Proc Natl Acad Sci US A. 2005 February 1؛ 102(5): 1737-1742.
ملخص
الكوكايين ، عقار تعاطي ، يزيد من مستويات الدوبامين المشبكية في المخطط عن طريق منع امتصاص الدوبامين في المحطات المحورية. تم العثور على كيناز 5 المعتمد على Cyclin (Cdk5) و المنشط p35 ، البروتينات التي تشارك في فسفرة ركائز في الخلايا العصبية ما بعد الصدمة ، إلى أن ينظم بعد التعرض المزمن للكوكايين. لمزيد من دراسة آثار Cdk5 وتحريض p35 على إشارات الدوبامين المخطط لها ، أنشأنا خطين منفصلين جينيا مستقلين تم فيه التعبير عن Cdk5 أو p35 بشكل خاص في الخلايا العصبية. نبلغ هنا أن زيادة نشاط Cdk5 ، كنتيجة p35 ولكن ليس من overexpression Cdk5 ، يؤدي إلى توهين إشارات الدوبامين بوساطة الكوكايين. ترافق زيادة الفسفرة Cdk5 بوساطة الدوبامين و phosphoprotein الخاضع للتنظيم ، الكتلة الجزيئية 32 kDa (DARPP-32) في Thr-75 ، مع انخفاض فسفرة DARPP-32 في Thr-34. إن زيادة فسفرة Cdk5 بوساطة الكيناز الخاضع للتنظيم الإشعاعي من كيناز 1 في Thr-286 كان مصحوبا بانخفاض تنشيط الكيناز الخاضع للتنظيم الإشعاعي 1 / 2. ساهمت هذه التأثيرات في تخفيف الفسفرة التي يسببها الكوكايين من بروتين ربط عنصر الاستجابة لـ cAMP بالإضافة إلى تحريض أقل لـ c-fos في المخطط المخطط. هذه النتائج تدعم فكرة أن نشاط Cdk5 يشارك في التعبير الجيني المتغير بعد التعرض المزمن للكوكايين ، وبالتالي يؤثر على التغيرات طويلة الأمد في الوظيفة العصبية الكامنة وراء إدمان الكوكايين.
يزيد الكوكايين مستويات الدوبامين المشبكي في المخطط ويغير التعبير الجيني في الخلايا العصبية الدوبامينية المفترسة عن طريق تنشيط المسارات داخل الخلايا التي تنشر الإشارة الأولية من مستقبل الدوبامين دي إكس إن إكس إلى النواة (1). يؤدي التعرض المزمن للكوكايين إلى تنظيم العديد من عوامل الانتساخ ، مما يؤدي إلى تغيرات طويلة الأمد في التعبير الجيني يُعتقد أنها تشكل تكيفًا عصبيًا في إدمان الكوكايين (2). ΔFosB ، التي تم تحديدها على أنها عامل النسخ (مثل3) ، وقد ثبت لتعزيز الاستجابة السلوكية للحيوانات إلى الكوكايين (4, 5). لذلك ، من المتوقع أن يسهم التعرف على الجينات المستهدفة التي ينظمها تحريض ΔFOSB في زيادة فهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء إدمان الكوكايين. في الآونة الأخيرة ، تبين أن المعالجة المزمنة للحيوانات مع الكوكايين تزيد من تنظيم التعبير عن كيناز XC-CX المعتمد على Cyclin (Cdk5) ومنشطه p5 في المخطط من خلال تحريض ΔFosB (6, 7).
