تنظيم استقرار DeltaFosB بواسطة الفسفرة (2006)

ي Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, رودينكو جي, Nestler EJ.

مصدر

قسم الطب النفسي ، مركز العلوم العصبية الأساسية ، جامعة تكساس ، المركز الطبي الجنوبي الغربي ، دالاس ، تكساس ، 75390-9070 ، الولايات المتحدة الأمريكية.

ملخص

يعد عامل النسخ DeltaFosB (المشار إليه أيضًا باسم FosB2 أو FosB [شكلًا قصيرًا]) وسيطًا مهمًا لللدونة طويلة الأمد التي يحدثها الدماغ عن طريق التعرض المزمن لعدة أنواع من المنبهات ذات التأثير النفساني ، بما في ذلك تعاطي المخدرات والإجهاد ونوبات التشنج الكهربائي. . ومن السمات المميزة لـ DeltaFosB ، أنه بمجرد ظهوره ، فإنه يستمر في الدماغ لفترات طويلة نسبيًا في غياب المزيد من التحفيز. ومع ذلك ، ظلت الآليات الكامنة وراء هذا الاستقرار الظاهر مجهولة. هنا ، نظهر أن DeltaFosB عامل نسخ مستقر نسبيًا ، مع نصف عمر تقريبًا من 10 h في استنبات الخلايا. علاوة على ذلك ، نظهر أن DeltaFosB هو عبارة عن فوسفور بروتين في الدماغ وأن الفسفرة من بقايا سيرين محفوظ بدرجة عالية (Ser27) في DeltaFosB يحميها من تدهور البروتينات. نحن نقدم عدة خطوط من الأدلة التي تشير إلى أن هذا الفسفرة يتم بوساطة الكازيناز كيناز 2. وتشكل هذه النتائج أول دليل على أن دلتا فوسفوس هو فسفوريل وإثبات أن الفسفرة تساهم في استقراره ، والذي هو في جوهر قدرته على التوسط في التكيف طويل الأمد في الدماغ.

المُقدّمة

عامل النسخ ΔFosB ، والمسمى أيضًا FosB2 أو FosB [شكل مختصرة] ، هو صيغة لصق C مقتبسة من الجين المبكر المباشر fosb (Dobrazanski وآخرون ، 1991; Nakabeppu و Nathans ، 1991; ين وآخرون ، 1991). مثل FosB بطول كامل ، ΔFosB لديه مجال أساسي ملزمة DNA وسحّاب leucine الذي من خلاله يختفي مع بروتينات Jun لتشكيل بروتينات عامل انتساخ البروتين 1 (AP-1) ، الذي ينظم التعبير عن العديد من الجينات (مورغان و كوران ، 1995; Rylski و Kaczmarek ، 2004). على الرغم من افتقارها إلى جزء من نطاق المعاملات المتوفر في المحطة C لـ FosB ، فإن ΔFosB تعمل كمنشط وناسخ فعال في النسج المستزرعة وفي الدماغ.Dobrazanski وآخرون ، 1991; Nakabeppu و Nathans ، 1991; تشن وآخرون ، 1997; McClung و Nestler ، 2003; كومار وآخرون ، 2005).

Δيتم تحفيز FosB إلى مستويات عالية بطريقة معينة في المنطقة في الدماغ بعد التعرض المزمن ، ولكن ليس الحاد ، لمجموعة متنوعة من المنبهات ذات التأثير النفساني ، بما في ذلك الإجهاد ، وآفات معينة ، والأدوية المضادة للذهان والعقاقير المضادة للاكتئاب ، والمخدرات من سوء المعاملة ، والمكافآت الطبيعية (Hope et al.، 1994b; Hiroi و Graybiel ، 1996; Moratalla et al.، 1996; Bing et al.، 1997; Mandelzys et al.، 1997; كيلز وآخرون ، 1999; Werme et al.، 2002; Andersson et al.، 2003; كولبي وآخرون ، 2003; Peakman وآخرون ، 2003; Perrotti et al.، 2004; Zachariou وآخرون ، 2006). يرتبط تحريض ΔFosB مباشرة بالتأثيرات الوظيفية للعديد من هذه المحفزات على الدماغ. إن استمرار ΔFOSB حتى في غياب التحفيز الإضافي يميزها عن جميع عوامل النسخ الأسرية الأخرى لـ Fos ، والتي يتم تحفيزها بسرعة استجابة للمنبهات الحادة ، والانحطاط إلى المستويات القاعدية خلال بضع ساعات ، وتظهر بشكل عام حساسية بعد التحفيز المزمن (نأمل وآخرون ، 1992; Daunais وآخرون ، 1993; Persico et al.، 1993; Hiroi و Graybiel ، 1996; Perrotti et al.، 2004). وهذا يجعل ΔFosB مرشحًا جذابًا للتوسط في بعض التغييرات طويلة الأمد في التعبير الجيني التي تكمن وراء التكيفات العصبية المستقرة التي تسببها بعض المحفزات المزمنة.

لأن الوجود الطويل لـ ΔFosB يحدث في غياب مزيد من الحث على mRNA (تشن وآخرون ، 1995) ، تخميننا أنه على عكس FosB كامل الطول وجميع بروتينات عائلة Fos الأخرى ، والتي هي غير مستقرة جوهريا ، ΔFosB قد يكون عامل نسخ مستقر بشكل غير عادي (Hope et al.، 1994b; تشن وآخرون ، 1997; Nestler et al.، 2001; McClung وآخرون ، 2004). وعلاوة على ذلك ، اقترح تحليل immunoblotting الأنسجة الدماغية الحادة مقابل المزمن أن ΔFosB التحولات في الظاهر Mr (كتلة جزيئية) من ∼33 kDa في الحالة الحادة إلى ∼35-37 kDa أثناء المعالجة المزمنة (Hope et al.، 1994a; تشن وآخرون ، 1995). ولأنه لا يوجد أي دليل لوجود mRNA إضافية يمكن أن تشفر هذه الأشكال الإسوية المختلفة ، فقد توقعنا أن ΔFosB يتم تعديله بشكل ما بعد التحويل وربما يساهم ذلك في ثباته غير المعتاد. ومع ذلك ، لم يتم حتى الآن الإبلاغ عن أي تحاليل بيوكيميائية لدوران أو تعديلات postfranslational لـ ΔFosB. كان الهدف من الدراسة الحالية هو تحديد ما إذا كانت ΔFosB عبارة عن فوسفور وما إذا كان الفسفرة تلعب دورًا في استقرارها.

القسم السابقالقسم التالي

مواد وطرق

خطوط الخلايا الثدييات وبنية الحمض النووي.

تم استزراع خلايا PC12 (Clontech ، Mountainview ، CA) في DMEM عالي الجلوكوز المحتوي على الجلوتامين (L-Gln) واستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، مصل الحصان 10٪ (كلاهما من Invitrogen ، Carlsbad ، CA) 100 U / ml penicillin و 100 μg / ml streptomycin (كلاهما من Sigma-Aldrich، St. Louis، MO). تم استزراع خلايا هيلا (المجموعة الأمريكية نوع الثقافة ، ماناساس ، VA) في جلوكوز DMEM يحتوي على L-Gln واستكمل مع 10 ٪ FBS ، البنسلين ، والستربتوميسين. تم الحفاظ على كل من خطوط الخلايا عند 37 ° C في 5٪ CO رطب2 الغلاف الجوي.

بالنسبة للعمليات الانتقالية العابرة مع الحمض النووي ، تم زرع بذور PC12 أو HeLa على صفائح بستة آبار (مغلفة مع الكولاجين I لخلايا PC12) وذلك للوصول إلى التقاء 90-100٪ في اليوم التالي وتم نقلها باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen). في بعض التجارب (انظر تين. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7) ، أعرب ΔFosB عابرة في خلايا PC12 عن طريق العدوى بفيروس الهربس البسيط المؤتلف (HSV).

تم الحصول على ΔFosB و FosB cDNAs من تراكيب pTetop الخاصة بنا (تشن وآخرون ، 1997) ، و subcloned إلى متجه pcDNA3.1 (Invitrogen). تم استخدام هذه التركيبات pcDNA3.1-ΔFosB / FosB للتعبير في خلايا الثدييات وكقالب للتطفير الموجه نحو الموقع. تم إعداد Recumpinant HSV-ΔFosB كما هو موضح سابقا (نفيه وآخرون ، 1997) ، وكان الإعداد عيارًا من ∼1 × 108 PFU / مل.

تجارب نبض مطاردة.

ما يقرب من 24 h بعد العدوى / ترنسفكأيشن ، والخلايا (PC12 أو HeLa) في لوحات ستة جيدا تم غسلها مرتين إلى ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وحضنت في 37 ° C ل ∼1 ح في 2 مل من Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) تكمل بـ 5٪ من FBS (Hyclone، Logan، UT) لاستنفاد تجمعات داخل خلوية من Met و Cys. في نهاية فترة "التجويع" هذه ، تمت إضافة الأدوية (إذا تمت معالجة الخلايا) وتم تمييز الخلايا (النبض) بـ 12-25 μCi of 35S بروتين Labeling مزيج (PERKINELMER، Wellesley ، MA) لـ ∼1 h عند 37 ° C لتصنيف جميع البروتينات المركبة حديثًا. ثم تم إزالة radiolabel عن طريق غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني ، و 35تتبعت بروتينات S-labeled (المطاردة) باستبدال الوسط بوسيط "بارد" (nonradioactive) مدعوم بـ 5٪ FBS وحصاد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة. تم الحفاظ على العلاجات الخلوية في جميع أنحاء المطاردة. جميع الأرقام من هذه التجارب تظهر كميات أولية مماثلة من البروتينات المختلفة لتحسين مقارنات معدلات دورانهم.

الحيوانات والعلاج المضبوط بالصعوبات المزمنة.

تم التعامل مع الجرذان الكبار سبراغ داولي الذكور (200 - 300 ز ؛ مختبرات تشارلز ريفر ، كينغستون ، RI) مرة واحدة يوميا مع النوبات electroconvulsive (ECS) ل 7 - 9 د. تم تنفيذ ECS كما هو موضح سابقا (Hope et al.، 1994a) باستخدام أوغو باسيلي (Comerio VA، Italy) وحدة ECS مع الإعدادات التالية: تردد ، نبضات 100 / s؛ النبض مع ، 0.5 مللي ثانية ؛ مدة الصدمة ، 1.0 s ؛ والتيار ، 75 mA. تم التعامل مع حيوانات تحكم الشام بالتوازي من خلال تطبيق أقطاب قطب الأذن دون أي تيار كهربائي.

32 P العلامات الأيضية.

بالنسبة لوضع العلامات على شرائح الدماغ ، تم قطع رأس الفئران ، وتم تشريح العقول بسرعة ، وتم تحضير شرائح 300 frontm الجبهية الأمامية باستخدام microslicer DSK (Ted Pella، Redding، CA). تم تحضين الشرائح داخل أنابيب بلاستيكية في 2 ml من CSF الاصطناعي (ACSF) الذي يعاني من نقص الفوسفات وحافظت على 30 درجة مئوية تحت فقاعات رقيقة مستمرة مع O2/ CO2 الخليط (Hemmings وآخرون ، 1989). تم وضع علامة على الشرائح (شريحتان لكل أنبوب) باستخدام 1.3 mCi لـ 8 – 10 h في وجود أو عدم وجود حمض okadaic (100 ng / ml). في نهاية هذا الحضانة ، تم شطف الشرائح ثلاث مرات على الأقل مع ACSF بارد ثم تجانسها بواسطة صوتنة في 250 ميكرولتر من اختبار مقايسة radiimmunoprecipitation الباردة (RIPA) [PBS ، pH 7.4 ، 150 mm NaCl ، 1٪ (v / v ) Igepal ، 0.5٪ (w / v) deoxycholate الصوديوم ، 0.1٪ (w / v) SDS ، 1 mm EDTA] تكمل قبل الاستخدام مع SDS حتى 0.6٪ ، كوكتيل مانع البروتياز لخلايا الثدييات (يستخدم في 5 μl / ml ؛ Sigma-Aldrich) ، الكوكتيلات المانع للفوسفاتيز الأول والثاني (المستخدم في 1: 100 ؛ Sigma-Aldrich) ، 1 mm PMSF و 2٪ glycerol. ثم تم تغليس المجانسة لمدة 15 دقيقة وتطهيرها بواسطة الطرد المركزي في 15,000 × g لـ 15 min. تم تقييم تركيز البروتين في المواد الطافية الناتجة باستخدام اختبار بروتين BCA (Pierce، Holmdel، NJ).

بالنسبة 32وضع العلامات P من الخلايا المستزرعة ، ∼24 h بعد العدوى / ترنسفكأيشن ، تم غسلها الخلايا 2-3 مرات مع المتوسطة خالية من الفوسفات وحضنت في هذا الوسيط ل ∼1 ح. بعد فترة المجاعة هذه ، 0.2 – 0.3 mCi of 32PH3PO4 (PERKINELMER) تمت إضافتها إلى كل بئر ، وتم تصنيف الخلايا لـ 4 – 12 h اعتمادًا على نوع التجربة (انظر Figs. 1 – 7 للمواصفات). ثم تم غسل الخلايا ثلاث مرات مع PBS و lysed على الجليد ل 15 دقيقة مع 50 ميكرولتر من العازلة RIPA التكميلية. تم جمع Lysates عن طريق الكشط وتم تمريرها مرات 10 من خلال إبرة 25 ga لقص الحمض النووي ، مسلوقة لمدة دقيقة 10 ، والطرد المركزي عند 15,000 rpm لـ 15 – 30 min عند 4 ° C. تم نقل lysates (supernatants) تطهيرها إلى أنبوب جديد وتم إجراء فحص البروتين BCA (بيرس). تظهر جميع الأرقام في هذه التجارب كميات متشابهة من البروتينات من النوع البري (WT) و S27A ΔFosB لتحسين المقارنات بين مستويات فسفرتها النسبية.

الكيماويات وعلاجات زراعة الخلايا.

