فك الدوائر العصبية التي تتحكم في السكروز القهري (2015) (آلية الانحناء)

من أجل تحديد الخلايا العصبية LH التي توفر مدخلات أحادية المشبك إلى VTA في الجسم الحي ومراقبة نشاطها أثناء السلوكيات التي تتحرك بحرية ، استخدمنا استراتيجية ثنائية الفيروس للتعبير بشكل انتقائي عن channelrhodopsin-2 (ChR2) في الخلايا العصبية LH التي توفر مدخلات أحادية المشبك إلى VTA (أرقام شنومكسأ و S1). قمنا بحقن ناقل فيروسي مرتبط بالأدوية (AAV₅) يحمل ChR2-eYFP في إطار قراءة مفتوح مقلوب مزدوج معتمد على الـ Cre-recombinase (DIO) في LH لإصابة الجسد المحلي وحقن فيروس الهربس البسيط المتجول إلى الوراء (HSV) الذي يحمل Cre-recombinase في VTA. سمحت إعادة التركيب اللاحقة بتعبير opsin و fluorophore بشكل انتقائي في الخلايا العصبية LH التي توفر مدخلات أحادية المشبك إلى VTA. لتأكيد نهجنا ، أجرينا تسجيلات مشبك التصحيح للخلايا الكاملة خارج الجسم الحي في شرائح الدماغ الأفقية التي تحتوي على LH وتم تسجيلها من الخلايا العصبية التي تعبر عن ChR2-eYFP ، وكذلك الخلايا العصبية LH المجاورة التي كانت ChR2-eYFP سلبية (شكل 1ب). تراوحت أزمنة الكمون الناتجة عن ارتفاع الضوء ، والتي يتم قياسها من بداية نبضة الضوء إلى ذروة جهد الفعل ، من 3 إلى 8 مللي ثانية (شكل 1ج). وجدنا أيضًا أن أيا من الخلايا غير المعبرة (سلبية ChR2) المسجلة أظهرت استجابات مثيرة للتحفيز الضوئي (ن = 14 ؛ شكل 1C) ، على الرغم من قربها من الخلايا التي تعبر عن ChR2.

من أجل إجراء التعرف الضوئي بوساطة البصريات الوراثية في الجسم الحي ، تم زرع optrode في LH لتسجيل النشاط العصبي أثناء مهمة البحث عن السكروز. في جلسة التسجيل نفسها ، قدمنا ​​عدة أنماط من التحفيز الضوئي لتحديد الخلايا العصبية LH-VTA التي تعبر عن ChR2 (أرقام شنومكسد و S1). قمنا بفحص توزيعات الاستجابة الضوئية الاستثارية عبر جميع الخلايا العصبية LH التي تظهر تغيرًا مغلقًا في معدل إطلاق النار استجابة للإضاءة ولاحظت توزيع ثنائي المنشأ (شكل 1ه). لاحظنا مجموعة من الخلايا العصبية أثناء التسجيلات في الجسم الحي مع فترات كمون في نطاق من 3-8 مللي ثانية. كان هذا مطابقًا لنطاق الكمون الموجود في الخلايا العصبية LH-VTA التي تعبر عن ChR2 عندما سجلنا خارج الجسم الحي. أطلقنا على هذه الوحدات اسم "النوع 1" (أرقام شنومكسC و 1E و 1 F). بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك مجموعة مميزة من الخلايا مع زمن استجابة ضوئي 100 مللي ثانية (أرقام شنومكسE و 1G) ، وقد أطلقنا على هذه الوحدات "Type 2". لاحظنا أيضا الخلايا العصبية التي تم تثبيط ردا على photostimulation من الخلايا العصبية LH-VTA (الشكل S2) ، وقد أطلقنا على هذه الوحدات "Type 3". قارنا مدة العمل المحتملة (كما تم قياسها من القمة إلى القاع) ومعدلات إطلاق النار لوحدات نوع 1 و 2 بالإضافة إلى تلك التي لم تظهر ضوئيًا (شكل 1H). توزيع فترات الجهد المحتملة لنوع 1 (شكل 1I) ونوع 2 (شكل 1تُظهر وحدات J) أن غالبية الوحدات من النوع 1 لها مدة عمل محتملة أقل من 500 μs (84٪ ؛ n = 16/19 ، التوزيع ذي الحدين ، p = 0.002).

على الرغم من أن وحدات النوع 1 تناسب المعايير القياسية لتصنيفها على أنها ChR2 معبرة (Cohen et al. ، 2012 ، Zhang et al. ، 2013) ، لم يكن من الواضح ما إذا كانت الاستجابة الضوئية الطويلة لوحدات النوع 2 تشير إلى الخلايا العصبية التي تعبر عن ChR2 والتي استجابت. بشكل أبطأ إلى التحفيز الضوئي ، أو ما إذا كان هذا التأثير ناتجًا عن نشاط الشبكة. بالنظر إلى أن الخلايا العصبية LH التي تعبر عن ChR2 (النوع 1) تعمل مباشرة على VTA ، كان أحد الاحتمالات أن الخلايا العصبية من النوع 2 كانت تتلقى تعليقات من VTA (شكل 1ك). هناك احتمال آخر وهو أن الخلايا العصبية من نوع 2 تم تنشيطها بواسطة ضمانات محوار من الخلايا العصبية من نوع 1 (شكل 1L). للتمييز بين هذين الطرازين المحتملين ، قمنا بتثبيط VTA بالتزامن مع تصوير الصورة في LH.

