بلوس واحد. 2013 Nov 25؛ 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
نيشيجيما تي, Kawakami M, كيتا أنا.
مصدر
مختبر علم وظائف الأعضاء السلوكية ، كلية الدراسات العليا لعلوم الصحة البشرية ، جامعة طوكيو متروبوليتان ، طوكيو ، اليابان.
ملخص
يحسن التمرين البدني من جوانب متعددة من وظيفة الحصين. تماشيا مع الفكرة القائلة بأن النشاط العصبوني هو المفتاح لتعزيز وظائف الخلايا العصبية ، أثبتت الأدبيات السابقة باستمرار أن نوبات التمارين الحادة تثير التنشيط العصبي في الحصين (hippocampus). تؤدي المحفزات التنشيطية المتكررة إلى تراكم عامل النسخ ΔFosB ، الذي يتوسط اللدونة العصبية على المدى الطويل..
في هذه الدراسة ، اختبرنا الفرضية القائلة بأن العجلة الطوعية طويلة المدى تعمل على حث التعبير ΔFosB في قرن آمون ، وفحص أي تأثيرات محتملة خاصة بالمنطقة داخل الحقول الفرعية الحصينية على طول المحور الظهري الظهري. تم إيواء الفئران الذكور C57BL / 6 مع أو بدون عجلة تشغيل لأسابيع 4. تشغيل عجلة طويلة الأجل بشكل كبير زيادة FosB / immFosB immunoreactivity في جميع المناطق قرن آمون قياس (أي في الحقول الفرعية DG و CA1 و CA3 لكل من الحصين الظهري والبطني). أكدت النتائج أن العجلة التي تحدثها منطقة محددة التعبير عن FosB / immFosB immunoreactivity في القشرة ، مما يوحي بأن الزيادة في FosB / ΔFosB داخل الحصين ليست نتيجة غير محددة للتشغيل. أشارت بيانات لطخة غربية إلى أن زيادة القدرة المناعية لـ FosB / ΔFosB Hippocampal كانت في المقام الأول بسبب زيادة ΔFosB. هذه النتائج تشير إلى أن ممارسة الرياضة البدنية على المدى الطويل هو محفز قوي لتحريض ΔFosB في جميع أنحاء قرن آمون بأكمله ، مما يفسر لماذا يمكن ممارسة تحسين وظائف كل من الظهرية والبطنية تعتمد على الحصين. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن تعبير FosB / ΔFosB في DG كان مرتبطًا بشكل إيجابي بعدد الخلايا العصبية المزدوجة (أي غير ناضجة).
على الرغم من أن الآليات التي يتوسط بها ΔFOSB في تكوين النسيج العصبي الناجم عن التمرين لا تزال غير مؤكدة ، فإن هذه البيانات تشير إلى أن تكون الخلايا العصبية الناتجة عن التمرين تعتمد على النشاط على الأقل. مع الأخذ في الاعتبار ، تشير نتائجنا الحالية إلى أن ΔFosB هو هدف جزيئي جديد ينطوي على تنظيم اللدونة الناتجة عن التمارين الرياضية في الحصين.
المُقدّمة
يمنح التمرين فوائد متنوعة على الجوانب الجزيئية والهيكلية والوظيفية للحُصين في القوارض1,2] ، بعضها مدعوم بدراسات بشرية [3,4]. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء التغييرات التي يسببها التمرين في اللدونة قرن آمون ليست مفهومة بما فيه الكفاية. وقد أثبتت الأدبيات السابقة باستمرار أن التمارين تستلزم تنشيط الخلايا العصبية في الحصين في القوارض. وقد أظهرت الدراسات المناعية باستخدام c-Fos ، وهي علامة التنشيط العصبوني العابر ، أن كل من الجري القسري والتطوعي زاد من تعبير c-Fos في الحقول الفرعية التلفيف المسنن (DG) ، و CA1 ، و CA3 من الحصين القوارض [5-7]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة سابقة باستخدام مقياس دوبلر الليزري (LDF) أن جهاز الجري الخفيف يعمل على زيادة تدفق الدم الدماغي الإقليمي (rCBF) ، وهو علامة بديلة للتنشيط العصبي ، في الحقل الفرعي CA1 في الجرذ [8]. وتمكّن الدراسات المناعية الكيميائية من إجراء تحليلات مفصلة خاصة بالمنطقة بعد توقف التمرين ، في حين يمكّن LDF الرصد في الوقت الحقيقي لـ rCBF في منطقة محلية خلال التمرين. على الرغم من مزايا وقيود كل دراسة ، أظهرت هذه الدراسات أيضا تأثير النوبات الحادة من ممارسة النشاط العصبي الحصين. تشير هذه النتائج إلى آلية تقوم من خلالها التمارين المنتظمة على المدى الطويل بتعزيز اللدونة في الحصين من خلال إطلاق التنشيط العصبي بشكل متكرر [9].
