PSMC5 ، وهو 19S Proteasomal ATPase ، ينظم عمل الكوكايين في Numleus Accumbens (2015)

بلوس واحد. 2015 مايو 11، 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, ناكامورا تي3, اهنو م4, كينيدي PJ5, ياسويوكي يا6, نيشي أ7, أبدا8, تسوزوكي تي4, Nestler EJ5.

ملخص

ΔFosB هو عامل نسخ ثابت يتراكم في النواة المتكئة (NAc) ، وهي جزء أساسي من دائرة المكافأة في الدماغ ، استجابةً للتعرض المزمن للكوكايين أو غيره من العقاقير المخدرة. في حين أن ΔFosB معروف بتغيره مع أحد أفراد عائلة Jun لتشكيل مركب عامل نسخ نشط ، لم يكن هناك حتى الآن استكشاف مفتوح لشركاء ربط محتملين آخرين لـ ΔFosB في الدماغ. هنا ، باستخدام مقايسات الخميرة ثنائية الهجين ، نحدد PSMC5 - المعروف أيضًا باسم SUG1 ، وهو وحدة فرعية تحتوي على ATPase من مجمع البروتوزومال 19S - كبروتين متفاعل جديد مع ΔFosB. نتحقق من هذه التفاعلات بين ΔFosB و PSMC5 الذاتية في NAc ونوضح أن كلا البروتينين يشكلان أيضًا مجمعات مع بروتينات تنظيمية للكروماتين أخرى مرتبطة بتنشيط الجينات. نستمر في إظهار أن الكوكايين المزمن يزيد مستويات PSMC5 النووية ، وليس السيتوبلازمية ، في NAc وأن الإفراط في التعبير عن PSMC5 في منطقة الدماغ هذه يعزز الاستجابات الحركية للكوكايين. تصف هذه النتائج معًا آلية جديدة تساهم في تصرفات ΔFosB ، وللمرة الأولى ، تورط PSMC5 في اللدونة الجزيئية والسلوكية التي يسببها الكوكايين.

تنويه: Ohnishi YH، Ohnishi YN، Nakamura T، Ohno M، Kennedy PJ، Yasuyuki O، et al. (2015) PSMC5 ، وهو 19S Proteasomal ATPase ، ينظم عمل الكوكايين في النواة المتكئة. PLoS ONE 10 (5): e0126710. دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710

محرر أكاديمي: James Edgar McCutcheon، University of Leicester، UNITED KINGDOM

تم الاستلام: كانون الأول (ديسمبر) 10 ، 2014 ، قبلت: أبريل شنومكس، شنومكس. نشرت: 11 مايو 2015

حقوق النشر: © 2015 Ohnishi et al. هذا هو مقال مفتوح الوصول موزعة وفقا لشروط رخصة المشاع الإبداعي، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط أن يُنسب إلى المؤلف الأصلي والمصدر

توافر البيانات: جميع البيانات ذات الصلة داخل الصحيفة.

التمويل: تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات ومؤسسة Ishibashi والجمعية اليابانية للنهوض بالعلوم (أرقام KAKENHI: 24591735 و 26290064 و 25116010). لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو تحليلها أو قرار نشرها أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

المُقدّمة

ΔFosB ، منتج مقطوع لل FosB تنتمي إلى عائلة Fos لعوامل النسخ ، والتي تتضمن أيضًا c-Fos ، FosB بالطول الكامل ، Fra-1 ، و Fra-2. ΔFosB ، مثل بروتينات Fos الأخرى ، يتجانس مع بروتين عائلة جون - c-Jun، JunB ، أو JunD - لتشكيل عامل انتساخ عامل AP-1 (منشط البروتين - 1) النشط ، الذي يحرض أو يثبط التعبير عن جينات معينة مستهدفة [1,2].

لقد ثبت أن ΔFosB تلعب دوراً رئيسياً في إدمان المخدرات [2]. فريد بين بروتينات عائلة فوس ، يتراكم في النواة المتكئة (NAc) ومناطق الدماغ الأخرى ذات الصلة بالمكافأة بعد تعاطي الدواء المتكرر بسبب ارتفاع مستوى ثباتها [3,4] ، والذي يتم توسطه بسبب نقص نطاقات ديجرون C-terminal وبواسطة الفسفرة بواسطة العديد من البروتينات kinases [5-7]. يتسبب هذا الحث لـ ΔFOSB في NAc في زيادة الاستجابات السلوكية لعقاقير الإساءة. وهكذا ، فإن الإفراط في التعبير عن ΔFosB في هذه المنطقة الدماغية من الحيوانات البالغة ، إما باستخدام ناقلات فيروسية أو فئران ذات صفة محرضة ، يؤدي إلى زيادة حساسية الحيوان للتأثيرات الحركية والمجزية للكوكايين والأفيونات ، بالإضافة إلى دوافع الحيوان لإدارة الذات. الكوكايين7-11]. على العكس من ذلك ، يؤدي الإفراط في التعبير عن المضادات السلبية السائدة لـ ΔFosB إلى ظهور الظواهر السلوكية المعاكسة [10-12].

لقد أكدنا نحن وآخرون من قبل ، من خلال استخدام فحوصات تغيير الجل ، أن JunD وربما بروتينات عائلة Jun الأخرى هي الشركاء الملزمين الرئيسيين لـ ΔFosB في الدماغ في الجسم الحي [13-15]. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يكن هناك تقييم مفتوح وغير متحيز لشركاء FOSB الملزمة في الدماغ. هنا ، سعينا لتحديد شركاء ملزمين جدد لـ ΔFosB باستخدام اختبار هجين الخميرة16,17]. كشفت بياناتنا أن PSMC5 ، المعروف أيضًا باسم SUG1 ، هو شريك قوي لـ ΔFosB سواء في المختبر أو في NAc في الجسم الحي ، حيث ينضم إلى ΔFosB كجزء من مركب تنشيط النسخ الناجم عن الكوكايين ، والذي يحتوي أيضًا على CBP (بروتين ربط CREB) ) و p300 - كلا من أسيتيل ترانسفيريز (HATs) - مثل برغكسنومكس (بروتين إعادة عرض الكروماتين). نذهب لإظهار أن التعرض المزمن للكوكايين يغير المستويات النووية لل PSMC1 ، وحدة فرعية تحتوي على ATPase من مجمع 5S proteasomal ، في NAc وأن PSMC19 بدوره يتحكم في الاستجابات السلوكية للكوكايين.

