Diabetologia. 2017. 60 (8): 1502 – 1511.
نشرت على الانترنت 2017 مايو 20. دوى: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1ملخص
وتهدف / الفرضية
يسبب إفراط في الدهون الغذائية البدانة لدى البشر والقوارض. وقد أظهرت الدراسات الحديثة في البشر والقوارض أن الإدمان على الدهون يشترك في آلية مشتركة مع إدمان الكحول والنيكوتين والمخدرات من حيث وجود خلل في أنظمة مكافأة الدماغ. وقد تم تسليط الضوء على أن اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HFD) يضعف مستقبلات الدوبامين D2 (D2R) في المخطط المخطط ، وهو منظم محوري لنظام مكافأة الدماغ ، مما يؤدي إلى الإفراط في تناول الطعام. ذكرنا سابقا أن المكون النشط بيولوجيا rice-oryzanol المكون من الأرز البني قد خفف من تفضيل HFD عبر التحكم في المهاد. ولذلك ، استكشفنا إمكانية أن يغير γ-oryzanol سير عمل نظام مكافآت الدماغ في الفئران.
طرق
تم علاج فئران ذكور C57BL / 6J التي غذيت ببدائل HFD عن طريق الفم مع γ-oryzanol ، وتم تقييم مستويات الجزيئات المشاركة في إشارات D2R. تم فحص تأثير γ-oryzanol على مثيلة الحمض النووي لمحفز D2R والتغييرات اللاحقة في تفضيلات الدهون الغذائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم دراسة تأثير 5-aza-2′-deoxycytidine ، وهو مثبط قوي لميثيل الناقلات (DNMTs) ، على تفضيل الأغذية ، D2R التشغيلي ومستويات DNMTs في المخطط المخطط. تم تقييم التأثيرات المثبطة لـ γ-oryzanol على نشاط DNMTs بطريقة إنزيمية في المختبر.
النتائج
في المخطط من الفئران تغذت HFD ، انخفض إنتاج D2Rs عن طريق زيادة في مثيلة الحمض النووي لمنطقة المحفز من D2R. خفضت الإدارة الفموية لـ γ-oryzanol التعبير ونشاط DNMTs ، وبالتالي استعادة مستوى D2R في المخطط. كما ساهم التثبيط الدوائي لـ DNMTs بواسطة 5-aza-2′-deoxycytidine في تحسين تفضيل الدهون الغذائية. بالتوافق مع هذه النتائج ، أثبتت الاختبارات الأنزيمية في المختبر أن γ-oryzanol تثبط نشاط DNMTs.
الاستنتاجات / التفسير
أثبتنا أن γ-oryzanol يحسن الحمض النووي مفرط الحمض النووي HFD من منطقة المروج من D2R في مخطط الفئران. يسلط نموذجنا التجريبي الضوء على γ-oryzanol باعتباره مادة مضادة للسمنة واعدة مع خاصية مميزة كونها مبتكر جيني جديد.
مواد تكميلية إلكترونية
تحتوي النسخة الإلكترونية من هذه المقالة (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) على مواد تكميلية لمراجعة الزملاء ولكنها غير متاحة ، وهي متاحة للمستخدمين المعتمدين.