Cdk5 هو عضو في عائلة Cdk من kinases سيرين / ثريونين. خلافا لغيرها من Cdks التي هي المنظمين الرئيسيين للتقدم دورة الخلية ، Cdk5 تشارك أساسا في الفسفرة من ركائز في الخلايا العصبية postmitotic (8). يتم تحقيق خصوصية النشاط العصبي لنشاط Cdk5 من خلال الارتباط مع منشطاته ، إما p35 أو p39 ، والتي يتم التعبير عنها في الغالب في الخلايا العصبية postuvotic (8). بالإضافة إلى الدور الأساسي لـ Cdk5 في تطوير الدماغ (9, 10) ، أناوقد تورط أيضا في انتقال الدوبامين في الدماغ بعد الولادة (11, 12). يؤدي تثبيط نشاط Cdk5 إلى زيادة إفراز الدوبامين في المخطط ، مما يشير إلى وظيفة ما قبل المشبكي لـ Cdk5 كمنظم سلبي لإطلاق الدوبامين. (11). علاوة على ذلك ، يقوم Cdk5 بتحوير فعالية إشارات الدوبامين ما بعد المشبكي عن طريق phophorylating phosphoprotein dopamine و cAMP ، الكتل الجزيئية 32 kDa (DARPP-32) في Thr-75 ، الذي يحول DARPP-32 إلى مثبط لـ kinase المعتمد على cAMP (PKA) (12).
وتشير هذه الملاحظات إلى أن Cdk5 و p35 هما منظمي تيار المصب للتفعيل لفترات طويلة من إشارات الدوبامين بعد التعرض المزمن للكوكايين ومن ثم في إدمان الكوكايين. لمزيد من معالجة دور Cdk5 على إشارات الدوبامين المخطط لها ، قمنا بتوليد اثنين من خطوط الفأر المعدلة وراثيا التي تم التعبير عنها بشكل مفرط إما Cdk5 أو p35 على وجه التحديد في الخلايا العصبية تحت سيطرة المروج p35. أشارت النتائج التي توصلنا إليها إلى أن نشاط Cdk5 قد تم تنظيمه مع زيادة مستويات بروتين p35 ولكن ليس بروتين Cdk5 ، مما يشير إلى أن مستوى البروتين p35 يحد من معدل نشاط Cdk5. نحن نقدم هنا في الجسم الحي الدليل على أن زيادة نشاط Cdk5 ، نتيجة لزيادة إفراز p35 ، يؤدي إلى توهين إشارات الدوبامين بوساطة الكوكايين إلى النواة من خلال تثبيط PKA وشلالات كيناز (ERK) الخاضعة للتنظيم خارج الخلية.
مواد وطرق
الأجسام المضادة. تم شراء الأجسام المضادة المتعددة النسيلة إلى Cdk5 (C-8) و p35 (C-19) من التكنولوجيا الحيوية لسانتا كروز. تم الحصول على الأجسام المضادة المعتمدة على الفسفرة والمستقلة إلى ERK kinase (MEK) 1 / 2 ، ERK1 / 2 ، وبروتين ربط عنصر الاستجابة لـ CAMP (CREB) من تقنية تشوير الخلية (Beverly، MA). الأجسام المضادة لالفوسفات- Thr-34 DARPP 32 (13) ، phospho-Thr-75 DARPP-32 (12) ، إجمالي DARPP-32 (12) و c-fos (14) كانت تستخدم كما هو موضح. تم شراؤها من الأجسام المضادة لأكتين من سيجما.
حيوانات تجريبية. نحن في وقت سابق استنساخ الجين p35 الماوس Cdk5r1والذي يشفر بروتين p35 ويميز تركيبه الجيني15). لتوليد الفأرة المعدلة وراثيا مع overexpression الخلايا العصبية من p35 (Tgp35) ، و 6-kb بيئةRI-بيئةتم تسطير جزء RI الذي يحتوي على منطقة المحفز 1.2-kb في pGEM9Z (-) plasmid ، وتم إدراج علامة 45-bp المشتقة من SV40 في كبنأنا موقع المصب من بولي (A+) إشارة (التين 1A). العلامة احتوت جمعية مهندسي البترولأنا الموقع من أجل التنميط الجيني للحيوانات. تم استئصال جزء 6-kb من البلازميد وتنقيته ، متبوعًا بالحقن النافذ للجينات المعدلة وراثياً لتوليد الفئران المحورة جينيا. لفحص ملف تعريف التعبير لل transgene تحت التحكم التنظيمي لمحفز 1.2-kb p35 في الجسم الحي، تم إنشاء مزيد من الفأر المعدلة وراثيا مزدوجة (Tgp35 ، p35 - / -) باستخدام استراتيجية تربية من خطوتين التي تم إعادة إنشاء الماوس Tgp35 في خلفية p35- خالية باطل. تضمنت نماذج الماوس الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة p35 +/– و p35 - / - و Cdk5 +/– ، والفأر المعدّل وراثيًا مع زيادة إفراز الأعصاب لـ Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). تم تحديد الطرز الوراثية من هذه الفئران عن طريق إجراء إما تحليل لطخة جنوب أو PCR على الحمض النووي الجيني المعزولة من الخزعات الذيل. كانت تؤوي الفئران تحت دورة الظلام 12-h / 12-h الظلام. تم تقديم كل الرعاية وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتجريبية.
