كفاءة محفز الدوبامين في Mesolimbic Neuron التحفيز للتقدم إلى الإدمان (2015)

المُقدّمة

الإدمان مرض يتطور في عدة خطوات (Everitt et al. ، 2008 ، George et al. ، 2014). يتم التشخيص عندما يصبح الاستخدام الترفيهي قهريًا ، ويستمر على الرغم من العواقب السلبية. بينما تفترض فرضية إدمان رائدة أن تعاطي المخدرات يسبب المرض لأنها تزيد بشكل مفرط من تركيز الدوبامين (DA) في الدماغ ، فمن غير الواضح ما إذا كان تشغيل هذا النظام كافياً لدفع التحولات من الاستخدام الترفيهي إلى الإدمان (Di Chiara and باساريو ، 2007 ، فولكو وموراليس ، 2015). لقد تراكمت الأدلة الداعمة لفرضية DA لتعزيز العقاقير على مدى عدة عقود وتعتمد على التأثير الأولي للعقاقير. على سبيل المثال ، تقلل العقاقير المسببة للإدمان من عتبة التحفيز الذاتي داخل الجمجمة (ICSS) لحزمة الدماغ الأمامي الإنسي ، وهي قناة ليفية تحتوي ، من بين أمور أخرى ، على إسقاط DA تصاعدي من الدماغ المتوسط ​​(Stein، 1964، Crow، 1970، Kornetsky et al.، 1979). ثم حددت دراسات علم الأدوية والآفات نظام DA القشراني المتوسط ​​القشري باعتباره أصل هذه الدائرة (Wise and Bozarth ، 1982). في أواخر الثمانينيات من القرن الماضي ، أكد مقياس مباشر لتركيز DA خارج الخلية مع الغسيل الدقيق أن الأدوية المسببة للإدمان تشترك في خاصية إثارة زيادة DA في NAc (Di Chiara and Imperato ، 1980) أدى ذلك إلى اقتراح تصنيف آلي للعقاقير المسببة للإدمان (Lüscher and Ungless ، 1988).

لا يُعرف الكثير عن كيفية تسهيل هذه التأثيرات الأولية لتعاطي المخدرات الانتقال إلى الإدمان. تم النظر في الآليات المستقلة DA لأن العقاقير التي تسبب الإدمان لها أهداف دوائية أخرى. على سبيل المثال ، الكوكايين ، بالإضافة إلى تثبيط ناقل DA (DAT) ، يرتبط أيضًا بـ SERT (ناقل السيروتونين) و NET (ناقل النوربينفرين) لتقليل امتصاص السيروتونين والنورادرينالين ، على التوالي ، وبالتالي زيادة تركيز جميع أحادي الأمين الرئيسي (هان و Gu، 2006، Tassin، 2008). قد تنطبق مخاوف مماثلة على المنشطات النفسية الأخرى. علاوة على ذلك ، هناك ادعاء بأن المواد الأفيونية هي ، على الأقل في المرحلة الأولية ، DA مستقلة (بادياني وآخرون ، 2011 ، Ting-A-Kee and van der Kooy ، 2012). تم تحدي فرضية DA أيضًا استنادًا إلى نماذج الفئران الجينية ، حيث لا تزال بعض أشكال السلوك التكيفي للأدوية ظاهرة بعد التداخل مع نظام DA. على سبيل المثال ، فئران DAT بالضربة القاضية تدير الكوكايين ذاتيًا (Rocha et al. ، 1998) ، وإلغاء تخليق DA إما دوائيًا (Pettit et al. ، 1984) أو وراثيًا (Hnasko et al. ، 2007) فشل في منع الإدارة الذاتية للعقار أو تفضيل المكان المشروط. في حين أن التوصيف الأفضل لهذه الفئران المعدلة وراثيًا وتوليد الضربات القاضية للناقلات أحادية الأمين قد حلت بعض هذه المشكلات (Rocha ، 2003 ، Thomsen et al. ، 2009) ، فإن كفاية DA لإثارة السمات الأساسية للإدمان غير معروف. للتحايل على قضايا عدم الخصوصية ، قررنا إذن السماح للفئران بالتحفيز الذاتي للخلايا العصبية VTA DA باستخدام نهج علم البصريات الوراثي.

أظهرت الدراسات الحديثة أن تنشيط الخلايا العصبية DA في الدماغ المتوسط ​​يمكن أن يؤدي إلى تفضيل المكان (Tsai et al. ، 2009) أو يعزز السلوك الفعال (Adamantidis et al. ، 2011 ، Witten et al. ، 2011 ، Kim et al. ، 2012 ، Rossi et al.، 2013، McDevitt et al.، 2014، Ilango et al.، 2014). في حين أن هذا التنشيط الانتقائي لمسارات DA يؤكد دراسات التحفيز الذاتي داخل الجمجمة (ICSS) التي أجريت منذ أكثر من 30 عامًا في تحديد نظام المكافأة (Fouriezos et al. ، 1978) ، فإنها تقصر في إثبات تحريض المرحلة المتأخرة من السلوك التكيفي الذي يحدد الإدمان ، ولم يحددوا التكيفات العصبية الأساسية. استخدمنا هنا التلاعب البصري الوراثي ليس فقط للسماح بالاختبار المباشر لمعيار الكفاية لإشارات DA الطورية في بدء التعزيز ، ولكن أيضًا لاختبار الانتقال إلى الإدمان.