المواد وطرق

الخميرة اثنين الهجين الفرز

خضعت خلايا الخميرة MaV203 (تكنولوجيات Invitrogen Life) للاصابة بالعدوى مع pDBLeu لقيادة شظايا مختلفة من البروتين ΔFosB ، وتم استعارة مكتبة للدماغ في pPC86 (Invitrogen Life Technologies). نمت الخلايا المحولة على SC- متوسطة تفتقر إلى leucine ، التريبتوفان ، والحامضين ، وتحتوي على 10 mM من 3-aminotriazole. الربط بين أجزاء FosB وشريك مرشح يحث على ثلاثة جينات مراسل (His3, Ura3و LacZ) ، والحث الذي يجعل المحولات قادرة على البقاء على قيد الحياة تحت الظروف المثقف المستخدمة. تم إعادة اختبار النسخ المستنسخة الإيجابية بشظايا pDBLeu-ΔFosB الطازجة من خلال اختبارات إعادة التحويل في خلايا MaV203.

خطوط الخلية

تم الحفاظ على خلايا الورم الأرومي العصبي في Mouse Neuro 2A (ATCC) في الوسط الأساسي الأدنى من Eagle (EMEM) (ATCC) ، مع استكماله بنسبة 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2. كانت خلايا الجرذ 1A هدية من Yusaku Nakabeppu (فوكوكا ، اليابان) [18[وصيانتها في Dulbecco MEM (DMEM) (تقنيات الحياة) ، تستكمل مع 10 ٪ FBS في 37 ° C و 5 ٪ CO2. تم تحقيق ترنسفكأيشن الخلايا مع الحمض النووي البلازميد باستخدام Effectene (Qiagen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

يبني PSMC5 و ΔFosB

تم إنشاء العديد من أشكال متحولة من PSMC5 ، كل FLAG الموسومة في N-terminus ، لاستخدامها في immunoprecipitation أو تجارب نقل الجينات الفيروسي بوساطة. وشملت هذه: PSMC5-K196M ، PSMC5-Δcoiled-coil domain (PSMC5-ΔCC ، تفتقر إلى الأحماض الأمينية 27-68) ، PSMC5-NT (تتكون من جزء N-terminal من البروتين ، والأحماض الأمينية 1-151) ، و PSMC5 -CT (تتكون من جزء C-terminal من البروتين ، والأحماض الأمينية 172) (انظر التين 1). لقد استخدمنا أيضًا نماذج N-terminal التي تحمل علامة MYC من نوع wildtype ΔFosB بالإضافة إلى ΔFosB مع طفرة في مجال leucine-zipper الخاص بها (تحور الأحماض الأمينية 182 إلى 205 المعروف بتطهير نسبة التباين مع بروتينات عائلة Jun [6].

صورة مصغرة
الشكل 1. ΔFosB يربط إلى PSMC5 في المختبر.

 

A. تخطيطي من ΔFosB ، ΔFosB-LZM حيث يتم طفر مجال السحاب leucine لطمس heFosB heterodimerization مع بروتينات يونيو ، و Δ2ΔFosB التي تفتقر إلى 78 الأحماض الأمينية الأولى من ΔFosB N-terminus. باء تخطيطي PSMC5 ، PSMC5-NT الذي يتألف من 151 الأحماض الأمينية 5 الأولى من PSMC5 ، PSMC235-CT التي تفتقر إلى 5 الأحماض الأمينية الأولى من PSMC5 ، و PSMC28-ΔCC التي تفتقر إلى مجال الملف الملفوف (الأحماض الأمينية 68 - 2.4) . يتوافق مجال AAA مع فكرة ، ATPases المرتبطة بأنشطة خلوية متنوعة ، موجودة في العديد من ATPases. C. 3.1 ofg من PCDNA1-ΔFosB (الممرات 4 – 5) أو ΔFosB-LZM (حارة 2.4) تم تشبيكها مع 5 μg من PSMC2 المعلمة بعلامة FLAG أو مختلف الحشرات في خلايا Neuro5a. بعد يومين من ترنسفكأيشن ، كانت lysed الخلايا وتعرضت إلى immunoprecipitation مع الأجسام المضادة لمكافحة FLAG ثم غارقة الغربية مع الأجسام المضادة لمكافحة ΔFosB أو مكافحة FLAG. لاحظ أن ΔFosB ، ولكن ليس ΔFosB-LZM ، يرتبط بقوة بـ PSMC5 أو PSMC5-NT ، ولكن ليس PSMC5-CT أو PSMCXNUMX-ΔCC. تم تكرار البيانات المعروضة في الشكل في ثلاث نسخ في كل من التجارب الثلاث المنفصلة.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

أشكال حيوانات

استخدمت الفئران الذكور (مختبر جاكسون) Nine- إلى 11-week-old-week لجميع التجارب. تم إيواء الحيوانات في دورة ضوء الظلام 57-h مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء libitum الإعلانية وكانوا يعتادون 1 أسبوع قبل التجريب. تم استخدام نظامين لعلاج الكوكايين. لدراسة التأثيرات البيوكيميائية للكوكايين ، أعطيت الحيوانات جرعات يومية من الكوكايين 7 (20 mg / kg) أو محلول ملحي ، وتم قتلها بقطع الرأس 24 hr بعد الحقن الأخير. هذا هو بروتوكول قياسي ، والذي ثبت أن ينتج العديد من الاستجابات الجزيئية والخلوية لهذا الدواء [7]. لدراسة تأثير PSMC5 في النواة المتكئة على الاستجابات السلوكية للكوكايين ، استخدمنا جرعة تحتية من الدواء (7.5 mg / kg ؛ انظر تحسس الحركي أدناه) على أساس الفرضية القائلة بأن PSMC5 ، مثل ΔFosB ، يزيد من حساسية الحيوان ل الكوكايين8]. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جبل سيناء.