المُقدّمة
الإفراط في تناول الطعام لدى الأفراد البدينين ، على الأقل جزئيا ، آليات مشتركة مع إدمان الكحول والنيكوتين والمخدرات [1]. فضلاً عن تنظيم الشهية للهرمونات والهرمونات ، فإن نظام مكافأة الدماغ ، ولا سيما إشارات مستقبلات الدوبامين ، يرتبط ارتباطًا وثيقًا بسلوك التغذية الإدماني أو الهيدوني [2]. أظهرت دراسة سابقة أجريت على الفئران أن ضربة قاضية لمستقبل الدوبامين D2 (D2R) من خلال دبوس قصير يتدخل عبر ال lنتيفيروس أدى بسرعة إلى حدوث عوائق مكافئة للإدمان وبحث عن غذاء شبيه بالإكراه.3]. بسبب انخفاض كثافة D2R ، يكون المخطط الظهاري أقل استجابة لمكافأة الطعام مقارنةً بمجموعات التحكم في الجسم في البشر والبدينين.3-5]. وفقا لهذه الفكرة ، فإن طقIA أليل من ANKK1 يرتبط موضع الجين (الترميز DRD2 / ankyrin تكرار ونطاق كيناز يحتوي على 1) ، مما يقلل من إنتاج D2R المخطط ، مع النمط الظاهري السمينة في البشر [6] ، في حين ترتبط الآثار المترتبة على فقدان الوزن بعد جراحة السمنة مع ارتفاع كثافة D2R مخطط [7]. هذه البيانات تشير بقوة إلى أهمية DDSNUMXR مخطط الجسم كهدف علاجي جديد لعلاج السمنة. ومع ذلك ، فإن بعض الأدوية التي تم تطويرها والتي عملت على نظام مكافأة الدماغ تسببت في آثار ضائرة كبيرة ، بما في ذلك مشاكل نفسية خطيرة ، مما أدى إلى انسحابها في نهاية المطاف من العيادات [8].
تعتبر التعديلات الوراثية اللاجينية حاسمة الأهمية ليس فقط بالنسبة للتطور والتمييز ، ولكن أيضًا لأنها تنشأ كنتيجة للتغيرات البيئية ، بما في ذلك في النظام الغذائي ونمط الحياة [9]. الحمض النووي المثيلي هو حدث جيني رئيسي لاستقرار التعبير الجيني [9]. في الفئران ، يؤدي التعرّض الأمومي لنظام غذائي غني بالدهون (HFD) إلى تغيير ميثيل الحمض النووي ضمن نظام المكافأة المركزي في النسل ، مما يؤدي إلى زيادة إفراز HFD من قبل الجراء [10]. على وجه الخصوص ، تلعب ناقلات الدنا DNA (DNMTs) أدوارًا مهمة في تنظيم سلوك التغذية والنشاط البدني10, 11] ، مما يشير إلى أن DNMTs قد تكون واعدة أهداف علاجية لعلاج متلازمة السمنة - مرض السكري. الأهم من ذلك ، من المعروف أن بعض المواد الطبيعية المشتقة من المواد الغذائية ، بما في ذلك حمض الكافيين و epigallocatechin ، بمثابة مثبطات DNMT [12, 13].
لقد أظهرنا مؤخرًا أن المكون b-oryzanol المكون من الأرز النشط بيولوجيًا والبني ، وهو مزيج من إستر حمض الفيروليك وعديد من phytosterols ، يخفف من تفضيل الدهون الغذائية عبر انخفاض في التوتر الشبكي الداخلي الخيطي (ER)14]. في الفئران والأرانب ، تم امتصاص γ-oryzanol عن طريق الفم بسرعة من الأمعاء وتوزيعها بشكل رئيسي على الدماغ [15, 16]. ومع أخذ هذه النتائج معًا ، يمكن أن تكون المنتجات الطبيعية المشتقة من الأغذية التي تعمل على الجهاز العصبي المركزي بديلاً لتحسين سلوك التغذية الضعيف في السمنة بشكل آمن. في هذا السياق ، اختبرنا الفرضية القائلة بأن γ-oryzanol سيغير حالة الحمض النووي DNA في نظام مكافأة الدماغ ، مما يؤدي إلى توهين تفضيل HFD في الفئران.
طرق
أشكال حيوانات
تم إيواء الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر سبعة أسابيع والتي تم الحصول عليها من Charles River Laboratories Japan (كاناغاوا ، اليابان) (3-4 لكل قفص) في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة عند 24 درجة مئوية تحت ضوء 12 ساعة / 12 ساعة / دورة مظلمة. بعد أسبوع من التأقلم ، تمت مطابقة وزن الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع وتم تقسيمها إلى مجموعتين أو ثلاث مجموعات للخضوع لكل تجربة. سُمح للفئران بالوصول المجاني إلى الطعام والماء. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات بجامعة ريوكيوس (أرقام 5352 و 5718 و 5943).
