السلوك التفاعلي الناجم عن تثبيط optogenetic من الخلايا العصبية الدوبامين tegmental منطقة dopamine يتم بوساطة مستقبلات الدوبامين D2 في النواة المتكئة (2014)

Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29، 2014؛ 111 (17): 6455 – 6460.

نشرت على الانترنت أبريل 15 ، 2014. دوى:  X

PMCID: PMC4036004

علم الأعصاب

هذه المقالة كانت استشهد بها مقالات أخرى في PMC.

انتقل إلى:

أهمية

تتفاعل الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في منطقة التجويف البطني (VTA) مع المحفزات الشريرة في الغالب عن طريق إسكات عابر. يبقى من غير الواضح ما إذا كان رد الفعل هذا يحث بشكل مباشر على ردود فعل سلبية في الفئران التي تتصرف. درسنا هذا السؤال عن طريق التحكم في الخلايا العصبية DA optogenetically في VTA ووجدنا أن تعطيل الخلايا العصبية DA أدى إلى استجابة وتعلم مكره. تعتبر النواة المتكئة (NAc) ، وهي نواة المخرجات الرئيسية للخلايا العصبية VTA DA ، مسؤولة عن هذه الاستجابة ، لذلك درسنا أيًا من المسارات الأساسية في NAc كان حاسمًا في هذا السلوك باستخدام ضربة قاضية لمستقبلات D1 أو D2 ، ووجدت أن المسار المحدد لمستقبلات D2 كان حاسمًا في هذا السلوك.

ملخص

يعد انتقال الدوبامين (DA) من منطقة التجويف البطني (VTA) أمرًا بالغ الأهمية للسيطرة على كل من السلوكيات المجزية والكره. يُعد إسكات الخلايا العصبية DA عابرة أحد الاستجابات للمنبهات الشريرة ، لكن آثارها وآلياتها العصبية فيما يتعلق بالردود على التعلم والتعلم لا تزال بعيدة المنال. هنا، لقد أبلغنا عن أن تثبيط الخلايا العصبية لـ VTA DA يؤدي إلى خفض مستويات DA على الفور وتسبب في تنظيم النشاط العصبي في النواة المتكئة (NAc)) كما تم تقييمها بواسطة التعبير Fos. تيأثار قمعه البصري لإطلاق نيران الخلايا العصبية DA ردود فعل سلبية على الفور على الغرفة المظلمة المفضلة سابقًا وأدت إلى التعلم النشط تجاه المكان المكيف ضوئيًا. الأهم من ذلك ، تم إلغاء النفور من هذا المكان من خلال ضربة قاضية لمستقبلات الدوبامين D2 ولكن ليس بسبب مستقبلات D1 في NAc. كان إسكات الخلايا العصبية DA في VTA وبالتالي لا غنى عنه للحث على ردود فعل مكرسة والتعلم من خلال مستقبلات الدوبامين D2 في NAc.

لا يلعب نظام الدوبامين للحساسية المتوسطة دوراً محورياً في مجموعة واسعة من الحوافز والتعلم (1-3) ، ولكن اختلاله كان متورطًا أيضًا في الاضطرابات العصبية والنفسية الحادة كما يتضح في مرض الشلل الرعاش وانفصام الشخصية وإدمان المخدرات. تتفاعل الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في منطقة التجويف البطني (VTA) مع المحفزات المكافئة من خلال إطلاق النار التدريجي ، وتتمثل الوظيفة الرئيسية لهذا الإطلاق في ترميز "خطأ التنبؤ بالمكافأة" ، وهو الفرق في القيمة بين المكافأة المتوقعة والمكافأة المتوقعة المكافأة الفعلية (4). على عكس الاستجابة للمنبهات المكافئة ، فإن ردود أفعالهم على المنبهات الشريرة ليست متماثلة. على سبيل المثال ، يتم تنشيط بعض الخلايا العصبية DA استجابة للمنبهات مكرهة ، في حين أن معظم الآخرين يتفاعلون عن طريق قمع عن طريق إطلاق النار عن عمد (5-9). في الواقع ، كشفت الدراسات الحديثة أن التنشيط البصري للخلايا العصبية GABAergic والتثبيط الناجم عن الخلايا العصبية DA يقمعان استهلاك المكافأة ويحثان على الاستجابة المفرطة (10, 11). ومع ذلك ، فقد ظل بعيد المنال إلى حد كبير حول أي آليات في الدوائر العصبية ضرورية لاكتساب التعلم النابض بعد تعطيل الخلايا العصبية DA في VTA وبالنسبة لكيفية التحكم في الاستجابات السلوكية لقمع استهلاك المكافأة وتحفيز السلوكيات الشريرة.

كشفت الأدلة المتراكمة أن التعلم التحفيزي والمعرفي استجابة للمنبهات الإيجابية والسلبية ينظم إلى حد كبير من قبل الدوائر العصبية بما في ذلك العقد القاعدية (12) ، والتي تتلقى كمية كبيرة من الإسقاط الدوبامين من الدماغ المتوسط. في المخطط ، تتكون دائرتان عصبيتان أساسيتان بواسطة عصبونات شوكي متوسطة الحجم محددة (MSNs) ، كل منها يعبر عن نوع متميز من مستقبلات DA (13).

  • إحدى الدارات هي المسار المباشر ، الذي يتألف من MSNs التي تتجه مباشرة إلى نوى الخرج من العقد القاعدية ، وإيجابيات نيجرا بارس ريتيكولاتا (SNr) ، والتعبير في الغالب عن مستقبلات الدوبامين D1Rs (D1Rs).
  • والآخر هو المسار غير المباشر ، الذي يتألف من MSNs التي تقوم بشكل غير مباشر عبر pobidus globus إلى SNr والتعبير عن مستقبلات الدوبامين D2 (D2Rs) بشكل أساسي.