Immunoprecipitation والنفحة الغربية

تم transfected الخلايا العصبية 2A مع أشكال wildtype أو متحولة من PSMC5. بعد يومين من ترنسفكأيشن ، تم غسل الخلايا في PBS ، المحسوس في RIPA buffer (50 mM Tris pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1٪ NP-40 ، 0.25٪ deoxycholate الصوديوم ، 10 mM sodium sodium ، زبدة ، مثبطات إنزيم البروتياز) . تم تقسيم Lysates وحضنت مع أي IgG (Sigma) nonimmune أو الأجسام المضادة FLAG (Sigma) ل 3 hr في 4 ° C. تم إجراء Immunoprecipitation مع حبات البروتين G (Invitrogen) كما هو موضح [19]. باختصار ، تم إخضاع البروتينات المنجزة مناعية إلى SDS-PAGE وتحليلها بواسطة النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة لـ FosB / ΔFosB (تقنية تشوير الخلية) على أساس البروتوكولات المنشورة [7]. لفحوصات ارتباط البروتين في الجسم الحي ، استخدمنا الكسور النووية المنقاة من NAc-dissected من الفئران بعد المعالجة المزمنة للكوكايين (20 mg / kg IP يومياً لـ 7 days ، مع استخدام الفئران 24 hr بعد الحقن الأخير). تم إجراء التعايش المناعي المشترك من الكسور النووية باستخدام المجموعة النووية Co-IP Kit (Active Motif) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم استخدام الأجسام المضادة التالية: MYC أو ß-actin ، تقنية الإشارة الخلوية (Danvers ، MA) ، PSMC5 و Histone H3 ، Abcam (Cambridge ، MA) ، CBP ، p300 و BRG1 ، Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz، CA) ، و FLAG M2، Sigma.

المناعية

تم إجراء الكيمياء المناعية وفقا للإجراءات المنشورة20]. تم تخدير الفئران و perfused intracardially مع بارافورمالدهيد 4 في PBS. تم cryoprotected الدماغ مع 30 ٪ السكروز ، ثم تجميدها وتخزينها في 80 ° C حتى استخدامها. تم قطع المقاطع التاجية (40 μm) على ناظم البرد ومعالجتها من أجل الكيمياء المناعية. تم تحضين الأقسام الحرة العائمة في مخزن عازلة يحتوي على 0.3٪ Triton و 3٪ من مصل الحمير العادي. تم الكشف عن ΔFosB باستخدام الأجسام المضادة للبولكلونيل الماعز مرفوعة ضد جزء N-terminal من البروتين (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). تم الكشف عن PSMC5 باستخدام أضداد polyclonal أرنب (1 / 100 Abcam ، كامبردج ، MA). تم التقاط الصور باستخدام مجهر مبائر (تكبير 60x ، زايس).

التحسس الحركي

تلقت جميع الفئران حقن IP يوميا من المياه المالحة للأيام 3 لتعويدهم على ضغوط من الحقن. في اليوم التالي ، تم حقن الفئران IP بالمحلول الملحي أو جرعة مغمورة من الكوكايين (7.5 mg / kg ؛ انظر تحت الحيوانات أعلاه) ووضعها على الفور في صناديق جذعية جديدة. تم تسجيل النشاط الحركي للفئران باستخدام نظام photobeam كما فواصل شعاع الإسعافية ل 30 دقيقة. تم تكرار هذه العلاجات يوميا لمدة أيام 3.

نقل الجينات الفيروسي

استخدمنا أساليب منشورة على نطاق واسع لنقل الجينات بواسطة الفيروسيين [7,8,11,19]. باختصار ، تم نقل بلازميدات التعبير لـ PSMC5 أو للعديد من طفراته (انظر PSMC5 و ΔFosBs المبينة أعلاه) إلى subconed bicistronic p1005 (+) HSV معربا عن GFP تحت سيطرة المروج CMV ، و PSMC5 أو متحولاته تحت ذلك من IE4 / 5 promoter. في ظل الكيتامين (100 ملغ / كغ) / زيلازين (10 ملغ / كغ) التخدير ، تم وضع الفئران في أداة التجسيمي الحيوانات الصغيرة ، وتعرض سطح الجمجمة. تم استخدام ثلاثة وثلاثين إبرة حقنة قياسية لإخراج 0.5 μ ل من متجه HSV إلى NAc بزاوية 10 (AP + 1.6؛ ML + 1.5 و DV-4.4) بمعدل 0.1 μl / min. سمح للحيوانات التي تتلقى حقن HSV بالاسترداد في الأيام 2 بعد الجراحة قبل إجراء التجربة.

إحصائيات

تم استخدام ANOVAs واختبارات t للطالب ، وتم تصحيحها لمقارنات متعددة ، مع تحديد الأهمية عند p <0.05.

النتائج

PSMC5: شريك ملزم جديد لـ ΔFosB

أجرينا تجارب أولية لتحديد جزء مناسب من ΔFosB التي خدمت كطعم في اختبار هجين ثنائي الخميرة دون تفعيل النظام. تسبب Holo-ΔFosB نشاط الجينات المراسل من تلقاء نفسه ، كما فعلت NN الطرفية 1 - 78 جزء من الأحماض الأمينية من البروتين. ومع ذلك ، فإن N-terminal مقطوعة ΔFosB (الشكل 1A) ، التي يطلق عليها "2ΔFosB" ، التي تفتقر إلى أحماض 78 الأمينية للبروتين ، لم يكن لها هذا التأثير. لذلك ، استخدمنا Δ2ΔFosB كبروتين الطُعم.

للكشف عن شركاء الربط المحتملين ، استخدمنا مكتبة لدماغ الفأر تحت فئة pPC86. حددنا المرشحين 11 لشركاء ملزمين. على الرغم من أن هذه البروتينات شملت شركاء heFosB المعروفين لمتعايشة الغدد الصماء ، c-Jun و JunD (الجدول 1) ، وكان المرشح الأكثر انتشارا حتى الآن PSMC5. في حين كان هذا مفاجئًا ، فقد كان هذا اكتشافًا مثيرًا للاهتمام ، حيث تم عرض PSMC5 في تقرير واحد منذ سنوات لربط c-Fos في المختبر [21]. ومع ذلك ، لا توجد تقارير سابقة عن مشاركة PSMC5 في عمل الكوكايين. ومع ذلك ، وبسبب قوة إشارة PSMC5 في اختبار الهجين ثنائي الخميرة ، شرعنا في إجراء مزيد من الدراسة لتفاعلات ΔFosB-PSMC5 الممكنة.