من الملاحظات اللافتة للنظر للمراحل المتأخرة من المرض أنه حتى مع أكثر العقاقير إدمانًا ، فإن جزءًا صغيرًا فقط من المستخدمين يصبح مدمنًا (Warner et al. ، 1995 ، O'Brien ، 1997). سيستمر المدمنون البشريون في تعاطي المخدرات على الرغم من العواقب السلبية (انظر تعريف الإدمان الصادر عن الجمعية الأمريكية لطب الإدمان ، DSM5 ، الجمعية الأمريكية للطب النفسي ، 2013) ، والتي تتعلق عادةً بالهزائم الاجتماعية والنفسية التي غالبًا ما تتأخر في الوقت المناسب. وبالمثل ، في القوارض ، يتم تصنيف واحد تقريبًا من كل خمسة حيوانات تحصل على إدارة ذاتية للكوكايين في النهاية على أنه مدمن (Deroche-Gamonet et al. ، 2004 ، Kasanetz et al. ، 2010 ؛ لكن انظر George et al. ، 2014). يمكن أيضًا محاكاة المثابرة في تناول الأدوية على الرغم من النتائج السلبية في القوارض من خلال إدخال حافز مكره بسيط لجدول الاستهلاك. في حين أن المرض البشري أكثر تعقيدًا ، فإن ربط العقوبة بالاستهلاك هو نموذج مباشر لمكون أساسي من مكونات الإدمان.

هنا ، استخدمنا صدمة خفيفة في القدم لتقييم آثارها على الإدارة الذاتية للكوكايين والسكروز والتحفيز الذاتي البصري. نحن نستكشف كذلك ما إذا كان التحفيز الذاتي للخلايا العصبية DA يمكن أن يحفز سلوكين مرتبطين بالإدمان - السعي للحصول على المكافأة والإكراه المرتبط بالاستهلاك على الرغم من النتائج السلبية - ويصف اللدونة العصبية المرتبطة بهذه السلوكيات.

النتائج

للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية DA ، حقننا فيروس التهاب الغدة الدرقية المرتبط بالعدوى (AAV) مع إطار القراءة مفتوحة مقلوب مزدوج floxed يحتوي على ChR2 انصهرت مع البروتين الأصفر الفلوري المحسن (eYFP) (Atasoy et al. ، 2008 ، Brown et al. ، 2010) في VTA لفئران DAT-Cre. بالإضافة إلى ذلك ، تم وضع ألياف بصرية لاستهداف VTA (ChR2، انظر إجراءات تجريبية). خصوصية ChR2 تم تأكيد التعبير عن طريق التوطين المشترك لـ eYFP مع Tyrosine Hydroxylase (TH) ، وهو إنزيم مطلوب لتوليف DA (شكل 1ا). 

أولاً ، لإنشاء بروتوكول التحفيز بالليزر ، تم وضع الفئران في صندوق فعال حيث يمكنهم الضغط على رافعة نشطة ، مما أدى إلى تحفيز عدد من تحفيز الليزر المتنوع (1 ، 2 ، 8 ، 32 ، 60 ، أو 120 رشقة) كل جلستين. لمحاكاة نمط إطلاق النار الطوري (Hyland et al. ، 2002 ، Mameli-Engvall et al. ، 2006 ، Zhang et al. ، 2009) المستحث عادةً عن طريق المكافأة الطبيعية (شولتز ، 1998) ، استخدمنا التحفيز الاندفاعي. تتألف دفعة واحدة من خمس نبضات ليزر تبلغ 4 مللي ثانية ، عند 20 هرتز ، وتتكرر مرتين في الثانية. وجدنا أن الفئران تكيفت مع سلوك الضغط على الرافعة كدالة للانفجارات لكل تحفيز بالليزر ، وبالتالي التحكم في العدد الإجمالي للرشقات المتلقاة (شكل 1ب). كان هذا السلوك يذكرنا بالإعطاء الذاتي للعقاقير المسببة للإدمان ، عندما اختلفت الجرعة لكل حقنة (بيازا وآخرون ، 2000). بالنسبة للتجارب اللاحقة ، اخترنا إدارة 30 رشقة لكل ضغطة رافعة ، مما ينتج عنه عدد نصف الحد الأقصى من الرشقات (شكل 1ب). لتقليد التأخير في زيادة DA التي يتم ملاحظتها عادةً عند إعطاء الأدوية عن طريق الوريد (Aragona et al. ، 2008) ، قمنا بتأخير تحفيز الليزر بمقدار 5 ثوانٍ وأضفنا ضوءًا وامضًا لمدة 10 ثوانٍ (شكل 1C).

خلال 12 يومًا متتاليًا ، سُمح للفئران بالتحفيز الذاتي بحد أقصى 80 مرة في ساعتين. زادت الفئران بسرعة من معدل التحفيز بالليزر ، حيث وصلت إلى 2 تحفيزًا بالليزر (LS) قبل نهاية الساعة الأولى من الجلسة (أرقام شنومكسمد و 1E). تم الحصول على التمييز بين الرافعة الفعالة وغير النشطة وزيادة عدد مكابس الرافعة النشطة وفقًا للزيادة في جداول النسب الثابتة (FR1 ، 2 ، 3) (أرقام شنومكسF و 1G). في تجارب السيطرة على الفئران أو الفئران DAT-Cre− التي عبرت عن ChR2 في الخلايا العصبية للحمض الأميني (GABA) (الفئران GAD-Cre + ، لاستهداف الخلايا العصبية المثبطة لل VTA) ، كانت معدلات التحفيز الذاتي منخفضة وتناقصت بشكل مستمر عبر الدورات. ينطبق هذا أيضًا على اثنين من حيوانات Cre + حيث أظهر التحقق من الصحة اللاحق أن VTA لم يصب بـ ChR2-eYFP (غير موضح). علاوة على ذلك ، لم يتم الكشف عن أي تمييز بين الرافعة النشطة وغير النشطة (أرقام S1A و S1B).