بناءً على نماذج الدوائر لدينا ، نتوقع أن يكون تثبيط البعيدة ليس له أي تأثير على photoresponses لـ ChR2-expressing LH neurons. ومع ذلك ، إذا اعتمدت عصبونات LH photoresponsive ، لكنها غير معبرة ، على التغذية المرتدة من VTA للحصول على استجابة مقفلة للإضاءة (شكل 1K) ، فإننا نتوقع توهين من photoresponses في هذه الخلايا العصبية على تثبيط VTA. لقد عبرنا عن ChR2 في خلايا LH-VTA على النحو الوارد أعلاه ، ولكن هذه المرة أيضًا عبرت عن تحسين halorhodopsin 3.0 (NpHR) في VTA وزرعت ألياف بصرية في VTA بالإضافة إلى optrode في LH (شكل 2ا). قدمنا ​​نفس أنماط الإضاءة ذات الإضاءة الزرقاء في LH لجميع العهود الثلاثة ، ولكننا قمنا أيضًا بتحويل VTA بالضوء الأصفر في الحقبة الثانية (شكل 2ا).

لم تتأثر التصويرات الضوئية لوحدات النوع 1 بإضاءة الضوء الأزرق في LH بإصدار photoinhibition للـ VTA ، والذي يتوافق مع تعبير ChR2 في الخلايا العصبية من النوع 1 LH-VTA (شكل 2ب). في المقابل ، أظهرت غالبية الوحدات من النوع 2 (87٪ ؛ n = 13/15 ، التوزيع ذي الحدين ، p = 0.004) توهينًا كبيرًا للاستجابات الضوئية لنبضات الضوء الأزرق التي يتم تسليمها في LH عند التثبيط الضوئي للخلايا العصبية VTA. كانت استجابات وحدات النوع 1 والنوع 2 أثناء التثبيط الضوئي لـ VTA مختلفة اختلافًا كبيرًا (مربع كاي = 7.64 ، ع = 0.0057 ؛ أرقام شنومكسب و 2C). يمكن أيضًا رؤية هذه الاختلافات في درجات Z القصوى خلال فترات زمنية فردية (شكل 2D) ومع العصر الأصفر ON قيدت إلى العصر الأصفر OFF (شكل 2E). هذه البيانات تشير إلى أن الخلايا العصبية نوع 2 LH تلقي المدخلات (إما بشكل مباشر أو غير مباشر) من VTA (شكل 1ك) بدلاً من استخدام الضمانات المحورية المحلية (شكل 1L).

بعد أن حددنا هذين النوعين المتميزين من الخلايا العصبية LH في حلقة LH-VTA ، أردنا فحص النشاط العصبي الذي يحدث بشكل طبيعي أثناء مهمة الإدارة الذاتية للسكروز (شكل 3أ). تم تدريب الفئران على أداء استجابات الأنف للحصول على إشارة تتنبأ بتسليم السكروز في منفذ مجاور (كما في Tye et al. ، 2008). للسماح لنا بالتمييز بين الاستجابات العصبية لمؤخرة الأنف والإشارة ، تم تسليم الإشارات والسكروز وفقًا لجدول تعزيز جزئي ، حيث تم إقران 50 ٪ من ضربات الأنف مع توصيل جديلة وسكروز.

عرضت وحدات نوع 1 استجابات طورية لمدخل منفذ السكروز ، كما هو موضح في وحدة تمثيل نوع 1 (شكل 3ب) ، وكذلك بيانات السكان لجميع وحدات نوع 1 (شكل 3C). ردود الفعل الطورية لوحدات نوع 2 ، ومع ذلك ، يعكس أساسا الردود على جديلة التنبؤية مكافأة (أرقام شنومكسD و 3E). يتم عرض أنماط إطلاق النار الطبيعية لجميع الخلايا العصبية المسجلة (ن = 198 ، مقسمة إلى وحدات من النوع 1 ، 2 ، 3 ، ووحدات غير مستجيبة) لكل مكون من مكونات المهمة: دقات أنف مقترنة بالإشارة ، وخطات أنف في غياب الإشارة ، و دخول منفذ السكروز (شكل 3F). كانت جميع وحدات النوع 1 التي أظهرت تغييرات طورية ذات صلة بالمهمة في النشاط (74٪ ؛ n = 14/19) إما متحمسًا مرحليًا أو مثبطًا عن طريق إدخال منفذ السكروز ، مع وجود عدد صغير يُظهر أيضًا تثبيطًا مرحليًا للإشارة التنبؤية للمكافأة (أرقام شنومكسB و 3C و 3G). في المقابل ، كانت وحدات النوع 2 أكثر تجانسا ، مع الخلايا العصبية تستجيب للمهمة ترميز جديلة انتقائي (35 ٪) ، والمنافذ مدخل السكروز انتقائي (26 ٪) ، أو كل من دخول جديلة والمنفذ (12 ٪ ؛ أرقام شنومكسD و 3E و 3H). لتوضيح قوة استجابات الوحدات النمطية 1 و Type 2 للأحداث المرتبطة بالمهام ، قمنا بتحديد كل خلية على قطعة أرض ثلاثية الأبعاد وفقًا لدرجة Z (شكل 3أنا). لإظهار توزيع التغييرات الطورية في إطلاق النار إلى أحداث متعددة متعلقة بالمهام على مستوى نوعي ، قمنا بتحديد عدد الخلايا لكل نوع من أنواع photoresponse التي تقع في فئة معينة (شكل 3J).