صورة مصغرة
جدول 1. نتائج فحص الخميرة اثنين الهجين مع Δ2ΔFosB.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

أولاً ، للتأكيد على التفاعل المادي بين ΔFosB و PSMC5 ، أجرينا تجارب في التجارب المناعية المشتركة. وجدنا أن FLAG-tagged PSMC5 (الشكل 1B) ، transfected إلى الخلايا العصبية 2A ، سحبت بفعالية أسفل ΔFosB (الشكل 1C). ثانيًا ، لتحديد المنطقة في PSMC5 المسؤولة عن ربطها بـ ΔFosB ، أنشأنا العديد من المسوحات PSMC5 التي تحمل علامة FLAG (الشكل 1B) وكرر تجربة coun immunoprecipitation. تم سحب ΔFosB بشكل فعال مع الأحماض الأمينية N-terminal 151 من PSMC5 (PSMC5-NT) ، ولكن ليس مع جزء 172 من الأحماض الأمينية من البروتين (PSMC5-CT) (الشكل 1C). كان PSMC5 تفتقر إلى مجال ملفوف الملفوف (PSMC5-ΔCC) أيضا غير فعالة في عجل ΔFosB. هذه النتائج تشير إلى أن PSMC5 بربط ΔFosB عبر المجال ملفوف لفائف (الأحماض الأمينية 27 - 68). علاوة على ذلك ، لم يعجل PSMC5 الذي يحمل علامة FLAG شكلاً متحولة من ΔFosB مع مجال سحاب leusine متحور (ΔFosB-LZM) (الشكل 1C) ، مما يشير إلى أن ΔFosB تربط إما PSMC5 عبر هذا النطاق أو ، على الأرجح ، أن heFosB heterodimerization مطلوب لربط PSMC5.

PSMC5-ΔFosB ملزمة في NAc بعد إدارة الكوكايين المزمن

استناداً إلى هذه النتائج في المختبر ، درسنا ما إذا تم تغيير مستويات PSMC5 في NAc استجابة لإدارة الكوكايين المزمن. وجدنا من خلال تجزئة التحت خلوي والتكتل الغربي أن الكوكايين المزمن يزيد من المستويات النووية من PSMC5 في هذه المنطقة الدماغية دون تغيير في المستويات السيتوبلازمية (الشكل 2A). لم يلاحظ هذا التأثير بعد تناول جرعات واحدة من الكوكايين (لا تظهر البيانات). بعد ذلك قمنا بفحص توطين PSMC5 و ΔFosB في NAc عن طريق الفحص المجهري المناعي. قمنا بتحليل الفئران 24 hr بعد آخر جرعة مكررة من الكوكايين ، وهي نقطة زمنية عندما يكون ΔFosB الوحيد القابل للاكتشاف FosB منتج جيني (انظر Nestler 2008). لقد وجدنا فعالية مناعية قوية لـ PSMC5 في NAc ، بما في ذلك إشارة نووية قوية. ~ 85٪ من ΔFosB + nuclei co-stained for PSMC5 (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تجارب coun immunoprecipitation على مستخلصات NAc ووجدنا أنه بعد المعالجة المزمنة للكوكايين ، تم سحب ΔFosB بشكل فعال بواسطة جسم مضاد لـ PSMC5 (الشكل 2C). في المقابل ، كشف تحليل NAc المخدرات-السذاجة (بعد الحقن المكررة المتكررة) لا يمكن الكشف عنها ΔFosB سحب (لا تظهر البيانات). هذه البيانات تتفق مع النتائج التي توصلنا إليها في زراعة الخلايا وتأكد من أن ΔFosB و PSMC5 يتفاعلان في NAc في الجسم الحي.

صورة مصغرة
الشكل 2. تنظيم PSMC5 في الماوس NAc.

 

النشاف الغربي للكسور النووية والخلوية من NAc للفئران المعالجة يوميًا بمحلول ملحي أو كوكايين (20 مجم / كجم) لمدة 7 أيام ، مع تحليل الحيوانات بعد 24 ساعة من الحقن الأخير. يزيد الكوكايين من مستويات PSMC5 النووية ولكن ليس عصاري خلوي. تم استخدام هيستون H3 و بيتا-أكتين ، والتي لم تتأثر بالكوكايين ، كعناصر تحكم في التحميل. البيانات تعني ± SEM (ن = 8-10 / مجموعة ، * ف <0.05). ب. التوطين المشترك لـ PSMC5 الداخلي (أخضر) و FosB (أزرق) في NAc للفئران المعالجة بشكل مزمن بالكوكايين كما هو الحال في AC النووية lysates من الماوس NAc بعد تعرض علاج الكوكايين المزمن للترسيب المناعي مع الأجسام المضادة لـ PSMC5 أو الفئران IgG كعنصر تحكم ، ثم تم مسح الغرب بأجسام مضادة مضادة لـ FosB / ΔFosB. يوضح الشكل تفاعلات PSMC5-ΔFosB في NAc في الجسم الحي. تم تكرار البيانات في B و C في ثلاث نسخ في كل من التجارب الثلاثة المنفصلة.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 يعزز التعبير ΔFosB في المختبر

نظرًا لأن PSMC5 عضو معروف في مجمع proteasome ، فقد اختبرنا ما إذا كان ينظم مستويات ΔFosB باستخدام خلايا 1A من الجرذ. لم يكن للفرط المفرط لـ PSMC5 أي تأثير على المستويات القاعدية لـ ΔFosB ، ولكنه تسبب في تحسن صغير لكن مهم في تحفيز ΔFosB عند تحفيز الخلايا في المصل (الشكل 3A). وقد شوهد اتجاه مماثل بالنسبة لـ FosB كامل الطول ولكن التأثير لم يحقق دلالة إحصائية. على العكس من ذلك ، فإن تثبيط تعبير PSMC5 الداخلي في خلايا 1A من الجرذ ، والذي تم تحقيقه باستخدام siRNAs التي تستهدف PSMC5 ، لم يؤثر على مستويات ΔFOSB القاعدية ولكنه كان يمنع بشدة تحريض ΔFosB بواسطة تحفيز المصل (الشكل 3B). شوهدت تأثيرات مشابهة لـ FosB كامل الطول. تشير هذه البيانات إلى أن PSMC5 لا يروج للتدهور البروتيزومي لـ ΔFosB ، كما يمكن توقعه كوحدة أساسية أساسية للبروتيسوم ، ولكن بدلاً من ذلك مطلوب لتراكم الحد الأقصى من FosB المنتجات الجينية في المختبر ، ربما من خلال تثبيت البروتينات.