تحليل لطخة الجنوبية. تم هضم الحمض النووي الجيني المستخرج من الخزعات الذيلية مع بيئةRI و جمعية مهندسي البترولأنا ، electrophoresed على هلام agarose 0.9 ٪ ، ونقلها إلى غشاء من النايلون. تم تهجين الغشاء مع عشوائية 32مسبار P المسمى في 42 ° C بين عشية وضحاها. تم إنشاء مسبار 485-bp للتشكيل الوراثي للجرعات p35 القاضية (p35 - / -) و Tgp35 بواسطة PCR باستخدام البرايمرات التالية: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 ′ و 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3 ′. تم غسل الغشاء المهجن مرتين في 2 × SSC / 0.1٪ SDS عند 42 ° C لـ 10 min ، ومرتين في 0.1 × SSC / 0.1٪ SDS عند 65 ° C لـ 20 min ، وعرضهما لفيلم الأشعة السينية.
العلاج من الإدمان. تم حل الكوكايين (Sigma) في محلول ملحي معقم. تم حقن الحيوانات بالحقن IP مع الكوكايين (15 mg / kg) أو حجم مساوٍ للمحلول الملحي في عمر 3 من الأشهر وتوفي بواسطة قطع الرأس في نقاط زمنية مختلفة (15 و 30 و 60 و 120 min) بعد الحقن. تمت إزالة العقول بسرعة وبرود في PBS الجليد الباردة. تم بعد ذلك تقسيم المخطط ثم إخضاعه لتحليل اللطخة الشمالية أو الغربية. للتحليل المناعي الكيميائي ، تم الحصول على أقسام المخطط من الفئران 2 h بعد الحقن.
تحليل لطخة الشمالية. تم استخلاص مجموع الحمض النووي الريبي من المخطط مع كاشف TRIzol (Invitrogen Life Technologies ، Carlsbad ، CA) وتعرض لتحليل لطخة الشمالية كما هو موضح (18). للكشف عن mRNA c-fos ، تم استخدام جزء 189-bp من الماوس c-fos cDNA كمسبار كما هو موضح (19). تم قياس مستويات c-fos mRNA عن طريق قياس الكثافة البصرية للنطاق المحدد باستخدام نظام تحليل الصور باستخدام برنامج nih image ، الإصدار 1.62.
تحليل لطخة غربية. كانت sentalated الأنسجة striatal في 1 ٪ SDS والمغلي ل 10 دقيقة. تم تحديد تركيز البروتين في كل عينة من قبل فحص البروتين BCA (بيرس). تم فصل كميات متساوية من البروتين بواسطة SDS / PAGE قبل نقلها إلى غشاء نيتروسليلوز. تم حظر الأغشية في 1 × PBS الذي يحتوي على 5٪ من الحليب الخالي من الدسم و 0.05٪ Tween 20 وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية خلال الليل في 4 ° C. تم إجراء التحضين مع بيروكسيداز-مترافق مكافحة الماوس أو أرنب IgG (سيغما) في درجة حرارة الغرفة ل 60 دقيقة. تم الكشف عن إشارة من خلال الانصهار الكيميائي المحسّن (بيرس) ، وتم تحديد الكثافات البصرية للنطاقات كما هو موصوف أعلاه.