تمت إذابة حامض أوكاداديك (OA، Sigma-Aldrich) في الإيثانول وتم استخدامه بتركيز نهائي من 100 ng / ml. تم حل 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB؛ Biomol، Plymouth Meeting، PA) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ Sigma-Aldrich) وتم استخدامه في زراعة الخلايا بتركيز نهائي من 50 μm. تمت إذابة السائل المنوي (Sigma-Aldrich) في الماء واستخدم عند التركيز النهائي لـ 200 μm. تم حل Calphostin-C (Biomol) في DMSO واستخدم في 0.2 μm ، في حين تم حل Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA؛ Promega ، Madison ، WI) في DMSO واستخدمت في 0.1 μm. تمت إذابة الببتيد المثبط لـ myristoylated-autocamtide-2 (m-AIP؛ Biomol) في الماء واستخدم عند التركيز النهائي لـ 1 و 10 μm. تم إذابة مثبطات كيناز البروتيين ذات الطيف الواسع H-7 و H-8 (Biomol) في الماء واستخدمت في التركيز النهائي لـ 150 و 200 μm ، على التوالي. تمت إذابة كل من MG132 (Calbiochem، San Diego، CA) و epoxomicin (الببتيدات الدولية ، لويزفيل ، KY) في DMSO واستخدم عند التركيز النهائي لـ 12.5 و 7.5 μm ، على التوالي. في جميع التجارب ، تمت إضافة DMSO (مركبة) إلى الخلايا عند الضرورة للحفاظ على كمية ثابتة من DMSO عبر العلاجات. إلى عن على 32تجارب P وضع العلامات ، وأضيفت الأدوية على الفور قبل التسمية والحفاظ على ما تبقى من فترة وضع العلامات. بالنسبة لتجارب المطاردة النبضية ، تمت إضافة الأدوية في وقت "التجويع" Cys / Met ، وتم الاحتفاظ بها خلال فترة وضع العلامات ، ثم تمت إضافتها مرة أخرى إلى وسط المطاردة. كانت مثبطات proteasome ارتفعت كل 3-4 ح في جميع أنحاء المطاردة للتعويض عن دوران سريع من هذه الببتيدات.

immFosB immunopritotting ، immunoblotting ، autoradiography.

بالنسبة للإسهابات المناعية ، تم تخفيف lysates 1: 5 مع RIPA العادي لخفض تركيز SDS إلى 0.1٪ قبل الشروع في immunoprecipitation (IP). للحد من الارتباط غير النوعي ، تم إزالة الألواح اللاوية أولاً عن طريق immunoprecipitating مع IgG nonmmune وبروتين G-Sepharose (Sigma-Aldrich) لـ 4 h على الأقل. imm تمت إزالة ΔFosB بعد ذلك من lysates مسح باستخدام الأجسام المضادة polyclonal الماعز الذي يتعرف على قمة لاصقة داخلية موجودة في كل من FosB و ΔFosB (SC-48G ؛ التكنولوجيا الحيوية سانتا كروز ، سانتا كروز ، كاليفورنيا) في 0.5 - 1 Ig IgG لكل 10 ميكروغرام من البروتين lysate (50 – 300 μg من إجمالي البروتين) في الحجم الإجمالي لـ 0.5 ml. تم خلط الـ IPs برفق عند 4 ° C على قرص دوار لـ 8 h على الأقل ، ثم تمت إضافة 15 μl من البروتين G-Sepharose وتم خلط IPs ل 4 h أخرى على الأقل. تم تكوير IPs عن طريق الغزل في 3000 × g ل 3 - 5 دقيقة في 4 درجة مئوية ، وغسلها ثلاث مرات مع 0.5 مل من RIPA عادي الباردة ومرتين مع PBS الباردة تحتوي 0.1 ٪ توين 20. ثم تم تعليق IP في 0.5 مل من PBS الباردة ، ونقل ، وتكوير في أنبوب جديد ، وتمت إزالة البروتينات immunoprecipitated ثم إضافة 15 - 25 ميكرولتر من 2 × الحد من عازلة عينة البروتين Laemmli. أدى بروتوكول IP هذا إلى الترسيب النوعي والفعال لكل من ΔFosB تقريباً في المحللة. تم إخضاع البروتينات المنجزة إلى SDS-PAGE عن طريق تحميل IP بالكامل على 12.5٪ Tris-HCl Criterion gel (Bio-Rad، Hercules، CA) ، ثم نقله إلى PVDF أو nitrocellulose. بعد النقل ، تم تجفيف الغشاء بالهواء و 32ف و 35لوحظت بروتينات S-radiolabeled البروتينية عن طريق التصوير الشعاعي autoradiography باستخدام فيلم كوداك (Rochester، NY) autoradiographic ، وكذلك عن طريق الفسفرة باستخدام العاصفة (Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ) PhosphorImager. تم الكشف عن مجموع (غير مجزأ وفسفوريتيد) ΔFosB في الخلايا lysates أو تجانس الدماغ عن طريق immunoblotting إما من البروتين immunoprecipitated (باستخدام نفس الغشاء المستخدمة للكشف عن 32بروتين (P-labeled protein) ، أو بكميات متساوية من بروتين lysate / homogenate الخاضع لـ SDS-PAGE ويتم نقله إلى PVDF أو nitrocellulose. تم حجب الغشاء أولاً بحضنته مع 1٪ (w / v) حليب جاف غير دهن (Bio-Rad) في PBS مدعوم بـ 0.1٪ (v / v) Tween 20 (Sigma) لـ 1 h عند 25 ° C. تم بعد ذلك مسح الغشاء خلال الليل في 4 ° C مع أضدادنا المضادة للفوسفات المضادة للفوسب التي تم إنشاؤها ضد الأحماض الأمينية 1 - 16 من FosB / ΔFosB (المستخدم في 1: 10,000). بعد التحضين الأولي ، تم غسل الأغشية أربع مرات لـ 5 دقيقة مع حاجز عازلة ، ومن ثم احتضانها في 25 ° C لـ ∼1 h مع agle anti-rabbit IgG مترافق مع peroxidase الفجل (يستخدم في 1: 5000 في حجب المخزن المؤقت ، من Vector مختبرات ، Burlingame ، كاليفورنيا). تم غسل الأغشية بعد ذلك ثلاث مرات لـ 10 min مع حجب المخزن المؤقت ومرة ​​واحدة لـ 5 min مع PBS. تم تصوير مجموع بروتين ΔFosB البروتيني على فيلم كوداك MR من خلال تحسين الانصهار الكيميائي (بيرس) و / أو من خلال الكشف عن الفلورة باستخدام كواشف ECL-Plus (Amersham Biosciences) و Storm PhosphorImager.

الإفراط في التعبير وتنقية المؤتلف ΔFosB من الخلايا الحشرية.

كان ΔFosB overexpressed في الخلايا الحشرية Sf9 كما بروتين N hexa-his-tagged (N-His (6) ΔFosB) باستخدام نظام التعبير البكالوريا Bac-to-Bac (Invitrogen) واتباع تعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تم وضع subconed لـ ΔFosB cDNA (بقايا 2 – 237) مسبوقة بعلامة N-terminal النهائية MGHHHHHHHAG في متجه pFASTBacTM1 ، والذي تم استخدامه لتوليد فيروس baculovirus المؤتلف. كانت خلايا Sf9 مصابة بفيروس مؤتلف ، وتم تنقيط N-His (6) ΔFosB من خلل في الخلية عن طريق عدة خطوات كروماتوجرافية بما في ذلك كروماتوجرافي تقارب باستخدام عمود النيكل (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا) ، تبادل الأنيون باستخدام عمود أحادي - Q (Amersham) العلوم الحيوية) ، واستبعاد الحجم باستخدام عمود الترشيح الجل (Amersham Biosciences).

في المختبر دراسات الفسفرة.

في المختبر تم تنفيذ تفاعلات الفسفرة لدورة الوقت وتحليل تقدير العناصر المتراكمة في حجم 30 μl الذي يحتوي على ركيزة 10 μm (N-His (6) ΔFosB أو ركيزة تحكم موجبة) و 250 Am ATP و 1 μCi / μl [γ-32P] ATP ، المخزن المؤقت الذي تم توفيره من قبل الشركة المصنعة ل kinase ، وأحد kinases التالية: CK2 (20 ng / μl؛ Upstate، Charlottesville، VA)، CaMKII (10 ng / μl؛ Upstate)، PKC (1.6 ng / μl؛ Calbiochem) أو p70S6K (2.5 mU / μl؛ Upstate). تم إجراء تفاعلات الدورة الزمنية عن طريق إزالة قُسَيْم 5 μl من محلول التفاعل في النقاط الزمنية المحددة وإضافة حجم متساوٍ من 4 × تقليل عازلة عينة بروتين Laemmli. تم تحديد المعلمات الحركية لـ Michaelis-Menten لتفاعل CK2 تحت ظروف الحالة المستقرة الخطية المحددة تجريبياً. تم تنفيذ هذه التفاعلات لـ 15 min في حجم 10 μl الذي يحتوي على 2 ng / μl enzyme و 250 μm ATP و 1 μCi / μl [γ-32P] ATP ، وتركيزات N-His (6) ΔFosB تتراوح من 2.5 - 30 μm. أجريت جميع التفاعلات عند 30 ° C في حمام مائي. بعد SDS-PAGE وتلطيخ الهلام مع Coomassie Bio-Safe (Bio-Rad) ، تم تجفيف الهلام ، و 32تم تقييم دمج ف فوسفات بواسطة تحليل الفسفرة (انظر أدناه ، الكمي البيانات ، الحسابات ، والإحصاءات).

خريطة phosphopeptide ثنائية الأبعاد وتحليل حمض phosphoamino.

تم تنفيذ كل من هذه التحليلات كما هو موضح من قبل Ploegh و Dunn (2000). لفترة وجيزة ، شظايا هلام الجافة التي تحتوي على 32P-labeled ΔFosB (إما من المختبر ردود الفعل أو من immunoprecipitates من الخلايا المسماة الأيضية) ، تم استئصالها ، rehydrated ، وغسلها ، وتعرضوا للهضم tryptic. تم تجفيد طاف يحتوي على منتجات الهضم تريبتيد وغسدت lyophilate عدة مرات و resuspended في 10 ميكرولتر من العازلة الكهربائي ، pH 1.9. تم رصد عينة (3 μl) على لوح كروماتوجرافي ذو طبقة رقيقة من السليلوز (TLC) (Analtech، Newark، DE) وفصلها بعدًا واحدًا عن طريق الرحلان الكهربائي والأبعاد الأخرى عن طريق TLC تصاعديًا. تم تصور خرائط phosphopeptide الناتجة عن طريق التصوير الشعاعي autoradiography والفوسفور. بالنسبة لتحليل حمض الفوسفومامينو ، تم تشطي 2 ميكرولتر من الهضمات المخروطية التي تم تعليقها في المخزن الكهربي عن طريق تحلل HCl عند 105 ° C لـ 25 min في 3 m HCl تحت N2 الغلاف الجوي. تم إيقاف التفاعل بتخفيف ستة أضعاف في الماء ، وتم تجفيف الخليط بالتجميد. تم إعادة تعليق مجفف lyophilate في 5 ofl من المخزن الكهربي ، pH 1.9 ، ورصد على لوحة TLC السليولوز جنبا إلى جنب مع معايير phospho-Ser ، -Thr ، و -Tyr. تم إجراء الرحلان الكهربائي على أكثر من نصف طول لوحة TLC باستخدام المخزن الكهربي ، pH 1.9 ، ثم تم نقل اللوحة إلى المخزن المؤقت pH 3.5 ، وتم تنفيذ الرحلان الكهربائي حتى اكتماله. تم تصور معايير حمض الفوسفوجامينو عن طريق رش لوحة TLC مع حل نينهيدرين 1 (v / v) في الأسيتون ، و 32تم تصور عينات الأحماض الأمينية P المسمى من قبل كل من التصوير الشعاعي autoradiography والفوسفور.

سيرنا التي يسببها CK2α نهدم.

استخدمنا طريقة تدخل RNA لتخفيض مستويات CK2 بشكل انتقائي (Di Maira et al.، 2005). تم زرع خلايا PC12 على صفائح كولاجين مكونة من ستة آبار لتصل إلى التقاء ∼70-80٪ في اليوم التالي ، عندما تم نقلها عابرًا باستخدام 20 nm (التركيز النهائي) إما من siRNA أو siRNA غير المستهدف الموجه نحو mRNA للحافز α الوحيدات من الفئران CK2 ، وذلك باستخدام 5 ميكرولتر من عامل ترنسفكأيشن SilentFectin (Bio-Rad) واتباع تعليمات من الشركة المصنعة. حوالي 24 h في وقت لاحق ، تم transfected الخلايا عابرة مع البلازميد ΔFosB ، كما هو مذكور أعلاه. ما يقرب من 24 h في وقت لاحق (∼48 h بعد ترنسفكأيشن siRNA) ، تعرض الخلايا إما 32P تصنيف الأيض أو تحليل المطابقة النبض كما هو موضح أعلاه. واستخدمت أربعة الرناوات siRNAs CK2α التالية مع نتائج مماثلة: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3، 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3، 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3، 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 "(Dharmacon، لافاييت، CO). كعنصر تحكم سلبي ، استخدمنا كاتم الصوت التحكم السلبي #3 siRNA من Ambion (Austin، TX). تم رصد مدى CK2 الهبوط من خلال immunoblotting باستخدام مضاد الأجسام المضادة ل CK2 (كتالوج # 06-873 من Upstate) بين عشية وضحاها في تخفيف 1: 1000. تم استخدام β-Tubulin للتحكم في التحميل وتم اكتشافه باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة (كتالوج 05-661 من Upstate) أثناء الليل باستخدام 1: 20,000 dilution.

الطفرات موقع الموجه.