صورة مصغرة
الشكل 3. تنظيم PSMC5 لتعبير FosB / ΔFosB في خلايا 1A من الجرذ.

 

تم نقل خلايا الفئران 1A باستخدام 4 ميكروغرام من PSMC5 أو الحمض النووي الضابط. لم يكن للإفراط في التعبير PSMC5 أي تأثير على مستويات التعبير القاعدية لبروتين FosB أو BFosB كما هو محدد بواسطة النشاف الغربي ، لكنه أنتج زيادة صغيرة ولكن مهمة في تحريض ΔFosB عن طريق تحفيز المصل (F (2,21،9.75) = 0.001 ، p = 1). تم نقل خلايا B. الفئران 5A باستخدام 5 pmol من أي من اثنين من siRNAs أو RNA مخلوط (التحكم). خفض كل من siRNAs بشكل فعال مستويات بروتين PSMC1 مقارنة بظروف التحكم (siRNA # 23 ، 5 ± 2٪ من التحكم ؛ siRNA # 18 ، 6 ± 0.05٪ ؛ p <4 ؛ n = 5). لم يكن لضربة قاضية PSMC2,6 أي تأثير على المستويات القاعدية من FosB أو ΔFosB ولكنها خففت من تحريض كل من FosB و ΔFosB عن طريق تحفيز المصل (FosB: F (20.99،0.002) = 2,6، p = 22.83؛ ؛FosB: F (0.002،XNUMX) = XNUMX ، ص = XNUMX).

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

formFosB و PSMC5 شكل مجمعات مع CBP و p300 و BRG1 في NAc

لفهم آليات النسخ بشكل أفضل التي قد تؤثر فيها PSMC5 على وظيفة ΔFosB ، قمنا بالتحقق من شركاء الربط الإضافيين المحتملين للبروتينين في NAc في ظروف المعالجة المزمنة للكوكايين. هناك تقرير واحد بأن PSMC5 يرتبط بـ CBP - وهو HAT - ويزيد من أستلة H3 الهستمية في المروج القريب MHC-II في خلايا هيلا [22]. وعلاوة على ذلك ، خفضت الفئران التي تعاني من نقص في CBP حساسية سلوكية للكوكايين وكذلك خفض أستلة هيستون في FosB المروجين [23]. لذلك قمنا باختبار ما إذا كان PSMC5 قد يرتبط بـ ΔFosB كجزء من المجمعات التي تحتوي أيضًا على CBP وربما غيرها من المنشطات النسخية.

لقد أوضحنا أولاً أن ΔFosB قد نجح في تقليل كل من CBP و p300 ، وهي خلايا HAT ذات صلة ، في خلايا Neuro2A (الشكل 4A). في المقابل ، لا يظهر شكل متحول سحاب لويزين من ΔFosB ، كما هو متوقع ، هذا النشاط. وبالمثل ، سحبت PSMC5 على نحو فعال أسفل CBP و p300 (الشكل 4B). ومن المثير للاهتمام أن هذا التأثير قد شوهد أيضًا في PSMC5-ΔCC ، والذي لم يسحب إلى أسفل ΔFosB ، مشيرًا إلى أن PSMC5 يتفاعل مع CBP و p300 عبر مجالات أخرى للبروتين وبشكل مستقل عن ارتباطه بـ ΔFosB.

صورة مصغرة
الشكل 4. تتفاعل ΔFosB و PSMC5 مع CBP و p300 و BRG1 في المختبر وفي الجسم الحي.

 

تم transfected A. خلايا Neuro2A مع 2.4 ميكروغرام من MYC الموسومة ΔFosB أو MYC الموسومة ΔFosB-LZM. كانت immunoprecipitated خلاصات الخلايا مع الأجسام المضادة لمكافحة CBP أو ضد p300 ، والرواسب كانت غارقة الغربية مع نفس الجسم المضاد أو مع الأجسام المضادة لمكافحة MYC. تتفاعل كل من CBP و p300 مع ΔFosB وتتطلب مثل هذه التفاعلات سحاب ليوسن سليم. تم transfected باء الخلايا Neuro2A مع 2.4 ميكروغرام من FLAG الموسومة PSMC5 أو FLAG الموسومة PSMC5-ΔCC. كانت immunoprecipitated خلاصات الخلايا مع الأجسام المضادة لمكافحة CBP أو ضد p300 ، والرواسب كانت غارقة الغربية مع نفس الجسم المضاد أو مع الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تتفاعل كل من CBP و p300 مع PSMC5 ولا تتطلب مثل هذه التفاعلات نطاق CC. تم إخضاع lysates من الفئران النووية NAc بعد المعالجة المزمنة للكوكايين للتعرض المناعي للجسم المضاد CBP أو anti-p300. أظهر النشاف الغربي اللاحق للرواسب الناتجة مع الأجسام المضادة لـ FosB / ΔFosB تفاعلات داخلية بين ΔFosB و CBP / p300. تم إخضاع D. Aliquots من نفس المحللات النووية للإصابة المناعية مع الأجسام المضادة لـ BRG1 أو anti-PSMC5 ، متبوعة بالنبض الغربي للرواسب مع الأجسام المضادة لـ FosB / ΔFosB أو Anti-BRG1. تظهر النتائج تفاعلات داخلية بين ΔFosB و BRG1 و BRG1 و PSMC5. E. توضيح تخطيطي لمجمع التنشيط النسجي المكون من ΔFosB: تفاعلات مجسمة JunD تتفاعل مع CBP / p300 و BRG1 و PSMC5.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