Cdk5 Kinase Assay. أعدت lysates stillatal مع عازلة تحلل تتكون من 50 mM Tris · حمض الهيدروكلوريك ، pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1٪ Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / مل leupeptin / مثبطات الفوسفاتيز (خليط مانع الفوسفاتيز الأول والثاني ، سيغما). تم امتصاص lysates immunoprecipitated إما مع anti-Cdk5 (C-8) أو anti-p35 (C-19) الأجسام المضادة. تم تحضير Cdk5 immunoprecipitates بواسطة احتضان 300 ofl من lysate (المقابل لـ 300 μg من البروتين) مع الأجسام المضادة لـ Cdk5 (3 μg) طوال الليل عند 4 ° C متبوعاً بمزيد من الحضانة مع 25 μl من بروتين A-agarose beads (50 ٪ من الطين في محلول التحلل ؛ تقنية سانتا كروز الحيوية) لـ 3 h عند 4 ° C. تم تحضير 35 ofl من lysate (الموافق 500 ملغ من البروتين) مع الأجسام المضادة لـ p1 (35 μg) كما تم وصفه أعلاه من أجل تحضير pnxmumx immunoprecipitates. تم غسل الغسالات المناعية مرتين مع المخزن المؤقت المحلل ومرتين مع مخزن مؤقت كيناز يتكون من 3 mM Tris · HCl، pH 50 / 7.4 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT ، معلق في 60 ofl من مخزن مؤقت kinase. تم قياس نشاط كيناز باستخدام هيستون H1 كركيزة (18).
المناعية. تم تخدير الفئران عن طريق حقن IP من Avertin (250 mg / kg، Fluka) و perfused transcardially مع 0.1 M فوسفات الصوديوم العازلة، pH 7.4، متبوعًا بـ Streck Tissue Fixative (Streck Laboratories، La Vista، NE) ، وهو مثبت لا يشابك. تم إصلاح مزيد من العقول تشريح في نفس ليلة وضحاها مثبت في 37 درجة مئوية. ثم ، تم تضمين العقول في البارافين ، مقطعة إلى أقسام إكليلية 5--m سميكة وتعرض للكيمياء المناعية عن طريق استخدام تقنية معقدة أفيدين البيوتين بيروكسيداز (Vector Laboratories) مع diaminobenzidine كركيزة. تم تحضين الأجزاء باستخدام جسم مضاد متعدد الألفة متقارب مضاد ضد f-fos أثناء الليل في 4 ° C. تم تقييم خصوصية تلطيخ عن طريق إغفال الأجسام المضادة الأولية.
النتائج
جيل من الفئران المعدلة وراثيا مع Overwellpression من الخلايا العصبية من p35. يتألف المتحولة المستخدمة لتحقيق زيادة في التعبير العصبوني لـ p35 من جزء 6-kb لجين p35 الفأري المستنسخ الذي يحتوي على محفز 1.2-kb وتسلسل التشفير الكامل لـ p35 (التين 1 A). تم تحديد الأنماط الجينية للفئران بواسطة تحليل لطخة جنوب باستخدام مسبار تم تصميمه لتمييز p35 - / - و Tgp35 الفئران من الفئران من النوع البري (التين 1 A و B). لفحص تعبير transgene تحت سيطرة المروج 1.2-kb p35 ، قمنا بإنشاء فئران معدلة جينيا مزدوجة (Tgp35 ؛ p35 - / -) حيث كان يتم نقل تعبير p35 فقط من الجينات المحورة. تم ملاحظة تعبير p35 في Tgp35 ؛ p35 - / - الفئران فقط في الدماغ (التين 1C) ، حيث كان نمط التعبير المكاني مشابهًا لنمط الفئران البرية (التين 1D). وقد تبين عدم وجود p35 يؤدي إلى بنية طبقات غير طبيعية في القشرة الدماغية وفرس في قرن آمون من الفئران (10). ومع ذلك ، أظهرت Tgp35 ؛ p35 - / - الفئران انقاذ كامل من النمط الظاهري p35 - / - الدماغ (التين 1E). أشارت هذه البيانات إلى أن مُحَفِز p1.2 35-kb يسيطر على التعبير عن الجينات المحورة بمظهر تعبير مشابه لصورة p35 من جين p35 الداخلي.