تم إنجاز طفرة Ser27 إلى Ala أو Asp باستخدام طقم تغيير الطفرات تغيير الموقع الموجه السريع (Stratagene، La Jolla، CA) وتتبع تعليمات الشركة المصنعة. لتقديم الطفرات Ser27 في البروتين ΔFosB الماوس ، واستخدمت بادئات الطفرات التالية. Ser27 إلى Ala: (primer primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3. Ser27 to Asp (primer forward) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3. تكون الأسس المتحولة بالخط العريض ، و codon Ser27 مائل.

المعلوماتية الحيوية.

تم البحث عن مواقع الفسفرة المحتملة و kinases لـ ΔFosB عن طريق تقديم تسلسل بروتين الفأرة إلى قواعد بيانات متخصصة بما في ذلك ProSite (http://www.expasy.org/prosite/) ، PredictProtein (Rost et al.، 2004) و NetPhosK (Blom et al.، 2004).

قياس البيانات والحسابات والإحصاءات.

تم قياس كمية البروتين الموجودة في PVDF أو غشاء النيتروسليلوز باستخدام Storm PhosphorImager وبرنامج ImageQuant المصاحب (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). في خلية ثقافة ودراسات فسفرة شريحة الدماغ ، والقيم التي تم الحصول عليها ل 32ثم تم تقسيم البروتين P-labeled بالقيم التي تم الحصول عليها من أجل ΔFosB الإجمالي ، وتم التعبير عنها كنسبة. في ال المختبر دراسات الفسفرة ، وكمية 32تم حساب P-labeled ΔFosB لكل مول من ΔFosB (المتوازنة) على النحو الموصوف سابقاً (ساهين وآخرون ، 2004). تم أخذ جميع القياسات ضمن نطاق الخطية للأداة المستخدمة. تم حساب المعلمات الحركية باستخدام نموذج Michaelis-Menten ، حيث V = Vاكثر شئ[S] / ([S]+KM) و Vاكثر شئ = k2[Eالإجمالي]. نصف العمر (t1/2) من ΔFosB و FosB تم تقديرها من خلال مخططات المطاردة النبضية (باستخدام الانحدار غير الخطي الذي كان أفضل تركيب لنقاط البيانات) وتوافق مع الوقت الذي تكون فيه كمية البروتين المتبقية هي 50٪ من الأصل. في جميع الأرقام ، تمثل النتائج المعروضة ما لا يقل عن اثنين أو ثلاث تجارب مستقلة. في جميع الرسوم البيانية ، تكون البيانات المعروضة هي المتوسطات ± SEMs (3 ≤ n ≤16). تم تقييم الأهمية الإحصائية للاختلافات باستخدام unpaired t اختبار ، تصحيحها لمقارنات متعددة ، والعلامات النجمية تشير p ≤ 0.05.

القسم السابقالقسم التالي

النتائج

ΔFosB هو عامل نسخ مستقر بشكل غير عادي

على الرغم من أننا قد توقعنا سابقًا أن ΔFosB عامل نسخ مستقر نسبيًا (Nestler et al.، 2001) ، لم يتم إجراء تحليل مباشر لملف معدل دوران البروتين حتى الآن. ولمعالجة هذا السؤال ، أجرينا تجارب النبض-المطارد باستخدام خلايا PC12 ، التي استخدمت على نطاق واسع كخلية خلوية تشبه العصبون ، حيث تم التعبير عن ΔFosB عابرًا عن طريق العدوى بفيروس الهربس البسيط المؤتلف (HSV-ΔFosB). البروتينات المصنعة حديثا تم تصنيفها بالأيض مع 35S-Met / Cys ، ونمط التدهور 35S-labeled ΔFosB (35تم رصد S-ΔFosB من خلال immunoprecipitating من lysates الخلية التي تم الحصول عليها في نقاط زمنية مختلفة بعد إزالة الأحماض الأمينية radiolabeled. أوضحت التحاليل التي أجراها المستحثون المناعيون بواسطة SDS-PAGE و autoradiography أن نصف عمر ΔFosB في خلايا PC12 هو ∼10 h (التين 1). تظهر هذه النتائج أن عمر النصف من ΔFosB أعلى من معظم عوامل النسخ المحفز (انظر المناقشة) ، بما في ذلك FosB بطول كامل ، والتي تم الإبلاغ عن نصف العمر في ثقافة الخلية أن يكون ∼90 دقيقة (Dobrazanski وآخرون ، 1991; كارلي وآخرون. 2004). بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن تدهور ΔFosB لا يتناسب مع منحنى الانحلال الأسي بالدرجة الأولى ، بل هو ثنائي الطور ، يبدأ بمعدل تباطؤ أبطأ. هذا يشير إلى وجود أكثر من واحد من أنواع FOSB و / أو أكثر من مسار التدهور.

الرقم 1.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 1.

ΔFosB هو عامل نسخ مستقر بشكل غير عادي. عمر النصف من ΔFosB هو ∼10 h في زراعة الخلايا. تم التعبير عن ΔFosB في خلايا PC12 إما عن طريق العدوى بـ HSV-ΔFosB أو transfection العابر مع البلازميد المحتوي على ΔFOSB ، وتم إخضاع الخلايا لتجارب المطاردة النبضية كما هو موضح في المواد والطرق. تم الحصول على نتائج مكافئة بغض النظر عن الطريقة المستخدمة للتعبير عن overfpress ΔFosB. ويبين الشكل دورة الزمن (والتصوير الذاتي التمثيلي) لتدهور ΔFosB. البيانات المخططة هي متوسط ​​± SEM لنقاط بيانات فردية 15 على الأقل تم الحصول عليها من خمس تجارب مستقلة على الأقل. للمقارنة ، يشار إلى نصف العمر المبلغ عنه من FosB طول كامل.

ΔFosB هو الفوسفور في الدماغ

لقد افترضنا أن تعديل posttranslational من ΔFosB قد يساهم في استقراره الظاهر. لأن الفسفرة أظهرت أن تعديل نشاط عوامل النسخ في العديد من الطرق ، بما في ذلك استقرارها (للمراجعة ، انظر ديستيرو وآخرون ، 2000; Whitmarsh و Davis ، 2000) ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان ΔFosB هو phosphoprotein. تحقيقا لهذه الغاية ، كان التعبير ΔFosB في الدماغ الفئران باستخدام ECS المزمن ، وهو علاج معروف للحث على مستويات عالية من ΔFosB ، وخاصة في القشرة الأمامية (Hope et al.، 1994a). بعد يوم واحد من معالجة ECS الأخيرة ، عندما تظل مستويات ΔFosB عالية ، تم تحضير شرائح رقيقة من الجبهين الجبهيين وتم تسميتها بالأيض. 32P-الفوسفاتية. لم تكن مجموعة متوازية من الشرائح مشعة بشكل راديوي ، وتم استخدام هذه للكشف عن مستويات ΔFOSB الإجمالية. بعد immunoprecipitation مع الأجسام المضادة لمكافحة FosB / ΔFosB محددة وفصل البروتينات immunoprecipitated بواسطة SDS-PAGE ، فسفرتهيد 32تم الكشف عن P-labeled ΔFosB عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي ، في حين تم الكشف عن مجموع ΔFosB بواسطة immunoblotting. كشف هذا التحليل أن ΔFosB يتم فسفرة في الدماغ ، كما يتضح من نوع معين 32P-labeled band of ∼35 kDa موجود في عينات المخ التي تتم معالجتها بشكل مزمن ، ولكن غير قابل للاكتشاف فعليًا في أدوات التحكم المُعالجة من قبل sham (التين 2A). وهذا يتفق مع حقيقة أنه في غياب التحفيز المزمن ، فإن المستويات الأساسية لـ ΔFosB منخفضة للغاية. يتضح خصوصية رد فعل immunoprecipitation عن طريق عدم وجود إشارة في ركام IgG غير المناعي.

الرقم 2.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 2.

ΔFosB هو الفوسفور في الدماغ. A، ΔFosB هو فسفوريلاتيد في الدماغ. تم استحثاث EndFosB الذاتية المنشأ في دماغ الفئران عن طريق علاج ECS المزمن كما هو موصوف في المواد والطرق. وكانت الشرائح القشرية الجبهية المسماة الأيض مع 32PH3PO4 لعدة ساعات. بعد تجانس الشرائح ، كان ΔFosB immunoprecipitated ، و phosphorylated ΔFosB (32تم الكشف عن P-ΔFosB من قبل autoradiography (أعلى اللوحة). تم الكشف عن مجموع ΔFosB في immunoprecipitates nonradioactive بواسطة immunoblotting (اللوحة السفلية). كضوابط سلبية ، يتم عرض immunoprecipitate من الحيوانات المعالجة و nongmune IgG. B، تم الحصول على مواقع الفسفرة المرشحة و kinases مع عشرات التنبؤ المقابلة لتتالي الماوس ΔFosB البروتين من خلال التحليل المعلوماتي الحيوي. يتم تمييز المواقع المرشحة ذات درجات التنبؤ الأعلى في تسلسل البروتين والمدرجة في الجدول. إن مجال ربط الـ DNA (الأساسي) وسحاب اللوسين تكون جريئة في تسلسل البروتين. C, D، يتم زيادة الفسفرة ΔFosB بواسطة المانع OA فوسفاتاز Ser / Thr. C, 32تم الكشف عن مستويات P-ΔFosB في immunoprecipitates من شرائح القشرة الجبهية المسمى في غياب (Ctr) أو وجود 100 نانوغرام / مل OA (الرسم البياني واللوحة العليا) عن طريق التصوير الشعاعي autoradiography. تظهر اللوحة السفلية مجموع ΔFOSB المكتشفة في immunoprecipitates من شرائح غير خاضعة للرقابة عن طريق immunoblotting. D، تم إصابة خلايا PC12 مع HSV-ΔFosB أو HSV-LacZ (متجه) والأيضي المسمى مع 32PH3PO4 في غياب (Ctr) أو وجود 100 ng / ml OA. 32تم الكشف عن مستويات P-ΔFosB في immunoprecipitates عن طريق autoradiography (الرسم البياني ، أعلى اللوحة). تظهر اللوحة السفلية إجمالي ΔFosB المكتشفة في الخلايا غير المحللة عن طريق التلصص المناعي.

كخطوة أولى نحو توضيح أي كينيز (s) وموقع (مواقع) مشتركة في فسفرة ΔFosB ، قمنا بتعريض تسلسل الأحماض الأمينية إلى العديد من التحاليل المعلوماتية الحيوية. وقد كشف هذا أنه على الرغم من أن ΔFosB لا يحتوي على أي مواقع مرشحة للفوسفور ، إلا أنه يحتوي على عدة مواقع إجماع Serra / Thr kinase ، بما في ذلك ثلاثة مواقع CaMKII ، وثلاثة مواقع CK2 ، واثنين من مواقع PKC مع درجات عالية للغاية للتنبؤ بالفوسفور (التين 2B). إذا ، كما هو متوقع من خلال المعلوماتية الحيوية ، فإن فوسفات الفوسفاتوزيدوزيدوزيدوز فقط يتم تفريخها على مخلفات Ser أو Thr ، فيجب عندئذ تعديل فسفرة الفوسفات بشكل ملحوظ عن طريق نشاط الفوسفاتاز Ser / Thr. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتصنيف الشرائح القشرية الأمامية مع 32P-orthophosphate في وجود أو عدم وجود OA ، مثبطات الفوسفاتاز بروتين Ser / ثر. كما هو موضح في الشكل 2C، تسببت OA في زيادة كبيرة (∼2.5-fold) في 32P-ΔFosB. كما أنه تسبب في زيادة طفيفة في مستويات ΔFOSB الكلية ، والتي تتسق مع التقارير السابقة التي تربط التأثيرات المسرطنة لـ OA بقدرته على إحداث العديد من الجينات المبكرة الفورية بما في ذلك بروتينات Fos (Miller et al.، 1998; Choe et al.، 2004). النتيجة الصافية هي زيادة إجمالية كبيرة (∼60٪) في مستويات pFosB phosphorylated.

ثم تحققنا مما إذا كانت خلايا PC12 ، التي هي أكثر قابلية للتلاعب التجريبي ، أظهرت ΔFosB نمطًا فسفوريًا مشابهًا لما ظهر في الدماغ. نحن أعرب عن ΔFosB في خلايا PC12 عن طريق العدوى مع HSV-ΔFosB والأيضية المسمى الخلايا مع 32P-orthophosphate في وجود أو عدم وجود OA. يظهر التعبير الناجح و immunoprecipitation من البروتين من الخلايا المصابة HSV-ΔFosB من خلال وجود في كل من immunoblot (التين 2D، لوحة أسفل) و autoradiograph (أعلى اللوحة) من الفرقة ∼35 kDa ، غائبة في الخلايا المصابة بالعدوى. كما لوحظ في الدماغ ، تسببت الزراعة العضوية في زيادة طفيفة في مستويات ΔFOSB الإجمالية ولكن زيادة أكبر بكثير (ما يقرب من شقين) في 32P-ΔFosB ، مما أدى إلى زيادة صافية كبيرة (∼50 ٪) في pFosB الفسفرة. علاوة على ذلك ، بما يتفق مع تنبؤات المعلوماتية الحيوية ، لم ينتج عن معالجة خلايا PC12 مع مثبط الفوسفاتيز Tyr تغييرات كبيرة في 32مستويات P-ΔFosB (لا تظهر البيانات). وكشفت هذه النتائج معًا أن ΔFosB يتم فسفريته على مخلفات Ser و / أو Thr في الدماغ وفي خلايا PC12 ، وأكدت أن هذا الأخير هو نظام زراعة خلايا جيد يمكن من خلاله مواصلة دراسة خصائص الفسفرة والتدهور في ΔFosB.