بالنظر إلى الدور المحدد جيدًا لـ VTA في خطأ التنبؤ بالمكافأة (على سبيل المثال ، التخفيض المرحلي لإطلاق الخلايا العصبية DA استجابةً للحذف غير المتوقع للمكافأة والإثارة المرحلية استجابةً لتسليم المكافأة غير المتوقع) (شولتز وآخرون ، 1997) ، حققنا فيما إذا كانت الخلايا العصبية LH ستشفر الحذف غير المتوقع لمكافأة السكروز. للقيام بذلك ، قمنا بتسجيل النشاط العصبي للخلايا العصبية المستجيبة للضوء أثناء نفس مهمة جديلة المكافأة في الحيوانات المدربة جيدًا ولكننا حذفنا بشكل عشوائي 30٪ من توصيلات السكروز بعد الإشارة (شكل 4ا).

كانت غالبية الوحدات من النوع 1 (88٪ ؛ n = 15/17 ، التوزيع ذي الحدين ، p = 0.001) غير حساسة لمكافأة الإغفال (أرقام شنومكسB و 4 D) ، في حين أن مجموعة فرعية كبيرة من وحدات النوع 2 (67٪ ؛ n = 12/18) أظهرت استجابة مختلفة بشكل كبير للتجارب المقدمة من المكافآت والمكافآت المحذوفة (أرقام شنومكسC و 4D). خلصنا إلى أن الخلايا العصبية LH-VTA (النوع 1) تشفر الإجراء الخاص بالدخول إلى المنفذ ، حيث كانت استجابات المدخل هذه مستمرة حتى عند حذف المكافأة (شكل 4D) ، على عكس وحدات النوع 2 (chi-square = 10.9804 ، p = 0.0009).

ولتحديد ما إذا كانت استجابات النوع 1 لإدخال المنفذ تشفِّر بالفعل الاستجابة المشروطة (CR) ، على عكس السلوك العام أو البحث الاستكشافي للمكافأة ، تم تسجيلنا في الفئران غير المدربة التي لم تكن قد اكتسبت المهمة بعد. في الفئران المهمة السذاجة ، قدمنا ​​السكروز إلى الميناء في غياب إشارة تنبؤية (تسليم مكافأة غير متوقعة) ووجدنا أن وحدات النوع 1 لم تظهر استجابات طورية لدخول الميناء (أرقام شنومكسE ، 4F ، و 4I) ، بما يتوافق مع النموذج الذي تشفّر به الخلايا العصبية نوع 1 CR (شكل 4J).

بعد ذلك ، لتحديد ما إذا كان نشاط الوحدة من نوع 2 متناسقًا مع ملف استجابة استجابة تشبه خطأ التنبؤ ، قمنا أيضًا بتسجيل هذه العصبونات في حيوانات مدربة بشكل جيد أثناء تسليم المكافآت غير المتوقعة (شكل 4ز). وجدنا أن مجموعة فرعية من وحدات النوع 2 استجابت لعمليات تسليم السكروز غير المتوقعة (50٪؛ أرقام شنومكسG-4I). مجتمعة ، مجموعات فرعية من وحدات نوع 2 حساسة لحذف المكافأة غير المتوقعة (أرقام شنومكسC و 4D) وتسليم الثواب غير المتوقعأرقام شنومكسG – 4I) ، بما يتوافق مع ملف استجابة استجابة تشبه خطأ التنبؤ.

كما أظهرنا أعلاه ، تمثل وحدات نوع 1 علاقة عصبية لـ CR. الأهم من ذلك ، أن الزيادة في معدل إطلاق النار تبدأ قبل CR ، تتصاعد حتى تم الانتهاء CR (أرقام شنومكسB و 3C و 4ب). لتحديد ما إذا كان تنشيط مسار LH-VTA يمكن أن يعزز CR ، أردنا اختبار قدرة تنشيط LH-VTA في دفع CR في مواجهة نتيجة سلبية. في الفئران من النوع البري ، أعربنا عن ChR2-eYFP أو eYFP بمفرده في أجسام خلايا LH وزرعنا أليافًا ضوئية فوق VTA (أرقام شنومكسأ و S4). على العكس من ذلك ، لاختبار دور مسار LH-VTA في التوسط في سلوكيات CR أو السلوكيات المتعلقة بالتغذية ، عبرنا بشكل ثنائي عن NpHR-eYFP أو eYFP بمفرده في خلايا LH وزرعنا الألياف الضوئية فوق VTA (أرقام شنومكسأ و S4).