مستوى البروتين p35 هو الحد من المعدل لأعلى تنظيم نشاط Cdk5. قمنا بفحص تأثيرات الجينات الجينية للجينات المشفرة p35 و Cdk5 على تعبير البروتين في المستخلصات المخططة من p35 - / - ، p35 +/– ، النوع البري ، Tgp35 ، Cdk5 +/– ، والفئران TgCdk5 في عمر 3 أشهر. ترتبط مستويات p35 وبروتين Cdk5 بشكل جيد مع جرعات الجينات ، على التوالي (التين 2 A و B). وأظهرت الفئران Tgp35 زيادة ≈1.6 أضعاف في مستوى البروتين p35 مقارنة مع الفئران من النوع البري ، في حين أن مستويات البروتين Cdk5 لم تتأثر مستويات مختلفة من البروتين p35. وأظهرت الفئران TgCdk5 زيادة ≈1.9 طية في مستوى البروتين Cdk5 بالمقارنة مع الفئران من النوع البري ، في حين كانت مستويات البروتين p35 تتأثر مستويات مختلفة من البروتين Cdk5. لفحص تأثيرات كميات مختلفة من بروتين p35 على نشاط Cdk5 ، تم امتصاص Cdk5 من المستخلصات المخططة مع الأجسام المضادة لـ Cdk5 وتم قياس نشاط كيناز. وبالمثل ، لفحص تأثيرات كميات مختلفة من بروتين Cdk5 على نشاط كيناز ، تم امتصاص p35 من المستخلصات المخططة مع الأجسام المضادة لـ p35 ، وتم قياس نشاط كيناز. يرتبط نشاط Cdk5 بشكل جيد مع مستوى البروتين p35 ولكن ليس بمستوى البروتين Cdk5 (التين 2 C و D). هذه النتائج تشير إلى أن كمية البروتين p35 هو عامل يحد من معدل نشاط Cdk5. ولذلك استخدمنا الفئران Tgp35 للتحقيق في آثار زيادة نشاط Cdk5 على إشارات الدوبامين المخطط لها.
يتم تخفيف الفسفرة التي يسببها الكوكايين من DARPP-32 عند Thr-34 في الفئران Tgp35. تعتمد وظيفة DARPP-32 على حالة فسفرة في مواقع متعددة (20). PKA phosphorylates DARPP-32 في Thr-34 ، بينما Cdk5 phosphorylates DARPP-32 at Thr-75. وبالتالي ، درسنا حالة الفسفرة من DARPP-32 في مقتطفات مخطط من الفئران البرية من نوع و Tgp35. كان مستوى phospho-Thr-75 DARPP-32 أعلى في الفئران Tgp35 (التين 3A. 1.6 ± 0.2-fold أعلى قيمة الفئران من النوع البري). قمنا بعد ذلك بتقييم آثار زيادة نشاط Cdk5 على إشارات الدوبامين المخطط لها. فحصنا تفعيل PKA الذي يسببه الكوكايين في الفئران Tgp35 من خلال تحليل حالة الفسفرة من DARPP-32 في Thr-34. تم زيادة مستوى phospho-Thr-34 DARPP-32 في الفئران من النوع البري 15 دقيقة بعد حقن الكوكايين (التين 3B. 1.8 ± 0.2-fold أعلى المستوى الأساسي). ومع ذلك ، تم تخفيف تأثير الكوكايين على فسفرة Thr-34 من DARPP-32 في الفئران Tgp35 (1.2 ± 0.3-fold فوق المستوى الأساسي). أشارت هذه النتائج إلى أن زيادة نشاط Cdk5 خففت من تفعيل PKA المستحث بواسطة الكوكايين على الأرجح من خلال فسفرة DARPP-32 في Thr-75 (6, 12). ومن الممكن أيضًا أن تؤدي زيادة نشاط Cdk5 قبل المشبكي إلى انخفاض إفراز الدوبامين ، وأن هذا يساهم في تقليل تأثير الكوكايين. والجدير بالذكر أن حقنة واحدة من الكوكايين لم تؤثر على مستويات p35 وبروتين Cdk5 بالإضافة إلى نشاط كيناز (التين 3 C و D). وهذا على النقيض من دراسة سابقة تبين أن التعرض المزمن للكوكايين قد زاد من تنظيم التعبير عن p35 و Cdk5 (6).