لاحظنا أن الفئران DAT-Cre + ضغطت في كثير من الأحيان على رافعة نشطة أكثر مما هو مطلوب لتنشيط الليزر. في الواقع مثلت هذه المطابع رافعة "غير مجدية" أكثر من 30 ٪ من جميع المطابع رافعة النشطة (الشكل S2أ) وحدثت - مع تقدم الجلسات - في الغالب بين بداية التنبيه وتحفيز الليزر (أرقام S2B و S2C). تطور هذا السلوك المفرد أثناء الاستحواذ وقد يعكس ردودًا دافعة.

مجتمعة ، نشاط الاندفاع في الخلايا العصبية VTA DA يعزز بقوة الاستجابة للذراع.

انسداد VTA DA العصبي الذاتي التحفيز من قبل الكوكايين

لاختبار ما إذا كان التحفيز الذاتي للخلايا العصبية VTA DA يتوقف على نفس دوائر الدماغ التي تستهدفها العقاقير المسببة للإدمان لتعزيز السلوك ، قمنا بحقن الكوكايين داخل الصفاق (IP) مباشرة قبل جلسات التحفيز الذاتي (الوصول المجاني إلى الليزر لمدة 45 دقيقة ، شكل 2أ). في الأساس ، ضغطت الحيوانات المدربة جيدًا حوالي 400 مرة للحصول على 85 ليرة سورية في 45 دقيقة بموجب جدول FR3. بعد حقن الكوكايين ، انخفض الأداء بشكل كبير بطريقة تعتمد على الجرعة إلى حوالي 30 ليرة تركية مقابل 100 ضغطة مع أعلى جرعة (شكل 2ب). كان هذا الانسداد أكثر وضوحًا خلال أول 30 دقيقة من الجلسة ، مما يعكس الحرائك الدوائية للعقار (شكل 2C). تشير هذه التجربة إلى أن التعزيز بواسطة التحفيز الذاتي البصري وتقوية الكوكايين يشتركان في الدوائر العصبية الأساسية.

لمزيد من مقارنة التحفيز الذاتي البصري الوراثي بالأدوية المسببة للإدمان ، سألنا بعد ذلك عما إذا كانت الفئران ستنتكس إلى التحفيز الذاتي للخلايا العصبية VTA DA بعد عدة أسابيع من الانسحاب. نظرًا لأن البحث عن الدواء المرتبط بجديلة يعد نموذجًا راسخًا للانتكاس (Epstein et al. ، 2006 ، Soria et al. ، 2008 ، Bossert et al. ، 2013) ، فقد وضعنا الفئران مرة أخرى في الغرفة الفعالة بعد 30 يومًا من آخر مرة. جلسة التحفيز ، حيث يؤدي الضغط على الرافعة النشطة الآن إلى تشغيل ضوء الإشارات بدون تحفيز الليزر (شكل 3ا). كان سلوك البحث القوي المرتبط جديلة ، والذي يتضح من ارتفاع معدل المطابع ذراع نشطة ، واضح فقط في الفئران مع التعبير عن eYFP-ChR2 في الخلايا العصبية VTA DA (DAT-Cre + وليس الفئران DAT-Cre− ، شكل 3B).

أظهرت الدراسات السابقة العلاقة السببية بين الانتكاس المرتبط بالإشارة واللدونة المشبكية التي يثيرها الكوكايين في نوع فرعي من الخلايا العصبية NAc التي تعبر عن DA D1R (Pascoli ، Terrier et al. ، 2014). لذلك ، لتقييم هذه اللدونة المتشابكة ، أنشأنا فئران DAT-Cre متقاطعة معها Drd1a-tdTomato الفئران لتحديد نوع الخلايا العصبية المتوسطة الحجم (MSNs) في NAc. بدلاً من اختبار البحث ، تم إعداد شرائح من NAc حيث كانت D1R-MSNs حمراء ، متناقضة مع الألياف الخضراء من الخلايا العصبية VTA DA المصابة بـ flox-ChR2-eYFP (شكل 3ج). كشفت تسجيلات مشبك الخلية الكاملة خارج الجسم الحي عن تصحيح علاقة الجهد الحالي للتيارات ما بعد المشبكية المستحثة من AMPAR (AMPAR-EPSCs) وزيادة نسبة AMPAR / NMDAR (أرقام شنومكسD و 3E) ، في D1R-MSN ولكن ليس في D2R-MSNs. تم عرض نتائج مماثلة تم الحصول عليها سابقًا بعد الانسحاب من الإدارة الذاتية للكوكايين للإشارة إلى الإدخال المشترك لـ GluA2 الذي يفتقر إلى GluA2 و GluA1 المحتوي على AMPARs ، عند مدخلات منفصلة على D2014R-MSNs (Pascoli ، Terrier et al. ، XNUMX).