إدارة γ-oryzanol و 5-aza-2′-deoxycytidine
لتقييم تفضيل HFD ، تم إدارة γ-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries، Osaka، Japan) إلى فئران 8-week-old عن طريق الإزراق أثناء اختبار اختيار الطعام كما هو موضح سابقًا [14, 17]. بالنسبة للتجارب الأخرى ، تم تصنيع HFD (D12079B ؛ حمية الأبحاث ، نيو برونزويك ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) التي تحتوي على 0.4٪ or-oryzanol ككريات. وتظهر مكونات النظام الغذائي في جدول المواد التكميلية الإلكترونية (ESM) 1. بعد 12 أسبوعًا من التغذية ، تم جمع الأنسجة من المخطط والوطاء. كان المدخول اليومي من γ-oryzanol ، المقدّر من متوسط تناول الطعام للفئران ، حوالي 320 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم. تم تحديد جرعات γ-oryzanol كما هو موصوف سابقًا [14]. تم حقن 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC ؛ Sigma-Aldrich ، St Louis ، MO ، USA) داخل الصفاق (0.25 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 12 أسبوعًا [18].
تقدير الأفضلية للدهون الغذائية
لتقييم تفضيلات الدهون الغذائية ، وفرت اختبارات الغذاء الاختيار بين تشاو و HFD (D12450B و D12451 ؛ الحمية البحثية) كما هو موضح سابقا [14]. يتم عرض مكونات النظام الغذائي في ESM Table 1. باختصار ، سُمح للفئران بالوصول المجاني إلى الطعام و HFD. تم قياس مآخذ الطعام و HFD أسبوعياً وتحليلها للتغيرات في تفضيل الدهون الغذائية. تم حساب تفضيل HFD وفقًا للمعادلة: تفضيل HFD = [(تناول HFD / إجمالي مدخول الطعام) × 100].
تسلسل بيسلفيت لمثيل مائي DNA
تمت تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN ، طوكيو ، اليابان). تم خلط محلول DNA مع 3 مول / لتر NaOH المحضر حديثًا ، وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وإضافته إلى 5.3 مول / لتر من اليوريا ، و 1.7 مول / لتر من ثنائي كبريتات الصوديوم و 4.9 ملي مول / لتر هيدروكينون. تعرض المحلول إلى 15 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وحضانة عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة [19]. تمت تنقية الحمض النووي المعالج بالبيزلفيت باستخدام MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) وتم تضخيمه بواسطة PCR باستخدام KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems، Woburn، MA، USA) و primers حول موقع CpG لمنطقة المحفز D2R . كانت تسلسلات التمهيدي كما يلي: primer forward ، 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′؛ التمهيدي العكسي ، 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. بعد ذلك ، تم إضافة سلاسل المحولات وتنظيفها باستخدام Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter، Brea، CA، USA). ثم تم تجميع العينات وتحميلها على GS جونيور (روش التشخيص ، طوكيو ، اليابان) للتسلسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم التعبير عن مستوى المثيلة كنسبة من السيتوزينات الميثيلية في جميع مخلفات السيتوزينات.
فحص نشاط DNMT
تم إجراء اختبار النشاط الأنزيمي DNMT باستخدام EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group، Brooklyn، NY، USA) و EPIgeneous Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan، Chiba، Japan) وفقًا لبروتوكولات الشركة الصانعة.