رفع ترتيب نشاط Cdk5 يضعف التنشيط الناجم عن الكوكايين لـ ERK1 / 2. تشير الدلائل الحديثة إلى أن تفعيل مستقبلات الدوبامين في المخطط المخطط ينشط أيضًا مجموعات إشارات أخرى ، بما في ذلك مسار ERK (21, 22) ، التي لها دور مهم في الاستجابة السلوكية للكوكايين (23). لذلك قمنا بفحص ما إذا كان نشاط Cdk5 قد يؤثر على تنشيط مسار ERK المستحث بالكوكايين. تمت ملاحظة تفعيل مسار ERK بعد حقن الكوكايين في المستخلصات المخططة من الفئران البرية من النوع ، كما يتضح من زيادة الفسفرة من MEK1 / 2 في Ser-217 و Ser-221 (1.5 ± 0.2-fold فوق المستوى الأساسي) و ERK1 / 2 عند Thr-202 و Tyr-204 (ERK2 phosphorylation: 1.5 ± 0.2-fold فوق المستوى الأساسي)التين 4 A و B). ومع ذلك ، تم تنشيط التنشيط الناجم عن الكوكايين من MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-fold فوق المستوى الأساسي) و ERK1 / 2 (ERK2 phosphorylation: 1.2 ± 0.2-fold فوق المستوى الأساسي) في الفئران Tgp35 (التين 4 A و B). علاوة على ذلك ، كانت المستويات القاعدية لـ phospho-ERK1 / 2 أقل في فئران Tgp35 (0.8 ± 0.2-fold أدنى من قيمة الفئران البرية) ، في حين أن هذا الاتجاه لم يكن ذو دلالة إحصائية. قد تعزى هذه النتيجة الأخيرة إلى الفسفرة المعتمدة على Cdk5 من MEK1 في Thr-286 ، مما يؤدي إلى انخفاض النشاط التحفيزي (24). لتقييم هذا الاحتمال ، قمنا بفحص حالة الفسفرة من MEK1 في Thr-286 ووجدنا أن مستويات أعلى من phospho-Thr-286 MEK1 كانت موجودة في المقتطفات المخططة من فئران Tgp35 (التين 4C. 1.3 ± 0.1-fold أعلى قيمة الفئران من النوع البري). علاوة على ذلك ، لم يتم تغيير حالة الفسفرة من MEK1 في Thr-286 عن طريق حقنة واحدة من الكوكايين ، بما يتفق مع النتيجة أن نشاط Cdk5 لم يتأثر بالعلاج (التين 3D).
يتم تخفيف انتشار إشارات الدوبامين إلى النواة من خلال زيادة نشاط Cdk5. يؤدي التنشيط الناجم عن الكوكايين لعدة أجهزة إرسال إشارات تتضمن PKA و ERK إلى تفعيل عامل النسخ CREB في النواة لاحقًا من خلال فسفرة في Ser-133 (22, 25). وللتحقق مما إذا كانت التأثيرات المثبطة بوساطة Cdk5 على شفرتي تنشيط PKA و ERK قد تتلاقى مع فسفرة CREB في النواة ، فقد فحصنا حالة الفسفرة لـ CREB في Ser-133 في المستخلصات المخططة من الفئران البرية من النوع Tgp35. كان المستوى الأساسي للفوسفات CREB أقل في الفئران Tgp35 (0.7 ± 0.1-fold من قيمة الفئران من النوع البري) (التين 5). استجابة لحقن الكوكايين ، تم زيادة مستوى الفوسفو CREB في مخطط الفئران من النوع البري (1.5 ± 0.1-fold فوق المستوى القاعدي) ، ولكن هذه الاستجابة للكوكايين كانت ضعيفة في الفئران Tgp35 (1.2 ± 0.1- أضعاف فوق المستوى القاعدي) (التين 5).