CK2 ولكن ليس phosphorylates PKC أو CaMKII ΔFosB المختبر

كما هو موضح أعلاه ، كشف تحليل تسلسل الأحماض الأمينية FOSB عن نتائج عالية للتنبؤ بمواقع فسفورية CK2 و PKC و CaMKII. لتحديد أي من هذه الكينازات قد phosphorylate ΔFosB ، أجرينا سلسلة من المختبر تفاعلات الفسفرة باستخدام كينازات مُنقى وناتج مؤتلف purFosB المنقى. كما هو موضح في الشكل 3A، من الكينازات المرشحة الثلاثة ، فقط CK2 phosphorylated ΔFosB بطريقة كبيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار العديد من الكينازات الأخرى (على سبيل المثال ، GSK3 و p70S6K) ولكن فشل في فوسفوريلاتي بشكل ملحوظ ΔFosB (لا تظهر البيانات). أظهر التوصيف الإضافي لتفاعل CK2 بتحليل الدورات الزمنية أن هذا الكيناز يمكن أن يحفز دمج ∼0.5 mol من الفوسفات لكل مول من ΔFosB (التين 3B). حقيقة أن CK2 يمكن phosphorylate ΔFosB المختبر إلى تكافؤ رياضي كبير (∼50٪) يوحي برد فعل من الناحية الفسيولوجية. ثم درسنا حركية هذا التفاعل من خلال احتضان CK2 في وجود كميات متزايدة من ΔFosB المنقى ، وحددنا أن CK2 phosphorylates ΔFosB مع Vماكس 5.8 pmol · min-1 · ميكروغرام-1 من الانزيم ، أ KM من 18.4 μm ، و kقط من 0.2 / s (التين 3C). القيم التي تم الحصول عليها لهذه المعلمات الحركية تدعم مزيدا من الأهمية الفسيولوجية لهذا التفاعل. على سبيل المثال ، KM من CK2 لـ DARPP32 ، أحد أكثر ركائزه المعروفة ، هو 3.4 μm ، و kقط هو ∼0.3 / s (Girault et al.، 1989)؛ ال KM لـ ATP يتراوح من ∼10 - 40 μm (Cochet وآخرون ، 1983; Silva-Neto et al.، 2002) ، ونطاقات الكازين من ∼10 – 50 μm (Meggio et al.، 1977; Pyerin وآخرون ، 1987). معا ، تشير هذه البيانات إلى أن ΔFosB هي ركيزة ناعمة لـ CK2 المختبر.

الرقم 3.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 3.

CK2 ولكن ليس phosphorylates PKC أو CaMKII ΔFosB المختبر. يُظهِر المُحَور المُصوَّر (اللوح العلوي) المنتج المُفَسَّر ، ويُظهر الهلام الملون Coomassie (اللوح السفلي) إجمالي ΔFosB الموجود في التفاعل. A، تم اختبار المؤتلف المنقى ΔFosB ل المختبر الفسفرة من قبل مختلف كينازات المرشح (ثلاثة منها موضحة). Bودورة الوقت والتحليلات متكافئة تشير إلى أن CK2 يمكن فسفوريلاتي ΔFosB المختبر مع رياضيات الكيمياء من ∼50٪. C، كشف التحليل الحركي للتفاعل CK2 أن ΔFosB هو حسن النية المختبر المادة المتفاعلة. وتظهر خطية التفاعل في مؤامرة ثنائية متبادلة (أسفل) ، ولكن تم اشتقاق المعلمات الحركية من منحنى ميكايلس - مينتين (أعلى).

CK2 ينظم الفسفرة واستقرار ΔFosB في الخلايا السليمة

لتقييم الصلة الفسيولوجية للفسفرة بوساطة CK2 من ΔFosB ، أجرينا رسم الخرائط الفوسفوربيتي المقارن باستخدام المختبر phosphorylated و PC12-cell-phosphorylated ΔFosB. بعد SDS-PAGE و gel elution من 32P-ΔFosB (من المختبر ردود الفعل أو من immunoprecipitate من 32الخلايا المسمى P) ، تم هضم البروتين مع التربسين ، وخضعت phosphopeptides الناتجة لفصل ثنائي الأبعاد. وكشف هذا التحليل أن الفوسفوptتيد الرئيسي من تفاعل CK2 كان يتصاحب مع واحد من اثنين من فسفوpeبتيد رئيسيين من pFosB phosphorylated في خلايا PC12 (التين 4A) ، في حين أن phosphopeptides الناتجة عن رد فعل PKC أو CaMKII (لا تظهر البيانات) لم يفعل ذلك. كان هناك phosphopeptide Δ FosB الثاني موجود في الخريطة من خلايا PC12 ، ولكن بسبب عدم قدرة أي كينازات قمنا باختبارها لتوليد الفوسفوبيد المتشابهة المختبر، نحن لا نعرف في الوقت الحالي ما إذا كان هذا الفوسفوبيد الثاني يحتوي على موقع فسفوري مختلف عن الفسفوببتيد الآخر أو ما إذا كان يمثل ببتيد تريبت مميز يحتوي على نفس موقع الفسفرة.

الرقم 4.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 4.

CK2 ينظم الفسفرة واستقرار ΔFosB في الخلايا السليمة. A، CK2 ولكن ليس PKC يبدو أن phosphorylate ΔFosB في الخلايا. خرائط phosphopeptide ثنائية الأبعاد لـ ΔFosB phosphorylated بواسطة CK2 أو PKC المختبر أو عن طريق خلايا PC12 سليمة. تظهر الأسهم هجرة الببتيد CK2-phosphorylated ولكن ليس PKC-phosphorylated واحد مع واحد من phosphopeptides ΔFosB التي تم الحصول عليها من خلايا PC12. B، يتم زيادة الفسفرة ΔFosB في خلايا PC12 من خلال معالجة الخلايا مع سمن المنشط CK2 (SP) وينخفض ​​عن طريق العلاج مع مثبط CK2 DRB. في المقابل ، لم يتأثر الفسفرة ΔFosB في خلايا PC12 بالمعالجة مع منشط PKC (PMA) أو مثبط PKC النوعي calphostin-C (Calph). يظهر تصوير autoradiogram (أعلى اللوحة) و immunoblot (اللوحة السفلية). C-F، تأثير نشاط CK2 على استقرار ΔFosB. توضح الأرقام الدورة الزمنية (والتصوير الأوتوماتيدي التمثيلي) لتدهور ΔFosB. خضعت خلايا PC12 المعبر عنها بشكل عابر لـ ΔFosB لتجارب المطاردة النبضية التي أجريت في غياب أو وجود مثبط CK2 DRB (C) ، و CK2 المنشط سبيرمين (D) ، أو مثبط كيناز واسع الطيف H-8 (E) ، والذي تم استخدامه للتحكم في التأثيرات غير المحددة لـ DRB. F، تأثير ضرب أسفل الوحدة التحفيزية من CK2 على استقرار ΔFosB. تمت transfected خلايا PC12 إما مع siRNA (Ctr) أو siRNA تستهدف الفئران CK2α و 24 h transfected لاحقا مع بلازميد ΔFosB. وتصور اللوحة العلوية طاقات مناعية للكلايات ذات الخلايا الكاملة تظهر تأثير CK2 siRNA على مستويات البروتين CK2 و ΔFosB. يتم عرض مناعة المناظرة المقابلة لـ β-tubulin كتحكم في التحميل.

لمزيد من معالجة الصلة الفسيولوجية لـ CK2 على أنها ΔFosB kinase ، عالجنا خلايا PC12 معربا عن اثنين من العقاقير التي تعدل نشاط CK2. كما هو موضح في الشكل 4B، تم تقليل الفسفرة ΔFosB عن طريق معالجة خلايا PC12 مع مثبط CK2 القابل للنفاذ الخلوي DRB (Meggio et al.، 1990; Szyszka وآخرون ، 1995) ، وتزداد من خلال المعالجة باستخدام مادة البولي أميد السائلة ، المعروفة بكونها منشطًا قويًا CK2 (Cochet و Chambaz ، 1983; Meggio et al.، 1983). في المقابل ، علاج خلايا PC12 مع مثبط PKC calphostin-C (كوباياشي وآخرون ، 1989; Tamaoki وآخرون ، 1990) أو من PKA المنشط (Schmidt و Hecker ، 1975; Beh et al.، 1989) لم يسفر عن تغييرات كبيرة في فسفرة ΔFosB. في حالة سلطة النقد الفلسطينية ، فإن الزيادة الطفيفة (وليست كبيرة) في 32يمكن حساب P-ΔFosB من خلال زيادة في مستويات ΔFOSB الكلية الناجمة عن هذا الدواء ؛ في الواقع ، تم الإبلاغ عن أن استرات phorbol تحث على التعبير عن العديد من بروتينات عائلة Fos ، بما في ذلك FosB (يوزا وآخرون ، 1992; سوه وآخرون ، 2004). وعلاوة على ذلك ، علاج الخلايا مع مثبط CaMKII نفاذية محددة من الخلايا M-AIP (إيشيدا وفوجيساوا ، 1995; ستيفنز وآخرون ، 1999) أيضا لم ينتج عنها انخفاض pFosB الفسفرة (لا تظهر البيانات). معا ، هذه النتائج متسقة مع شركائنا المختبر وتشير النتائج إلى أنه في الخلايا السليمة is من المحتمل أن يكون الفوسفوريتيد فسفوريليته CK2 ولكن ليس PKC أو CaMKII. حقيقة أن تثبيط CK2 لا يمنع تمامًا pFosB الفسفرة يشير إلى وجود مواقع فسفرة إضافية في البروتين.

بعد ذلك قمنا بفحص ما إذا كان CK2 يلعب دورًا في دوران ΔFosB وبالتالي في استقراره. ولتحقيق هذه الغاية ، أجرينا تجارب مطارد النبض باستخدام خلايا PC12 التي تعالج بـ CK2 أو مثبط CK2 المستخدم في دراسة الفسفرة. كما هو موضح في الشكل 4Cكان للعلاج بالخلايا مع مثبط CK2 DRB تأثير معنوي على معدل دوران ΔFosB ، ويتضح ذلك من خلال تغير شكل منحنى الانحطاط ، من ثنائي الطور إلى منحنى أقرب إلى الانحراف الأسي. على العكس من ذلك ، تسبب وجود المنشط CK2 سبيرمين في انخفاض ملحوظ في معدل تحلل ΔFosB ، مما أدى إلى تراكم البروتين خلال الساعات الأولى من المطاردة (التين 4D).

كما هو الحال مع العديد من المنشطات والمثبطات كيناز ، يمكن أن يكون سبرمين و DRB آثار الأيضية خارج تعديل نشاط CK2. في الواقع ، تم إظهار DRB لتثبيط عامل النسخ IIH (TFIIH) - kasease المرتبطة (Yankulov et al.، 1995) ، مما يؤدي إلى تثبيط النسخ RNA البلمرة II بوساطة. لأن هذا التأثير يمكن أن يؤثر على استقرار ΔFosB ، قمنا بتحليل تأثير مثبط كيناز واسع الطيف H-8 (Hidaka و Kobayashi ، 1992) على دوران ΔFosB عند التركيز (200 μm) المعروف بتثبيط الكيناز المصاحب لـ TFIIH ولكن ليس CK2 (Yankulov et al.، 1995). كما هو موضح في الشكل 4E، لم يؤثر العلاج باستخدام H-8 على معدل دوران ΔFosB. تم الحصول على نتائج مماثلة مع H-7 ، وهو مثبط كيناز واسع الطيف واسع ، يستخدم عند التركيز الذي يثبط كينازات TFIIH المرتبطة ولكن ليس CK2 (لا تظهر البيانات). وتدعم هذه البيانات أيضًا التفسير بأن الانخفاض في ثبات ΔFosB الناتج عن DRB يُعزى على الأرجح إلى تثبيط CK2.

لمزيد من تأسيس دور CK2 في دوران ΔFosB ، قمنا بالتحقيق في عواقب التخلص من CK2 عبر siRNA. أجرينا هذه التجارب باستخدام خلايا PC12 التي أُصيبت بالتهاب مع التحكم (sontaget) siRNA أو siRNA الذي يستهدف mRNA للوحدة التحفيزية للجرذان CK2 (CK2α) و 24 h لاحقًا مع ΔFosB. كما هو موضح في الشكل 4F، ترنسفكأيشن مع CK2α siRNA بشكل فعال وعلى وجه التحديد هدم مستويات البروتين CK2α دون التأثير على مستويات ΔFosB (اللوحة العليا). كشف تحليل مطارد النبض أن هدم CK2 أدى إلى زيادة كبيرة في معدل دوران ΔFosB كما يتضح من التدهور الأسرع للبروتين. حقيقة أن تثبيط نشاط CK2 (سواء عن طريق العلاج DRB أو siRNA) يزيد من معدل دوران ΔFosB ويؤدي إلى اختفاء مكون معدل بطيء لمنحنى ثنائي الطور ، بينما يعزز تنشيط CK2 الطور البطيء للمنحنى ، ويوفر دعمًا قويًا فكرة أن CK2 يلعب دورًا في تنظيم استقرار ΔFosB.

CK2 phosphorylates ΔFosB على Ser27

للبدء في تحديد الموقع (المواقع) على ΔFosB phosphorylated بواسطة CK2 ، أجرينا تحليل phospho-amino acid لـ recombinant ΔFosB phosphorylated by CK2 المختبر و ΔFosB phosphorylated في خلايا PC12. وكشفت هذه التجارب أنه في كلتا الحالتين ، كان الحمض الأميني الفوسفاتي الوحيد المكتشف هو الفوسفو-سير (phospho-Ser).التين 5A). هذه النتيجة ، جنبا إلى جنب مع رياضيات الكيمياء التي تم الحصول عليها ل CK2 المختبر تفاعل فسفرة (∼50٪) (التين 3B) ووجود بقعة واحدة كبيرة فقط على خريطة فوسفوبتيدي CK2 (التين 4A) ، يقترح أن الفسفرة CK2 من ΔFosB على الأرجح تقتصر على بقايا واحدة serine. هذا الاستنتاج يتسق مع تحليل موقع الإجماع الفسفوري (التين 2B) ، التي توقعت وجود مرشح واحد فقط ، وهو Ser27 ، لـ CK2. كشف التحليل التصنيفي أن Ser27 محمي بشكل كبير من خلال التطور بين أفراد عائلة Fos (التين 5B) ، مما يوحي بأنها قد تحمل وظيفة فسيولوجية مهمة.