إن عامل الانتساخ ΔFosB ، وهو شكل متشابك لصق متساوي من FosB كامل الطول ، يسببه أنواع مختلفة من المنبهات المتكررة في مناطق معينة من الدماغ ، حيث يتراكم تدريجيا بسبب استقراره الفريد (نصف عمر الأسابيع) [10-12]. تظهر مجموعة متزايدة من الأدلة أن زيادة مستويات ΔFOSB تتوسط اللدونة العصبية والسلوكية طويلة الأمد المرتبطة بمحفزات معينة11,13]. على سبيل المثال ، يؤدي تعاطي المخدرات المزمنة مثل تعاطي الكوكايين والمورفين عادة إلى زيادة تعبير ΔFOSB في النواة المتكئة ، وهو ما يمثل إحدى الآليات الجزيئية الكامنة وراء زيادة الحساسية لهذه الأدوية. [11,14,15]. Similarly إلى غيرها من المحفزات مكافأة ، بما في ذلك اتباع نظام غذائي عالي الدهون وتجربة جنسية [16,17] ، لعلى المدى الطوعي تشغيل المدى الطوعي أيضا زيادة FosB / immFosB immunoreactivity في النواة المتكئة الفئران ، مما يشير إلى أن تشغيل الطوعي هو مكافأة طبيعية للقوارض [18,19]. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يدرس أي أدب ما إذا كان التعرض المتكرر لممارسة الرياضة يحفز التعبير ΔFosB في قرن آمون. لأن التمرين يؤدي إلى تنشيط الخلايا العصبية في منطقة قرن آمون ، افترضنا أن تشغيل العجلة الطوعية على المدى الطويل من شأنه أيضًا أن يحفز تعبير FosB في قرن آمون hippocampus. في حين أن الآليات الدقيقة التي من خلالها ينظم ΔFOSB اللدونة الحصين لا يزال غير مؤكد ، فقد أثبتت الدراسات أن الفئران تفتقر إلى fosB تثبيط تكوين الجينات اختلال عصبي في الحصين وزيادة السلوك الشبيه بالاكتئاب [20,21]. أناndeed ، ومن المعروف أن ممارسة لتحسين تنشؤ النسيج العصبي ولها خصائص مضادة للاكتئاب [22-25]. أناإن فرضيتنا صحيحة ، Δ قد يكون ΔFosB هدفاً جزيئياً محتملاً جديدًا يتوسط اللدونة التي يسببها التمرين الحصين.
يحتوي الحصين على تدرج تشريحي وعملي على طول المحور الطولي (dorso – ventral) [26]. يلعب الحصين الظهري دورًا رئيسيًا في التعلم المكاني والذاكرة [27,28] ، في حين تشارك الحصين البطني بشكل تفضيلي في تنظيم السلوكيات العاطفية [29,30]. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن المنبهات الفسيولوجية تحفز أنماطًا مختلفة من التعبير c-Fos في الأجزاء الظهرية والبطنية من الحصين [31-33]. لأن التمارين تحسن كل الظهر34-37] والوظائف البطنية الحصين تعتمد [24,25,38] ، من المهم فحص ما إذا كان الجريان الطوعي على المدى الطويل يسبب تعبيرًا خاصًا بكل منطقة لـ ΔFosB في منطقة قرن آمون.
كانت الفرضية الأولية لهذه الدراسة هي أن تشغيل العجلات الطوعية طويلة الأجل من شأنه أن يحفز التعبير ΔFosB في قرن آمون الفأر. وقد تم التحقيق في هذه الفرضية من قبل FosB / ΔFosB immunohistochemistry في الحقول الفرعية الظهرية والبطنية في الحصين ، DG ، CA1 ، و CA3 ، مع التركيز بشكل أكبر على تحديد الحث المخصص للمنطقة. تم تأكيد النتائج من قبل النشاف الغربي ، والذي تم استخدامه للتعرف على الشكل الإسوي fosB المنتجات الجينية المستحثة في قرن آمون. فحصنا أيضا القشرة لتحريض FosB / ΔFosB المنطقة محددة لاستبعاد احتمال أن ممارسة طويلة الأجل غير محددة بشكل خاص زيادة FosB / ΔFosB immunoreactivity في الدماغ. وأخيرا ، تم بحث العلاقة المترابطة بين تعبير FosB / ΔFosB وتكوين الخلايا العصبية كخطوة أولى في البحث عن الآثار الوظيفية لتحريض FOSB المستحث بالرياضة في تنظيم اللدونة الحصينية.
مواد وطرق
1: بيان الحيوانات والأخلاق
تم شراء عشرين من الفئران C57BL / 6 الذكور (أسابيع 8 من العمر) من مربي التجارية (SLC ، شيزوكا ، اليابان). تم استخدام عشرة فئران لتجربة 1 ، والعشرة الآخرون لتجربة 2. تم وضع الفئران تحت ظروف درجة الحرارة التي تسيطر عليها (22 - 24 ° C) والضوء (12 / 12-h ضوء / دورة داكنة ، الضوء على 0500) ، وقدمت الطعام والماء libitum الإعلانية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الأخلاق التجريبية الحيوانية في جامعة طوكيو متروبوليتان.
في كل تجربة ، عند الوصول ، تم تعيين الفئران عشوائيا إما لمجموعة التحكم (Control، n = 5) أو مجموعة قيد التشغيل (Runner، n = 5). خلال الأسبوع الأول ، تم إيواء جميع الفئران في أقفاص بلاستيكية قياسية في مجموعات (الفئران / القفص 5) للتأقلم الأولي. ثم ، تم نقل الفئران عداء في قفص مجهزة بعجلة تشغيل (ENV-046 ، ميد Associate ، جورجيا ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية). لأنه من المعروف أن العزلة الاجتماعية لقمع تكوين الخلايا العصبية الناجم عن ممارسة في الحصين [39] ، تم تعيين الفئران عداء كمجموعة (5 الفئران / قفص) لمدة أسابيع 4 إضافية. تم تسجيل عدد دورات الدوران كل صباح وتم قياس وزن الجسم (غرام) أسبوعياً.