تزيد فسفرة CREB في Ser-133 نشاطه النسخي من خلال عنصر استجابة cAMP في منطقة المحفز لجينات معينة ، بما في ذلك الجين c-fos (26). ولذلك درسنا تحريض c-fos في المخطط من الفئران البرية من نوع Tgp35 بعد حقن الكوكايين. في الفئران من النوع البري ، ارتفع مستوى c-fos mRNA إلى قيمة ذروة (1.8 ± 0.2-fold فوق المستوى الأساسي) 30 دقيقة بعد حقن الكوكايين ، ثم عاد إلى المستوى القاعدي بواسطة 120 دقيقة بعد الحقن (التين 6 A و B). ومع ذلك ، كانت مستويات c-fos mRNA أقل بـ ≈30٪ في فئران Tgp35 من الفئران ذات النوع البري حتى وصول 30 بعد الحقن (التين 6 A و B). تم تأكيد تحريض أقل من ف-ج في فئران Tgp35 من قبل immunohistochemistry (التين 6 C-F). أدى تعاطي الكوكايين إلى زيادة فاعلية الـ c-fos ، في الأجزاء الظهارية dorsomedial dorsocentral من المخطط المخطط وضعفًا في الأجزاء الجانبية ، في كل من النوع البري والفئران Tgp35. ومع ذلك ، فقد لوحظت الزيادة التي يسببها الكوكايين في عدد خلايا c-fos-immunopositive بشكل ملحوظ في مخطط Tgp35 الفئران (التين 6G). وقد أشارت هذه النتائج مجتمعة إلى أن تثبيط تعاطي الدوبامين المخطط إلى نواة الكوكايين قد تم تثبيطه في فئران Tgp35 ، وهي نتيجة محتملة لزيادة نشاط Cdk5.
مناقشة
وقد تم تحديد Cdk5 والمنشط p35 على أنها جينات مستهدفة يتم تنظيمها من خلال التعرض المزمن للكوكايين. (6). نحن نورد هنا أدلة على أن زيادة نشاط Cdk5 ، كنتيجة للتنظيم التصاعدي لـ p35 بدلاً من تنظيم Cdk5 التصاعدي ، يؤدي إلى توهين إشارات الدوبامين بوساطة الكوكايين في الخلايا العصبية المخطط لها. لفحص النتائج المترتبة على تعبير منظم من Cdk5 أو p35 على إشارة الدوبامين المخطط لها ، تم تحليل اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا ، TgCdk5 و Tgp35 الفئران. لقد وجدنا أن نشاط Cdk5 قد تم تنظيمه بشكل يتناسب مع زيادة مستوى البروتين p35 ولكن لم يتأثر بمستوى متزايد من بروتين Cdk5. كما أظهر تقريرنا السابق أيضًا أن نشاط Cdk5 في دماغ فأر TgCdk5 كان أقل من نشاط دماغ الفئران من النوع البري عندما تم قياس النشاط باستخدام Cdk5 immunoprecipitates (17) ، مما يشير إلى أن الإفراط في التعبير عن Cdk5 يؤدي إلى زيادة مستوى Cdk5 مونومري إذا لم يتم زيادة مستوى p35. هذه النتائج تشير إلى أن مستوى البروتين p35 هو عامل يحد من معدل نشاط Cdk5.
أظهرت الفئران Tgp35 تحريض أقل من كل من فسفرة CREB و c-fos في المخطط بعد الحقن الحاد للكوكايين ، مما يشير إلى أن الاستجابة الجدية للكوكايين تم تثبيتها بزيادة نشاط Cdk5. كان من المحتمل تحقيق توهين إشارات الدوبامين بوساطة الكوكايين في فئران Tgp35 من خلال تثبيط Cdk5 بوساطة العديد من أجهزة التعاقب الإشارية التي تشمل DARPP-32 و PKA و ERK. زادت إدارة الكوكايين فسفرة PKA من DARPP-32 في Thr-34 في الفئران من النوع البري ، في حين تم تخفيف هذه الاستجابة في الفئران Tgp35. لقد ثبت أن فسفرة PKA لـ DARPP-32 في Thr-34 تمنع نشاط البروتين phosphatase 1 (PP1) ، وهو الإنزيم المسئول عن فك الترميز ل Ser-133 من CREB (27). وبالتالي ، لن يكون النشاط PP1 معادلاً عبر مسار DARPP-32 / PP1 في فئران Tgp35.