الرقم 5.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 5.

CK2 Phosphorylates ΔFosB على Ser27. A، تحليل حمض Phosphoamino من CK2-phosphorylated (المختبر) و PC12 cellFosB الفسفرة الخلوية التي تبين ، في كلتا الحالتين ، فإن المتبقي الرئيسي phosphorylated هو سيرين. B، أظهر تحليل الأنواع المشتركة من FOSB / ΔFosB amino acid sequence الحفاظ العالي على Ser27 بين أفراد عائلة Fos من الإنسان إلى الزرد (تسليط الضوء المظلم). ومع ذلك ، لا يتم حفظ البقايا الحمضية في الموضع + 3 ، المطلوب لموقع توافق الآراء CK2 (تمييز الضوء). C، transfected خلايا HeLa عابر مع إما نوع البرية ΔFosB (WT) أو ΔFosB تحتوي على طفرة نقطة لتحل محل Ser27 مع علاء (S27A). كانت الخلايا الأيضية المسمى مع 32PH3PO4 وتعامل مع مركبة أو مع سبيرم (SP) لتنشيط CK2. يظهر تصوير autoradiogram (أعلى اللوحة) و immunoblot (اللوحة السفلية) من immFosB immunoprecipitates التي تم الحصول عليها. يتم عرض immunoprecipitate من الخلايا transfected وهمية (ناقل).

لتحديد ما إذا كان Ser27 يتم فسفوريلته في ΔFosB ، قمنا بتحوير هذه المادة المتبقية إلى Ala ، وقمنا بتحليل العواقب على حالة الفسفرة للبروتين. تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا خلايا هيلا (التي يمكن transfected مع أعلى كفاءة) للتعبير عابر إما WT أو S27A متحولة ΔFosB. ما يقرب من 24 ح بعد ترنسفكأيشن ، تم تسمية الخلايا الأيضية مع 32وقد أعدت P-orthophosphate ، و lysates خلية كاملة. بعد التدبير المناعي و SDS-PAGE ، 32تم الكشف عن P-ΔFosB عن طريق التصوير الشعاعي الشامل و ΔFosB الكلي عن طريق immunoblotting. كما هو موضح في الشكل 5C (اللوحة السفلية) ، لم يتم الكشف عن ΔFosB في الخلايا المتناقلة transfected ، في حين أن الخلايا transfected مع إما WT أو S27A متحولة ΔFosB بنجاح عبرت عن البروتين. وجدنا أن طفرة S27A تسببت في انخفاض كبير (∼30٪) في 32مستويات P-ΔFosB (التين 5C, أعلى اللوحة والرسم البياني) ، مما يدل على أن ΔFosB في الخلايا الحية هو phosphorylated على Ser27. في محاولة لتحديد ما إذا كان Ser27 في الخلايا يتم بالفعل فسفرة من CK2 ، قمنا بمقارنة قدرة المنمنم CK2 المنوي لتعديل فسفرة WT و S27A ΔFosB. كما لاحظنا سابقًا في خلايا PC12 (التين 4B) ، علاج خلايا هيلا مع سبرمين زيادة فسفرة بشكل ملحوظ من البروتين WT. حقيقة أن هذا التأثير تقلص بشكل ملحوظ من خلال طفرة S27A (التين 5C) يدعم تفسير أن Ser27 في ΔFosB هو الركيزة الفسيولوجية ل CK2.

الفسفرة من Ser27 ينظم استقرار ΔFosB

بعد التأكد من أن استقرار ΔFosB ينخفض ​​عندما يتم منع CK2 وتحسينه عند تنشيط CK2 (التين 4) ، وأن CK2 phosphorylates ΔFosB على Ser27 (التين 5) ، وتوقعنا أن منع الفسفرة من هذا الموقع يجب أن يزعزع استقرار البروتين. كشفت تجارب Pulse-chase التي أُجريت مع خلايا HLA بشكل عابر إما WT أو S27A mutant ΔFosB ، أنه ، كما كان متوقعًا ، أدى تحور S27A إلى زيادة كبيرة في معدل تحلل ΔFosB ، وما يصاحب ذلك من انخفاض في عمر النصف للبروتين. (التين 6A). ثم تحققنا مما إذا كانت هذه الآلية التنظيمية تحدث أيضًا في خط الخلية PC12 الأكثر تشابهاً مع العصبون. وكشفت هذه التجارب ، كما لاحظنا في خلايا هيلا ، أن طفرة نقطة S27A تسبب في انخفاض كبير في نصف عمر ΔFosB في خلايا PC12 (من ∼11 إلى ∼4 h) (التين 6B). حقيقة أن زعزعة الاستقرار مشابهة لتلك الناجمة عن تثبيط CK2 أو نهدم (التين 4) يوفر المزيد من الدعم لفكرة أن الفسفرة بوساطة CX2 من Ser27 ينظم استقرار ΔFosB. تم الحصول على أدلة إضافية للدور التنظيمي للفسفرة Ser27 على دوران البروتين ΔFosB باستخدام Ser27 phosphomimetic إلى طفرة Asp (S27D). تعتبر S27D طفرة فسفورية ، لأنها تضع مجموعة كبيرة سالب الشحنة (carboxyl) في الأحماض الأمينية 27 ، وبالتالي تحاكي جزئيا فسفرة Ser27. كما هو موضح في الشكل 6C، تسببت الطفرة S27D في التأثير المعاكس لطفرة S27A وأدت إلى بروتين أكثر استقرارًا من بروتين WT. على نحو مماثل للتأثير الذي تم الحصول عليه بعد تنشيط CK2 (التين 4D) ، أدى تحور S27D إلى التراكم وبالتالي زيادة مستويات ΔFosB خلال الساعات الأولى من مطاردة.

الرقم 6.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 6.

الفسفرة من Ser27 ينظم استقرار ΔFosB. A, C، تحليل نبض مطاردة تبين تأثير SerphonumXPhosphorlation على معدل دوران ΔFosB. يتم عرض ملف تعريف الانحطاط وفترة نصف العمر المقدرة للنوع البري ΔFosB (WT) ، و Ser27 إلى Ala mutant (S27A) ، و Ser27 الفسفوري إلى Asp mutant (S27D). تم الحصول على نفس النتائج في خلايا هيلا (A) وخلايا PC12 (B, C).

SerocNUMX phosphorylation يستقر ΔFosB عن طريق منع تدهورها البروتيزومي

للبدء في توضيح الآلية التي بواسطتها يعمل الفسفرة من Ser27 على استقرار ΔFosB ، قمنا بفحص قدرة مثبطات البروتوزوم MG132 (Palombella et al.، 1994; Tsubuki وآخرون ، 1996) و epoxomicin (Hanada وآخرون ، 1992; كيم وآخرون، 1999) لتعديل معدل تدهور WT و S27A متحولة ΔFosB. أجريت تجارب النبض- المطارد باستخدام خلايا PC12 المصابة بفيروس HSV المعاد تعبئته معربًا عن WT أو S27A ΔFosB وتعامل مع أي من DMSO أو أحد مثبطات البروتوزوم. كشفت هذه التجارب أنه على الرغم من أن معدل تحلل البروتين WT غير حساس نسبيا لوجود أي من مثبطات البروتوزوم (التين 7A) ، أن من متحولة S27A حساس لهذه الأدوية (التين 7B). يشير هذا إلى أنه على عكس بروتين WT ، فإن طور S27A هو هدف لتدهور البروتينات. وبالفعل ، فإن معالجة الخلايا التي تحتوي إما على MG132 أو epoxomicin عكس تأثير طفرة S27A بالكامل على معدل تحلل ΔFosB ، ويتضح ذلك من خلال زيادة عمر النصف من متحور S27A من ∼4 إلى ∼9 h من أجل MG132 وإلى ∼ 12 h for epoxomicin (التين 7B). معا ، تشير هذه النتائج إلى أن الفسفرة من ΔFosB على Ser27 يحمي البروتين من تدهور proteasomal ولذلك فهو ضروري لاستقراره غير عادية.

الرقم 7.

عرض نسخة أكبر:

الرقم 7.

تعمل الفسفرة من Ser27 على استقرار ΔFosB من خلال منع تدهورها البروتيزومي. A, B، تحليل مطارد النبض مع خلايا PC12 المصابة بفيروس HSV والتي تعرض صورة الانحلال وتقدير عمر النصف لنوع ΔFosB البري (A) أو S27A ΔFosB (B) في غياب أو وجود أي من مثبطات البروتوزوم 2 [MG132 و epoxomin (Epoxo)]. لاحظ حقيقة أن أي عقار له تأثير كبير على دوران البرية من نوع ΔFosB ، في حين أن علاج الخلايا مع أي مثبطات proteasome أدى إلى استقرار S27A ΔFosB. C، نموذج لدور الفسفرة Ser27 في قدرة ΔFosB للتوسط لدونة الدماغ على المدى الطويل. وبمجرد استحثاثها ، يتم تثبيت جزء من ΔFosB في الدماغ بواسطة الفسفرة CX2 بوساطة S27. هذا يؤدي إلى تراكمها ، وهذا بدوره يؤدي إلى تغييرات طويلة الأمد في التعبير الجيني. تساهم هذه التغيرات المستقرة في التعبير الجيني في التكيف السلوكي المستقر. وعلى العكس من ذلك ، يؤدي فسفرة S27 بواسطة Sypn Thr phosphatases PP1 و / أو PP2A إلى زعزعة استقرار البروتين ومعالجته بآلات proteasomal.

القسم السابقالقسم التالي

مناقشة

في الدراسة الحالية ، نظهر أن ΔFosB له عمر نصف ∼10 h في زراعة الخلايا ، مما يجعله مستقرًا مقارنةً مع FosB بالطول الكامل ومعظم عوامل النسخ التحويلية الأخرى ، والتي يمكن أن تكون أعمار النصف في زراعة الخلايا قصيرة كدقائق قليلة ونادرًا ما تتجاوز 3 h (Hann و Eisenman ، 1984; Dobrazanski وآخرون ، 1991; روبرتس ووايتلو ، 1999; فيرارا وآخرون ، 2003; هيراتا وآخرون ، 2004). بالإضافة إلى ذلك ، نجد أن ΔFosB يتم فوسفوريلته في الدماغ وأن الفسفرة له حساسة تجاه مثبط PP1 / PP2A أوكاداديك. تثبت دراسات استزراع الخلايا لدينا أن استقرار ΔFosB يتشكل بواسطة CK2 ، مع زيادة نشاط CK2 في تثبيت البروتين. وأخيرًا ، توحي نتائجنا بأن CK2 يفسر ΔFosB على سيرينات N شديدة التحفظ (S27) ويثبت أن الفسفرة من S27 تحمي ΔFosB من التدهور البروتينيزي. ولذلك فإننا نقترح نموذجًا حيث تكون phosphorylation of ΔFosB على S27 بواسطة CK2 آلية تنظيمية حرجة لدوران ΔFosB (التين 7C). هذا الاستقرار الفسفوري-الوسيط لـ ΔFosB مهم من الناحية الوظيفية ، وذلك لأن زيادة مستويات ΔFOSB في مناطق معينة من الدماغ قد تم تنظيمها مباشرة لتنظيم العديد من الجينات العصبية. في الجسم الحي وممارسة التأثيرات السلوكية القوية في النماذج الحيوانية للعديد من الاضطرابات العصبية والنفسية (انظر المقدمة).

على الرغم من أن الفسفرة هي طريقة سريعة وقابلة للانعكاس لتنظيم نشاط النسخ لبعض عوامل النسخ ، مثل CREB (بروتين ربط عنصر استجابة cAMP) (Bohmann ، 1990) ، إن تعديل تحلل عوامل النسخ يوفر شكلاً أكثر قوة (أقل قابلية للعكس) للتنظيم (ديستيرو وآخرون ، 2000). عوامل النسخ التي ينظم نشاطها الوظيفي على مستوى تدهورها تشمل NFκB (ديستيرو وآخرون ، 2000) ، c-Myc (سيرز وآخرون ، 1999) و c-Fos (فيرارا وآخرون ، 2003)، من بين أمور أخرى. في العديد من الحالات ، يعد الفسفرة منظمًا رئيسيًا لاستقرار عامل النسخ ، كما هو موضح لـ c-Fos (Okazaki و Sagata ، 1995; تسورومي وآخرون ، 1995) ، مستضد FOS-related 1 (Fra-1) (فيال ومارشال ، 2003) ، Fra-2 (مانابي وآخرون ، 2001) ، ج-جون (Fuchs et al.، 1996) ، جون بFuchs et al.، 1997) ، ATF2 (Fuchs et al.، 2000) و p53 (Buschmann et al ، 2001). وبالتالي ، فإن دراساتنا تضيف ΔFosB إلى قائمة عوامل النسخ التي يتم تنظيم نشاطها الوظيفي من خلال ثباتها المعتمد على الفسفرة.

CK2 هو Ser / Thr كيناز في كل مكان ونشط بشكل أساسي يحتوي على أكثر من 300 ركيزة مزعومة تم تحديدها حتى الآن وهي متورطة في عمليات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك موت الخلايا وبقائها (ليتشفيلد ، 2003; Unger et al.، 2004) ، استجابات التوتر الخلوي (Yanagawa et al.، 1997; كاتو وآخرون ، 2003) ، وإصلاح الحمض النووي وإعادة عرض الكروماتين (بارز وآخرون ، 2003; كرون وآخرون ، 2003). أكثر من ثلث الركائز المفترضة لـ CK2 هي بروتينات ضالعة في تنظيم التعبير الجيني (Meggio و Pinna ، 2003). في الواقع ، لقد ثبت أن CK2 هو كيناز نووي بارز (Krek وآخرون ، 1992) (للمراجعة ، انظر يو وآخرون ، 2001) والتفاعل مع مجالات bZIP للعديد من عوامل النسخ (Yamaguchi et al.، 1998). وقد تبين أيضا أن الفسفرة CK2 بوساطة تعديل التحلل (إما تعزيز أو خفضه) من العديد من البروتينات ، بما في ذلك IkB (Schwarz وآخرون ، 1996) ، PTEN (Torres و Pulido ، 2001) ، عدسة connexin (يين وآخرون ، 2000) ، بروتين المرتبطة الكروماتين HMG1 (Wisniewski وآخرون ، 1999) وعدة عوامل نسخ مثل HMGB (Stemmer et al.، 2002) ، Myf-5 (Winter et al.، 1997) و c-Myc (Channavajhala و Seldin ، 2002). CK2 هو الأكثر وفرة في الدماغ (Alcazar وآخرون ، 1988; Girault et al.، 1990) ، وقد تورط نشاطه في العديد من جوانب وظائف المخ ، بما في ذلك البقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية (Boehning et al.، 2003)، التفاضل (Nuthall وآخرون ، 2004) ، وظيفة قناة أيون (جونز وياكل ، 2003; Bildl et al.، 2004) ، والجهد على المدى الطويل واللدونة العصبية (Diaz-Nido et al.، 1992; ليبرمان و مودي ، 1999; Reikhardt وآخرون ، 2003).