2: Experiment 1. الفحص المناعي الكيميائي لتعبير FosB / ΔFosB وتكوين الخلايا العصبية في قرن آمون
2.1: الإرواء ومعالجة الأنسجة
في الصباح (0900 - 1100) بعد اليوم الأخير من فترة التشغيل ، تم تخدير الفئران بعمق مع الصوديوم بنتوباربيتال وعطر perfcardially مع المالحة الباردة. تمت إزالة الدماغ بسرعة وبعد إصلاحه في XIVUM ٪ بارافورمالدهيد في 4 M فوسفات المالحة المخزنة (PBS ، pH 0.1) بين عشية وضحاها. ثم تم cryoprotected الدماغ في 7.4 ٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتجمد حتى مزيد من المعالجة. تم الحصول على أقسام الدماغ التاجي (30 )m) من نصف الكرة باستخدام microtome تجميد والتي تم جمعها في PBS مع 40 ٪ أزيد الصوديوم.
2.2: Immunohistochemistry
تم اختيار مجموعة واحدة من ستة أقسام بشكل عشوائي لـ FosB / ΔFosB immunostaining. تم استخدام سلسلة متجاورة لوضع العلامات على doublecortin (DCX) ، وهو علامة على الخلايا العصبية غير الناضجة المصادق عليها لتقييم تكوين الخلايا العصبية40,41]. بعد إخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي مع 1٪ H2O2 في برنامج تلفزيوني ، تم preincubated أقسام العائمة الحرة مع حل حظر يحتوي على 10٪ مصل الحصان العادي في برنامج تلفزيوني ل 2 ح. بعد الشطف في PBS ، تم تحضين الأقسام مع أضداد polyclonal pan-FosB (1: 1000 ، sc-48 ، Santa Cruz Biotechnology ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) مخففة في PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 0.5٪ BSA (PBST -BSA) لـ 24 h عند 4 ° C. تم تحضين سلسلة أخرى من الأقسام مع الأجسام المضادة لـ Polyclonal anti-DCX (1: 500، sc-8066، Santa Cruz) في PBST-BSA لـ 48 h عند 4 ° C. تم تحضين القسمين بشكل إضافي مع جسم مضاد ثانوي مناسب من البيروكسيدين (مضاد للأرانب IgG ، 1: 1000 ، AP182B ؛ مضاد للماعز IgG ، 1: 1000 ، AP180B ، كلا من الأجسام المضادة من EMD Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في PBST-BSA لـ 2 h في درجة حرارة الغرفة. ثم تمت معالجة الأقسام باستخدام مركب avidin-biotin-peroxidase (Vectastain ABC peroxidase kit، Vector Laboratories Inc، Burlingame، CA، USA) لـ 90 min بعد إرشادات الشركة المصنعة. تم تصور المستضدات أخيراً مع 0.02٪ 3,3-diaminobenzidine (DAB) في 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) الذي يحتوي على 0.01٪ H2O2. بالنسبة لـ FosB / immFosB immunostaining ، تم تكثيف التفاعل مع كبريتات الأمونيوم من النيكل. لتلطيخ DCX ، تم التصدي لنواة الخلية مع تلطيخ نيسل. تم تركيب المقاطع على شرائح مغلفة بالجيلاتين وتم وضع coverslips.
2.3: التحديد الكمي لـ immunoreactivity FosB / using باستخدام عتبة الصورة
تم رفع الأجسام المضادة لـ Pan-FosB المستخدمة في هذه الدراسة ضد منطقة داخلية مشتركة بين FosB و ΔFosB N-terminal ، بحيث لا يمكن التمييز بين الشكلين الإسويين. لذلك ، وصفت الهياكل المناعية بأنها نواة FosB / ΔFosB (FosB / ΔFosB-ir). للحصول على تقدير كفيف غير مستقر ، تم ترميز الشرائح قبل التحليل. أطلس دماغ الفأر42] تم استخدامه لتحديد موقع مناطق الاهتمام التالية (ROIs): طبقة الخلايا الحبيبية (GCL) من DG (أقسام 3) ، وطبقة خلية الهرمية من CA1 (مقاطع 3) و CA3 (أقسام 2 – 3) في الحصين الظهري. (مغلق إلى -2.2 ملم من bregma) ؛ DG (أقسام 2) و CA1 (أقسام 2) و CA3 (أقسام 2) في الحصين البطني (مغلق إلى - 3.4 ملم من bregma) (الشكل 4، اليسار). تحتوي المقاطع الذيلية على كل من الأجزاء الظهرية والبطنية في قرن آمون ، ولكن الجزء البطني كان مستهدفًا. في DG ، تم تحليل شفرات الأدرار (DGsp) والأفراج تحت الأدمة (DGip) بشكل منفصل. القشرة الحركية (أقسام 2 – 3 ، مغلقة إلى -0.6 مم من البرجا) ، قشرة البروز الحسية الجسدية (أقسام 2 – 3 ، مغلقة إلى -0.6 ملم من البرج) ، القشرة البصرية (مقاطع 3 ، مغلقة إلى -2.9 ملم من bregma) ، تم تحليل القشرة السمعية (أقسام 3 ، مقفلة إلى 2.9 ملم من bregma) ، ومصباح شمي (أقسام 3 ، مغلقة إلى + 4.3 مم من bregma) (الشكل 6، اليسار).
تم التقاط الصور الرقمية (2070 × 1548 pixels) لكل عائد استثمار باستخدام المجهر الضوئي (BX-51 ، أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) المزودة بكاميرا CCD (DP-73 ، أوليمبوس) وبرامج التصوير (cellSens ، أوليمبوس). كان التكبير عدسة موضوعي 10 × لعائدات ROY الحصين و 4 × لعائدات الاستثمار القشرية. من أجل تحديد معتدلة إلى قوية FosB / immFosB immunoreactivity (الشكل 1D – G) ، باستخدام عدة أقسام مقدمًا ، تم تحسين كل من إعدادات التقاط الصور (شدة الضوء ، وحجم التوقف الميداني ، ووقت التعريض ، وتوازن اللون الأبيض) ومستويات العتبة لكل من مكونات RGB لعائدات ROY الحصين والقشرية. ثم تم إجراء التحليل التالي تحت الظروف المثلى (1). تم اختيار ROIs بواسطة مضلع غير منتظم الشكل (الشكل شنومكسا، B) (2). كانت الصورة عتبة ، والتي حولت نواة FosB / ΔFosB-ir إلى لون أحمر (الشكل 1C-G) (3). تم بعد ذلك احتساب العائد على الاستثمار (ROI) تلقائيًا على النحو التالي:٪ ROI = (منطقة محولة (باللون الأحمر) / إجمالي منطقة العائد) × 100.