للتأكد من أن هذه التفاعلات تحدث أيضًا في الجسم الحي ، قمنا بإدارة الكوكايين بشكل مزمن للحث على مستويات ΔFOSB و PSMC5 النووية ، ثم مقتطفات NAc مناعية مع مضادات CBP أو anti-p300. تمشيا مع بيانات ثقافة الخلية لدينا ، انسحبت المناعية من CBP أو من p300 على نحو فعال لأسفل ΔFosB (الشكل 4C). اختبرنا ما إذا كانت BRG1 ، وهي وحدة أساسية من وحدة إعادة عرض chromatin SWI-SNF ، قد ترتبط أيضًا بـ ΔFosB و PSMC5 ، استنادًا إلى اكتشافنا السابق بأن BRG1 يتم تجنيده لجينات مستهدفة ΔFosB معينة بالتنسيق مع تنشيطها في NAc بعد الكوكايين المزمن [24]. وجدنا أن مناعة BRG1 انخفض إلى أسفل ΔFosB في مقتطفات NAc ، و immunoprecipitation من PSMC5 وبالمثل copgramipitated BRG1 الذاتية (الشكل 4D). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن ΔFosB-PSMC5 تشكل مجمعات في NAc تتضمن أيضًا CBP / p300 و BRG1 (الشكل 4E).

يزيد overcompression PSMC5 ردود فعل الحركي إلى الكوكايين

لقد دفعنا الارتباط البارز لـ PSMC5 مع ΔFosB في NAc إلى التحقق مما إذا كانت زيادة مستويات PSMC5 في هذه المنطقة الدماغية تنظم الاستجابات السلوكية للكوكايين. أنشأنا ناقل فيروسات Herpes Simplex (HSV) الذي يفرط فيه إما wildtype PSMC5 أو واحد من طفراته وتحقق من المتجهات في NAc في الجسم الحي (الشكل 5A). يسود التعبير الفيروسي لـ PSMC5 في نواة الخلية (الشكل 5B). لم تظهر الفئران المبالغة في تضخيمها من النوع البري (PSMC5) استجابات متغيرة للجرعات الأولية من الكوكايين ، لكنها أظهرت زيادة في تنشيط الحركي استجابة للجرعات المتكررة من الكوكايين مقارنة مع الفئران التي تتحكم في GFP. على النقيض من ذلك ، فإن الفئران التي تضخم شكل متحولة من PSMC5 الذي يفتقر إلى مجال الملف الملفوف (PSMC5-ΔCC) لم تظهر هذا التأثير (الشكل 5B). ومن المثير للاهتمام ، أن الإفراط في إفراز PSMC5-K196M ، الذي يفتقر إلى نشاط ATPase لبروتين wildtype ، يستجيب أيضًا للاستجابات الحركية للكوكايين.

صورة مصغرة
الشكل 5. يزيد إفراز PSMC5 في NAc من الاستجابة الحركية للكوكايين.

 

ألف التعبير الجيني ممثل بوساطة HSV في NAc الإنسي. AC ، الصوار الأمامي. تمت الإشارة إلى المناطق الفرعية الأساسية NAc والقذيفة في الشكل. ب. تكبير أعلى تمثيليًا (60x) للتلطيخ الكيميائي الهيستولوجي المناعي لـ PSMC5 في الخلايا العصبية NAc بعد حقن HSV-PSMC5 الذي يُظهر أن البروتين هو في الغالب نووي كما يتضح من تلطيخ DAPI. تلقت الفئران حقنًا ثنائية من فيروس الهربس البسيط في NAc متبوعة بحقن IP يومية بجرعات منخفضة من الكوكايين (7.5 مجم / كجم). تظهر الاستجابات الحركية استجابة لأول وآخر 3 جرعات يومية من الدواء. يزيد التعبير المفرط عن PSMC5 أو PSMC5-K196M من استجابات الحركة للكوكايين المتكرر ، وهو تأثير لم يُلاحظ مع PSMC5-ΔCC. لم يكن هناك تأثير كبير للجينات المحورة على الاستجابات الحركية لجرعات الكوكايين الأولية. ANOVA F (3,125،4.163) = 0.05 ، * p <XNUMX بواسطة اختبار Dunnett اللاحق.

دوى: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

مناقشة

تكشف نتائج الدراسة الحالية عن آلية جديدة تتوسط بها ΔFosB آثاره على الدماغ وآلية جديدة تشارك في عمل الكوكايين. باستخدام نهج غير متحيز ، اختبار الخميرة ثنائي الهجين ، حددنا PSMC5 كشريك ملزم جديد لـ ΔFosB. نحن التحقق من صحة هذه النتيجة سواء في الخلايا المثقوبة في المختبر وفي NAc في الجسم الحي من خلال إظهار ملزمة PSMC5-ΔFosB قوية. الأهم من ذلك ، يتم تحفيز المستويات النووية من PSMC5 في NAc من قبل إدارة الكوكايين المزمن. أظهرنا كذلك أن الربط PSMC5-ΔFosB يحدث بالتنسيق مع العديد من بروتينات التنشيط الاستنساخية الأخرى ، وبالتحديد CBP و p300 (اثنين من HATs) و BRG1 (مكون أساسي من معقدات إعادة عرض الكروماتين SWI-SNF). معًا ، تدعم نتائجنا الفرضية القائلة بأن PSMC5 هو جزء من مجمع التنشيط النسخي الذي يتم تجنيده إلى جينات معينة على الأقل Δ FosB خلال دورة إدارة الكوكايين المزمن (الشكل 4E). بالتوافق مع هذه الفرضية ، فإن النتيجة الإضافية التي تشير إلى أن الإفراط في التعبير عن PSMC5 في NAc ، مثل overexpression لـ ΔFosB نفسه ، يعزز الاستجابات السلوكية للكوكايين. سيكون من المثير للاهتمام في الدراسات المستقبلية لمتابعة هذه الملاحظات في الجسم الحي مع توصيف تفاعلات PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 عن طريق استخدام فحوصات المختبر في المختبر.

إشراك PSMC5 في عمل الكوكايين هو جديد تماما. تم تعريف PSMC5 في البداية كعضو في عائلة كبيرة من ATPases تشتمل على proteasome ، وقد تم عرضه على مر السنين للتفاعل مع العديد من عوامل النسخ ، بما في ذلك c-Fos و p53 ومستقبلات الهرمونات النووية ومكونات مجمع النسخ الأساسي [25] ، ومع ذلك ، فقد أجريت بعض الدراسات الوظيفية على مر السنين [26]. إن أفضل عمل يقوم به هو تعزيز نشاط عوامل النسخ MYC في الخلايا المستزرعة27]. واقترح ضمنا PSMC5 في آليات النسخ دورًا محتملاً لنشاط ubiquitination-proteasomal في تنظيم النسخ الجيني ، ولكن مشاركة PSMC5 في مثل هذا التنظيم تظل غير مختبرة حتى الآن [28,29].