على الرغم من هذه الأدلة المتنامية لدور CK2 في تنظيم وظيفة الخلايا العصبية ، لا يعرف إلا القليل عن ما يتحكم في نشاطها. من المعتقد أن CK2 نشط بشكل أساسي ، مع تنظيم قدرته على فسفوريلات معينة تعتمد في الغالب على التغيرات في توطينه داخل الخلايا (على سبيل المثال ، السيتوسول مقابل النواة) (أحمد والتوفيق ، 1994; يو وآخرون ، 1999). تثير هذه المعلومات سؤالًا مهمًا حول الإشارات المطلوبة للحث على تراكم ΔFOSB في الدماغ بعد التحفيز المزمن (التين 7C). شرط واحد هو تكرار التنشيط fosB الجين وتحريض ΔFosB mRNA (تشن وآخرون ، 1995). تشير بياناتنا إلى أن فسفرة CK2 لـ ΔFosB ضرورية لاستقراره ، مما يشير إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى إشارة ثانية للتأثيرات طويلة الأجل لـ ΔFosB على التعبير الجيني ، وهي إشارة تحفز فسفرة البروتين بواسطة CK2. قد ينطوي ذلك على تفعيل CK2 بواسطة آلية غير معروفة أو نقلها إلى النواة. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون فسفرة CK2 من ΔFosB مؤسسية ، بحيث يتم ترجمة Δ البروتين بروتين ΔFosB استجابة لكل حافز ، يحصل جزء منه على فسفوريلود وبالتالي استقر ، بحيث يتراكم مع التحفيز المتكرر إلى مستويات عالية في الخلايا العصبية المتأثرة.

تظهر النتائج التي توصلنا إليها أن CK2 و S27 ليسا على الأرجح الكياناز الوحيد والموقع المسئول عن phosphorylation ،FosB ، لأن تثبيط CK2 ولا طفرة S27A كانا قادرين على منع phosphorylation ΔFosB تمامًا. على نفس المنوال ، فإن حقيقة أن طفرة S27A تؤدي إلى تقليل 30٪ في phospho-ΔFosB تجادل بأن S27 موقع فسفوري رئيسي على البروتين. نحن ، مع ذلك ، نحقق في مواقع كينازات وفاشية أخرى مفترضة على ΔFosB. في النهاية ، سيكون من المهم أيضًا تحليل فسفرة S27 وأي مواقع فسفورية أخرى في ΔFosB في الدماغ في الجسم الحي بعد أنواع مختلفة من التحفيز المزمن ، على سبيل المثال ، من خلال استخدام مطياف الكتلة أو الأجسام المضادة الفوسفورية.

كما ذكرنا أعلاه ، فإن S27 الموجود في ΔFosB محفوظ بدرجة عالية في جميع مراحل التطور وبين بروتينات عائلة Fos الأخرى. ومع ذلك ، موقع التوافق لـ CK2 ليس: كما هو موضح في الشكل 5B، فقط FosB / ΔFosB (و xenolog الزرد) ، ولكن ليس c-Fos أو Fra-2 ، تمتلك بقايا حمضية عند + 3 ، وهو محدد رئيسي لفسفرة CK2 (مارين وآخرون ، 1986; Meggio et al.، 1994). وبالتالي ، فإن عدم وجود فسفرة CK2 على S27 قد يفسر لماذا ليست بروتينات عائلة Fos الأخرى مستقرة مثل ΔFosB. ومع ذلك ، لا يفسر هذا سبب عدم استقرار FosB كامل الطول ، والذي يحتوي على نفس موقع الإجماع CK2 كـ ΔFosB ، بشكل مماثل. نحن لا نعرف ما إذا كان FosB كامل الطول يتم فسفوريلته بواسطة CK2 على هذه البقية المحفوظة. التقارير الوحيدة من FosB (سكينر وآخرون ، 1997) و c-Fos (Okazaki و Sagata ، 1995; تشن وآخرون ، 1996يصف الفسفرة المواقع في منطقة C-terminal لهذه البروتينات ، والتي تكون غائبة في ΔFosB. تتطلب الفسفرة المحتملة لـ FosB بالطول الكامل وبروتينات عائلة Fos الأخرى بواسطة CK2 إجراء تحقيق مباشر. ومع ذلك ، حتى إذا كانت فسفورية ، فإن بروتينات عائلة فوس الأخرى معروفة بأنها تحتوي على زخارف في الوسيطة C التي تستهدف البروتينات للتدهور السريع (Papavassiliou وآخرون ، 1992; Jariel-Encontre et al.، 1997; Acquaviva وآخرون ، 2002). على سبيل المثال ، فقد تبين أن امتدادًا من بقايا ∼21 الموجودة في النهاية C لجميع بروتينات عائلة Fos ، ولكنه غائب في ΔFosB ، يعمل كمجال يزعزع استقرار c-Fos (Acquaviva وآخرون ، 2001). وجدنا أنه على الرغم من أن هذا التسلسل يزعزع استقرار FosB بطول كامل (Carle et al.، 2004) ، عدم وجود هذا المجال في ΔFosB لا يفسر بالكامل لاستقراره. بدلا من ذلك ، يبدو أن الجمع بين عدم وجود هذا النطاق C terminus و SerxNUMX fhosphorylation يفسر بشكل كامل الفارق بخمس مرات تقريبًا في الثبات بين ΔFosB و FosB.

على الرغم من أن تدهور بروتينات عائلة فوس هو أمر معقد وغير مفهومة تمامًا ، إلا أن تدهور البروتينات البروتيزومية يبدو أنه المسار الرئيسي المعني (سالفات وآخرون ، 1999; Acquaviva وآخرون ، 2002; فيرارا وآخرون ، 2003). البيانات المقدمة هنا ، والتي لا تغير فيها مثبطات البروتوزوم بشكل كبير معدل تدهور FOSB ، تجادل بأن ، خلافا لبروتينات عائلة Fos الأخرى ، ev FOSB يتهرب من Proteasome 26S ، وهذا يلعب دورا مركزيا في استقراره. لذلك نقترح مخططًا يُعزى إليه الاستقرار المعزز لـ ΔFosB إلى مزيج من عاملين رئيسيين هما: (1) عدم وجود مجال لزعزعة وحدة C الطرفية و (2) فسفرة S27 بواسطة CK2.

وباختصار ، فإن الدراسة الحالية توفر رؤية ميكانيكية عن لماذا ΔFosB ، وهو منتج من الجين في وقت مبكر fosB، على عكس جميع أفراد عائلة فوس الأخرى ، وهو بروتين طويل العمر نسبيا. على الرغم من أن بروتينات عائلة فوس الأخرى يُعتقد أنها تتوسط في اقتران التحفيز والاستنساخ السريع ولكن العابر (مورغان و كوران ، 1995) ، الاستقرار النسبي لـ ΔFosB يمنحها القدرة على التوسط في تغييرات النسخ طويلة الأمد الناجمة عن التحفيز المزمن. هذا يدعم الرأي القائل بأن ΔFosB يعمل كمحول جزيئي مستديم في الدماغ ، وتحويل ردود الفعل الحادة تدريجيا إلى تكيفات مزمنة. التعرف على سيرورة سيركسنومكس كآلية مركزية لاستقرار ΔFosB يفتح سبلا جديدة لتطوير وسائل لتنظيم وظيفة ΔFosB وبالتالي تعديل آثاره على المدى الطويل على اللدونة العصبية والسلوكية.

القسم السابقالقسم التالي

الحواشي

  • تم استلام نوفمبر 21 ، 2005.
  • تم استلام المراجعة في فبراير 21 و 2006.
  • تم قبولها في أبريل 2 و 2006.
  • تم دعم هذا العمل من قبل التحالف الوطني لأبحاث عن الفصام والاكتئاب جائزة الباحث الشاب إلى PGU ، وهي جائزة المعهد القومي لبحوث تعاطي المخدرات (NIDA) لجامعة PGU ، والمنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية و NIDA إلى EJN نحن أشكر الدكتور جيمس Bibb لمساعدته مع المختبر مقاييس الفسفرة ، الدكتور مينغ هو هان لمساعدته في إعداد شرائح الدماغ المستخدمة في وضع العلامات الأيضية ، والدكتور راشيل نفيه لمساعدتها في تغليف HSVs المؤتلف.
  • عنوان G.Rudenko الحالي: معهد علوم الحياة وقسم الصيدلة ، جامعة ميشيغان ، 210 Washtenaw Avenue # 3163A، Ann Arbor، MI 48109-2216.
  • يجب إرسال المراسلات إلى Eric J. Nestler و 5323 Harry Hines Boulevard و Dallas و TX 75390-9070. البريد الإلكتروني: [البريد الإلكتروني محمي]

القسم السابق

 

مراجع حسابات

  1. ↵

Acquaviva C، Brockly F، Ferrara P، Bossis G، Salvat C، Jariel-Encontre I، Piechaczyk M (2001) التعرف على شكل ثلاثي الببتيد ثلاثي الأطراف المتضمن في التحكم في التحلل السريع للبروتيزومي للبروتين المفترس (C-Fos proto-oncoprotein) أثناء انتقال المرحلة G (0) إلى - S. الجين الورمي 20:7563-7572.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Acquaviva C، Bossis G، Ferrara P، Brockly F، Jariel-Encontre I، Piechaczyk M (2002) مسارات تدهور متعددة لبروتينات عائلة Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

MEDLINE

  1. ↵

أحمد ك ، توفيق س (1994) آلية للتنظيم داخل الخلايا من البروتين كيناز CK2: دور رابطة شبه النووية التحفيز بوساطة. Cell Mol Biol Res 40:539-545.

MEDLINE

  1. ↵

Alcazar A، Martin E، Lopez-Fando J، Salinas M (1988) إجراء تنقية محسنة وخصائص الكازيناز الثاني من الدماغ. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Andersson M، Westin JE، Cenci MA (2003) دورة زمنية من معدل الجرعة DeltaFosB تشبه immunoreactivity ومستويات الحمض النووي الريبي المرنازي بعد التوقف عن العلاج الدوبامينوميتيمي المزمن. يورو J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Barz T، Ackermann K، Dubois G، Eils R، Pyerin W (2003) تشير الشاشات التعبيرية على نطاق الجينوم إلى الدور العالمي للبروتين كيناز CK2 في إعادة عرض الكروماتين. J Cell Sci 116:1563-1577.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Beh I، Schmidt R، Hecker E (1989) اثنين من isozymes من PKC وجدت في خلايا HL-60 تظهر اختلاف في التنشيط من قبل TPA phorbol. بادئة رسالة FEBS 249:264-266.

MEDLINE

  1. ↵

Bildl W، Strassmaier T، Thurm H، Andersen J، Eble S، Oliver D، Knipper M، Mann M، Schulte U، Adelman JP، Fakler B (2004) يتم تجميع بروتين كيناز CK2 بالتوصيل الصغير Ca (2 +) - قنوات K + المنشط وينظم تحريك القناة. الخلايا العصبية 43:847-858.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Bing G، Wang W، Qi Q، Feng Z، Hudson P، Jin L، Zhang W، Bing R، Hong JS (1997) تعبير طويل المدى للمستضد المرتبط بفوس والتعبير العابر من دلتا فوسب المصاحب للنوبات في فرس الحصين والمخطط. J نوروتشيم بمعدل 68:272-279.

MEDLINE

  1. ↵

Blom N، Sicheritz-Ponten T، Gupta R، Gammeltoft S، Brunak S (2004) التنبؤ بالجليكوزيل بعد المرسال والفوسفرة من البروتينات من تسلسل الأحماض الأمينية. البروتينات 4:1633-1649.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Boehning D، Moon C، Sharma S، Hurt KJ، Hester LD، Ronnett GV، Shugar D، Snyder SH (2003) neurotransmission أول أكسيد الكربون تفعيلها CK2 فسفر من heme oxygenase-2. الخلايا العصبية 40:129-137.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

بوهمان د (1990) فسفرة عامل النسخ: صلة بين نقل الإشارة وتنظيم التعبير الجيني. الخلايا السرطانية 2:337-344.

MEDLINE

  1. ↵

Buschmann T، Potapova O، Bar-Shira A، Ivanov VN، Fuchs SY، Henderson S، Fried VA، Minamoto T، Alarcon-Vargas D، Pincus MR، Gaarde WA، Holbrook NJ، Shiloh Y، Ronai Z (2001) إن استخدام NH2-terminal kinase phosphorylation من p53 على Thr-81 مهم من أجل تثبيت p53 وأنشطة النسخ في استجابة للإجهاد. مول خلية بيول 21:2743-2754.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Carle TL، Ulery PG، Nestler EJ (2004) يساهم عدم وجود مجال طرفي C محفوظ لعائلة Fos في استقرار deltaFosB الفريد. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

  1. ↵

Channavajhala P، Seldin DC (2002) تفاعل وظيفي للبروتين كيناز CK2 و c-Myc في تكون الغدد اللمفاوية. الجين الورمي 21:5280-5288.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Chen J، Nye HE، Kelz MB، Hiroi N، Nakabeppu Y، Hope BT، Nestler EJ (1995) تنظيم الدلتا FosB والبروتينات FosB مثل الصرع electroconvulsive والعلاجات الكوكايين. مول Pharmacol 48:880-889.