وللتحقق من صحة تحليل العتبة لهذه الصورة ، تم اختيار مناطق 20 عشوائياً من مناطق دماغية مختلفة بأحجام مناطق مختلفة. بالإضافة إلى تقدير كمية العتبة ، تم حساب عدد نوى FosB / ΔFosB-ir داخل المناطق المختارة يدوياً وتم الحصول على كثافة FosB / ΔFosB-ir nuclei عن طريق قسمة عدد FosB / ΔFosB-ir nuclei من خلال قياس المنطقة (مم2).
2.4: الكمي من الخلايا العصبية غير ناضجة DCX الأشعة تحت الحمراء في التلفيف المسنن
كانت الخلايا العصبية غير ناضجة DCX-ir في DG من الفئران عداء وفيرة ومتداخلة ، مما يجعل من الصعب على وجه التحديد العد العدد المنفصل من سوما DCX-ir باستخدام مجهر بصري. ومع ذلك ، في دراسة سابقة ، أظهر تحليل Sholl للتقييم المورفولوجي أن كل عصبون DCX-ir لديه ، في المتوسط ، تغصن واحد عند قياسه داخل 40 μm من السوما [43]. لذلك ، تم تطوير التحليل الأصلي التالي لتمكين القياس الكمي للمنطقة من الخلايا العصبية DCX-IR.
- (1) تم عرض صورة GCL على شاشة كمبيوتر باستخدام برنامج تصوير وعدسة 40 × موضوعية (2). على الصورة المباشرة ، تم رسم مقطع خط (150 ± 0.1 μm) على طول منتصف GCL (الشكل 2) (3). تغيير عمق البؤري ، تم عد عدد المرات التي عبرت فيها شريحة الخط dendx-ir dendrites (4). تناظر عوائد الاستثمار (DSCS الظهرية ، dDGsp ؛ الظهرية DGip ، dDGip ؛ DGSP البطنية ، vDGsp ؛ البطني DGip ، vDGip) إلى المناطق حيث تم تحليل FosB / ΔFosB immunoreactivity (5). في كل عائد على الاستثمار ، تم رسم شرائح 2 – 3 لكل قسم وتم حساب متوسط عدد مرات العبور عبر أقسام 2 – 3 لكل ماوس. نظرًا لأن سمك GCL هو 60 – 80 approximatelym تقريبًا ، يجب أن يعكس عدد المعابر عدد الخلايا العصبية DCX-ir داخل المنطقة المحظورة التي تم تحليلها.
3. التجربة 2. تحديد FosB / isFosB isoform الناجم عن عجلة تشغيل
3.1: الإرواء ومعالجة الأنسجة
تم التعامل مع مجموعة إضافية من الفئران على النحو الوارد أعلاه في التجربة 1. بعد أسابيع من التدخل 4 ، تم perfused على الفئران مع ضخ المياه المالحة الباردة تحت التخدير العميق. تم تشريح الحصين بسرعة وتجميده بالنيتروجين السائل وتخزينه عند -80 ° C. تم تجانس الحصين لكل فأر في المخزن المؤقت RIPA (150 mM NaCl ، 25 mM Tris-HCl pH 7.6 ، 1٪ NP-40 ، 1٪ deoxycholate الصوديوم ، 0.1٪ SDS ، #8990 ، Thermo Scientific ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على البروتياز مثبطات (cOmplete ميني ، روش ، مانهايم ، ألمانيا). تم طرد الطرد المركزي لـ 15 min عند 5000 rpm عند 4 ° C وتم جمع supernatants. تم قياس تراكيز البروتين مع مجموعة فحص البروتين BCA (#23227، Thermo Scientific، IL، USA).
3.2: النشاف الغربي
تم نقل كميات متساوية من البروتين (30 μg / lane) على هلام 10٪ polyacrylamide ، ثم نقل إلى غشاء PVDF (Immun-Blot، 0.2 μm، Bio-Rad، MD، USA). تم حظر الربط غير محدد من خلال غشاء الغشاء لـ 1 h في TBST (0.5 M NaCl و 20 mM Tris-HCl pH 7.5 و 0.1٪ Tween-20) الذي يحتوي على 3٪ BSA. تم تحضين الغشاء مع الجسم المضاد FosB pan (1: 1000) التي استخدمت أعلاه للكيمياء المناعية ، إذابة في TBST التي تحتوي على 3 ٪ BSA. بعد الغسيل مع TBST ، تم تحضين الغشاء مع الأجسام المضادة IgG المضاد للأرانب HRP (1: 5000 في TBST ، NA934 ، GE Healthcare ، Buckinghamshire ، المملكة المتحدة) لـ 1 h في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسل باستخدام TBST ، تم تصوير أشرطة البروتين عن طريق الحضانة باستخدام Chemiluminescence المحسن (Western Lightning Plus-ECL ، PerkinElmer ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم التقاطها باستخدام Image Quantity LAS 4000 mini (GE Healthcare، Buckinghamshire، UK). تم غشاء الغشاء بعد ذلك باستخدام الجسم المضاد للجلايكيرالديهايد 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (#2275 ، 1: 5000 في TBS-T ، Trevigen ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) للتحكم في التحميل. تم قياس الكثافة البصرية لنطاقات البروتين باستخدام Image-J وتطبيعها إلى مستوى GAPDH.