التحفيز الذاتي على الرغم من العقوبة

استخدام المواد على الرغم من العواقب السلبية هو سمة أخرى حاسمة لتعريف الإدمان (انظر تعريف DSM5 ، الجمعية الأمريكية للطب النفسي ، 2013). تم إنشاء نماذج الفئران (Deroche-Gamonet et al. ، 2004 ، Pelloux et al. ، 2007 ، Pelloux et al. ، 2015 ، Chen et al. ، 2013) حيث تؤدي الصدمة الكهربائية التي تم إدخالها في جدول تعاطي الكوكايين الذاتي إلى قمع الكوكايين. الاستهلاك في بعض الحيوانات. بعد 12 يومًا من التعرض الأولي (الاستحواذ) ، سُمح للفئران بالحصول على ثلاث جلسات إضافية في FR3 ولكن مع إيقاف جلسة مخفضة (60 دقيقة أو 40 مكافأة كحد أقصى). كانت هذه الجلسات الثلاث بمثابة خط أساس للجلسات الأربع اللاحقة ، حيث تم إقران كل تحفيز ليزر ثالث بصدمة قدم (500 مللي ثانية ؛ 0.2 مللي أمبير) تنبأ بها جديلة جديدة (شكل 4ا). تم ضبط شدة ومدة صدمة القدم لقمع ذراع الضغط بالكامل للحصول على مكافأة السكروز (انظر أيضًا البيانات أدناه). أدى الجدول الزمني للعقاب إلى استجابتين سلوكيتين متعارضتين (شكل 4ب). توقفت بعض الفئران عن الاستجابة بسرعة عند تطبيق العقوبة (تسمى "حساسة") ، في حين واصلت أخرى الاستجابة للحصول على أكبر عدد ممكن من محفزات الليزر ويمكن اعتبارها "مقاومة" للعقوبة. ظهرت مجموعتان من الحيوانات بالكامل في نهاية جلسات العقوبة الأربع (شكل 4C). حافظت "الفئران المقاومة" على عدد منبهات الليزر (أقل من 20 ٪ تخفيض) في حين أن "الفئران الحساسة" انخفض التحفيز الذاتي بأكثر من 80 ٪. مع هذه المعايير ، لا يمكن تعيين سوى حيوان واحد (النقاط الرمادية). توضح هذه الملاحظة أن نشاط الاندفاع القسري الناجم عن التحفيز الذاتي للخلايا العصبية VTA DA يكفي للحث على ثبات الاستهلاك على الرغم من النتائج السلبية في جزء صغير من الفئران. كعنصر تحكم ، في مجموعة مستقلة من الفئران التي أثبتت مقاومة أو حساسية للعقوبة المرتبطة التحفيز الذاتي ، تم تقييم nociception باستخدام مقايسة الذيل نفض الغبار. لم يتم اكتشاف فرق في الكمون لسحب الذيل منغمسين في الماء الساخن بين الحساسة والمقاومة (الشكل S3).

سألنا بعد ذلك ، بعد الطلب ، عما إذا كان يمكن لأي ميزة معينة خلال مرحلة الاستحواذ على التحفيز الذاتي أن تتوقع مقاومة العقوبة. صنعت الفئران الحساسة والمقاومة عددًا مماثلاً من مكابس الذراع النشطة وغير النشطة خلال جلسات الأساس ، ووصلت جميع الفئران إلى أقصى حد من 80 LS (أرقام S4A و S4B) ، في مقدار مماثل من الوقت (أرقام S4A و S4C). في حين أن الكسر من الصحافة رافعة عقيمة النشطة لم يكن مرة أخرى لا يختلف في اثنين من السكان الفرعية (أرقام شنومكسد و S4D) ، أصبح عدد ضغطات الذراع غير المجدية قبل بداية التحفيز بالليزر أعلى بكثير في الفئران المقاومة بنهاية جلسات الاستحواذ (أرقام شنومكسه و S4ه). نظرًا لتطور هذا السلوك أثناء الاستحواذ ، فقد يساهم ، جنبًا إلى جنب مع الاندفاع الفطري (إيكونوميدو وآخرون ، 2009 ، برووس وآخرون ، 2012 ، جينتش وآخرون ، 2014) ، في إثبات مقاومة العقاب. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تجربة النسبة التقدمية في اليوم 11 لتحديد الدافع لتحفيز علم البصريات الوراثي (Richardson and Roberts ، 1996). أظهرت الفئران المقاومة نقطة توقف لا تختلف إحصائيًا عن الفئران الحساسة (الشكل S4F).

مقاومة للعقاب على الكوكايين ولكن ليس للسكروز

لاختبار ما إذا كان نموذج الاستهلاك على الرغم من العواقب الضارة جنبًا إلى جنب مع ضغط رافعة الدافع يمكن أن يتنبأ أيضًا بالتناول القهري لعقار يسبب الإدمان ، خضعت مجموعة جديدة من الفئران 12 يومًا من تعاطي الكوكايين الذاتي. تم تعيين المعلمات التجريبية لاكتساب الإدارة الذاتية للكوكايين بحد أقصى 80 جرعة من الكوكايين في غضون 4 ساعات أثناء الاستحواذ و 40 حقنة في غضون ساعتين خلال الجلسات الأساسية الثلاث التي سبقت جلسات العقوبة الأربع (أرقام شنومكسأ و S5ا). مرة أخرى ، ظهرت مجموعتان بعد مزاوجة مكافأة الكوكايين بالصدمات الكهربائية. في الواقع ، تم تصنيف 5 من الفئران 22 على أنها مقاومة (أقل من 20٪ انخفاض من خط الأساس) ، في حين تأهلت 17 على أنها حساسة (أكثر من 80٪ تناقصت) ووقع حيوان واحد بين (دفعات 13 في يوم 19)) (شكل 5ب). ثم بحثنا عن تنبؤات سلوكية لمقاومة العقاب. بين المجموعتين ، لم يكن عدد الحقن ، ومعدل التسريب ، وعدد ضغطات الذراع النشطة أو غير النشطة مختلفًا (أرقام S5B – S5D) ، وكانت نقاط الانهيار متشابهة (الشكل S5E). ما كان مختلفًا هو تطور التوزيع في وقت المطابع غير المجدية على الرافعة النشطة. في الجلسات الأربع الأولى ، انخفضت ضغطات الذراع غير المجدية بانتظام خلال فترات المهلة في كل من الفئران المقاومة والحساسة ، بينما في نهاية عملية الاستحواذ ، حافظت الفئران الحساسة فقط على هذا السلوك (أرقام شنومكسجيم و 5D و S5F). على النقيض من ذلك ، تميل الفئران المقاومة إلى زيادة العدد الإجمالي لضغوط الذراع غير المجدية (أرقام شنومكسC و S5د) ، خاصة في الربع الأخير من فترة المهلة (شكل 5د). على الرغم من تشابه نوعيًا مع الملاحظة التي تم إجراؤها مسبقًا مع التحفيز البصري للخلايا العصبية DA (انظر أعلاه) ، إلا أن تجميع المكابس غير المجدية خلال فترة المهلة المبكرة لم يشاهد مع الكوكايين ، على الأرجح بسبب الحركية البطيئة التي يستخدم بها الدواء زيادة مستويات DA. ومع ذلك ، يمكن استخلاص استنتاجات مماثلة بناءً على هذا التطور المفرد لتوزيع مكبس ذراع عديم الجدوى خلال الفترة القصيرة من الزمن التي تسبق "الاكتشاف الداخلي لارتفاع DA". وبالتالي ، تشير ملاحظتنا إلى أن توزيع مكابس الرافعة النشطة غير المجدية يتنبأ بتعاطي المخدرات رغم العواقب السلبية.