لتقييم النشاط المثبط لكل مركب على ميثيل الحمض النووي ، وتشكيل Sتم قياس -adenosyl-l-homocysteine (SAH) في وجود كل مركب (20 ميكرو مول / لتر لفحوصات الفحص) ، S-ادينوسيل ميثيونين (SAM ؛ 10 ميكرول / لتر) وركيزة DNMT (4 نانوغرام / ميكرولتر) عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. لتقييم حركية Michaelis-Menten ، تم تحضين DNMT1 (20 ميكرو مول / لتر) باستخدام γ-oryzanol ، SAM (5 ميكرو مول / لتر) والتركيز المشار إليه لـ poly dI-dC عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. تم تحضين DNMT3a (100 ميكرولتر / لتر) و DNMT3b (100 ميكرولتر / لتر) باستخدام γ-oryzanol و SAM (5 ميكرو مول / لتر) والتركيز المشار إليه لـ poly dG · dC عند 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة. تم إجراء الفحوصات بشكل رباعي. تم تحضين البروتين المستخلص (0.75 مجم / مل) باستخدام SAM (5 ميكرو مول / لتر) ، بولي دي دي سي (5 ميكروغرام / مل) ، وبولي دي جي · دي سي (5 ميكروغرام / مل) عند 40 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة ، و تم قياس تشكيل SAH.
اختبار مستقبلات Est مستقبلات هرمون الاستروجين
تم تقييم النشاط العدائي المحتمل لـ γ-oryzanol على المستقبل المرتبط بالإستروجين- γ (ERRγ) باستخدام نظام اختبار مراسل جاما لمستقبلات هرمون الاستروجين البشري (INDIGO Bioscience ، State College ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار ، تعرضت خلايا مراسل الثدييات غير البشرية التي تعبر بشكل أساسي عن ERRγ للتركيزات المشار إليها لكل مركب لمدة 24 ساعة في ثلاث نسخ.
النشاف الغربي
تم تنفيذ هذا كما هو موضح سابقًا [20] مع الأجسام المضادة ضد D2R (1: 500 ، أرنب) ، ناقل الدوبامين (DAT ؛ 1: 500 ، أرنب) ، هيدروكسيلاز التيروزين (TH ؛ 1: 1000 ، أرنب) (AB5084P ، AB1591P و AB152 ، Merck Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، محول إشارة ومنشط النسخ 3α (STAT3α ؛ 1: 1000 ، أرنب) ، DNMT1 (1: 1000 ، أرنب) ، DNMT3a (1: 1000 ، أرنب) (رقم 8768 ، 5032 و 3598 ؛ تقنية تشوير الخلية ، طوكيو ، اليابان) ، DNMT3b (1 ميكروغرام / مل ، أرنب) ، ERRγ (1: 1000 ، أرنب) و β-actin (1: 10,000 ، فأر) (ab16049 ، ab128930 و ab6276 ؛ Abcam ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية).
الكم في الوقت الحقيقي PCR
تم فحص التعبير الجيني كما هو موضح سابقا [14]. تم تطبيع مستويات مرنا ل Rn18s (18S rRNA). يتم تلخيص مجموعات التمهيدي المستخدمة لتحليل PCR الكمي في الوقت الحقيقي في ESM Table 2.
تحليل احصائي
يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SEM. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه والقياسات المتكررة ANOVA متبوعة باختبارات مقارنة متعددة (طريقة Bonferroni-Dunn) حيثما أمكن ذلك. الطلاب t تم استخدام اختبار لتحليل الاختلافات بين مجموعتين. واعتبرت الاختلافات كبيرة في p <0.05.