4: التحليل الإحصائي
تم تحليل التغييرات في وزن جسم الفأرة من خلال إجراءات متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA (مجموعة × الوقت). تم استخدام اختبار t غير محدد لتحديد الاختلافات الإحصائية بين المجموعات (Control vs. Runner). تم استخدام تحليل الارتباط بيرسون للتحقق من صحة تحليل FosB / ΔFosB المناعة (العد اليدوي مقابل عتبة الصورة) ، ودراسة العلاقة بين مستوى FosB / ΔFosB التعبير وعدد من المعابر DCX في DG. تم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. تم تحديد عتبة الأهمية الإحصائية في P <0.05.
النتائج
1: وزن الجسم ومسافة التشغيل في Experiment 1 و 2
يتم تجميع التغييرات في وزن الجسم لكل من فئتي Control and Runner في Experiment 1 و 2 ويتم عرضها في الشكل 3. تدابير ANOVA المتكررة ذات الاتجاهين أشارت إلى تفاعل هام (مجموعة × الوقت ، F(4 ، 72) = 13.6 ، P <0.001) والتأثير الرئيسي للمجموعة F(1 ، 18) = 6.07 ، P <0.05) ، مما يشير إلى انخفاض وزن الجسم بشكل ملحوظ في الفئران العداء. تظهر مسافة الجري لكل قفص في الجدول 1. على الرغم من أن مسافة التشغيل الدقيقة لكل فأر كانت غير مؤكدة لأن الفئران كانت موضوعة مع بعضها البعض ، إلا أن الملاحظة المنتظمة تؤكد أن جميع الفئران كانت تعمل باستمرار على عجلة. تم تشغيل فئران Runner في Experiment 2 لفترة أطول من تلك الموجودة في Experiment 1 ، لكن متوسط مسافة التشغيل (m / day / cage) كان ثابتًا خلال كل تجربة.
2: التحقق من الكميات المناعية لـ FosB / ΔFosB باستخدام عتبة الصورة
كان هناك ارتباط معنوي بين منطقة FosB / ΔFosB-ir التي تم الحصول عليها بواسطة عتبة الصورة وكثافة نوات FosB / ΔFosB-ir التي تم الحصول عليها بواسطة العد اليدوي (r = 0.941 ، P <00001 ، الشكل 4).
3: FosB / ΔFosB immunoreactivity في hippocampus
تم عرض صور تمثيلية لـ FosB / ΔFosB المناعية في الحقول الفرعية الظهارية والبطنية في الحصين في الشكل 5. في جميع ROIs تحليلها ، FosB / ΔFosB immunoreactivity في الفئران عداء (الشكل 5، صحيح) كان أعلى نوعيا من ذلك في الفئران السيطرة (الشكل 5، مركز). في الفئران العداء ، أشار التحليل الكمي إلى زيادة كبيرة في منطقة FosB / ΔFosB-ir في كل من الظهرية (DGsp: P <0.01 ؛ DGip: P <0.01 ؛ CA1: P <0.05 ؛ CA3: P <0.05) والحقول الفرعية البطنية (DGsp: P <0.01 ؛ DGip: P <0.05 ؛ CA1: P <0.05 ؛ CA3: P <0.05 ؛ الشكل 6).
4: FosB / ΔFosB immunoreactivity في القشرة
يتم عرض صور تمثيلية لـ FosB / immFosB immunostaining في عوائد الـ ROI القشرية الشكل 7. كشف التحليل الكمي عن تغيرات تعتمد على المنطقة في مجال المناعة المناعية لـ FosB / ΔFosB مع تشغيل على المدى الطويل (الشكل 8). في فئران العداء ، كانت منطقة FosB / ΔFosB-ir أعلى بكثير في القشرة الحركية (P <0.05) وقشرة البرميل الحسية الجسدية (P <0.05) ، ولكن ليس في القشرة البصرية (P = 0.662) أو اللمبة الشمية (P = 0.523). في القشرة السمعية ، تميل منطقة FosB / ΔFosB-ir نحو زيادة في الفئران عداء (P = 0.105).
5: Neurogenesis
يتم عرض صور الممثل من المناعية DCX في الشكل 9. في الحصين الظهرية ، DCX immunoreactivity في فئران عداء (الشكل 9، صحيح) كان أعلى نوعيا مقارنة بفئران التحكمالشكل 9، اليسار). مقارنة مع الحصين الظهرية ، كان DCX immunoreactivity في الحصين البطني أضعف في كل من الفئران تحكم وعداء. في فئران العداء ، كان عدد المعابر أعلى بكثير في dDGsp (P <0.01) و dDGip (P <0.01 ؛ الشكل 10). في الحصين البطني ، كان عدد المعابر في فئران العداء يميل إلى الزيادة ، ولكن لم تكن هناك اختلافات كبيرة بين المجموعات (vDGsp ، P = 0.101 vDGip، P = 0.257؛ الشكل 10).
6: العلاقة بين تعبير FosB / ΔFosB وتكوين الخلايا العصبية
تم إجراء تحليل الارتباط بين منطقة FosB / ΔFosB-ir وعدد معابر DCX (الشكل 11). لأن كل مجموعة بيانات (على سبيل المثال ، DGSP الظهرية في الفئران التحكم) تتكون من أزواج 5 فقط ، تم إجراء التحليل الأول مع جميع أزواج 40. ومما يثير الاهتمام أن هناك علاقة ملحوظة بين منطقة FosB / ΔFosB-ir وعدد معابر DCX (r = 0.885 ، P <0.0001). بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد ارتباطات مهمة أيضًا عند DG الظهري (r = 0.762 ، P <0.05) و DG البطني (r = 0.816 ، P <0.01) تم تحليلها بشكل منفصل.