تقوم إشارات DA من الدماغ المتوسط ​​بتعديل هذين المسارين المتوازيين ديناميكيًا بطريقة معاكسة عبر D1Rs و D2Rs ، ومن المفترض أن يسهل هذا التعديل التعلم التحفيزي (3, 14).

  • أما بالنسبة للمحفزات المجزية ، فإن مستويات DA المُنظَّمة الناتجة عن إشارات مجزية تُعتبر لتنشيط D1Rs وبالتالي تسهل في الغالب المسار المباشر في النواة المتكئة (NAc).
  • من ناحية أخرى ، فإن قمع إطلاقات الخلايا العصبية DA استجابةً للمنبهات النكهة يقلل من مستويات DA في NAc ؛ ومن المفترض أن يعزز هذا التفاعل على وجه التحديد انتقال الإشارة في المسار غير المباشر من خلال D2Rs المنشطة.

على الرغم من أن الدراسات التي تستخدم الاستراتيجيات الدوائية وطريقة منع النقل العصبي العكسي (RNB) قد دعمت آلية التنظيم هذه في NAc (15, 16) ، فقد ظل مجهولًا ما إذا كان قمع إطلاق الخلايا العصبية DA كافيًا لتعزيز نشاط المسار غير المباشر ولحث سلوك التجنب لاحقًا. في هذه الدراسة الحالية ، قمنا بمعالجة هذه المشكلة عن طريق تعطيل الخلايا العصبية DA بشكل انتقائي في VTA عن طريق التلقيح البصري بروتين القوس الغشاء.17) وأظهر صراحة أن قمع الخلايا العصبية DA في VTA في وقت لاحق انخفض مستويات DA في NAc وتسبب رد فعل وتفاعل aversive. علاوة على ذلك ، قمنا بالتحقيق في آليات تنظيم هذا التفاعل وكشفنا أن رد الفعل النكراء هذا تم التحكم فيه بشكل خاص بواسطة D2Rs في NAc.

النتائج

التعطيل البصري لخلايا DA Neurons يعوق تفضيل الغرفة المظلمة.

لإيقاف نشاط إطلاق الخلايا العصبية DA بشكل انتقائي ، حقننا بنية فيروسية مصاحبة بالعدوى مرتبطة بـ adeno ترميز Arch-eGFP [AAV-double-floxed إطار القراءة المفتوح المقلوب (DIO) -Arch] (17) من جانب واحد في VTA من الفئران التيروزين هيدروكسيلاز (TH) -Cre (18) والحيوانات البرية (WT) القمامة ووضع الألياف البصرية فوق VTA (الشكل. S1 A و C). بعد أسبوعين من الجراحة ، تم اكتشاف Arch-eGFP بشكل مقيد في VTA (الشكل. S1B). اختبرنا تأثير فرط الاستقطاب لبروتين القوس من خلال تسجيل الفيزيولوجيا الكهربية وقياس تأثير التحفيز البصري لل VTA من الفئران TH-Cre حقن مع AAV-DIO-Arch. في تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي من VTA من الفئران TH-Cre تخدير وكشف أن التحفيز البصري للخلايا العصبية DA المفترضة تحول دون إطلاقها (الشكل. S2) ، مما يشير إلى أن التحفيز البصري مفرط الاستقطاب بما فيه الكفاية إمكانات الغشاء لخلايا DA للتعبير عن القوس وبالتالي منع إطلاقها التلقائي.

باستخدام هذه الفئران ، درسنا بعد ذلك ما إذا كان التعطيل البصري للخلايا العصبية DA في VTA يمكن أن يكون بمثابة إشارة نابية للتعلم السلوكي. الفئران تمتلك ميل فطري لتفضيل بيئة مظلمة (19). لقد صممنا جهازًا سلوكيًا يمكن للفئران فيه استكشاف الغرفة المظلمة بحرية وفتح مساحة مشرقة (التين 1A). بعد التعود ، بقي الفئران WT تفضيلي في غرفة مظلمة إما مع أو بدون التحفيز البصري في الغرفة المظلمة (الشكل. S1D) ، ضمان أن التحفيز البصري نفسه لم يكن له تأثير على سلوكهم المفضل في الغرفة المظلمة. حددنا التجربة السلوكية للحيوانات لاختبار تأثير التعطيل البصري للخلايا العصبية DA على سلوكهم (الشكل. S1E). بعد التعود والإختبار ، كانت الفئران مشروطة بتحفيز الخلايا العصبية DA بصريًا في منطقة VTA عندما بقوا في الغرفة المظلمة. حتى خلال دقيقة 5 الأولى من التكييف ، بقيت الفئران TH-Cre خارج الغرفة المظلمة المفضلة سابقًا وتجنبت الغرفة المظلمة في جميع مراحل التكييف (التين 1B). لم عكس الفئران TH-Cre تجنبها ضد الغرفة المظلمة على الرغم من أنها لم تتلق أي تحفيز بصري في الاختبار البعدي (التين 1C). تشير هذه البيانات إلى أن فرط الاستقطاب في الخلايا العصبية DA لا يؤدي فقط إلى السلوك البغيض العابر ، ولكنه أيضًا بمثابة إشارة للتعلم البغيض ضد الغرفة المظلمة ويظهر أيضًا أن تعطيل الخلايا العصبية DA لعبت دورًا سببيًا في كل من السلوك البغيض العابر والتعلم البغيض الطويل.

التين. 1.  

يؤدي التباطؤ البصري للخلايا العصبية DA إلى إعاقة تفضيل الغرفة المظلمة للفئران التي تتصرف بحرية. (Aرسم توضيحي للجهاز المستخدم في اختبار تفضيل الغرفة المظلمة. سمح الفئران بحرية التحرك في جميع أنحاء الغرفة المظلمة ومساحة مشرقة. (B) بالطبع الوقت ...

Optogenetic أسفل تنظيم مستويات DA في NAc.