النتائج
إن التثبيط الدوائي لـ DNMTs بواسطة 5-aza-dC يضعف تفضيل الدهون الغذائية في الفئران
في الفئران التي غذيت HFD ، تم زيادة ميثيل الحمض النووي في منطقة المحفز من D2R في المخطط بشكل ملحوظ مقارنة مع الفئران تغذية نظام غذائي تشاو (الشكل. (Fig.1a) .1ا). من ناحية أخرى ، كان مثيلة الحمض النووي الوطاء في منطقة المروج من D2R على ما يبدو أعلى من ذلك في المخطط تحت نظام غذائي تشاو (p <0.01) (الشكل. (Fig.1a، 1a، f) ولم يتم تعديله بواسطة HFD (الشكل. (Fig.1f) .1F). في الفئران التي غذيت HFD ، تم تطبيع مثيلة الحمض النووي في منطقة المحفز من D2R في المخطط المخطط من خلال العلاج مع 5-aza-dC ، مثبط قوي DNMT (الشكل. (Fig.1a) .1ا). في المقابل ، لم يتم تغيير مثيلة الحمض النووي في منطقة المحفز من D2R في منطقة ما تحت المهاد بشكل كبير عن طريق العلاج مع 5-aza-dC (الشكل. (Fig.1f) .1F). في مخطط فئران ذكور عمرها 20 أسبوعًا تم تغذيتها على HFD لمدة 12 أسبوعًا ، انخفضت مستويات الرنا المرسال والبروتين بشكل كبير (الشكل 2 ب). (Fig.1b، 1ب ، ك ، ل). في المقابل ، ومستويات من مستقبلات الدوبامين D1 (D1Rs ، المشفرة بواسطة Drd1) ، والتي تعمل بطريقة معاكسة ل D2R على adenylyl cyclase و cAMP-mediated interracellular signaling ، لم تتغير (الشكل. (Fig.1c) .1ج). علاوة على ذلك ، لم يكن هناك أي تغيير في مستويات الجزيئات الأخرى ذات الصلة بإشارات D2R ، مثل TH و DAT على مستوى mRNA و / أو مستوى البروتين (الشكل. (Fig.1d، 1د ، ه ، ك ، م). من ناحية أخرى ، لوحظ عدم وجود تغييرات واضحة في منطقة ما تحت المهاد ، بما في ذلك ل D2R (الشكل. (Fig.1g م) .1ز-م). والجدير بالذكر أن مستويات البروتين D2R و TH في الوطاء كانت أقل بكثير من تلك الموجودة في المخطط (الشكل. (Fig.1l، 1ل ، م)، ربما يعكس الأهمية النسبية لإشارات مستقبلات الدوبامين في نظام مكافأة الدماغ مقارنة مع المهاد.
لفحص ما إذا كان ميثيل الحمض النووي في منطقة المحفز من D2R من شأنه أن يغير تفضيل الدهون الغذائية ، تم تحليل سلوك التغذية من الفئران 5-aza-dC المعاملة. كما هو متوقع ، زاد 5-aza-dC بشكل كبير من مستويات الحمض الريبي النووي الريبوزي (mRNA) والبروتين لـ D2R في مخطط الفئران التي تغذيها HFD (الشكل. (Fig.1b، 1ب ، ك ، ل). من ناحية أخرى ، لم يكن هناك أي تأثير على مستويات Drd1, Th و Slc6a3 (ترميز DAT) في المخطط ، أو على مستويات Drd2, Drd1، Th و Slc6a3 في منطقة ما تحت المهاد (الشكل. (Fig.1c الإلكترونية، 1c –e، g –m). في حين فضلت الفئران المعالجة على مركبات HFD ، فإن تفضيل HFD انخفض بشكل كبير في الفئران المعالجة بـ 5-aza-dC (88٪ من قيم الفئران المعالجة بالمركبة) (الشكل. (Fig.1n) .1ن). وبالتالي ، أدى العلاج باستخدام 5-aza-dC إلى خفض الكسب في وزن الجسم (الشكل. (Fig.11س).
or-oryzanol يقلل من مستويات DNMTs في المخطط من الفئران التي تغذيها HFD
كما ذكرنا سابقا14] ، عن طريق الفم من γ-oryzanol إلى الفئران الذكور عن طريق ضخ الموهن بشكل ملحوظ على تفضيل HFD (93 ٪ من قيم الفئران التي عولجت مركبة) (الشكل. (Fig.2a)، 2أ) ، مما يؤدي إلى توهين واضح من زيادة وزن الجسم (الشكل. (Fig.2b) .2ب). لذلك ، اكتشفنا التأثير المحتمل لـ γ-oryzanol على التعديل اللاجيني لـ D2R في المخطط.