ملخص

  1. ↵

Chen J، Kelz MB، Hope BT، Nakabeppu Y، Nestler EJ (1997) المستضدات المزمنة المرتبطة بـ Fos: المتغيرات المستقرة لـ ΔFosB المستحثة في الدماغ بواسطة العلاجات المزمنة. J Neurosci 17:4933-4941.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Chen RH، Juo PC، Curran T، Blenis J (1996) يعزز فسفرة c-Fos في الطرف C من نشاط التحويل. الجين الورمي 12:1493-1502.

MEDLINE

  1. ↵

Choe ES، Parelkar NK، Kim JY، Cho HW، Kang HS، Mao L، Wang JQ (2004) ويزيد حمض الفوسفاتاز مثبطات 1 / 2A حمض okadaic CREB و Elk-1 phosphorylation وتعبير c-fos في المخطط الفئران في الجسم الحي. J نوروتشيم بمعدل 89:383-390.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Cochet C، Chambaz EM (1983) phosphorylations البروتينات بوساطة بروتين: هدف محتمل لعمل البوليامين داخل الخلايا. خلية مولدة Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Cochet C، Feige JJ، Chambaz EM (1983) الخصائص التحفيزية والجزيئية لنوع كايناز عالي النقاوة نوع G من أنسجة الرئة البقري. Biochim Biophys اكتا 743:1-12.

MEDLINE

  1. ↵

Colby CR، Whisler K، Steffen C، Nestler EJ، Self DW (2003) يعزز overexpression من نوع DeltaRosB الخاص بالخلية القابلة للإستزاف من الحافز للكوكايين. J Neurosci 23:2488-2493.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Daunais JB، Roberts DC، McGinty JF (1993) إن الإدارة الذاتية للكوكايين تزيد من preprodynorphin ، ولكن ليس c-fos ، mRNA في مخطط الفئران. NeuroReport 4:543-546.

MEDLINE

  1. ↵

Desterro JM، Rodriguez MS، Hay RT (2000) تنظيم عوامل النسخ عن طريق تدهور البروتين. خلية مول الحياة العلوم 57:1207-1219.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Diaz-Nido J، Armas-Portela R، Avila J (1992) زيادة في حالة الكازينوب السيتوبلازمي كيناز من النوع الثاني يرافق نمو الخلايا العصبية بعد تثبيط تخليق الحمض النووي في خلايا الورم العصبي NIA-103. J نوروتشيم بمعدل 58:1820-1828.

MEDLINE

  1. ↵

Di Maira G، Salvi M، Arrigoni G، Marin O، Sarno S، Brustolon F، Pinna LA، Ruzzene M (2005) بروتين كيناز CK2 phosphorylates و upregulates Akt / PKB. موت الخلية يختلف 12:668-677.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Dobrazanski P، Noguchi T، Kovary K، Rizzo CA، Lazo PS، Bravo R (1991) إن كلا منتجي جين fosB ، FosB وشكله القصير ، FosB / SF ، هما منشطتان للنسخ في الخلايا الليفية. مول خلية بيول 11:5470-5478.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Ferrara P، Andermarcher E، Bossis G، Acquaviva C، Brockly F، Jariel-Encontre I، Piechaczyk M (2003) تختلف المحددات الهيكلية المسؤولة عن تدهور بروتين بروتين c-Fos وفقًا لشروط التعبير. الجين الورمي 22:1461-1474.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Fuchs SY، Dolan L، Davis RJ، Ronai Z (1996) استهداف الفسفرة التي تعتمد على تواجد C-Jun بواسطة Jun N-kinase. الجين الورمي 13:1531-1535.

MEDLINE

  1. ↵

Fuchs SY، Xie B، Adler V، Fried VA، Davis RJ، Ronai Z (1997) وتستهدف c-Jun NH2-terminal kinases تواجد عوامل النسخ المرتبطة بها. J بيول كيم 272:32163-32168.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Fuchs SY، Tappin I، Ronai Z (2000) وينظم استقرار عامل النسخ ATF2 عن طريق الفسفرة وفسفور الفوسفور. J بيول كيم 275:12560-12564.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Girault JA، Hemmings HC Jr، Williams KR، Nairn AC، Greengard P (1989) Phosphorylation من DARPP-32 ، وهو عبارة عن فوسفاتين ينظم الدوبامين والـ CAMP ، بواسطة الكازيناز IIin. J بيول كيم 264:21748-21759.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Girault JA، Hemmings HC Jr، Zorn SH، Gustafson EL، Greengard P (1990) توصيف في الدماغ في الثدييات من كيناز DARPP-32 كيناز مماثلة لكازيناز كيناز الثاني. J نوروتشيم بمعدل 55:1772-1783.

MEDLINE

  1. ↵

Hanada M، Sugawara K، Kaneta K، Toda S، Nishiyama Y، Tomita K، Yamamoto H، Konishi M، Oki T (1992) Epoxomicin ، وهو عامل جديد مضاد للأورام من أصل ميكروبي. J Antibiot (طوكيو) 45:1746-1752.

MEDLINE

  1. ↵

Hann SR، Eisenman RN (1984) البروتينات المشفرة بواسطة الجين الورمي البشري c-myc: التعبير التفاضلي في خلايا الأورام. مول خلية بيول 4:2486-2497.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Hemmings HC Jr، Girault JA، Williams KR، LoPresti MB، Greengard P (1989) ARPP-21 ، وهو فوسفوري بروتين منظم AMP منظم (Mr = 21,000) غني بالمناطق الدماغية التي تحتوي على الدوبامين. تسلسل الأحماض الأمينية في الموقع phosphorylated بواسطة AMP دوري في الخلايا السليمة والدراسات الحركية من الفسفرة في المختبر. J Biol Chem 264:7726-7733.

  1. ↵

Hidaka H، Kobayashi R (1992) علم الأدوية من مثبطات البروتين كيناز. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Hirata H، Bessho Y، Kokubu H، Masamizu Y، Yamada S، Lewis J، Kageyama R (2004) عدم استقرار البروتين Hes7 أمر حاسم لساعة تجزئة الجسيدة. نات جينيه 36:750-754.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Hiroi N، Graybiel AM (1996) العلاجات الذهنية غير التقليدية والنباتية تحرض برامج متميزة من التعبير عن عامل النسخ في المخطط. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Hope B، Kosofsky B، Hyman SE، Nestler EJ (1992) تنظيم التعبير الجيني الفوري المبكر وربط AP-1 في نواة الفئران المتكئة بالكوكايين المزمن. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Hope BT، Kelz MB، Duman RS، Nestler EJ (1994a) ينتج عن نوبة الصرع الكهربائي المزمن (ECS) تعبيرًا عن مركب AP-1 طويل الأمد في الدماغ مع تكوينه وخصائصه المعدلة. J Neurosci 14:4318-4328.

ملخص

  1. ↵

Hope BT، Nye HE، Kelz MB، Self DW، Iadarola MJ، Nakabeppu Y، Duman RS، Nestler EJ (1994b) تحريض مركب AP-1 طويل الأمد يتألف من بروتينات شبيهة بفيروس Fos في الدماغ عن طريق الكوكايين المزمن وغيرها من العلاجات المزمنة. الخلايا العصبية 13:1235-1244.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Ishida A، Fujisawa H (1995) استقرار بروتين كيناز الثاني المعتمد على الهدنة الهادئة من خلال مجال autoinhibitory. J بيول كيم 270:2163-2170.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Jariel-Encontre I، Salvat C، Steff AM، Pariat M، Acquaviva C، Furstoss O، Piechaczyk M (1997) آليات معقدة للتحليل c-fos و c-jun. مولول بيول ريب 24:51-56.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

جونز س ، ياكل ج (2003) ينظم الكازين kinase الثاني (بروتين kinase ck2) وظيفة مستقبلات القناة السيروتونين 5-ht (3) في خلايا ng108 – 15. علم الأعصاب 119:629-634.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Kato T Jr، Delhase M، Hoffmann A، Karin M (2003) CK2 هو C-terminal IkappaB kinase المسؤول عن تنشيط NF-kappaB أثناء استجابة الأشعة فوق البنفسجية. مول الخليوي 12:829-839.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Kelz MB، Chen J، Carlezon WA Jr، Whisler K، Gilden L، Beckmann AM، Steffen C، Zhang YJ، Marotti L، Self DW، Tkatch T، Baranauskas G، Surmeier DJ، Neve RL، Duman RS، Picciotto MR، Nestler EJ (1999) التعبير عن عامل النسخ deltaFosB في الدماغ يتحكم في الحساسية للكوكايين. الطبيعة 401:272-276.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Kim KB، Myung J، Sin N، Crews CM (1999) تثبيط Proteasome بواسطة المنتجات الطبيعية epoxomicin و dihydroeponemycin: رؤى في خصوصية وقوة. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Kobayashi E، Nakano H، Morimoto M، Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C) ، وهو مركب ميكروبي جديد ، هو مثبط قوي للغاية ومحددة لبروتين كيناز C. الكيميائية الحيوية Biophys الدقة Commun 159:548-553.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Krek W، Maridor G، Nigg EA (1992) الكازين كيناز الثاني هو إنزيم النووي في الغالب. J سيل بيول 116:43-55.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Krohn NM، Stemmer C، Fojan P، Grimm R، Grasser KD (2003) بروتين كيناز CK2 يفسر بروتين مجال مجموعة الحركة العالية SSRP1 ، مما يحفز التعرف على الحمض النووي التالف من الأشعة فوق البنفسجية. J بيول كيم 278:12710-12715.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

كومار A، Choi KH، Renthal W، Tsankova NM، Theobald DEH، Truong HT، Russo SJ، LaPlant Q، Whistler K، Neve RL، Self DW، Nestler EJ (2005) إعادة تشكيل الكروماتين هي آلية رئيسية وراء اللدونة التي يسببها الكوكايين في المخطط. الخلايا العصبية 48:303-314.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

DN ليبرمان ، مودي الأول (1999) ينظم الكازين كيناز-II وظيفة قناة NMDA في الخلايا العصبية قرن آمون. نات نيوروسكي 2:125-132.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Litchfield DW (2003) بروتين كيناز CK2: الهيكل والتنظيم والدور في القرارات الخلوية للحياة والموت. الكيميائية الحيوية J 369:1-15.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Manabe T، Kuramoto N، Nakamichi N، Aramachi K، Baba K، Hirai T، Yoneyama M، Yoneda Y (2001) تدهور بروتين c-Fos المعبر عنه بـ N-methyl-dحمض -ASpartic في الأجزاء النووية من الحصين الفئران. الدماغ الدقة 905:34-43.

MEDLINE

  1. ↵

Mandelzys A، Gruda MA، Bravo R، Morgan JI (1997) عدم وجود مستضد مرتبط بإستمرار 37 kDa و مستضد FOS و AP-1 يشبه نشاط ربط DNA في أدمغة الفئران الخالية من الحمض kosic المعالج. J Neurosci 17:5407-5415.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Marin O، Meggio F، Marchiori F، Borin G، Pinna LA (1986) خصوصية الموقع من الكازين كيناز - 2 (TS) من cytosol الكبد الفئران. دراسة مع ركائز نموذج الببتيد. Eur J Biochem 160:239-244.

  1. ↵

McClung CA، Nestler EJ (2003) تنظيم التعبير الجيني ومكافأة الكوكايين من قبل CREB و DeltaFosB. نات نيوروسكي 6:1208-1215.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

McClung CA، Ulery PG، Perrotti LI، Zachariou V، Berton O، Nestler EJ (2004) DeltaFosB: مفتاح جزيئي للتكيف على المدى الطويل في الدماغ. دماغ الدقة مول 132:146-154.

MEDLINE

  1. ↵

Meggio F، Pinna LA (2003) واحد ألف واحد ركائز بروتين كيناز CK2؟ بولسن J 17:349-368.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Meggio F، Donella-Deana A، Pinna LA، Moret V (1977) فسفرة كسور الكازين بواسطة "فوسفيتين كيناز" في كبد الفئران. بادئة رسالة FEBS 75:192-196.

MEDLINE

  1. ↵

Meggio F، Brunati AM، Pinna LA (1983) Autophosphorylation من نوع 2 casein kinase TS في كل من وحدتي ألفا وبيتا. تأثير المستجيبات المختلفة. بادئة رسالة FEBS 160:203-208.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Meggio F، Shugar D، Pinna LA (1990) مشتقات ريبوفورانوسيل بنزميدازول كمثبطات للكازيناز كيناز 2 و الكازيناز كيناز - 1. Eur J Biochem 187:89-94.

MEDLINE

  1. ↵

Meggio F، Marin O، Pinna LA (1994) خصوصية الركيزة من البروتين كيناز CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.

MEDLINE

  1. ↵

Miller C، Zhang M، He Y، Zhao J، Pelletier JP، Martel-Pelletier J، Di Battista JA (1998) التحريض النسخي لجين الأكسيل الحلقية-2 بواسطة تثبيط حمض أوكادايك لنشاط الفوسفاتيز في غضروفية الإنسان: التحفيز المشترك للبروتينات AP-1 و CRE النووية. J خلية Biochem 69:392-413.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Moratalla R، Elibol B، Vallejo M، Graybiel AM (1996) التغيرات على مستوى الشبكة في التعبير عن بروتينات Fos-Jun المحرضة في المخطط المخطط لها خلال المعالجة المزمنة للكوكايين والانسحاب. الخلايا العصبية 17:147-156.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Morgan JI، Curran T (1995) جينات فورية مبكرة: عشر سنوات. اتجاهات neurosci 18:66-67.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Nakabeppu Y، Nathans D (1991) شكل مبتور بشكل طبيعي لـ FosB يثبط نشاط النسخ من Fos / Jun. الموبايل 64:751-759.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Nestler EJ، Barrot M، Self DW (2001) دلتا FosB: التبديل الجزيئي المستمر للإدمان. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Neve RL، Howe JR، Hong S، Kalb RG (1997) مقدمة من وحدة فرعية مستقبلات الغلوتامات 1 في الخلايا العصبية الحركية في المختبر وفي الجسم الحي باستخدام فيروس الهربس البسيط المؤتلف. علم الأعصاب 79:435-447.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Nuthall HN، Joachim K، Stifani S (2004) الفسفرة من 239 سيرين من Groucho / TLE1 بروتين كيناز CK2 مهم لتثبيط التمايز العصبية. مول خلية بيول 24:8395-8407.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Okazaki K، Sagata N (1995) يعمل مسار الكينيز موس / MAP على تثبيت c-Fos بواسطة الفسفرة ويزيد من نشاط التحويل في خلايا NIH 3T3. EMBO J 14:5048-5059.