نحن التحقيق التالي إذا كان تعطيل الخلايا العصبية DA في VTA بالفعل تعديل تركيز DA في منطقة الاستهداف الرئيسية لها ، NAc. قمنا بقياس مستويات DA في NAc بواسطة قياس الجهد الدوري السريع (FSCV) في الفئران TH-Cre المخدرة التي تم حقنها بواسطة AAV-DIO-Arch في VTA الخاص بهم. تم رفع مستويات DA في NAc على الفور عن طريق التحفيز الكهربائي لـ VTA ، وتم تقليل إطلاق DA المستحث بشكل كبير عن طريق التحفيز البصري المتزامن لـ VTA (الشكل. S3). ثم قمنا باختبار ما إذا كان التحفيز البصري لـ VTA يمكن أن يقلل من مستوى DA منشط في NAc. في نفس الإعدادات التجريبية ، لاحظنا أن مستوى DA في NAc انخفض بشكل عابر بواسطة 20 s من التحفيز البصري لـ VTA (التين 2) ، وهو ما يتفق مع رد فعل FSCV المبلغ عنه ضد المحفزات الشريرة (20). هذه البيانات تثبت أن التحفيز البصري لل VTA كان فعالا بما فيه الكفاية لتعطيل الخلايا العصبية VTA DA وتقليل مستوى DA في NAc خلال التجربة السلوكية.

التين. 2.  

يؤدي التعطيل البصري للخلايا العصبية DA في VTA إلى تقليل مستوى DA في NAc. (A) استجابات DA المتوسط ​​على التحفيز البصري في NAc كما تقاس FSCV. يشير الخط الأخضر إلى مدة التحفيز البصري (n = آثار 7 – 11). (B) متوسط ...

Up-Regulation of Fos Gene Expression by Inactivation of DA Neurons in the VTA.

التغير السلوكي الناجم عن تعطيل مشروط للخلايا العصبية DA في VTA اقترح أن التحفيز البصري يغير مباشرة النشاط العصبي ويؤدي إلى تحول في الأداء السلوكي. لذلك قمنا بعد ذلك بالتحقيق في المناطق التي ارتفع فيها النشاط العصبي من خلال تعطيل الخلايا العصبية DA المشروطة عن طريق فحص تعبير Fos ، وهو جين مبكر مبكر. بعد فترة وجيزة من إجراء التكييف في اختبار الغرفة المظلمة ، تمت معالجة الفئران بسرعة لتحديد مقدار تعبير Fos عن طريق تحليل التهجين الكمي في الموقع (التين 3 و الشكل. S4). أظهرت NAc ، المنطقة التي تتلقى كمية كبيرة من توقعات الدوبامين من VTA ، زيادة كبيرة في تعبير Fos في الفئران TH-Cre (التين 3). تم الكشف عن هذا التنظيم أيضًا في الجانب المقابل من التحفيز البصري ، والذي كان من المفترض أن سبب ذلك هو وجود كمية صغيرة من عدوى الفيروس في هذا الجانب. ومع ذلك ، كان التنظيم up أعلى بكثير في الجانب المماثل مما كان عليه في الجانب المقابل من التحفيز البصري ، مما يشير إلى أن التعطيل البصري للخلايا العصبية DA تنظيم مباشرة النشاط العصبي لل NAc. ولوحظ أيضا زيادة التعبير Fos في مناطق أخرى في المخ بما في ذلك الحاجز ، والمناطق المحيطة بالبطين من المخطط ، اللوزة الجانبية السفلية (BLA) ، وما تحت المهاد الجانبي ، ولكن ليس في الوريد الجانبي الوحشي أو القشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC؛ الشكل. S4). تشير هذه النتائج إلى أن المناطق التي يتم تنشيطها عن طريق التعطيل البصري للخلايا العصبية DA لم تقتصر على المناطق المستهدفة المباشرة من الخلايا العصبية VTA DA ، بل شملت المناطق التي يمكن تنشيطها بشكل غير مباشر بطريقة تعتمد على الدائرة العصبية. تشير هذه الملاحظة إلى أن التعطيل البصري للخلايا العصبية DA قد عدل نشاط الخلايا العصبية على نطاق الدائرة ولم يستطع فقط استحضار رد فعل مفرط ، ولكن أيضًا يؤدي إلى العديد من وظائف الدماغ الأخرى مثل القلق والخوف واستجابات الإجهاد (21).

التين. 3.  

التعبير المتعلق بالنشاط لجين FOS الناجم عن تعطيل الخلايا العصبية الضوئية DA. (A-Cصور ممثلة للتعبير Fos (أصفر) في NAc. تم التقاط صور للجانب المحفز من فأر TH-Cre (A) ، من غير محفز ...

DA الإشارة من خلال D2R أمر بالغ الأهمية للكشف عن مكان الشرط التي يسببها Optogenetically.

يتم نقل غالبية إشارات الدوبامين من VTA إلى MSNs في NAc من خلال مستقبلات DA و D1R و D2R. يتم التعبير عن D1R تقريبًا بشكل حصري في المادة P (المشفرة بواسطة جين Tac1) - التعبير عن MSNs ، ويتم التعبير عن D2R في الغالب في enkephalin (مشفرة بجين Penk) - للتعبير عن MSNs ؛ يشكل كل نوع من أنواع MSN المسارات المباشرة وغير المباشرة ، على التوالي ، في NAc (3). نظرًا لأن التقارب لـ DA أعلى كثيرًا بالنسبة إلى D2R (ترتيب الرنين المغناطيسي) منه بالنسبة إلى D1R (ترتيب µM) (22, 23) ، ويعتقد أن انخفاض مستويات DA يؤدي إلى تعطيل Gi- D2R مقسوم ولكن ليس له أي تأثير ملموس على D1R (3, 24) ، وبالتالي تنظيم النشاط العصبي على وجه التحديد في المسار غير المباشر. علاوة على ذلك ، لوحظ تنشيط Fos بشكل بارز في خلايا Penk- أو Drd2 (D2R) التي تظهر في خلايا Tac1 أو Drd1a (D1R) -الشكل. S5). بناءً على هذه الملاحظات ، افترضنا أن إشارات DA من خلال D2R يمكن أن تلعب دورًا رئيسيًا في التكييف النفي المرصود.