في الثدييات ، هناك ثلاثة DNMTs رئيسية - DNMT1 ، 3a و 3b. وظائف DNMT1 للحفاظ على ميثيلة الحمض النووي ، في حين تلعب DNMT3a و 3b دورًا في تسهيل مثيلة الحمض النووي دي نوفو [21]. لاستكشاف التأثير المحتمل لـ γ-oryzanol على DNMTs في الجسم الحي ، قمنا بتقييم مستويات DNMTs في أدمغة الفئران التي تغذيها HFD. على الرغم من أن HFD في حد ذاته لم يكن له أي تأثير على mRNA ومستويات البروتين في DNMTs سواء في المخطط أو المهاد ، فإن المكملات مع γ-oryzanol انخفضت بشكل ملحوظ مستويات DNMTs في المخطط ولكن ليس في الوطاء (الشكل. (Fig.2c الإلكترونية، 2c –e، g – i، k – n). هذه البيانات تثير احتمال أن γ-oryzanol قد ينظم مستويات DNMTs بطريقة محددة المخطط. بطريقة مماثلة ، خفضت 5-aza-dC بشكل كبير مستويات mRNA من DNMT3a و 3b بشكل تفضيلي في المخطط المخطط (ESM Fig. 1ميلادي).
على أساس دراسة سابقة تبين أن مستوى mRNA من DNMT1 تم تنظيمه بشكل إيجابي ، جزئيا على الأقل ، بالمستقبل النووي ERRγ [22] ، درسنا التأثير المحتمل ل γ-oryzanol على نشاط ERRγ. في خلايا الثدييات غير البشرية التي تعبر بشكل فعال عن ERRγ النشط ، 4-hydroxy tamoxifen ، وهو ناهض عكسي قوي من ERRγ ، انخفض بشكل ملحوظ نشاط ERRγ. من ملاحظة ، انخفض γ-oryzanol جزئيا نشاط ERRγ (وهو ما يقرب من تخفيض 40 ٪ من القيمة الفطرية) (الشكل. (Fig.3a) .3ا). الأهم من ذلك ، تم التعبير عن ERRγ بشكل كبير في المخطط ولكن ليس في الوطاء (الشكل. (Fig.3b-د) .3ب-د). على عكس الوضع بالنسبة للمخطط المخطط ، أدى γ-oryzanol بشكل ملحوظ إلى زيادة مستويات البروتين في DNMT1 فقط في منطقة ما تحت المهاد (الشكل. (Fig.2k، 2ك ، ل). يمكن تفسير هذه النتائج ، على الأقل جزئيًا ، من خلال اكتشافنا أن STAT3α ، منظم إيجابي لمستوى DNMT1 [23] ، تم التعبير عنه بوفرة في الوطاء ولكن ليس في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.33ه-ز).
لمزيد من تقييم تأثير γ-oryzanol على نشاط DNMTs في الجسم الحي ، تم تقييم تكوين SAH ، وهو منتج ثانوي من مثيلة الحمض النووي وكذلك مثبط قوي من DNMTs ، في الفئران المعالجة or-oryzanol تغذية HFD. لم تكن هناك تغييرات كبيرة في تشكيل SAH في المخطط أو الوطاء بين الفئران التي تغذت على الهيدروفلوروكربون والفاليت. (Fig.2f، 2و ، ي). بشكل ملحوظ ، انخفض γ-oryzanol بشكل ملحوظ تشكيل SAH في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.2f) 2و) ولكن ليس في الوطاء (الشكل. (Fig.2j)، 2ي) ، مما يوحي بأن γ-oryzanol قد يقمع نشاط الـ DNMTs بطريقة محددة خاصة بالفئران التي تغذيها HFD.