لقد صممنا مهمة تكييف بافلوفي اضطر فيها الفئران المحرومون بالأغذية إلى عبور شبكة صدمة لاسترداد مكافأة السكروز (شكل 5ب). في حقبة "الخط الأساسي" الأولى (مع إيقاف شبكة الصدمات) ، تحققنا من أن كل فأر قد اكتسب مهمة أسلوب بافلوفيان الشرطي. في الحقبة الثانية ("الصدمة") ، قدمت شبكة الصدمات صدمات خفيفة بالقدم كل ثانية. أخيرًا ، في الحقبة الثالثة ("Shock + Light") ، واصلنا تقديم صدمات القدم ولكن أيضًا أطراف LH مضاءة في VTA بضوء أزرق (10 Hz) في الفئران التي تعبر عن ChR2 وعناصر تحكم eYFP المتطابقة والضوء الأصفر (ثابت) الفئران التي تعبر عن NpHR وضوابط eYFP الخاصة بهم (شكل 5B).

لاحظنا وجود عدد أكبر بكثير من إدخالات المنافذ في كل جديلة خلال حقبة Shock + Light ومعدل فرق أعلى بكثير (Shock + Light epoch - Shock-only epoch) في فئران ChR2 بالنسبة لفئران eYFP (شكل 5C و فيلم S1). وعلى النقيض من ذلك ، أدى التصوير الضوئي لمسار LH-VTA إلى انخفاض ملحوظ في إدخالات المنافذ في كل جديلة ومعدلات فرق في الفئران NpHR بالنسبة لفئران eYFP (شكل 5د و فيلم S2). أظهرت التجارب على الانقراض داخل الدورة التي لم تتبعها العروض التقديمية عن طريق تسليم السكروز اتجاهات مماثلة في التأثير (الشكل S4).

الأهم من ذلك ، أردنا تحديد ما إذا كانت التغييرات في طلب السكروز التي حصلنا عليها ناتجة عن التغيرات في السلوك المرتبط بالتغذية أو الحساسية للألم. لاحظنا أن تنشيط ضوئي لإسقاط LH-VTA سيزيد بشكل كبير من الوقت الذي يقضيه الطفل في تغذية الفئران في مجموعة ChR2 (شكل 5E). ومع ذلك ، فإن التصوير الضوئي لمسار LH-VTA لا يقلل بشكل كبير من التغذية (شكل 5F) ، على الرغم من أن هذه الحيوانات كانت محرومة من الطعام لتعزيز قدرتنا على الكشف عن انخفاض نسبة إلى حقبة خط الأساس (مقارنة للحيوانات المغلفة في شكل 5E). في لا ChR2 (شكل 5G) ولا مجموعة NpHR (شكل 5H) هل لاحظنا اختلافًا في وقت الاستجابة لسحب الذيل من الماء الساخن (Ben-Bassat et al. ، 1959 ، Grotto and Sulman ، 1967) ، مما يشير إلى أن التلاعب في إسقاط LH-VTA لم يغير التسكين.

لدراسة تكوين مكونات النقل السريع لمدخلات LH إلى VTA التي كانت تثير هذه التأثيرات ، أجرينا تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية VTA في إعداد شريحة حادة أثناء تنشيط مدخلات LH بصريًا تعبر عن ChR2-eYFP (أرقام شنومكسأ و S5). بالنظر إلى وجود تباين راسخ داخل VTA ، بما في ذلك الخلايا العصبية ∼65٪ DA ، و 30٪ من الخلايا العصبية GABA ، و ∼5٪ من الخلايا العصبية الغلوتاماتية (Margolis et al. ، 2006 ، Nair-Roberts et al. ، 2008 ، Yamaguchi et al. ، 2007) ، قمنا بملء الخلايا بالبيوسيتين أثناء التسجيل للسماح بتحديد نوع الخلية باستخدام الكيمياء المناعية اللاحقة للتيروزين هيدروكسيلاز (TH ؛ شكل 6ب) ، بالإضافة إلى تسجيل تيار الكاتيونات الذي يتم تنشيطه بواسطة فرط الاستقطاب (I_h) وتحديد موقع الخلية (أرقام شنومكسفرقة S5).

أولاً ، قمنا بالتسجيل في المشابك الحالية أثناء التحفيز الضوئي لمدخلات LRXNXX معبرًا عن LH ولاحظنا أن 2 من الخلايا العصبية 23 أظهرت استجابة مؤمّنة للوقت لتحفيز ضوئي لمدخلات LH (شكل 6C). تلقت غالبية الخلايا العصبية DA التي تم أخذ عينات منها في VTA مدخلات استثنائية صافية من LH (56٪) ، في حين أظهرت مجموعة فرعية أخرى تثبيط صافي (30٪؛ شكل 6C). يتم تعيين التوزيع المكاني لهذه الخلايا العصبية DA على أطلس للشرائح الأفقية التي تحتوي على VTA (شكل 6د).