لاختبار هذه الفرضية ، أجرينا اختبار النفور المكيف من ثلاث غرف (CPA) (الشكل. S6). قمنا بإعداد جهاز سلوكي يحتوي على غرفتين مع ظروف متطابقة تقريبًا وممر صغير واحد. مكنتنا هذه الحالة البيئية غير المتحيزة في اختبار CPA من مواصلة دراسة ما إذا كان تعطيل الخلايا العصبية VTA DA قادرًا على إحداث رد فعل وتعلم مكرهين ، بالإضافة إلى منع تفضيل الغرفة المظلمة. عندما سمح للحيوانات بالتحرك بحرية في جميع أنحاء الجهاز ، بقي معظمهم في غرفتين دون أي اختلاف سلوكي نموذجي في الاختبار القبلي. ثم تم إجراء التكييف البصري عن طريق مزاوجة التحفيز البصري بغرفة واحدة ثابتة. حتى عندما تم استخدام أي من الغرف للتكييف ، فإن الفئران TH-Cre تجنبت بثبات وبشكل كبير البقاء في الغرفة المكيفة بصريًا أثناء التكييف وفي الاختبار البعدي (الشكل. S6 B-E). التحقق من صحة التحليل الإحصائي انخفاض كبير في وقت البقاء من الفئران TH-Cre في غرفة مكيفة بصريا في البعدي مقارنة مع وقت البقاء على الفئران WT (الشكل. S6F).

حاولنا بعد ذلك تحديد الأنواع الفرعية لمستقبلات DA المتورطة في هذا السلوك الشائن من خلال قمع كل مستقبلات DA في NAc على وجه التحديد (التين 4 و الشكل. S7). لقد قمنا بتصميم والتحقق من صحة ناقلات lentiviral تحتوي على RNA دبوس الشعر القصير (shRNA) محددة لكل مستقبلات DA مع التعبير التأسيسي من mCherry. بعد ثلاثة أسابيع من حقن الفيروسة البطيئة في NAc ، تم ترجمة تعبير قوي عن mCherry في NAc (التين 4B). تم تأكيد ضربة قاضية فعالة للتعبير مرنا من كل مستقبلات بواسطة تحليل PCR في الوقت الحقيقي الكمي (الشكل S7A). كشف قياس مستويات البروتين من خلال النشاف الغربي أيضًا أن حقن كل من الفيروسات البطيئة قلل بشكل انتقائي من منتج البروتين المستهدف دون التأثير على التعبير عن النوع الفرعي الآخر من مستقبلات DA (التين 4C و الشكل. S7 B-G). خفضت فيروسات lentivirus التي تعبر عن shD1R و shD2R مستوى البروتين المستهدف إلى 46.2 ± 1.1٪ و 38.4 ± 4.9٪ ، على التوالي ، مقارنة بمستوى فيروس التحكم (التين 4C). تحقق هذه النتائج من أن ناقلات lentiviral التي تعبر عن shRNA خاصة بـ D1R و D2R قمعت بشكل انتقائي وكافي RNAs المستهدف وقللت من كمية منتجات البروتين المعنية. أكدنا أيضًا أنه لم يتم اكتشاف تعبير mCherry بوساطة فيروس في VTA ، باستثناء احتمال أن يكون shRNA بوساطة فيروس lentivirus يؤثر بشكل مباشر على VTA.

التين. 4.  

تعتبر إشارة DA من خلال D2R أمرًا مهمًا للاكتساب المستحث بصريًا. (Aرسم توضيحي يوضح العملية الجراحية. تم حقن lentivirus لترميز shRNA لـ D1R أو D2R بشكل ثنائي في NAc. تم حقن AAV-DIO- القوس من جانب واحد في ...

باستخدام هذه الفيروسات التي تحتوي على shRNA ، قمنا باختبار أي نوع من مستقبلات DA كان مسؤولاً عن السلوك الشائن الناجم عن تثبيط الخلايا العصبية DA. لقد حقننا الفيروسة البطيئة التي تحتوي على shRNA أو التحكم في الفيروس البطيء في NAc الثنائي مع AAV-DIO-Arch في VTA الأيسر من الفئران TH-Cre. تم إدخال الألياف الضوئية أيضًا أعلى VTA (التين 4A). عندما تم إجراء اختبار CPA المكون من ثلاث غرف بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة ، فإن الفئران TH-Cre التي تم حقنها بـ lenti: shD1R-mCherry لا تزال تظهر وجود CPA صريح ضد الغرفة المقترنة بالتنبيه البصري والتي تشبه تلك الموجودة في الفئران TH-Cre المحقونة مع السيطرة الفيروسة البطيئة (lenti: mCherry). في المقابل ، فشلت الفئران TH-Cre حقن مع lenti: shD2R-mCherry لإظهار CPA واضحة أثناء التكييف (التين 4D). عجز التعلم الحصري للفئران TH-Cre حقن مع lenti: shD2R-mCherry تم زيادة إثباته من خلال تحليل التعلم النابض في البعدي (التين 4E). هذه النتائج تدل على أن السلوك البغيض للمكان مشروط بتثبيط الخلايا العصبية DA تم استحضاره على وجه التحديد من خلال D2R ، وليس من خلال D1R ، في NAc.