وأخيرًا كررنا تجربة الفئران التي تغذت عليها الشحوم والتي يمكن أن تضغط من أجل الحصول على مكافأة السكروز. بمجرد إدخال العقوبة ، توقفت جميع الفئران عن إدارة السكروز (شكل 5E) ، مما يدل على أن هذا الجدول الزمني قمع تناول مكافأة طبيعية غير ضرورية ، لكنه سمح للكشف عن تناول القهري من المخدرات الإدمان أو تحفيز الخلايا العصبية قوية DA.

مجتمعة ، توضح هذه النتائج أن التحفيز الذاتي VTA DA يكفي للحث على الإكراه ، كما يتضح من مقاومة العقوبة في مجموعة فرعية من الفئران (68٪). وبالمثل ، بعد الكوكايين SA ، أصبحت بعض الفئران مقاومة للعقوبة (23٪) ، وهو ما لم يكن أبدًا بعد السكروز SA (شكل 5F).

لتحديد منطقة الدماغ التي قد تتحكم في قرار المثابرة في الإدارة الذاتية على الرغم من العواقب السلبية ، قمنا أولاً بمراقبة "النشاط العصبي" العام عن طريق حساب عدد الخلايا العصبية التي أدت فيها جلسة العقاب إلى ظهور الجين المبكر الفوري cFos في 15 مناطق مختلفة. تم perfused الفئران intracardially مع PFA 90 دقيقة بعد نهاية جلسة العقوبة الأخيرة. تضمنت المجموعات الضابطة حيوانات ساذجة ، بالإضافة إلى فئران تم ربطها بفئران حساسة أو مقاومة من أجل التحكم في التأثير المربك المحتمل لعدد الصدمات المتلقاة.

بينما في معظم المناطق المختارة ، كان عدد الخلايا العصبية الإيجابية لـ cFos أعلى في الشرائح من الفئران المقاومة مقارنة بشرائح الفئران الساذجة ، ظهر نوعان من الاستجابات ، مثال على ذلك القشرة المخاطئة (PL) والـ OFC الجانبية. في PL ، وجدنا زيادة مماثلة للخلايا إيجابية cFos في الفئران المقاومة وعناصر التحكم فيها ، في حين أن هذه الزيادة في OFC كانت واضحة فقط في الفئران المقاومة وليس في الفئران المقابلة لها (أرقام شنومكسA و 6B). لقياس هذا الاختلاف ، تم تطبيع جميع البيانات لأول مرة إلى مستويات التعبير في الحيوانات الساذجة. بعد ذلك ، تم حساب النسبة بين المقاومة على الحساس مقسومة على yoked على المقاومة على نير إلى حساسة (نسبة_{المدراء الماليين} = (R / S) / (YR / YS) ، شكل 6ب). حدد هذا الإجراء القشرة الحزامية ، و OFC ، و VTA باعتبارها المناطق التي يتم تنشيطها في الفئران المقاومة ولكن ليس في الفئران الحساسة وحيث كان هناك اختلاف بسيط في كلتا المجموعتين من عناصر التحكم المقربة (في الواقع ، الخلايا العصبية منخفضة cFos إيجابية في مقيد) . العثور على VTA ليس مفاجئًا ، حيث إنها منطقة الخلايا العصبية المحفزة بالليزر. يتماشى هذا مع تقرير سابق يوضح أن تحفيز ChR2 يؤدي إلى تنشيط cFos (Lobo et al. ، 2010 ، Van den Oever et al. ، 2013). نسبة منخفضة_{المدراء الماليين} تم العثور عليه في المناطق التي كان التنشيط فيها مشابهًا للحساسية والمقاومة (مثل CeA و PAG). النسبة_{المدراء الماليين} كان منخفضًا أيضًا عند موازاة التنشيط بفارق كبير في عناصر التحكم المزودة (مثل PL ، شكل 6C لنسبة ملخصة_{المدراء الماليين} البيانات). لذلك ، كان على الأرجح تعبير cFos المماثل في الفئران المقاومة والمقاومة للوقود بسبب عدد صدمات القدم ولم يكن له علاقة تذكر بمقاومة العقوبة. مجتمعة ، نسبة عالية_{المدراء الماليين} في OFC تشير إلى أن النشاط العصبي في هذه المنطقة يرتبط بمقاومة العقوبة ، وبالتالي قد يفضل الانتقال إلى الإدمان.