7: تعرف على شكل FosB / isFosB المستحث بواسطة تشغيل طويل الأجل
وأخيرا ، لتحديد الايسوفورم من fosB المنتجات الجينية المستحثة في قرن آمون استجابة للهروب على المدى الطويل ، تعرضت الحصين من مجموعة إضافية من الفئران إلى النشاف الغربي باستخدام نفس الجسم المضاد FosB pan-pan. نطاقات متعددة من 35 – 37 kDa ، التي تمثل الأشكال المتشابهة المعدلة لـ ΔFosB [44] ، زيادة كبيرة في الفئران ضد Runner الفئران (الشكل 12, P <0.01). من ناحية أخرى ، كان الشكل الإسوي 48 كيلو دالتون FosB غير قابل للكشف في أي من المجموعتين. من المحتمل أن يمثل النطاق الآخر المرئي بشكل خافت فوق 25 كيلو دالتون الشكل الإسوي Δ2ΔFosB (27 كيلو دالتون). كان هناك نطاقان آخران ، أعلى من 50 كيلو دالتون و 37 كيلو دالتون ، والتي كانت على الأرجح بسبب الارتباط غير المحدد. عند القياس الكمي ، لم يتم العثور على اختلافات في هذه النطاقات غير ΔFosB بين المجموعات (البيانات غير معروضة).
مناقشة
وباختصار ، فإن الدراسة الحالية أجرى أول تحليل immunohistochemical لفحص 1) ما إذا كانت عجلة طوعية طويلة الأجل يحث على التعبير FosB / ΔFosB في قرن آمون. و 2) ما إذا كانت هناك استجابة خاصة بالمنطقة على طول محورها dorso – ventral.
أسفرت أربعة أسابيع من تشغيل العجلة الطوعي زيادة كبيرة في FosB / immFosB immunoreactivity في جميع مناطق الحصين تحليلها (أي ، والحقول الفرعية DG ، CA1 ، و CA3 من كل من الأجزاء الظهرية والبطنية من الحصين). لقد تأكدنا من أن 35-37kDa isFosB isoform هو العامل الرئيسي fosB يتراكم المنتج الجيني استجابة للتشغيل على المدى الطويل. تدعم هذه النتائج بوضوح الفرضية القائلة بأن التمرين المنتظم طويل الأمد هو محفز قوي لتحفيز ΔFosB في جميع أنحاء قرن آمون ، وأن تحريضه قد يكون آلية جزيئية جديدة تؤثر فيها التمارين الرياضية على أنواع مختلفة من الوظائف المعتمدة على الحصين الظهرية و / أو البطنية.
1: التحقق من صحة وقيود القياس الكمي لمعايرة FosB / ΔFosB باستخدام عتبة الصورة
تم اعتماد تقنية عتبة للصورة ، استخدمت على نطاق واسع في الدراسات المناعية الكيميائية لحساب عدد الخلايا المستهدفة ولتقييم مورفولوجيا الخلية ، في هذه الدراسة للتقييم الكمي الخاص بالمنطقة لـ immunoreactivity FosB / ΔFosB [15,45,46]. تم إثبات وجود علاقة ملحوظة بين مستويات FosB / ΔFosB التي تم قياسها من خلال قياس عتبة الصورة والفرز اليدوي (الشكل 4). ومع ذلك ، نظرًا لأن الكثافة والتداخل منعت حساب عدد نوى FosB / FosB-ir في المناطق عالية الكثافة ، فإن الارتباط الواضح لا يشير إلا إلى دقة طريقة عتبة الصورة عندما تمثل مناطق FosB / FosB-ir <~ 40٪ من إجمالي العائد على الاستثمار منطقة. لذلك ، مطلوب تفسير دقيق لمناطق FosB / FosB-ir> 40٪ من إجمالي مساحة عائد الاستثمار.
على وجه الخصوص ، في DG من الفئران عداء (الشكل 4) ، تم تحفيز تعبير FosB / ΔFosB بشكل كبير عن طريق تشغيل العجلة وتداخل معظم نوى FosB / ΔFosB-ir. في هذه المناطق ، يؤدي التحريض المتزايد لتعبير FosB / ΔFosB إلى اختزال أكبر لمستوى التعبير ، بغض النظر عن طريقة القياس المستخدمة (عتبة الصورة أو العد اليدوي). ومع ذلك ، على الرغم من خطر التقليل ، فمن المهم ملاحظة أن هذه الدراسة أظهرت بنجاح زيادات كبيرة في مجال FosB / ΔFosB-ir في المديرية العامة للفئران عداء. هذا يشير إلى أن القيود المنهجية لا تعرض نتائجنا للخطر. وبدلاً من ذلك ، يزيد الاحتمال الناقص من موثوقية النتيجة التي تقول إن المدى الطويل يزيد من فعالية FosB / ΔFosB المناعية في الحصين (hippocampus).