مناقشة

في المخطط ، كشفت الدراسات أن تفعيل GsDcNUMXR -coupled يسهل إطلاقه ، في حين أن تفعيل Giينتج عن D2R - كفاءة إطلاق النار المكبوتة (25). Acوفقًا لخصوصية التعبير عن مستقبلات DA ، تعمل عمليات إطلاق طورية من الخلايا العصبية DA بشكل أساسي على تنشيط المسار المباشر من خلال D1R ، في حين أن النقص العابر في إطلاقات الخلايا العصبية DA يعزز في الغالب من كفاءة المسار غير المباشر من خلال D2R (3, 26). بناءً على آلية التنظيم هذه ، فقد تم اقتراح أن إسكات الخلايا العصبية DA استجابةً للمنبهات الشريرة يتم معالجته بشكل أساسي من خلال المسار غير المباشر وينتج عنه سلوك ينكر (3). وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الحصار المفروض على انتقال متشابك من المسار غير المباشر يعرقل اكتساب السلوك المنكر الناجمة عن صدمة كهربائية (15) وهذا الاختلال ناتج عن تثبيط إرسال إشارة D2R بوساطة (16). أنان بالإضافة إلى ذلك ، يثير التنجيم البصري للـ MSNs المعبر عن D2R في المسار غير المباشر تجنب السلوكية (27). ومع ذلك ، نظرًا لأن الخلايا العصبية DA تظهر إطلاقًا معززًا ومكبوتًا استجابةً لمحفزات مكرهة ولأن المعلومات الحسية الأخرى المتعلقة بالصدمة تتم معالجتها في وقت واحد في المخ ، فلا يزال يتعين توضيح ما إذا كان إسكات الخلايا العصبية DA يمكن أن يؤدي مباشرة إلى رد فعل وتعلم مكرمين ، وما إذا كان رد الفعل هذا يتم تنظيمه من خلال D2R- للتعبير عن MSNs في المسار غير المباشر.

في هذه الدراسة ، استخدمنا التحكم البصري في إطلاقات الخلايا العصبية DA في الاختبارين السلوكيين: اختبار التفضيل للغرفة المظلمة واختبار CPA المكون من ثلاث غرف. وأظهر التلاعب البصري لدينا قمع فعال لإطلاقات الخلايا العصبية DA في VTA وانخفاض تنظيم مستويات DA في NAc. إن التعطيل البصري الدقيق لإطلاقات الخلايا العصبية DA فقط خلال الفترة التي بقيت فيها الحيوانات في الغرفة المكيفة أثارت بشكل صريح رد فعل وتعلم مكرهين ، مما يدل على أن إسكات DA عابر تسبب مباشرة سلوك تجنب السلبي. علاوة على ذلك ، أوضح هذا التحقيق أن معالجة الإشارات التي تتم بوساطة D2R هي أحد المحددات الرئيسية لتحريض رد الفعل والتعلم اللاذع.

على الرغم من أن بياناتنا أثبتت أن D1R لم يكن له أي تأثير في التجارب السلوكية لاستحضار اتفاق السلام الشامل ، فقد وثقت العديد من الدراسات أن إطلاق تدريجي للخلايا العصبية DA هو مطلوب لاستجابات الخوف والتعلم المفرط (28, 29). هذا الاختلاف يرجع إلى الإعداد التجريبي. على سبيل المثال ، استبعد منهجنا البصري إمكانات الإشارة من خلال الخلايا العصبية DA المنشّطة لإثارة السلوك المنكر ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية DA المعطلة كانت كافية للحث على السلوك النشط والتعلم. إن وظيفة ومعالجة إشارات إطلاق DA المنشطة التي أثارتها المنبهات البغيضة سيكون لها مساهمات مختلفة في السلوكيات البغيضة عن تلك التي تمت دراستها هنا وتحتاج إلى التوضيح في المستقبل.

الخلايا العصبية DA أيضا المشروع إلى مناطق أخرى مختلفة بما في ذلك mPFC ، اللوزة ، الحصين. وأشارت دراسة حديثة إلى أن التنشيط البصري للخلايا العصبية الحبيبية الجانبية التي تتجه للخلايا العصبية DA في منطقة VTA قادرون على تحفيز السلوك المنكر ، وهذه الخلايا العصبية DA تستهدف بشكل خاص و تحديداً mPFC (30) ، على الرغم من أن تكييفها البصري كان مختلفًا عن تكييفها في دراستنا الحالية ، حيث كان التحفيز البصري الخاص بها مطولًا لجلسة تكييف كاملة. لأنه تم الإبلاغ عن أن مدخلات الدوبامين إلى mPFC قد تم تنشيطها ليس فقط عن طريق المنبهات البغيضة ولكن أيضًا عن طريق الإجهاد المزمن (31, 32) ، من الممكن أن ينظر إلى تنشيطها المستمر للخلايا العصبية DA إسقاط mPFC كإشارات من بيئة مرهقة للغاية ؛ وكنتيجة لتراكم التكييف المجهد ، ستُظهر الحيوانات سلوكًا شائنًا للغرفة المكيفة. على النقيض من ذلك ، قمنا بمنع إطلاق الخلايا العصبية DA فقط أثناء بقاء الحيوانات في الغرفة المكيفة. أشارت نتائج تجاربنا السلوكية باستخدام التكييف المتطابق مع التوقيت إلى أن الكبت المفاجئ لإشارة DA سوف يُنظر إليه على أنه مدخلات تنفيسية مفاجئة ، مما أدى إلى استجابتها السريعة الشريرة.

الخلايا العصبية DA أيضا المشروع إلى اللوزة ، المنطقة التي تسهم إلى حد كبير في استجابة الخوف. في الواقع ، تم إشراك DA للإشارة إلى اللوزة في استجابة الخوف واكتساب ذاكرة الخوف (33, 34). في دراستنا ، حددت تسمية الخلايا العصبية DA في VTA مجموعة من الخلايا العصبية DA إسقاط ل BLA ، ولكن مدى هذه التوقعات كانت أقل بكثير من تلك التوقعات إلى NAc. على الرغم من أننا لم نتمكن من استبعاد تأثير خفي لإشارة DA المتوقعة من amygdala على سلوكنا البغيض الملحوظ ، يجب أن يكون التأثير الرئيسي لإبطال نشاطنا البصري للخلايا العصبية DA على NAc ، لأن تجاربنا مع ضربة قاضية محددة من D2R في NAc تقلصت بشكل كبير السلوك البغيض. هناك حاجة إلى تحقيقات مستقبلية تتناول إشارات DA الخاصة بالهدف لتوضيح آثار التعديل على نطاق الدائرة للخلايا العصبية DA على المحفزات الشريرة وتكييف الخوف.