لتأسيس المساهمة أحادية المشبك لمدخلات LH في الخلايا العصبية VTA DA ، استخدمنا رسم خرائط الدائرة بمساعدة ChR2 ، حيث تم إجراء تسجيلات الجهد المشبك في وجود tetrodotoxin (TTX) و 4-aminopyridine (4AP ؛ Petreanu et al. ، 2007) . تمشيا مع ملاحظاتنا من تسجيلات المشبك الحالية ، لاحظنا أن غالبية الخلايا العصبية VTA DA المسجلة تلقت حصريًا مدخلات استفزازية أحادية المشبك من LH (67٪) ، مقارنة بالخلايا العصبية VTA DA التي تلقت حصريًا مدخلات مثبطة أحادية المشبك (11٪) ، أو كلاهما (22٪؛ أرقام شنومكسه و S6).

حددنا الخلايا العصبية VTA GABA عن طريق حقن فلوروفور معتمد على Cre (AAV₅-DIO-mCherry) في VTA لـ VGAT :: Cre الفئران واستخدم تعبير mCherry لتوجيه تسجيل الخلايا العصبية VTA GABA (ن = 24 ؛ شكل 6F). أجاب 46 ​​في المئة من الخلايا العصبية VTA GABA مع الإثارة الصافية ، في حين أجاب 54 ٪ مع تثبيط صافي ، إلى photostimulation من المدخلات LH - ChR2 معربا عن (شكل 6G). يتم عرض التوزيع المكاني لهذه الخلايا شكل 6H. عند فحص المدخلات أحادية القطب من LH (كما هو موضح أعلاه) ، وجدنا أن نسبة 18٪ من الخلايا العصبية GABA التي تم أخذ عينات منها حصلت على مدخل استثنائي حصريًا ، وتلقى 9٪ مدخلات تثبيط حصريًا (شكل 6أنا). ومع ذلك ، بالنسبة إلى الخلايا العصبية VTA DA ، وجدنا أن المزيد من الخلايا العصبية VTA GABA تلقت كلاً من GABA الاستثاري بوساطة AMPAR والمثبط._Aمدخلات أحادية المشبك بوساطة R من LH (73٪ ؛ مربع كاي = 5.0505 ، ع = 0.0246 ؛ أرقام شنومكسI و S6).

بالنظر إلى أن تسجيلاتنا خارج الجسم الحي قدمت أدلة تدعم المدخلات القوية من كل من توقعات GABAergic و glutamatergic LH إلى VTA ، قمنا بعد ذلك بالتحقيق في دور كل مكون بشكل مستقل. للقيام بذلك ، استخدمنا خطوط الماوس المعدلة وراثيًا التي تعبر عن Cre-recombinase في الخلايا العصبية التي تعبر إما عن ناقل الغلوتامات الحويصلي 2 (VGLUT2) أو ناقل GABA الحويصلي (VGAT). قمنا بحقن AAV₅-DIO-ChR2-eYFP أو AAV₅-DIO-eYFP إلى LH من VGLUT2 :: Cre و VGAT :: Cre والفئران زرع ألياف بصرية على VTA (الشكل S7). ثم تم تشغيل هذه الحيوانات على كل من الاختبارات السلوكية المبينة في شكل 5.

لم نلاحظ أي اختلافات يمكن اكتشافها في عدد إدخالات المنفذ التي تم إجراؤها لكل إشارة بين الفئران التي تعبر عن ChR2 أو eYFP في LH^تخمةإسقاط -VTA (شكل 7أ) أو في LH^GABAإسقاط -VTA (شكل 7ب). ومع ذلك ، عند تحليل الفيديو ، لاحظنا سلوكًا شنيعًا قذرًا في LH^GABA-VTA: مجموعة ChR2 على إضاءة زرقاء خفيفة (انظر أفلام S3 و S4). في LH^تخمةالفئران -VTA ، على الرغم من وجود اتجاه نحو خفض التغذية على التحفيز الضوئي في مجموعة ChR2 بالمقارنة مع المجموعة eYFP ، لم يكن هذا ذو دلالة إحصائية (شكل 7C). في المقابل ، لاحظنا زيادة قوية في الوقت الذي يقضيه التغذية في الفئران التي تم فصلها على الإضاءة في LH^GABA-VTA: مجموعة ChR2 نسبة إلى عناصر التحكم (شكل 7د و فيلم S3). في أي مجموعة من الحيوانات كان هناك تأثير التحفيز الضوئي في فحص سحب الذيل (أرقام شنومكسE و 7F).

أثناء مهمة التغذية ، كما فعلنا أثناء مهمة البحث عن السكروز ، لاحظنا مرة أخرى تسلسلات السيارات ذات الصلة بالتغذية التي لم تكن موجهة إلى الطعام. قمنا بتصوير ماوس تمثيلية في LH^GABA-VTA: مجموعة ChR2 في غرفة شفافة فارغة ، وعند التحفيز الضوئي 20 هرتز ، لاحظنا تسلسلات حركية شهية غير عادية مثل لعق وقضم الأرض أو مساحة فارغة (فيلم S4). حددنا هذه السلوكيات "القضمية" خلال مهمة التغذية في LH-VTA من النوع البريشكل 7G) ، LH^تخمة-VTA (شكل 7ح) ، و LH^GABA-VTA (شكل 7I) مجموعات وأظهرت أن LH^GABA-VTA: الفئران ChR2 نخر أكثر من نوع البرية أو LH^تخمة-VTA: ChR2 الفئران عندما photostimulated ، بالمقارنة مع مجموعات eYFP الخاصة بهم (شكل 7J). نظرنا في ما إذا كان يمكن فصل السلوكيات المرتبطة بالتغذية الشاذة عن التغذية الموجهة بشكل مناسب عند ترددات منخفضة. ومع ذلك ، عندما اختبرنا LH^GABA-VTA: مجموعة ChR2 بقطارات 5 هرتز و 10 هرتز من الضوء الأزرق ، لاحظنا وجود علاقة تناسبية بين تردد التحفيز وكلا من التغذية والقضم (شكل 7ك).