2: الاستقراء موحدة من ΔFosB داخل الحصين عن طريق تشغيل على المدى الطويل
لدى الحصين تدرجات تشريحية وظيفية على طول المحور الطولي26] ، لذلك بالنسبة للدراسة الحالية تم تحليل FosB / ΔFosB immunoreactivity في الأجزاء الظهرية والبطنية من قرن آمون على حدة. أظهرت البيانات أن المدى الطويل يعمل بشكل موحد لزيادة تعبير FosB / ΔFosB في جميع عائد الاستثمار الحصين قياسا. قد يكون هذا التحريض المنتظم لـ FosB / immFosB immunoreactivity غير ناتج بشكل خاص عن التغيرات الأيضية النظامية المرتبطة بالتشغيل على المدى الطويل. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هناك زيادات خاصة بكل منطقة من FosB / ΔFosB immunoreactivity في القشرة المخية. ويدعم هذه النتيجة من خلال النتائج الأخيرة التي تبين أن نوبة مفرغة من حلقة مفرغة تعمل على زيادة تدفق الدم الدماغي الإقليمي في قرن آمون ، ولكن ليس في البصيلة الشمية [8]. علاوة على ذلك ، رودس وآخرون. أظهر (2003) أن أيام 7 من العجلة الطوعية التي يتم تشغيلها في التعبير c-Fos المستحث في DG و CA2 / 3 من الحصين (لم يتم قياس CA1) وفي القشرة الحسية ، ولكن ليس في القشرة البصرية [47]. مجتمعة ، تشير هذه الدراسات إلى أن الحث الموحد لتعبير FosB / ΔFosB في قرن آمون ليس نتيجة غير محددة للتشغيل على المدى الطويل. ومن المثير للاهتمام ، هاولي وآخرون. ذكرت مؤخرا أن التوتر المزمن لا يمكن التنبؤ به زيادة التعبير FosB / ΔFosB في الظهرية ، ولكن ليس في البطني ، DG من الحصين الجرذ [48]. مع مزيد من الاستقصاء ، فإن الأنماط المتميزة لتحريض FosB / ΔFosB مثل تلك التي أثارها التمرين أو الإجهاد ستوفر رؤى متواصلة حول التأثيرات المعتمدة على التحفيز على قرن آمون hippocampus.
من المعروف أن الجسم الأساسي الأساسي FosB المستخدمة في هذه الدراسة للتعرف على جميع الأشكال الإسوية من البروتينات FosB. عند تحليل النشاف الغربي ، وجدنا أن الأشكال الإسوية الوحيدة التي زادت في قرن آمون بعد تشغيل طويل المدى كانت الأشكال الإسوية المعدلة لـ ΔFosB (35 – 37 kDa) ، وهي الأشكال الإسوية الوحيدة المستقرة بين بروتينات Fos العائلية [11]. تتوافق هذه النتيجة مع العمل السابق باستخدام الأجسام المضادة Pan-Fos لإثبات أن 35 – 37 kDa ΔFosB هو بروتين Fos العائلي السائد المستحث في القشرة الأمامية بسبب الإجهاد المزمن [44]. وبالتالي ، فإن الزيادة في الحصانة المناعية لـ FosB / ΔFosB hippocampal المستحثة هنا على المدى الطويل على الأرجح تعكس مستوى ΔFosB.
أقل من ذلك هو معروف عن الآثار المحددة للمنطقة من ممارسة على الجوانب الجزيئية والهيكلية في قرن آمون. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات السلوكية تشير إلى وجود إمكانات كبيرة للتحسينات التي يسببها ممارسة في كل من وظائف الحصين الظهري والبطني. تم شرح التمرين لتحسين التعلم المكاني والذاكرة [34-38] والمعالجة المكانية والسياقية تعتمد بشكل رئيسي على الحصين الظهري [27,28]. في المقابل ، من المعروف أيضًا أن التمارين الرياضية تمارس خواص مزيل القلق ومضادًا للاكتئاب [24,25,38] ويتم تنظيم هذه الاستجابات الانفعالية في الغالب من قبل الحصين البطني [29,30]. يقترح الحث المنتظم لـ ΔFosB على المدى الطويل في هذه الدراسة أن هناك شكلاً من التغيرات العصبية يحدث في جميع أنحاء قرن آمون. هذا من شأنه أن يفسر لماذا ممارسة يمكن أن تؤثر على كل الوظائف التي تعتمد على الحصين الظهري والبطني.
3: تحليل محدد للمنطقة من تكوين عصبي الناجم عن التمرين
كان التفكك الوظيفي لتكوين الخلايا العصبية بين الحصين الظهري والبطني يحظى أيضًا باهتمام متزايد49]. في هذه الدراسة ، والاستفادة من الخصائص المورفولوجية من الخلايا العصبية غير ناضجة DCX- الأشعة تحت الحمراء [43] ، لقد حسبنا عدد التقاطعات بين dendxs الأشعة تحت الحمراء وجزء خط رسمها على طول منتصف GCL. لم يوفر هذا القياس العدد الإجمالي للعصبونات DCX-IR في المديرية العامة ، لكنه مكن الكميات المحددة للمنطقة اللازمة لإجراء تحليل الارتباط مع بيانات تعبير FosB / ΔFosB (انظر أدناه). بعد تشغيل على المدى الطويل ، زاد عدد الخلايا العصبية DCX-IR بشكل ملحوظ في الظهرية ، ولكن ليس البطنية ، DG. هذا يشير إلى أن ممارسة الرياضة قد تحفز تكوين الخلايا العصبية بشكل لافت للنظر في الظهري مقارنة مع الجزء البطني من المديرية العامة. ومع ذلك ، فقد أفادت دراسات سابقة نتائج متضاربة في تشغيل عجلة زيادة neurogenesis في كل من DG الظهرية والبطنية50,51]. في الدراسة الحالية ، كان عدد معابر DCX-ir في DG البطنية يميل إلى الزيادة مع الجري ، على الرغم من أن حجم العينة الصغير (فئران 5 لكل مجموعة) قد حد من القدرة على الكشف عن فرق ذو دلالة إحصائية بين المجموعات. لذلك ، من السابق لأوانه أن نستبعد احتمال أن الجري الطوعي يمكن أن يحفز تكوين الخلايا العصبية البطني في الحصين. هناك حاجة لمزيد من الدراسات التفصيلية لفهم خصوصية المنطقة للتكوُّن العصبي الناجم عن التمرين فيما يتعلق بعملية تعدد الخطوات (تكاثر الخلايا ، والتمايز ، والهجرة ، والبقاء على قيد الحياة).