مواد وطرق

المواضيع.

Tyrosine hydroxylase :: الفئران الضاربة في الفئران (IR: -NE-Cre) (EM: 00254) (18) تم الحصول عليها من أرشيف Mouse Mutant الأوروبي. تم نقل جميع حيوانات التجارب إلى سلالة C57BL / 6J لأكثر من أجيال 10. تم تزاوج الفئران باستخدام فئران C57BL / 6J WT ووضعها في دائرة مظلمة قياسية 12-h / 12-h مع إعطاء الغذاء والماء. لجنة المساواة العرقية+ و Cre- استخدمت الفئران من نفس الفضلات (3 – 6 مو من العمر) للتجارب. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الحيوان بمعهد أوساكا للعلوم البيولوجية بموجب إرشادات التجارب على الحيوانات.

الاختبارات السلوكية.

خلال جميع الاختبارات السلوكية ، تم توصيل الفئران بألياف بصرية وتم السماح لها بالتنقل حول الجهاز بأكمله. تم رصد حركة الفئران حتى يتمكنوا من التحرك دون أي عقبات حتى عندما كانت مرتبطة مع الألياف البصرية على رؤوسهم. تم اكتشاف موضع الماوس بواسطة كاميرا فيديو معلقة على الجهاز السلوكي وتحليلها بواسطة برنامج مخصص باستخدام برنامج Labview.

اختبار تفضيل الغرفة المظلمة.

يتكون الجهاز السلوكي المخصص المستخدم في الاختبار من غرفة مظلمة (15 × 9.5 cm) ومساحة مفتوحة مشرقة (15 × 11 cm). تحتوي الغرفة المظلمة على جدران وأرضية وسقف ، وكلها ملونة باللون الأسود وكان لها مدخل (4.5 سم) إلى المساحة المشرقة المفتوحة. كانت المساحة المشرقة المفتوحة تشبه القطع الناقص وكان لها أرضية شبكية معدنية وجدران واضحة بدون سقف. قبل الاختبار ، كانت جميع الفئران تعاد ل 10 دقيقة في الجهاز. تألف الاختبار من ثلاث جلسات: في النصف الأول من اليوم 1 (الاختبار القبلي: 5 دقيقة) ، سُمح للفئران باستكشاف الجهاز بأكمله. من النصف الأخير من اليوم 1 إلى اليوم 4 (تكييف: 35 دقيقة في المجموع) ، تلقت الفئران التحفيز البصري عندما بقوا في غرفة مظلمة. في يوم 5 ، تم اختبار تفضيل الغرفة المظلمة دون التحفيز البصري (الاختبار البعدي: 5 min ؛ الشكل. S1E).

اختبار ثلاث غرف CPA.

يتكون تفضيل المكان المكيف المكون من ثلاث غرف / جهاز CPA المستخدم في الاختبار من غرفتين (10 × 17 cm) وممر متصل. تألف الاختبار من ثلاث جلسات. يوم 1 (الاختبار القبلي: دقيقة 15): تم السماح للفئران باستكشاف الجهاز بأكمله مجانًا. تم استبعاد الفئران التي بقيت 1.5 مرات أطول في غرفة واحدة مما كانت عليه في الغرفة الأخرى من الاختبار. أيام 2 و 3 (تكييف: 15 دقيقة لكل منهما): تلقت الفئران التحفيز البصري عندما بقوا في غرفة المقترنة الخفيفة. وكان اختيار الغرفة المزدوجة الخفيفة متوازنة. يوم 4 (الاختبار البعدي: دقيقة 15): تم إجراء الاختبار في نفس الظروف كما في الاختبار القبلي (الشكل. S6A).

في جلسة التكييف ، تم إيقاف التحفيز البصري لـ 30 s عندما بقيت الفئران بشكل مستمر فوق 30 s في الغرفة المظلمة أو الغرفة المقترنة بالضوء لتجنب ارتفاع درجة الحرارة. تم التحكم في طاقة الليزر لتكون 5 mW تقريبًا عند طرف الألياف البصرية في جميع الاختبارات السلوكية.

في الجسم الحي سريع المسح دوري الجهد.

أجريت تجارب FSCV باستخدام الطريقة الموضحة في الدراسات السابقة (35-37). تم تخدير الفئران بخليط الكيتامين / الزيلازين كما هو موضح في SI المواد والطرق وتوضع في إطار التجسيمي. يقع الألياف الضوئية المستخدمة لتحفيز الخلايا العصبية DA التعبير عن القوس بالقرب من القطب تحفيز. بعد ذلك تم وضع optrode المحفز في VTA (من bregma: الأمامي - الخلفي ، N3.2 mm ؛ الوحشي ، 0.5 mm ؛ والظهري - البطني ، 3.5 mm) وخفض في فترات 0.25 ملم. تم خفض الإلكترود الميكروي المصنوع من ألياف الكربون (طول 300 µm) لتسجيل الفولتميتر إلى NAc (من bregma: الأمامي الخلفي ، 1.0 mm ؛ الوحشي ، 1.0 mm ؛ والظهري - البطني ، 3.5 mm). تم إجراء قياسات الفولتميتر كل مللي 100 من خلال تطبيق شكل موجة مثلث (N0.4 V إلى + 1.3 V إلى −0.4 V مقابل Ag / AgCl ، عند 400 V / s) على microelectrode من ألياف الكربون. تم استخدام potentiostat حسب الطلب لعزل الموجي والتضخيم الحالي. أثار إطلاق DA عن طريق التحفيز الكهربائي للخلايا العصبية DA باستخدام تحفيز نبض 24 (100 µA ، مدة 5 ms ، 30 Hz). تم تطبيق التحفيز البصري للخلايا العصبية DA (532 نانومتر ، ∼5 قدرة mW في طرف الألياف) لبدء 10 s 5 s قبل بدء التحفيز الكهربائي. تمت معايرة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من ألياف الكربون في محلول بتركيزات معروفة من DA (0.2 µM ​​و 0.5 µM ​​و 1.0 µM). تم تحليل جميع بيانات قياس الجهد بواسطة برامج مخصصة باستخدام برنامج Labview و Matlab. تم حل انخفاض مستويات DA بواسطة التحفيز البصري من خلال تحليل المكون الرئيسي ، باستخدام أشكال أشكال DA التي تم الحصول عليها من تحفيزات VTA الكهربائية لفصل إشارات الدوبامين (35, 36).