تم استكشاف إسقاط LH إلى VTA من خلال دراسات تصادم التحفيز الكهربائي (Bielajew و Shizgal و 1986) وتم الافتراض لفترة طويلة للعب دور في معالجة الثواب (Hoebel و Teitelbaum و 1962 و Margules و Olds و 1962) ، مع تحديد هذا دور كان تحديا. هنا ، نحن نقدم تشريحًا تفصيليًا حول كيفية معالجة المكونات الفردية لعملية حلقة LH-VTA جوانب مختلفة للمهمة المرتبطة بالمكافأة.

من خلال استخدام phototagging optogenetic بوساطة (شكل 1) ، حددنا مجموعتين منفصلتين من الخلايا العصبية LH: الخلايا التي ترسل الإسقاطات إلى VTA (النوع 1) والخلايا التي تتلقى تعليقات من VTA (النوع 2؛ شكل 2) - على الرغم من أن هذه المجموعات السكانية لا يجب أن تكون متنافية ، حيث أنه من الممكن أن تقوم الخلايا العصبية LH بإرسال واستقبال المدخلات من وإلى VTA. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن عددًا قليلًا نسبيًا من الخلايا العصبية photoresponsive يقع خارج نطاق التوزيع النسقي الذي يحوي هذين التجمعين (أرقام S2فرقة 1ه). بالنظر إلى ذلك ، بالاقتران مع التأخير الطويل في الاستجابة الضوئية من النوع 2 (∼ 100 مللي ثانية) ، فإننا نتوقع أنه قد يكون هناك مسار واحد مهيمن يساهم في نشاط الخلايا العصبية من النوع 2. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن DA يربط المستقبلات المقترنة بالبروتين G ، فإن الخواص الحركية تكون أبطأ من معظم المشابك الغلوتاماتيكية (Girault and Greengard ، 2004) وقد تفسر هذه المجموعة من 100 مللي ثانية كمون وحدات الاستجابة الضوئية. من الممكن أيضًا أن توفر VTA ردود فعل غير مباشرة من خلال المناطق البعيدة الأخرى ، عبر مناطق وسيطة مثيرة مثل اللوزة ، أو مع إزالة التثبيط عبر النواة المتكئة (NAc) أو نواة السرير من السطور الطرفية (BNST).

ومن المثير للاهتمام ، في حين أن التحفيز الضوئي للوحدات من النوع 1 يثير استجابات مثيرة في وحدات النوع 2 ، فإن النوعين 1 و 2 يظهران خصائص ترميز سلوكية مميزة. على سبيل المثال ، تختلف أعداد الوحدات من النوع 1 والنوع 2 التي تقوم بترميز الإشارات التنبؤية للمكافأة بشكل انتقائي (n = 0/19 اكتب 1 مقابل n = 12/34 اكتب 2 ، chi-square = 8.67 ، p = 0.003) . يمكن أن يكون نمط الاستجابة المتناقض هذا بسبب العمليات الحسابية في عنصر الدائرة الوسيطة ، مثل VTA ، التي قد تلعب دورًا نشطًا أثناء المهمة السلوكية ولكنها غير نشطة أثناء وضع العلامات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر الحالة السلوكية للحيوان على كيفية معالجة هذه البيانات.

لقد سمحت لنا تجارب الإمتناع عن المكافأة بالتمييز بين التشفير العصبي لـ LH لـ CR واستهلاك التحفيز غير المشروط (الولايات المتحدة). في هذه التجارب ، استجابت مجموعة فرعية من وحدات النوع 2 إلى جواب التنبئ بالمكافأة (CS) والولايات المتحدة ، كما أظهرت انخفاضًا في معدل إطلاق النار عندما تم حذف المكافآت المتوقعة. علاوة على ذلك ، تُظهر مجموعة فرعية من وحدات نوع 2 أيضًا إثارة طورية عند التسليم غير المتوقع للمكافأة (أرقام شنومكسG و 4 H). تذكرنا هذه البيانات بالطريقة التي تقوم بها الخلايا العصبية DA في VTA بتشفير خطأ توقع المكافأة (Cohen et al. ، 2012 ، Schultz et al. ، 1997). نتوقع أن الخلايا العصبية VTA قد تنقل إشارات خطأ التنبؤ بالمكافأة إلى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية LH ، والتي تكون في وضع جيد لدمج هذه الإشارات لتحديد الناتج السلوكي المناسب. على وجه التحديد ، يرتبط LH ارتباطًا وثيقًا بالعديد من مناطق الدماغ الأخرى (Berthoud and Münzberg ، 2011) وقد تم ربطه سببيًا بالحالات المتجانسة مثل النوم / الإثارة والجوع / الشبع (كارتر وآخرون ، 2009 ، جينينغز وآخرون. ، 2013).

