس عدد الفقرات على 1-2 neurites تقريبًا لكل خلية عصبية تعادل على الأقل 299 ofm من التشعبات الثانوية من GFP-expressing NAc medium الخلايا العصبية الشوكية (ام اس ان). وبالنظر إلى أن إم إس إنس تختلف بشكل مورفولوجي عن المجموعات العصبية الأخرى في NAc ، بالإضافة إلى التقارير السابقة التي تشير إلى أن فيروس HSV يصيب DARPP-32 بشكل أساسي معربا عن العصبونات في هذه المنطقة الدماغية (S19) ، نحن واثقون من أن MSN تم تقييمها بشكل حصري في هذه الدراسات. بالنسبة لكل حيوان ، فحصنا ~ 6-8 neurons في 3-4 الحيوانات لكل مجموعة (مجموعات 7) ، وبعد ذلك تم الحصول على قيمة متوسطة لكل حيوان للتحليل الإحصائي. تم تنفيذ التجارب المصممة لفحص تأثيرات زيادة إفراز ΔFosB على كثافة عمود العمود الفقري NAc على نحو مشابه لتلك المذكورة أعلاه ، باستثناء أنه تم استخدام نواقل AAV للتعبير عن GFP أو ΔFosB-GFP لفترات طويلة من الزمن (أسابيع 8). تم التقاط جميع صور HSV باستخدام مجهر متحد البؤر مع هدف غمر الزيت 100X (تم التقاط صور AAV باستخدام هدف غمر 63X). تم الحصول على الصور باستخدام الثقب الموجود في وحدة 1 التعسفية وحجم إطار 1024 × 1024. تم قياس طول شجيري باستخدام برنامج NIH Image J ، وتم حساب أعداد العمود الفقري من قبل المجرب الأساسي ، حيث تم ترميز الشرائح قبل المسح التجريبي. تم حساب متوسط عدد الأشواك لكل 10 ofm من dendrite.
تحليل احصائي
أجريت اختبارات ANOVA ذات الاتجاه الواحد أو الاتجاهين لتحديد الأهمية لتفضيل المكان المشروط وتحليل العمود الفقري الشجيري بأكثر من مجموعتين. تم استخدام اختبارات t للطلاب لإجراء مقارنات أخرى بما في ذلك qPCR ، والنبض الغربي ، وتحليل العمود الفقري الشجيري مقارنة HSV-GFP بـ HSV-CR في G9aفلوريدا / فلوريدا الفئران ، تحليلات ميكروأري (انظر أعلاه) وتجارب الكروماتين المناعي. تم استخدام اختبارات t للطالب المخطط لها بعد تحليل ANOVA ثنائي الاتجاه لكثافة العمود الفقري الشجيري بعد إفراط FosB مع تأكيد التأثيرات الرئيسية الهامة للعلاج الدوائي والفيروسات. تمثل جميع القيم المدرجة في وسيلة إيضاح الشكل المتوسط ± SEM (* p ≤ 0.05 ؛ ** p <0.001). تحليلات إحصائية مفصلة لـ تين. 1-3 في النص الرئيسي ترد في: أساطير شخصية مفصلة بما في ذلك الإحصاءات.
الحواشي
أشهد أن أيا من المواد المدرجة ضمن المخطوطة بعنوان الدور الأساسي للهيتون Methyltransferase G9a في اللدونة الناجم عن الكوكايين سبق نشرها أو هي قيد النظر في مكان آخر ، بما في ذلك على الإنترنت.
تم تنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC والمؤسسي في كل من جامعة تكساس مركز جنوب غرب الطبية ومدرسة جبل سيناء للطب.
المراجع والملاحظات
;