تم أيضا التنشيط الناجم عن الكوكايين من ERK1 / 2 أيضا في الفئران Tgp35. هناك العديد من الآليات المتميزة التي من خلالها يمكن Cdk5 تثبيط التنشيط الناجم عن الكوكايين من ERK1 / 2. أولاً ، يمكن أن يثبط الفسفرة المعتمد على Cdk5 من DARPP-32 في Thr-75 PKA ، مما يؤدي إلى تثبيط لاحق لأي تنشيط MEK1 / 2 بوساطة PKA مطلوب لتنشيط ERK1 / 2. كما وجدت دراسة حديثة أن فسفرة DARPP-32 في Thr-34 مطلوبة للتفعيل بوساطة الكوكايين من ERK1 / 2 بمسارات متعددة تنطوي على تنظيم غير مباشر لتنشيط مجاهدي خلق وكذلك إشراك تنظيم الفوسفاتاز المخصب بمادة بروتينية ، وهو تيروزين الفوسفاتيز الذي يعمل مباشرة على ERK1 / 2 (28). يقترح دعم هذه الإمكانية من خلال اكتشاف أن الفسفرة التي يسببها الكوكايين من MEK1 / 2 في Ser-217 و Ser-221 قد ألغيت في فئران Tgp35. هناك مسار آخر محتمل عبر الفسفرة المعتمد على Cdk5 من MEK1 في Thr-286 ، مما يؤدي إلى انخفاض نشاطه التحفيزي ويؤدي إلى تثبيط نشاط ERK1 / 2 (24).
وقد ثبت تثبيط نشاط Cdk5 في المخطط إلى تحفيز الآثار السلوكية للعلاج بالكوكايين المزمن في الحيوانات (6). تتفق مع فرضية أن التنظيم المتزايد لنشاط Cdk5 قد يسهم في التكيف العصبي لمقاومة تأثيرات تعاطي الكوكايين المتكرر (6) ، وجدنا أن الفسفرة Cdk5 بوساطة من DARPP-32 و MEK1 ساهمت في تخفيف التفعيل الناجم عن الكوكايين من ERK1 / 2 ، مما أدى إلى الحث أقل من فسفرة CREB و c-fos في المخطط. تدعم النتائج التي توصلنا إليها فكرة أن زيادة نشاط Cdk5 ، كنتيجة لتنظيم p35 ، قد يغير التعبير الجيني في المخطط بعد التعرض المزمن للكوكايين. قد يحدث هذا من خلال التغييرات في أنشطة عوامل النسخ مثل CREB و c-fos. وهكذا ، فإن المنشط CxxxNUMX p5 ، بحكم تأثيره على معدل الحد على نشاط Cdk35 ، قد يساهم في تغييرات طويلة الأمد في وظيفة الخلايا العصبية الكامنة وراء إدمان الكوكايين..
شكر وتقدير
نشكر الدكاترة. ماري جو دانتون ، فيليب غرانت ، وساشي كيسافاباني لقراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة Grant Z01DE00664-05 (إلى ABK) ، و US Health Service Service Grant DA10044 ، ومنح من مؤسسة Simons ، ومؤسسة Peter J. Sharp ، ومؤسسة Picower (إلى PG).
ملاحظة
الاختصارات: Cdk5 ، كيناز 5 تعتمد على السيكلين. ERK ، كيناز خاضع للإشارة خارج الخلية ؛ DARPP-32، dopamine and phosphoprotein خاضع للتنظيم ، الكتلة الجزيئية 32 kDa؛ PKA ، الكيناز المعتمد على cAMP ؛ MEK ، ERK kinase ، CREB ، بروتين ربط عنصر cAMP-response.
مراجع حسابات
;