تمت مناقشة السلوك القهري الساعي للمكافأة في المقام الأول في سياق إدمان المخدرات ، حيث كان النموذج الكلاسيكي للبحث عن المخدرات القهري هو فحص درجة استمرار سلوك البحث عن المخدرات في مواجهة النتائج السلبية ، مثل صدمة القدم (Belin et al.، 2008، Pelloux et al.، 2007، Vanderschuren and Everitt، 2004). قمنا بتكييف هذه المهمة للسكروز في محاولة للسماح لنا بالتحقيق فيما إذا كان تنشيط مسار LH-VTA كافياً لتعزيز البحث عن السكروز القهري. بالنظر إلى أن الاختلاف الواضح بين الدواء والمكافأة الطبيعية هو أن المكافآت الدوائية ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة ، فهناك جدل حول السلوكيات التي يمكن أن تشكل السكروز القهري أو سلوك البحث عن الطعام. التفسير البديل لبياناتنا هو أن تنشيط مسار LH-VTA يزيد ببساطة الدافع التحفيزي أو الرغبة في البحث عن معززات شهية. نظرًا لارتفاع معدلات السمنة في العقود الأخيرة (Mietus-Snyder and Lustig ، 2008) ، فإن الإفراط في تناول الطعام وإدمان السكر من الحالات السائدة التي تشكل تهديدًا كبيرًا لصحة الإنسان (Avena ، 2007). يذكرنا سلوك التغذية في الفئران المتخمرة (التي تتغذى بالكامل) بعد تنشيط مسار LH-VTA بسلوكيات الأكل التي شوهدت لدى البشر الذين تم تشخيصهم باضطراب الإفراط في الأكل القهري (أو اضطراب الأكل بنهم) (DSM-V).

وقد اقتُرح أن تؤدي الأعمال المتكررة إلى تكوين عادات ، تؤدي في حد ذاتها إلى المكافأة القهرية التي تسعى إلى وصف الإدمان (Everitt and Robbins، 2005). إن اكتشافنا أن الخلايا العصبية LH-VTA تشفِّر فقط دخول المنفذ بعد التكييف تشير إلى أن هذا المسار يشفر بشكل انتقائي استجابة مشروطة ، وليس مجرد عمل محفز. وهذا يتفق مع ملاحظاتنا بأن تفعيل هذا الإسقاط بصريًا يمكن أن يعزز المكافأة القهرية في مواجهة نتيجة سلبية (شكل 5C) ، وكذلك في غياب الحاجة (كما رأينا في الفئران التي تم فصلها ، شكل 5E). تم إثبات هذا التفسير بشكل أكبر من خلال اكتشافنا أن إزالة آثار مسار LH-VTA يقلل بشكل انتقائي من طلب السكروز القهري (شكل 5D) ولكنه لا يقلل من التغذية في الفئران المقيدة بالطعام (شكل 5F). واحد من أكبر التحديات في علاج الإفراط في القهري أو اضطرابات الأكل بنهم هو خطر إعاقة سلوكيات التغذية بشكل عام. من منظور متعددي ، قد نكون حددنا دائرة عصبية محددة كهدف محتمل لتطوير تدخلات علاجية للإفراط في الأكل أو إدمان السكر دون التضحية بسلوك التغذية الطبيعية.

نوضح أنه بالإضافة إلى مكون الجلوتامات LH-VTA (Kempadoo وآخرون ، 2013) ، هناك أيضًا مكون GABAergic مهم في الإسقاط (Leinninger et al. ، 2009) ، وأن الخلايا العصبية LH تتشابك مباشرة على كل من DA و الخلايا العصبية GABA في VTA (شكل 6). ومع ذلك ، هناك اختلاف في توازن المدخلات الإثارة / المثبطة على الخلايا العصبية VTA DA و GABA.