4: الآثار الوظيفية للتحريض الناجم عن التمارين Δ FosB لتنظيم اللدونة الحصينية
وأخيرًا ، كخطوة أولى في التعرف على الآثار الوظيفية للتحريض المستحث بالمدرسة بفيروس FSB في الحصين ، فقد فحصنا العلاقة بين immunoreactivity FosB / ΔFosB إلى معابر DCX-ir في كل من DG الظهرية والبطنية ووجدنا ارتباطًا إيجابيًا كبيرًا بين المتغيران. على الرغم من أن الآليات الدقيقة التي ينظم بها ΔFOSB عملية تنشؤ النسيج العصبي الناجم عن التمرين تبقى غير مؤكدة ، فقد أظهرت دراسة حديثة أن fosBالفئران ، التي تفتقر إلى FosB ، ΔFosB ، و Δ2ΔFosB (كل fosB المنتجات) ، وعيوب في نقص النسيج العصبي قاعدي الحصين ، بما في ذلك انخفاض انتشار الخلايا السلفية الخلايا العصبية ، وزيادة الهجرة خارج الرحم من الخلايا العصبية حديثي الولادة ، والهياكل DG غير طبيعي [20]. ومع ذلك ، لم يلاحظ هذه التعديلات في fosB(د / د) الفئران ، التي تفتقر إلى FosB ، ولكن ليس ΔFosB / Δ2ΔFosB. من المثير للاهتمام ، في fosBفئران فارغة ، والتعبير عن بعض الجينات ذات الصلة تكوين العصبية ، بما في ذلك VGF (عامل نمو الأعصاب VGF محفز) و غال (Galanin prepropeptide) تم تخفيضها [20]. بما أن VGF و GAL هما جزيئات إفرازية ، فإن أحد المقترحات التي تحمل الوعد يعتبر أن الخلايا العصبية التي تعبر عن ΔFosB قد تنظم عملية تكوين الخلايا العصبية من خلال نشاط الاستبانة / الإفراز20].
بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن المنطقة حيث يتم تحفيز ΔFosB عن طريق تشغيل تداخل مكاني مع المنطقة حيث النشاط العصبي مرتفع. تقترح هذه النتيجة أن تكون الخلايا العصبية الناتجة عن التمرين عند الحد الأدنى من النشاط. التنشيط العصبي هو مفتاح صيانة وتحسين وظيفة الجهاز العصبي المركزي9من خلال آليات بما في ذلك التعبير والإفراج عن عامل التغذية العصبي المشتق من الدماغ (BDNF) [52,53[] ، امتصاص عامل النمو الشبيه بالأنسولين- 1 (IGF-1) من خلال الحاجز الدموي الدماغي [54,55] قمع الاستماتة56] ، وتنظيم حركية الميتوكوندريا [57]. ومن ثم ، تشير الدراسة الحالية إلى أن التمرين طويل المدى قد أثار تنشيطًا عصبيًا متكررًا ، جليًا في زيادة تعبير ΔFosB ، والذي يساهم في تعزيز اللدونة في الحصين ، والتي من المحتمل من خلال هذه الآليات المتعددة الموضحة أعلاه.
الدراسة الحالية فقط تقييم neurogenesis الناجم عن ممارسة الرياضة وارتباطه مع التعبير FosB / ΔFosB في DG. ومع ذلك ، فقد تم أيضا تحفيز الفحوصات المناعية FosB / ΔFosB في الحقول الفرعية CA1 و CA3. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاكتساب المزيد من الفهم للأدوار الوظيفية للتعبير الناشئ عن ممارسة التمارين الرياضية في هذه الحقول الفرعية ، فإن الأدبيات السابقة تقدم إمكانية واعدة. جوان وآخرون. أظهرت (2011) أن الاجتثاث المحدد للزناز المعتمد على السيكلين 5 (Cdk5) في الخلايا العصبية الهرمية CA1 أو CA3 يضعف توحيد الذاكرة أو استرجاعها ، على التوالي [58]. ومن المثير للاهتمام أن Cdk5 هو هدف المصب لـ ΔFosB [59] وتشارك في تنظيم اللدونة متشابك [60]. لذلك ، يمكن أن ينطوي التعبير ΔFosB الناجم عن التمرين على تنظيم اللدونة المشبكية من خلال تنشيط Cdk5 في حقلي CA1 و CA3.
وفي الختام
على الرغم من أن نوبات التمارين الحادة كانت معروفة في حثها على التعبير عن البروتينات الجينية المبكرة في منطقة قرن آمون ، فإن الدراسة الحالية توفر أول دليل على أن التمرين المنتظم طويل الأمد يحفز بشكل كبير تعبير ΔFosB في كامل قرن آمون hippocampus. ثهو تحريض موحد من ΔFosB يدعم الفهم الحالي بأن التمرين هو تدخل غير دوائي فعال قادر على تحسين وظائف الحصين المتعددة. جنبا إلى جنب مع الارتباط الكبير بين تعبير FosB / ΔFosB وتكوين الخلايا العصبية ، فإن هذه البيانات هي استفزازية وتشير إلى الحاجة إلى مزيد من الدراسات التي تحدد دور ΔFosB في التوسط في آثار التمرين على وظيفة قرن آمون ، بما في ذلك تكوين الخلايا العصبية neurogenesis.
بيان التمويل
مراجع حسابات