لتحديد ركيزة النشاط العصبي المتزايد في OFC في الفئران التي تقاوم العقوبة ، قمنا بإعداد شرائح من PL و L-OFC لمدة 24 ساعة بعد جلسة العقوبة الأخيرة لاختبار استثارة الجوهر. تم اختيار المنطقتين بسبب نمطهما المتميز للغاية لتعبير c-Fos في التجارب السابقة. تم قياس استثارة الخلايا العصبية عن طريق حساب عدد إمكانات العمل (APs) الناتجة عن حقن كميات متزايدة من التيار (من 0 إلى 600 باسكال) في تسجيلات الخلية الكاملة. كشفت هذه التسجيلات عن وجود استثارة مستدامة في الخلايا العصبية الهرمية للـ PL للفئران المقاومة (وتحكمها المقيد) عند مقارنتها بالفئران الحساسة أو الساذجة (شكل 7ا). لم تكن إمكانات غشاء الراحة (RMP) من الخلايا العصبية المسجلة مختلفة بين المجموعات التجريبية (شكل 7ب). هذه النتائج تشير بقوة إلى أن استثارة الخلايا العصبية في PL يرتبط مباشرة مع عدد من الصدمات الواردة ، وربما ليس مع قرار مقاومة العقوبة. يعكس هذا على الأرجح تكييفًا سلبيًا للتغذية المرتدة ينجم عن الإثارة العصبية الناتجة عن صدمات القدم في اليوم السابق. في المقابل ، كانت الخلايا العصبية من L-OFC أكثر إثارة فقط في الفئران المقاومة. لم تكن استثارة الخلايا العصبية من الفئران المخفوقة مختلفة عن استثارة الخلايا العصبية من الفئران الساذجة ، واستبعاد تأثير صدمة القدم نفسها (أرقام شنومكسC و 7D). هذا النشاط المتزايد للخلايا العصبية OFC يحتمل أن يكون أساس تعبير cFos وقد يدفع المقاومة للعقاب.

لاختبار السببية بين استثارة الخلايا العصبية المحسنة لـ OFC ومقاومة العقاب ، عبرنا عن DREADD المثبط (مستقبلات المصمم التي يتم تنشيطها حصريًا بواسطة الأدوية المصممة: CamKIIα-hM4D) في الخلايا العصبية الهرمية لـ OFC من الفئران DAT-Cre + (شكل 8ا). في الشرائح الحادة من OFC ، استحث استخدام حمام CNO (كلوزابين- أكسيد أكسيد) تيارًا بطيئًا للخارج ، على الأرجح بوساطة قنوات GIRK ، تم عكسه بواسطة الباريوم (Ba²⁺) ، مانع غير محدد لقنوات البوتاسيوم (شكل 8ب). تحول CNO أيضًا منحنى الإدخال / الإخراج إلى اليمين (شكل 8C). الفئران DAT-Cre + المصابة بـ AAV1 / CamKIIIA-hM4D-mCherry في OFC (شكل 8D) اكتسب نموذج التحفيز الذاتي للخلايا العصبية DA متبوعًا بكتلتين متتاليتين مع جدول العقوبة ، الأولى في وجود CNO والثانية بدون CNO. تم قطع الكتلتين لمدة 6 أيام دون عقاب (شكل 8E). في نهاية كتلة العقوبة الأولى ، في ظل وجود CNO ، كانت فقط الفئران 5 من 16 مقاومة (شكل 8F ، اللوحة اليسرى). في المقابل ، دون تثبيط OFC ، خلال فترة العقوبة الثانية ، تم تصنيف 14 من 16 على أنه "مقاوم" (أرقام شنومكسF ، اللوحة اليمنى ، و 8G). بمعنى آخر ، كان جزء الفئران المقاومة أقل بشكل ملحوظ في وجود CNO مقارنة بالفوج الأول من الفئران 34 التي تم اختبارها مسبقًا في نفس الظروف (مقارنة بين المجموعة ، شكل 8H) وأصبحت مماثلة للفوج الأول دون CNO (داخل المجموعة المقارنة). أخيرًا ، بالنسبة للفئران التسعة التي تحولت من حساسية إلى مقاومة ، فإن CNO لم تعدل زمن انتقال الذيل عند الغمر في الماء الساخن (شكل 8I).

مجتمعة ، توضح هذه التجربة أن نشاط الخلايا العصبية الهرمية في OFC يدفع قرار مواصلة التحفيز الذاتي على الرغم من العواقب السلبية التي تمثل سمة رئيسية للانتقال إلى الإدمان في القوارض.

مناقشة 

يميز نموذج الإدمان المقترح مؤخرًا ثلاث خطوات في تطور المرض: تعاطي المخدرات الترفيهي المتقطع ، متبوعًا بتعاطي المخدرات بشكل مكثف ومستمر ومتصاعد ، ثم الاستخدام القهري المرتبط بفقدان السيطرة (Piazza and Deroche-Gamonet ، 2013 ؛ لكن انظر جورج وآخرون ، 2014). توضح دراستنا أن تحفيز الخلايا العصبية VTA DA كافٍ لدفع هذا التقدم من خلال دورة زمنية سريعة نسبيًا.

من خلال محاكاة نمط إطلاق النار الذي يحدث بشكل طبيعي ، يتم استحضار الإطلاق الفعال لـ DA في المناطق المستهدفة من VTA ، مثل NAc (باس وآخرون ، 2010). لذلك من المحتمل أن تتحكم مستويات DA في NAc في التحفيز الذاتي ، تمامًا كما تقوم القوارض بإعطاء التسريب التالي من الكوكايين أو الهيروين بمجرد انخفاض تركيز DA إلى ما دون العتبة (Wise et al. ، 1995). وهذا مدعوم أيضًا من خلال ملاحظتنا أن الكوكايين ، المحقون ، يمكن أن يسد التحفيز الذاتي وبالتالي ، فإن التحفيز الذاتي للخلايا العصبية DA يشبه إلى حد كبير الإدارة الذاتية للعقار ، على الرغم من أن حركته أسرع بالتأكيد من أي مادة دوائية ، بما في ذلك الكوكايين ، كما هو مقترح من خلال معدل الاستجابات المختلفة الذي لوحظ في هذه الدراسة.