القليل جدا معروف عن وظيفة PSMC5 في الدماغ. أظهرت دراسة سابقة تعبيرًا واسع النطاق عن الحمض الريبوزي الحرفي (PSMC5 mRNA) في جميع أنحاء الدماغ [30] ، ولكن نشاطه الوظيفي ظل غير مدروس. توحي نتائجنا الآن بإجراء المزيد من التحريات حول هذا البروتين المثير للاهتمام لفهم دوره بشكل أفضل في تنظيم عملية النسخ الجيني وعلاقته بوظيفة البروبيسنوما في الدماغ. يتم توسيط ربط PSMC5 بـ ΔFosB بواسطة مجال الملفوف المضمن في PSMC5. وعلاوة على ذلك ، فإن قدرة PSMC5 على تعزيز الاستجابات الحركية للكوكايين ، بينما تتطلب المجال الملفوف ، لا تتطلب نشاط ATPase الجوهري للبروتين. تثير هذه النتائج إمكانية أنه ، على الأقل في نظامنا ، قد يتم توسط النشاط الرئيسي لـ PSMC5 من خلال ربطه بـ ΔFosB والبروتينات التنظيمية الأخرى غير النسخية وليس من خلال نشاطه المرتبط بالبروتوسومي في حد ذاته. هناك حاجة لمزيد من العمل لاختبار هذه الإمكانيات والبديلة بشكل مباشر. كانت الفرضية القائلة بأن الإفراط الفيروسي عبر الوساطة في PSMC5 قد زادت من الاستجابة الحركية للكوكايين من خلال التفاعلات مع ΔFosB وهو أمر معقول ، على الرغم من استخدام نظام علاج كوكايين 3 اليوم ، لأنه من المعروف أن مستويات عالية من ΔFosB تتراكم في الدماغ خلال هذا الإطار الزمني [3].

وتؤكد النتائج الحالية كذلك فائدة استخدام أساليب تجريبية غير منحازة مفتوحة في دراسة الأساس الجزيئي لتنظيم الدماغ. استند اهتمامنا الأولي إلى PSMC5 فقط إلى ارتباطه البارز بـ ΔFosB في اختبار هجين ثنائي الخميرة ، ومع ذلك يبدو أنه مكون مهم من التغييرات النسخية التي يتم تجنيدها في NAc عن طريق تعاطي الكوكايين المتكرر. فهم أفضل للآليات التفصيلية التي بواسطتها يتم تحفيز المستويات النووية لـ PSMC5 عن طريق الكوكايين ، والتي بدورها تساهم PSMC5 في تكوينات تنشيط النسخ الناجم عن الكوكايين هي محور التحقيقات الحالية. وفي الوقت نفسه ، كشفت مقايسة الخميرة اثنين الهجين عدة شركاء ملزمة إضافية ملزمة من ΔFosB (الجدول 1) والتي تستدعي الآن الفحص المباشر في نماذج الكوكايين. ويساهم هذا العمل معًا في زيادة فهم الآليات الجزيئية المعقدة التي يغير الكوكايين من خلالها وظيفة NAc.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات ، ومن مؤسسة Ishibashi وجمعية اليابان لتعزيز العلوم (أرقام KAKENHI: 24591735 ، 26290064 ، 25116010).

الكاتب الاشتراكات

تصور وتصميم التجارب: YHO YNO EJN. نفذت التجارب: YHO YNO PJK RN. تحليل البيانات: YHO YNO EJN. المواد / الأدوات / أدوات التحليل المسعرة: TN MO OY AN RN TT. كتبت الورقة: YHO EJN.