التحليل الإحصائي.

أجري التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad PRISM 5.0 (برنامج GraphPad). وقد تم تحليل البيانات عن طريق التدابير المتكررة ANOVA (تين. 1B, ، 4D,4Dو الشكل. S6 D و E) أو ANOVA في اتجاه واحد (تين. 1C, ، 3D,3D, 4 C و Eو تين. S4 K-M, S6Fو S7A) ، وتم إجراء التحليلات اللاحقة باستخدام اختبار Bonferroni. تمثل كل العلامات / الأعمدة والشرائط الوسط و EM SEM ، على التوالي.

يتم وصف الإجراءات التجريبية الأخرى بما في ذلك تحضير الفيروس وحقنه وتسجيل الفيزيولوجيا الكهربية وتحليل المناعي ورنا المرسال بالتفصيل في SI المواد والطرق.

المواد التكميلية

دعم المعلومات:  

شكر وتقدير

نشكر E. Boyden على إنشاء Arch ، و R. Matsui للحصول على المشورة الفنية في إنتاج وتنقية الفيروسة البطيئة ، و Y. Hayashi على المشورة التقنية في برمجة تحليل البيانات. تم دعم هذا العمل من قِبل Research Grants-in-Aid 22220005 (إلى SN) و 23120011 (إلى SY و SN) و 24700339 (إلى TD) و 25871080 (إلى SY) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم و تكنولوجيا اليابان ومنحة من مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى SN).

الحواشي

 

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

تحتوي هذه المقالة على معلومات داعمة عبر الإنترنت على www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.