بينما استهدفنا بشكل انتقائي الخلايا العصبية DA في VTA ، فإن التحفيز الذاتي للوراثة الضوئية قد يكون قد نشط مجموعات من الخلايا ذات وظائف فسيولوجية مختلفة. على سبيل المثال ، تم اقتراح أن بعض الخلايا العصبية DA ترمز إلى المنبهات المكروهة (Lammel et al. ، 2012 ، Gunaydin et al. ، 2014). تُسقط هذه الخلايا إلى mPFC ، بينما تتوسط الخلايا العصبية VTA DA التي تظهر على غلاف NAc الجانبي التعزيز الإيجابي (Lammel et al. ، 2012). سيكون من المثير للاهتمام تقييم التحفيز الذاتي والتقدم مع الاستهداف الانتقائي (Gunaydin et al. ، 2014). نظرًا لأن التلاعب لدينا نشّط جميع الخلايا العصبية VTA DA ، تمامًا كما يعمل الكوكايين على جميع الخلايا العصبية التي تعبر عن DAT ، فمن المتصور أن بعض الخلايا العصبية DA ستقود التعلم المعزز بينما الخلايا العصبية الأخرى DA ستقود تعلم النفور. سيظل التأثير الصافي تعزيزًا للسلوك ؛ ومع ذلك ، يمكن أن تسهم "الخلايا العصبية النفورية" في تحريض عملية الخصم (كوب ، 2013 ، وايز وكوب ، 2014).

بعد الإجبار على الامتناع عن ممارسة الجنس ، أدت إعادة العرض إلى السياق إلى السعي وراء التحفيز الذاتي ، وهو نموذج قارض راسخ لانتكاس المخدرات. بشكل ملحوظ ، لا يمكن تمييز اللدونة العصبية الأساسية عن تلك التي لوحظت بعد الانسحاب من تعاطي الكوكايين الذاتي (Pascoli ، Terrier et al. ، 2014). يضيف هذا إلى دراسة أبلغت سابقًا عن مرونة متشابكة متطابقة في الخلايا العصبية VTA DA أثارتها جلسة واحدة من التحفيز البصري أو الحقن الأول لعقار يسبب الإدمان (Brown et al. ، 2010). يظهر نمط من التكيفات المتشابكة في السلوك التكيفي الشائع لجميع العقاقير المسببة للإدمان.

السمة اللافتة للنظر في دراستنا هي الانقسام في الاستجابة لمحفز مكره قوي بما يكفي لتعطيل استهلاك المكافآت الطبيعية غير الضرورية في جميع الحيوانات. في بيئتنا ، لم تُظهر الفئران المقاومة حافزًا أعلى بكثير للتوصيل الذاتي للمكافأة ، وهو ما يتناقض مع دراسة أجريت على الكوكايين في الفئران (Pelloux et al. ، 2007). كان المتنبئ السلوكي لمقاومة العقاب في الفئران ، مع ذلك ، يضغط على رافعة عقيمة خلال الثواني الخمس التي سبقت بداية تحفيز الخلايا العصبية DA. لذلك يمكن اعتبار عدم القدرة على الانتظار حتى تسليم المكافأة علامة على الاندفاع (Dalley et al. ، 5 ، Olmstead ، 2011 ، Everitt et al. ، 2006 ، Winstanley ، 2008 ، Leyton and Vezina ، 2011). لقد أثار اهتمامنا الملاحظة التي تفيد بأن أخذ الاندفاع لم يتطور إلا بعد عدة جلسات من التحفيز الذاتي. هذا يثير احتمال أن مقاومة العقوبة (وبالتالي التعرض للإدمان) قد لا تكون فطرية بالكامل ، ولكنها تتطور خلال المراحل الأولية نحو الإدمان. إذا كانت هذه هي الحالة ، فإن الانقسام الذي لاحظناه نحن والآخرون (Deroche-Gamonet et al. ، 2014) قد لا يتم تحديده من خلال العوامل الوراثية فقط. هذا من شأنه أن يفسر أيضًا أن جزءًا مشابهًا من الأفراد يصبح مدمنًا على سلالات الفئران المتجانسة وراثيًا نسبيًا وبالتأكيد أكثر تنوعًا في التجمعات البشرية.

إذا كشفت مقاومة العقوبة عن ضعف الفرد للإدمان ، المقدّر بنسبة 20٪ لدى البشر حتى مع الكوكايين (وارنر وآخرون ، 1995 ، أوبراين ، 1997 ، جورج وآخرون ، 2014) ، فإن النسبة الأعلى بكثير الموجودة هنا يمكن أن يعكس قوة التحفيز المباشر والانتقائي للخلايا العصبية DA. بمعنى آخر ، قد يكون التحفيز الانتقائي للخلايا العصبية DA أكثر إدمانًا من أي عقار آخر. يمكن تفسير ذلك من خلال العمل غير الانتقائي للمواد الدوائية. في حالة الكوكايين ، على سبيل المثال ، قد تؤخر الأمينات الأحادية بخلاف DA بالفعل تحريض الإدمان. في الواقع ، قد يعارض السيروتونين السلوكيات التكيفية المعتمدة على DA مثل الاستجابة للمكافأة المشروطة ، والتحفيز الذاتي ، وتفضيل المكان المشروط (Wang et al. ، 1995 ، Fletcher and Korth ، 1999 ، Fletcher et al. ، 2002) من خلال تسهيل الارتباط من الإشارات إلى المحفزات المكروهة (باور ، 2015 ، هندي عطار وآخرون ، 2012). بدلاً من ذلك ، قد يكمن الاختلاف في اختلاف الحركية بين التحفيز الذاتي البصري الوراثي والحث الدوائي لزيادة DA خارج الخلية. قد يكون هذا الاختلاف في فاعلية الإدمان موجودًا أيضًا بين عقاقير مختلفة من التعاطي (George et al.