مراجع حسابات

  1. 1. مورغان JI ، كوران T (1995) الجينات الفورية في وقت مبكر: عشر سنوات. اتجاهات Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) آليات النسخ من الإدمان: دور deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. عرض المادة
  4. مجلات / NCBI
  5. الباحث العلمي من Google
  6. عرض المادة
  7. مجلات / NCBI
  8. الباحث العلمي من Google
  9. عرض المادة
  10. مجلات / NCBI
  11. الباحث العلمي من Google
  12. عرض المادة
  13. مجلات / NCBI
  14. الباحث العلمي من Google
  15. عرض المادة
  16. مجلات / NCBI
  17. الباحث العلمي من Google
  18. عرض المادة
  19. مجلات / NCBI
  20. الباحث العلمي من Google
  21. عرض المادة
  22. مجلات / NCBI
  23. الباحث العلمي من Google
  24. عرض المادة
  25. مجلات / NCBI
  26. الباحث العلمي من Google
  27. عرض المادة
  28. مجلات / NCBI
  29. الباحث العلمي من Google
  30. عرض المادة
  31. مجلات / NCBI
  32. الباحث العلمي من Google
  33. عرض المادة
  34. مجلات / NCBI
  35. الباحث العلمي من Google
  36. عرض المادة
  37. مجلات / NCBI
  38. الباحث العلمي من Google
  39. عرض المادة
  40. مجلات / NCBI
  41. الباحث العلمي من Google
  42. عرض المادة
  43. مجلات / NCBI
  44. الباحث العلمي من Google
  45. عرض المادة
  46. مجلات / NCBI
  47. الباحث العلمي من Google
  48. عرض المادة
  49. مجلات / NCBI
  50. الباحث العلمي من Google
  51. عرض المادة
  52. مجلات / NCBI
  53. الباحث العلمي من Google
  54. عرض المادة
  55. مجلات / NCBI
  56. الباحث العلمي من Google
  57. عرض المادة
  58. مجلات / NCBI
  59. الباحث العلمي من Google
  60. عرض المادة
  61. مجلات / NCBI
  62. الباحث العلمي من Google
  63. عرض المادة
  64. مجلات / NCBI
  65. الباحث العلمي من Google
  66. عرض المادة
  67. مجلات / NCBI
  68. الباحث العلمي من Google
  69. عرض المادة
  70. مجلات / NCBI
  71. الباحث العلمي من Google
  72. عرض المادة
  73. مجلات / NCBI
  74. الباحث العلمي من Google
  75. عرض المادة
  76. مجلات / NCBI
  77. الباحث العلمي من Google
  78. عرض المادة
  79. مجلات / NCBI
  80. الباحث العلمي من Google
  81. عرض المادة
  82. مجلات / NCBI
  83. الباحث العلمي من Google
  84. عرض المادة
  85. مجلات / NCBI
  86. الباحث العلمي من Google
  87. عرض المادة
  88. مجلات / NCBI
  89. الباحث العلمي من Google
  90. 3. Hope BT، Nye HE، Kelz MB، Self DW، Iadarola MJ، Nakabeppu Y، et al. (1994) استقراء مركب AP-1 طويل الأمد يتألف من بروتينات شبيهة بفيروس Fos في الدماغ عن طريق الكوكايين المزمن وغيرها من العلاجات المزمنة. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N ، Brown J ، Haile C ، Ye H ، Greenberg ME ، Nestler EJ (1997) الفئران المتحولة FosB: فقدان تحريض الكوكايين المزمن للبروتينات المرتبطة بـ Fos وزيادة الحساسية تجاه تأثيرات الكوكايين الحركية والمجزية. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397-10402. pmid: 9294222 دوى: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG، Rudenko G، Nestler EJ (2006) Regulation of ΔFosB stability by fhosphorylation. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL، Ohnishi YN، Ohnishi YH، Alibhai IN، Wilkinson MB، Kumar A، et al. (2007) يساهم غياب مجال ديجرون C-terminal المحفوظة في استقرار ΔFosB الفريد. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ، Vialou V، Mazei-Robison M، Feng J، Kourrich S، Collins M، et al. (2013) تتطلب الاستجابات السلوكية والهيكلية للكوكايين المزمن حلقة تغذية مستمرة تنطوي على ΔFOSB و CaMKII في غلاف النواة المتكئة. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB، Chen J، Carlezon WA Jr، Whisler K، Gilden L، Beckmann AM، et al. (1999) التعبير عن عامل النسخ ΔFosB في الدماغ يتحكم في الحساسية للكوكايين. Nature 401: 272 – 276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR، Whisler K، Steffen C، Nestler EJ، Self DW (2003) ΔFosB يعزز الحافز للكوكايين. J Neurosci 23: 2488 – 2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA، Nestler EJ (2003) Regulation of gene expression and cocaine reward by CREB and DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V، Bolanos CA، Selley DE، Theobald D، Cassidy MP، Kelz MB، et al. (2006) ΔFosB: دور أساسي ل ΔFosB في النواة المتكئة في عمل المورفين. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC، Colby C، Perrotti LI، Tekumalla P، Carle T، Ulery P، et al. (2003) ، فإن التعبير المحدد في منطقة الدماغ عن المتحول السلبي السائد لـ c-Jun في الفئران المعدلة وراثيًا يقلل من الحساسية للكوكايين. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J، Nye HE، Kelz MB، Hiroi N، Nakabeppu Y، et al. (1995) تنظيم الدلتا FosB والبروتينات FosB-like من الاستيلاء electroconvulsive والعلاجات الكوكايين. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N، Marek GJ، Brown J، Ye H، Saudou F، Vaidya VA، et al. (1998) الدور الأساسي للجين fosB في الإجراءات الجزيئية والخلوية والسلوكية من المضبوطات electroconvulsive. J Neurosci 18: 6952 – 6962. PMID: 9712664
  102. 15. يرافق Perez-Otano I ، Mandelzys A ، Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonism بالتعبير المستمر للبروتين D-FosB-like في مسارات الدوبامين. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J، Ptashne M (1988) تحويل مثبط نسجي حقيقي النواة إلى منشط. الخلية 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT، Bartel PL، Sternglanz R، Fields S (1991) The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1، Oda S، Sekiguchi M (1993) Activive activation of quatcent Rat-1A cells by delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN، Damez-Werno D، Sun H، Shao N، Gancarz A، Panganiban CH، et al. (2014) الدور الأساسي للبولي (ADP-ribosyl) في عمل الكوكايين. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI، Weaver RR، Robison B، Renthal W، Maze I، Yazdani S، et al. (2008) أنماط متميزة من تحريض ΔFosB في الدماغ عن طريق تعاطي المخدرات. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL، Chevray PM، Nathans D (1996) Mammalian Sug1 and c-Fos in the Nuclear 26S proteasome. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1، Dudley RK، Truax AD، Gerhardt D، Bhat KP، McNeal S، et al. (2008) تنظيم أستلة في المعقد الرئيسي لمعادلة التوافق النسيجي من الدرجة الثانية معزز من قبل 19S proteasomal ATPase Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA، Guan Z، Barco A، Xu S، Kandel ER، Schwartz JH (2005) CREB-binding protein control response to cocaine by acetylating histones at the fosB promoter in the mouse striatum. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A، Choi KH، Renthal W، Tsankova NM، Theobald DEH، Truong HT، et al. (2005) إعادة تشكيل الكروماتين هو آلية رئيسية وراء اللدونة الناجم عن الكوكايين في الجسم المخطط. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) وظائف مزدوجة لمنظمي النسخ: أسطورة أم حقيقة. J Cell Biochem ملحق 32/33: 32-40. دوى: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co؛ 2-x
  113. 26. Ferrell K، Wilkinson CRM، Dubiel W، Gordon C (2000) تفاعلات الوحدتين التنظيميتين لبروتومونوم 26S ، مشكلة معقدة. اتجاهات Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N، Johansson S، Larson LG (2003) Implication of the ubiquitin / proteasome system in the myc-regulated transcription. Cell Cycle 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ، Wenzel S، Tansey WP (2012) Ubiquitin and proteasomes in transcription. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA، Tansey WP (2006) the proteasome: a utility tool for transcription؟ Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH، Swaffield JC، Johnston SA، Milligan CE، Zoeller RT، Schwartz LM (1997) تحديد أحد أفراد عائلة Sug1 CAD المحفوظة نسبيًا والتي يتم التعبير عنها بشكل مختلف في الجهاز العصبي للفأر. ديف نيوروبيول 33: 877-890. دوى: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co؛ 2-5