مراجع حسابات

1. الحكيمة RA. الدوبامين والتعلم والتحفيز. نات ريف نيوروسكي. 2004، 5 (6): 483-494. [مجلات]
2. شولتز دبليو وظائف الدوبامين متعددة في دورات زمنية مختلفة. انو ريف نيوروسكي. 2007، 30: 259-288. [مجلات]
3. Bromberg-Martin ES ، و Matsumoto M ، و Hikosaka O. Dopamine في مجال التحكم التحفيزي: المكافأة ، والنبذ ​​، والتنبيه. الخلايا العصبية. 2010، 68 (5): 815-834. [بك المادة الحرة] [مجلات]
4. شولتز دبليو ، ديان ف ، مونتاج للعلاقات العامة. الركيزه العصبيه للتنبؤ والثواب. علم. 1997، 275 (5306): 1593-1599. [مجلات]
5. شولتز دبليو ، رومو ر. ردود من الخلايا العصبية الدوبامين nigrostriatal على التحفيز الحسية الجسدية عالية الكثافة في القرد تخدير. ي Neurophysiol. 1987، 57 (1): 201-217. [مجلات]
6. Ungless MA، Magill PJ، Bolam JP. تثبيط موحد من الخلايا العصبية الدوبامين في المنطقة tegmental البطني بواسطة المنبهات مكره. علم. 2004، 303 (5666): 2040-2042. [مجلات]
7. Brischoux F، Chakraborty S، Brierley DI، Ungless MA. الإثارة المرحلية للخلايا العصبية الدوبامين في VTA البطني بواسطة المحفزات الضارة. Proc Natl Acad Sci USA. 2009، 106 (12): 4894-4899. [بك المادة الحرة] [مجلات]
8. Matsumoto M ، Hikosaka O. هناك نوعان من الخلايا العصبية الدوبامين ينقلان بوضوح إشارات تحفيزية إيجابية وسلبية. طبيعة. 2009، 459 (7248): 837-841. [بك المادة الحرة] [مجلات]
9. Cohen JY، Haesler S، Vong L، Lowell BB، Uchida N. Neuron-type-وخاصة إشارات المكافأة والعقاب في منطقة tegmental البطنية. طبيعة. 2012، 482 (7383): 85-88. [بك المادة الحرة] [مجلات]
10. تان KR ، وآخرون. الخلايا العصبية GABA من VTA محرك النفور مكان مشروط. الخلايا العصبية. 2012، 73 (6): 1173-1183. [مجلات]
11. فان Zessen R ، Phillips JL ، Budygin EA ، Stuber GD. تنشيط الخلايا العصبية VTA GABA يعطل استهلاك المكافأة. الخلايا العصبية. 2012، 73 (6): 1184-1194. [بك المادة الحرة] [مجلات]
12. Packard MG، Knowlton BJ. وظائف التعلم والذاكرة من العقد القاعدية. Annu Rev Neurosci. 2002، 25: 563-593. [مجلات]
13. Surmeier DJ، Song WJ، Yan Z. تعبير منسق لمستقبلات الدوبامين في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة حديثي الولادة. J Neurosci. 1996، 16 (20): 6579-6591. [مجلات]
14. Surmeier DJ، Plotkin J، Shen W. Dopamine and لدونة متشابك في الدوائر الفتحاوية الظهرية التي تتحكم في اختيار العمل. Curr Opin نيوروبول. 2009، 19 (6): 621-628. [بك المادة الحرة] [مجلات]
15. Hikida T ، Kimura K ، Wada N ، Funabiki K ، Nakanishi S. أدوار مميزة من انتقال متشابك في مسارات الهجوم المباشر وغير المباشر لمكافأة والسلوك الشائن. الخلايا العصبية. 2010، 66 (6): 896-907. [مجلات]
16. حكيدة تي ، وآخرون. التشكيل الخاص بالمسار الخاص بالنواة يتراكم في السلوك المكافئ والمكره عبر مستقبلات مرسل انتقائية. Proc Natl Acad Sci USA. 2013، 110 (1): 342-347. [بك المادة الحرة] [مجلات]
17. تشاو باي ، وآخرون. إسكات عصبية بصرية عالية الأداء مستهدفة وراثيا بواسطة مضخات بروتون مدفوعة بالضوء. طبيعة. 2010، 463 (7277): 98-102. [بك المادة الحرة] [مجلات]
18. Lindeberg J et et. التعبير المعدل وراثيا من لجنة تقصي الحقائق recombinase من موضع التيروزين هيدروكسيلاز. منشأ. 2004، 40 (2): 67-73. [مجلات]
19. Bourin M، Hascoët M. اختبار ضوء الفأرة / الصندوق الداكن. Eur J Pharmacol. 2003، 463 (1-3): 55-65. [مجلات]
20. Roitman MF، Wheeler RA، Wightman RM، Carelli RM. الاستجابات الكيميائية في الوقت الحقيقي في النواة تتجمع تفرق بين المنبهات المجزية والمكرهة. نات نيوروسي. 2008، 11 (12): 1376-1377. [بك المادة الحرة] [مجلات]
21. LeDoux JE. دارة الأحاسيس في الدماغ. Annu Rev Neurosci. 2000، 23: 155-184. [مجلات]
22. مستقبلات ماينو H. الدوبامين في نواة ذوات الكلاب. مول خلية Biochem. 1982، 43 (2): 65-80. [مجلات]
23. Richfield EK ، Penney JB ، Young AB. مقارنات حالة تشريحية وتقارب بين مستقبلات الدوبامين D1 و D2 في الجهاز العصبي المركزي للفئران. علم الأعصاب. 1989، 30 (3): 767-777. [مجلات]
24. آليات العقد Hikosaka O. Basal لحركة العين الموجهة نحو المكافأة. آن نيويورك أكاديمية العلوم. 2007، 1104: 229-249. [مجلات]
25. Surmeier DJ و Ding J و Day M و Wang Z و Shen W. D1 و D2 مستقبل مستقبلات الدوبامين لتعديل الجلوتاماتريك القاتل في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة الفتاكة. الاتجاهات Neurosci. 2007، 30 (5): 228-235. [مجلات]
26. فرانك إم جي. تعديل الدوبامين الديناميكي في العقد القاعدية: حساب عصبي لحالات العجز الإدراكي في مرض الشلل الرعاشي الدوائي وغير المصاب. J Cogn Neurosci. 2005، 17 (1): 51-72. [مجلات]
27. كرافيتز AV ، تاي LD ، كريتزر AC. أدوار مميزة للخلايا العصبية المميتة ذات المسار المباشر وغير المباشر في التعزيز. نات نيوروسي. 2012، 15 (6): 816-818. [بك المادة الحرة] [مجلات]
28. Fadok JP، Dickerson TM، Palmiter RD. الدوبامين ضروري لتكييف الخوف الذي يعتمد على جديلة. J Neurosci. 2009، 29 (36): 11089-11097. [بك المادة الحرة] [مجلات]
29. Zweifel LS، et al. تنشيط الخلايا العصبية الدوبامين أمر بالغ الأهمية لتكييف مكره والوقاية من القلق المعمم. نات نيوروسي. 2011، 14 (5): 620-626. [بك المادة الحرة] [مجلات]
30. Lammel S، et al. التحكم في المدخلات الخاصة بالمكافأة والنفور في منطقة التجويف البطني. طبيعة. 2012، 491 (7423): 212-217. [بك المادة الحرة] [مجلات]
31. Mantz J، Thierry AM، Glowinski J. تأثير قرصة الذيل الضار على معدل إفراز الخلايا العصبية الدوبامين mesocimbical و mesolimbic: التنشيط الانتقائي للنظام mesocortical. الدماغ الدقة. 1989، 476 (2): 377-381. [مجلات]
32. Tidey JW ، Miczek KA. الإجهاد الناتج عن الهزيمة الاجتماعية يغير بشكل انتقائي إطلاق الدوبامين mesocorticolimbic: دراسة في الجسم الحي للحيوية. الدماغ الدقة. 1996، 721 (1-2): 140-149. [مجلات]
33. Pezze MA ، Feldon J. Mesolimbic مسارات الدوبامين في تكييف الخوف. بروغ نيوروبول. 2004، 74 (5): 301-320. [مجلات]
34. de la Mora MP، Gallegos-Cari A، Arizmendi-García Y، Marcellino D، Fuxe K. دور آليات مستقبلات الدوبامين في تعديل اللمبيين من الخوف والقلق: التحليل الهيكلي والوظيفي. بروغ نيوروبول. 2010، 90 (2): 198-216. [مجلات]
35. Heien ML، Johnson MA، Wightman RM. حل الناقلات العصبية التي اكتشفت بواسطة قياس سرعة الدوران الدوري السريع. علم الشرج. 2004، 76 (19): 5697-5704. [مجلات]
36. Heien ML ، وآخرون. في الوقت الحقيقي قياس تقلبات الدوبامين بعد الكوكايين في دماغ الفئران تتصرف. Proc Natl Acad Sci USA. 2005، 102 (29): 10023-10028. [بك المادة الحرة] [مجلات]
37. Natori S، et al. الافراج عن الدوبامين المرتبطة مكافأة الثانية في المخطط الماوس الظهرية. الدقة العصبية 2009، 63 (4): 267-272. [مجلات]