في حين استخدمنا المعالجة المناعية الكيميائية للتحقق من هوية الخلايا العصبية VTA ، قمنا أيضًا بقياس I_h، تيار كاتيوني غير محدد منشط بفرط الاستقطاب داخليًا (لاسي وآخرون ، 1989 ، أنجليس وجريس ، 2012). تم استخدام وجود هذا التيار على نطاق واسع في دراسات الفيزيولوجيا الكهربية لتحديد الخلايا العصبية DA ، ولكن ثبت أنه موجود فقط في مجموعات سكانية فرعية من الخلايا العصبية DA ، المحددة بواسطة هدف الإسقاط (Lammel et al. ، 2011). على الرغم من أنه قد تم اقتراحه سابقًا في مراجعة قام بها فيلدز وزملاؤه بأن "الخلايا العصبية LH تتشابك مع إسقاطات VTA إلى PFC ، ولكن ليس تلك التي تسقط على NAc" (Fields et al. ، 2007) ، تشير بياناتنا إلى إعادة فتح هذا الجدل لمزيد من التحقيق. على الرغم من أننا لاحظنا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية DA التي تلقت إثارة صافية من LH وتمتلك مجموعة صغيرة جدًا من I_h (تماشيا مع الخلايا العصبية DA التي تحتوي على الإنزيم الوسيط القوقعي أو NAc) ، لاحظنا أيضا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية DA التي تلقت المدخلات الصافية الصافية وأظهرت كبيرة_h (بما يتفق مع خصائص الخلايا العصبية DA الإسقاط إلى القشرة الجانبية لل NAc ؛ الشكل S5؛ لاميل وآخرون ، 2011). على العكس من ذلك ، أظهرت الخلايا العصبية VTA DA التي تلقت مدخلات مثبطة صافية أنا صغيرة جدًا_h أو يفتقر إلى هذا التيار ، وهو ما يتوافق مع فكرة أن LH يرسل مدخلات مثبطة في الغالب إلى الخلايا العصبية VTA DA التي تسقط على mPFC أو الغلاف الإنسي لـ NAc. نوضح أيضًا أنه يمكن ملاحظة مدخلات LH في كل من VTA الإنسي والجانبي ، مما يشير إلى أن LH يوفر مدخلات على الخلايا العصبية VTA ذات أهداف إسقاط متنوعة ، حيث من المعروف أن هدف إسقاط VTA يتوافق إلى حد ما مع الموقع المكاني على طول المحور الجانبي الإنسي ( لاميل وآخرون ، 2008).

تم إرجاع دور مسار LH-VTA في تعزيز المكافأة سابقًا إلى انتقال الجلوتامات في VTA (Kempadoo et al. ، 2013) ، حيث يُعتقد غالبًا أن محفز CaMKIIα انتقائي للخلايا العصبية الإسقاطية المثيرة. ومع ذلك ، تُظهر بياناتنا بوضوح أن التعبير عن ChR2 تحت سيطرة محفز CaMKIIα يستهدف أيضًا الخلايا العصبية الإسقاط GABAergic في LH (شكل 6).

السلوك الذي أثاره photostimulation من LH^GABAكان المسار -VTA مسعور ، وسوء التوجيه ، وغير مؤهل (فيلم S4). تفسير واحد هو أن تفعيل LH^GABAالمسار -VTA يرسل إشارة إلى الفأرة التي تسبب التعرف على معزز فاتح الشهية. التفسير البديل هو أن LH^GABAقد يؤدي مسار -VTA إلى تحفيز البصيرة أو "الرغبة" الشديدة ، بما يتوافق مع الإشارة المرتكزة على نهج مشروط ، ولكن على مستوى غير فيزيولوجي ينتج هذا السلوك المرتبط بالتغذية المنحرفة (Berridge and Robinson، 2003). تمشيا مع هذا ، فمن الممكن أن تفعيل LH^GABA-VTA إسقاط في الواقع تنتج أحاسيس شديدة من شغف ، أو تحث على إطعام. ومع ذلك ، تظهر تجاربنا أن تفعيل LH^GABA-VTA لا تنتج زيادة في طلب السكروز القهري ، ولكن هذا على الأرجح بسبب السلوك المفرط القذر والشاذة الشاذة التي تركز على الأشياء غير الغذائية في غرفة الاختبار. على الرغم من صعوبة تحديد تجربة الماوس أثناء هذا التلاعب ، فمن الواضح أن السلوكيات الموجهة للتغذية الموجهة بشكل مناسب تتطلب التنشيط المتناسق لكل من مكونات GABAergic و glutamatergic لمسار LH-VTA.

التلاعبات الوراثية وعلم الجينات الدوائية هي أدوات قوية لإقامة علاقات سببية ، لكنها لا تكشف عن الخصائص الفيزيولوجية الذاتية لعناصر الدارة العصبية. توحد دراستنا المعلومات حول الاتصال المتشابك ، والوظيفة الداخلية التي تحدث بشكل طبيعي ، والدور السببي لمسار LH-VTA ، مما يوفر مستوى جديد من البصيرة تجاه كيفية دمج المعلومات في هذه الدائرة. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية دراسة الدور الوظيفي للخلايا العصبية عن طريق التوصيلية ، بالإضافة إلى العلامات الجينية. قامت الخلايا العصبية LH-VTA بشكل انتقائي بتشفير حركة البحث عن المكافأة ولكنها لم تشفر المنبهات البيئية ، في حين تم تشفير المنبهات المكافئة والمنبهات التنبؤية المكافئة من قبل مجموعة منفصلة من الخلايا العصبية LH في اتجاه VTA. علاوة على ذلك ، حددنا إسقاطًا محددًا مرتبطًا سببيًا بسلوك الإكثار من السكروز والتغذية. إن عدم التجانس في إسقاط LH-VTA ضروري لتوفير توازن توافقي بين دافع القيادة وتنظيم سلوكيات السلوكيات الموجهة بشكل مناسب. هذه النتائج توفر رؤى ذات صلة بالظروف المرضية مثل اضطراب فرط الإلزام القهري وإدمان السكر والسمنة