MEDLINE

  1. ↵

Palombella VJ، Rando OJ، Goldberg AL، Maniatis T (1994) مطلوب مسار ubiquitin-proteasome لمعالجة بروتين NF-kappa B1 السلائف وتفعيل NF-kappa B. الموبايل 78:773-785.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Papavassiliou AG، Treier M، Chavrier C، Bohmann D (1992) التدهور المستهدف لـ c-Fos ، ولكن ليس v-Fos ، بواسطة إشارة تعتمد على الفسفرة على c-Jun. علوم 258:1941-1944.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Peakman MC، Colby C، Perrotti LI، Tekumalla P، Carle T، Ulery P، Chao J، Duman C، Steffen C، Monteggia L، Allen MR، Stock JL، Duman RS، McNeish JD، Barrot M، Self DW، Nestler EJ ، شيفر إي (2003) ويؤدي التعبير النوعي للدماغ ، المتحول إلى دماغ سلبي سائد في c-Jun في الفئران المحورة جينيا ، إلى انخفاض حساسية الكوكايين. الدماغ الدقة 970:73-86.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Perrotti LI، Hadeishi Y، Ulery PG، Barrot M، Monteggia L، Duman RS، Nestler EJ (2004) تحريض DeltaFosB في هياكل الدماغ ذات الصلة مكافأة بعد الإجهاد المزمن. J Neurosci 24:10594-10602.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Persico AM ، Schindler CW ، O'Hara BF ، Brannock MT ، Uhl GR (1993) التعبير عن عامل النسخ الدماغي: آثار الأمفيتامين الحاد والمزمن والإجهاد الناتج عن الحقن. دماغ الدقة مول 20:91-100.

MEDLINE

  1. ↵

Ploegh HL، Dunn BM (2000) بعد التعديل متعدية: الفسفرة والفوسفاتاز. في: البروتوكولات الحالية في علوم البروتين (Dunn BM، ed.) pp. 13.01-13.02. نيويورك: وايلي وأولاده.

  1. ↵

Pyerin W، Burow E، Michaely K، Kubler D، Kinzel V (1987) الخصائص التحفيزية والجزيئية للنوع الثاني من الفوسفيتين / الكازيناز المنقى بدرجة عالية من الخلايا الطلائية البشرية في الثقافة (HeLa) وعلاقته بالبروتين كيناز ecto. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

MEDLINE

  1. ↵

Reikhardt BA، Kulikova OG، Borisova GY، Aleksandrova IY، Sapronov NS (2003) حالة نظام "بروتين كيناز CK2-HMG14" في فقدان الذاكرة المرتبط بالعمر في الجرذان. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

MEDLINE

  1. ↵

Roberts BJ، Whitelaw ML (1999) تدهور لمستقبلات دايوكسين المجال التوافقي الحلزوني الحلقي / لكل ARNT-Sim عبر مسلك ubiquitin / proteasome. J بيول كيم 274:36351-36356.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Rost B، Yachdav G، Liu J (2004) خادم PredictProtein. الأحماض النووية الدقة 32:W321-W326.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Rylski M، Kaczmarek L (2004) أهداف Ap-1 في الدماغ. الجبهة Biosci 9:8-23.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Sahin B، Kansy JW، Nairn AC، Spychala J، Ealick SE، Fienberg AA، Greene RW، Bibb JA (2004) التوصيف الجزيئي لأدمين كيناز الفأر المؤتلف وتقييمه كهدف لفسفرة البروتين. Eur J Biochem 271:3547-3555.

MEDLINE

  1. ↵

Salvat C، Aquaviva C، Jariel-Encontre I، Ferrara P، Pariat M، Steff AM، Carillo S، Piechaczyk M (1999) هل هناك مسارات متعددة للبروتين تساهم في تدهور البروتين c-Fos و c-Jun و p53 في الجسم الحي؟ مولول بيول ريب 26:45-51.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Schmidt R، Hecker E (1975) أوتوإكسدة إسترات البوربول تحت ظروف التخزين العادية. مرض السرطان 35:1375-1377.

النص الكامل مجانا

  1. ↵

Schwarz EM، Van Antwerp D، Verma IM (1996) الفسفرة التأسيسية من IkappaBalpha بواسطة الكازين كيناز II يحدث بشكل تفضيلي في 293 سيرين: شرط لتدهور IkappaBalpha مجانا. مول خلية بيول 16:3554-3559.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Sears R، Leone G، DeGregori J، Nevins JR (1999) Ras يعزز الاستقرار بروتين Myc. مول الخليوي 3:169-179.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Silva-Neto MA، Fialho E، Paes MC، Oliveira PL، Masuda H (2002) الفسفرة المستقلة النوكليوتيدات الحلقية من فيتيلين من الكازين كيناز الثاني تنقيته من البويضات رودنيوس prolixus. الحشرات Biochem مولود بيول 32:847-857.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Skinner M، Qu S، Moore C، Wisdom R (1997) تتطلب عملية التنشيط والتحويل بواسطة بروتين FosB فسفرة مجال تنشيط الكربوكسل الطرفية. مول خلية بيول 17:2372-2380.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Stemmer C، Schwander A، Bauw G، Fojan P، Grasser KD (2002) بروتين كيناز CK2 تفاضليًا فسفوريلاتس ذرات الكروموسومات عالية الحركة مجموعة ب (HMGB) بروتينات تعديل استقرارها والتفاعلات الحمض النووي. J بيول كيم 277:1092-1098.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Stevens I، Derua R، Rondelez E، Waelkens E، Merlevede W، Goris J (1999) تحديد cyk ، ciclin B2 kinase ، كبروتين كيناز II يعتمد على الكالسيوم / الكودودينولين ، ودوره أثناء عملية نضوج البويضات. إكسب Cell Res 252:303-318.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Suh HW، Choi SS، Lee JK، Lee HK، Han EJ، Lee J (2004) تنظيم التعبير الجيني c-fos و c-jun بواسطة lipopolysaccharide و cytokines في الخلايا النجمية المستزرعة الأولية: تأثير مسارات PKA و PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.

MEDLINE

  1. ↵

Szyszka R، Boguszewska A، Grankowski N، Ballesta JP (1995) الفسفرة التفاضلية لل proteروتينات الحمضية الريبوزومية من خلية الخميرة بواسطة اثنين من كينازات البروتينات الذاتية: الكازيناز kinase-2 و 60S kinase. أكتا بيوشيم بول 42:357-362.

MEDLINE

  1. ↵

Tamaoki T، Takahashi I، Kobayashi E، Nakano H، Akinaga S، Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) والمركبات ذات الصلة calphostin ، فئة جديدة من مثبطات محددة وقوية من البروتين كيناز C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.

MEDLINE

  1. ↵

Torres J، Pulido R (2001) هو phosphorylated الورم القامع للورم PTEN بواسطة بروتين كيناز CK2 في المحطة C الخاصة بها. الآثار المترتبة على الاستقرار PTEN إلى تدهور بروتوسوميسيد. J بيول كيم 276:993-998.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Tsubuki S، Saito Y، Tomioka M، Ito H، Kawashima S (1996) التثبيط التفاضلي لأنشطة البرسبين والبروتيسوم عن طريق ألدهيدات الببتيدل من الليوسين وثلاثي يوسين. J Biochem (طوكيو) 119:572-576.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Tsurumi C، Ishida N، Tamura T، Kakizuka A، Nishida E، Okumura E، Kishimoto T، Inagaki M، Okazaki K، Sagata N (1995) يتم تسريع تدهور c-Fos بواسطة بروتومونوم 26S بواسطة c-Jun و kinases بروتينات متعددة. مول خلية بيول 15:5682-5687.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Unger GM، Davis AT، Slaton JW، Ahmed K (2004) بروتين كيناز CK2 كمنظم لبقاء الخلية: الآثار المترتبة على علاج السرطان. Curr Cancer Drug Targets 4:77-84.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Vial E، Marshall CJ (2003) يحمي نشاط كيناز ERK-MAP المرتفع FA عضو العائلة FOS FRA-1 ضد تحلل proteasomal في خلايا سرطان القولون. J Cell Sci 116:4957-4963.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Werme M، Messer C، Olson L، Gilden L، Thoren P، Nestler EJ، Brene S (2002) ΔFosB ينظم عجلة القيادة. J Neurosci 22:8133-8138.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Whitmarsh AJ، Davis RJ (2000) تنظيم وظيفة عامل النسخ عن طريق الفسفرة. خلية مول الحياة العلوم 57:1172-1183.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Winter B، Kautzner I، Issinger OG، Arnold HH (1997) اثنين من المواقع الفسفورية بروتين كيناز CK2 المفترضة مهمة لأنشطة Myf-5. بيول كيم 378:1445-1456.

MEDLINE

  1. ↵

Wisniewski JR، Szewczuk Z، Petry I، Schwanbeck R، Renner U (1999) إن الفسفرة التأسيسية للذيول الحمضية لبروتينات 1 المجموعة الحركية العالية بواسطة الكازيناز كينيز II تبدل تركيبها ، ثباتها ، وخصائص دناها الملزمة. J بيول كيم 274:20116-20122.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Yamaguchi Y، Wada T، Suzuki F، Takagi T، Hasegawa J، Handa H (1998) الكازين كيناز II يتفاعل مع مجالات bZIP للعديد من عوامل النسخ. الأحماض النووية الدقة 26:3854-3861.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Yanagawa T، Yuki K، Yoshida H، Bannai S، Ishii T (1997) الفسفرة من البروتين الإجهاد A170 بواسطة الكازين نشاط كيناز الثاني مثل في الضامة. الكيميائية الحيوية Biophys الدقة Commun 241:157-163.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Yankulov K، Yamashita K، Roy R، Egly JM، Bentley DL (1995) مثبط استطالة الاستطالة النصفي 5,6-dichloro-1-beta-d-profuranosylbenzimidazole يمنع العامل الانتساخ IIH المرتبطة البروتين كيناز. J بيول كيم 270:23922-23925.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Yen J، Wisdom RM، Tratner I، Verma IM (1991) وهناك شكل بديل مفصول من FosB هو منظم سلبي للتنشيط والنسخ التحويلي بواسطة بروتينات Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Yin X، Jedrzejewski PT، Jiang JX (2000) الكازين كيناز II فسفوريلاتيس عدسة connexin 45.6 وتشارك في تدهورها. J بيول كيم 275:6850-6856.

الملخص / النص الكامل المجاني

  1. ↵

Yoza BK، Brooks JW، Mizel SB (1992) تحريض مكونات عامل النسخ AP-1 أثناء تنشيط الخلايا التائية عن طريق الإنترلوكين 1 واسترات phorbol. نمو الخلايا يختلف 3:677-684.

ملخص

  1. ↵

Yu S، Wang H، Davis A، Ahmed K (2001) عواقب CK2 يشير إلى المصفوفة النووية. مول الخليوي الكيميائية الحيوية 227:67-71.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Yu S، Davis AT، Guo C، Green JE، Ahmed K (1999) الاستهداف التفاضلي لبروتين كيناز CK2 إلى المصفوفة النووية عند الإفراط الزائد في وحداته الفرعية. J خلية Biochem 74:127-134.

CrossRefMEDLINE

  1. ↵

Zachariou V، Bolanos CA، Selley DE، Theobald D، Cassidy MP، Kelz MB، Shaw-Lutchmann T، Berton O، Sim-Selley LJ، DiLeone RJ، Kumar A، Nestler EJ (2006) ΔFosB: دور أساسي لـ ΔFosB في النواة المتكئة في عمل المورفين. نات نيوروسكي 9:205-211.

CrossRefMEDLINE

المقالات التي تستشهد من هذا المقال

  • تتطلب الاستجابات السلوكية والهيكلية للكوكايين المزمن حلقة تغذية مسببة للدخان {Delta} FosB والكالسيوم / الكالسيوم المعتمد على الكالسيوم في الكالسيوم الثاني في النواة المتكئة Nucleus مجلة العلوم العصبية, شنومكس مارس شنومكس، 33(10):4295-4307
  • تعبير overexpression من {Delta} FosB Reproduces الحركات اللاإرادية المزمنة التي يسببها ليفودوبا مجلة العلوم العصبية, مايو 26 2010، 30(21):7335-7343
  • ملخص
  • نص كامل
  • النص الكامل (PDF)
  • ملخص
  • نص كامل
  • النص الكامل (PDF)
  • ملخص
  • نص كامل
  • النص الكامل (PDF)
  • ملخص
  • نص كامل
  • النص الكامل (PDF)
  • آليات النسخ من الإدمان: دور {Delta} FosB المعاملات الفلسفية للجمعية الملكية ب: العلوم البيولوجية, 12 October 2008 ، 363(1507):3245-3255
  • ضعف دائم لاستعادة سلوكيات البحث عن الميتامفيتامين في الخلايا العصبية الفئران المشتقة من الخلايا العصبية المشتقة من الخط مجلة FASEB, 1 2007 يوليو، 21(9):1994-2004
  • عامل المنشط بروتين- 1 في الجهاز التنفسي الظهارة التسرطن بحوث السرطان الجزيئي, 1 February 2007 ، 5(2):109-120