على الرغم من أنه لا يمكننا استبعاد الاختلافات رسميًا في إطلاق DA و / أو الإشارة النسبية للمساهمة في إنشاء مقاومة للعقاب ، إلا أن هذا السيناريو غير مرجح لأن التحقق النسيجي من إصابة الحيوانات المدرجة في الدراسة أظهر EYFP-ChR2 التعبير في VTA بأكمله. علاوة على ذلك ، أدى بروتوكول التحفيز البصري الوراثي المصمم لتشبع إطلاق DA إلى التحفيز الذاتي الذي توج بقيم موزعة أحادي الاتجاه لنقطة الانكسار ، مما يعكس الحافز التحفيزي.

نتيجة أخرى مفاجئة هي أن عدد صدمات القدم الكهربائية مرتبط باستثارة الخلايا العصبية في PL. لوحظ انخفاض استثارة الخلايا العصبية الهرمية وزيادة نسبة AMPAR / NMDAR في الخلايا العصبية الهرمية لنفس الخلايا في "الجرذان المدمنة" ، ومع ذلك لم تتحكم هذه الدراسات في تأثير الصدمات الكهربائية في حد ذاتها (Kasanetz et al.، 2010، Kasanetz وآخرون ، 2013 ، تشين وآخرون ، 2013). وبالتالي يمكن تفسير عدم الانفصال من خلال الدور المزدوج لـ mPFC في كل من عمليات اتخاذ القرار وتكامل الخوف (Peters et al. ، 2009). على العكس من ذلك ، يرتبط التغيير في استثارة الخلايا العصبية الهرمية في القشرة الحوفية بصدمات القدم (Santini et al. ، 2008). لا يستبعد هذا الدليل احتمال أن تلعب mPFC دورًا بارزًا في قرار متابعة المدخول. ومع ذلك ، فإن تحليلنا وملاحظاتنا الخاصة بالاستثارة الجوهرية تشير إلى OFC والقشرة الحزامية. علاوة على ذلك ، فإن تثبيط استثارة الخلايا العصبية في OFC مع DREADD منع مقاومة العقوبة. يمثل هذا الارتباط السببي خطوة مهمة في فهم الآليات الخلوية المسؤولة عن الانتقال إلى الإدمان. ستكون هناك حاجة لدراسات مستقبلية لاختبار ما إذا كان هذا ينطبق أيضًا على النطاق الكامل للعقاقير المسببة للإدمان.

تتماشى النتائج التي توصلنا إليها مع الملاحظات التي تشير إلى أن الخلل الوظيفي في OFC يمكن أن يضعف عملية صنع القرار المتعلق بالتكلفة والعائد (Seo and Lee ، 2010 ، Walton et al. ، 2010 ، Fellows ، 2011) وقد يؤدي إلى سلوكيات قهرية (Burguière et al. ، 2013) ). في البشر ، تم ربط تعاطي المخدرات بضعف اتخاذ القرار وتغيير وظيفة OFC (Lucantonio et al. ، 2012 ، Gowin et al. ، 2013). مجتمعة ، يظهر نشاط الخلايا العصبية OFC كمحدد رئيسي للانتقال إلى تعاطي المخدرات القهري (Everitt et al. ، 2007). هذا لا يمنع دور اللدونة التي يثيرها الدواء في الوصلات المثيرة على MSNs التي لوحظت هنا وفي دراسات أخرى (Kasanetz et al. ، 2010). سيكون من المثير للاهتمام تقييم ما إذا كانت التلاعبات التي تهدف إلى التحكم في استثارة OFC تؤثر على الدافع لدى المدمنين.

هنا نقترح التحفيز الذاتي للخلايا العصبية DA كنموذج قوي لدراسة المراحل التي تؤدي إلى الإدمان. نحن نعيد إنتاج المكونات الأساسية لإدمان المخدرات ، مثل الانتكاس ، واللدونة المشبكية ، والمثابرة على الاستهلاك على الرغم من العواقب السلبية. في حين أن النموذج ليس مناسبًا بالتأكيد لدراسة التأثيرات المحددة لعقار معين (على سبيل المثال ، مقارنة المواد الأفيونية بالمنشطات النفسية) ، إلا أنه يتمتع بالعديد من المزايا. إنه يسمح بالتحكم الزمني الدقيق في تسليم المكافأة ، فهو ينشط بشكل خاص الخلايا العصبية VTA DA فقط ، وأخيراً وليس آخراً ، فإنه يوفر إمكانية دراسة الفئران لفترة أطول بكثير من الإدارة الذاتية للدواء. من خلال التركيز على القواسم المشتركة المحددة للعقاقير التي تسبب الإدمان ، فإن الأمل هو كشف الآليات العصبية الكامنة وراء أشكال الإدمان غير المعتمدة على المواد (Alavi et al. ، 2012 ، Robbins and Clark ، 2015) وبالتالي المساهمة في نظرية عامة عن الإدمان. المرض. وهكذا تسمح نماذج الأمراض الوراثيّة الوراثيّة بخطوة حاسمة لفهم شامل للخلل العصبي الذي ينطوي عليه المراحل المتأخرة من الإدمان ، وستوجه علاجات جديدة وعقلانية لمرض لا يوجد حاليًا علاج له.

قام VP و JT و AH بإجراء التجارب السلوكية بينما قام VP بإجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية وتنسيق التحليل. تم تصميم الدراسة وكتابتها من قبل جميع المؤلفين.

تم دعم هذا العمل من خلال المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية السويسرية ومنحة ERC المتقدمة (MeSSI) ، و Carigest SA ، والجمعية الأكاديمية في جنيف ، و Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT طالب MD-PhD يدفعه الاتحاد السويسري.

المستند S1. الإجراءات والأشكال التجريبية التكميلية S1 – S6

الجدول S1. تحاليل احصائية