التحليلات الإنزيمية على خصائص تثبيط γ-oryzanol لـ DNMTs في المختبر
قمنا بعد ذلك بتقييم تأثير γ-oryzanol على نشاط DNMTs في المختبر. تم تقييم التأثيرات المثبطة لـ γ-oryzanol ، وحامض الفيروليك ، و 5-aza-dC ، و haloperidol (ممثل D2R) ، و quinpirole (ناهض D2R ممثل) و SAH ضد DNMTs. وكتحكم إيجابي ، فإن SAH خففت بشدة من أنشطة DNMTs بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل. (Fig.4a-و) .4على بعد و). كما هو متوقع ، لم يظهر هالوبيريدول و quinpirole أي تأثير على أنشطة DNMTs (ESM Fig. 2). بشكل ملحوظ ، مثبط γ-oryzanol بشكل ملحوظ أنشطة DNMT1 (IC50 = 3.2 ميكرولتر / لتر) ، 3 أ (IC50 = 22.3 ميكرولتر / لتر) و 3 ب (أقصى تثبيط 57٪) (الشكل. (Fig.4d-و) .4د-و). في المقابل ، كان النشاط المثبط لحمض الفيروليك ، وهو مستقلب γ-oryzanol ، أقل بكثير من γ-oryzanol (الشكل. (Fig.44د-و).
نحن أيضا التحقيق في خصائص المثبطة γ-oryzanol على DNMTs. تم قياس تشكيل SAH لتقييم النشاط التثبيطي γ-oryzanol على DNMTs في المختبر. تشير البيانات حول تشكيل SAH خلال ميثيل الحمض النووي بوساطة DNMT إلى وجود نمط قابل للتشبع من حركيات Michaelis – Menten لكل من وجود وغياب γ-oryzanol (الشكل. (Fig.4g-ط) .4ز-ط). في مثيلة الحمض النووي الموصولة بـ DNMT1 ، أظهر تحليل Eadie – Hofstee أن γ-oryzanol لم تظهر أي تأثيرات على V ماكس من تكوين SAH (مركبة ، 597 pmol / min ؛ γ-oryzanol 2 ميكرول / لتر ، 619 pmol / min ؛ γ-oryzanol 20 ميكرول / لتر ، 608 pmol / min) ، بينما يبدو أن γ-oryzanol زاد K m (مركبة ، 0.47 ميكروغرام / مل ؛ γ-oryzanol 2 ميكرولتر / لتر ، 0.67 ميكروغرام / مل ؛ γ-oryzanol 20 ميكروغرام / لتر ، 0.89 ميكروغرام / مل) (الشكل. (Fig.4j) .4ي). هذه النتائج تشير إلى أن or-oryzanol يثبط DNMT1 على الأقل جزئيا بطريقة تنافسية. من ناحية أخرى ، بالنسبة لـ DNMT3a- و 3b-mediated DNA methylation ، فقد انخفضت γ-oryzanol V ماكس تشكيل SAH (DNMT3a: مركبة ، 85.3 pmol / min ؛ γ-oryzanol 2 ميكرول / لتر ، 63.1 بمول / دقيقة ؛ γ-oryzanol 20 ميكرو مول / لتر ، 42.5 pmol / min ؛ DNMT3b: مركبة ، 42.3 pmol / min ؛ γ -oryzanol 2 ميكرول / لتر ؛ 28.0 بمول / دقيقة ، γ-oryzanol 20 ميكرو مول / لتر ، 15.0 بمول / دقيقة) وبالمثل K m لهذا التفاعل (DNMT3a: مركبة ، 0.0086 ميكروغرام / مل ؛ γ-oryzanol 2 ميكرومول / لتر ، 0.0080 ميكروغرام / مل ؛ γ-oryzanol 20 ميكرو مول / لتر ، 0.0058 ميكروغرام / مل ؛ DNMT3b: مركبة ، 0.0122 ميكروغرام / مل ؛ γ- oryzanol 2 ميكرومول / لتر ، 0.0097 ميكروغرام / مل ؛ γ-oryzanol 20 ميكرومول / لتر ، 0.0060 ميكروغرام / مل) (Fig.4k، 4ك ، ل). هذه النتائج تشير إلى أن γ-oryzanol يثبط DNMT3a و 3b على الأقل جزئيا بطريقة غير تنافسية.
γ-oryzanol يزيد من مستويات D2R في المخطط من الفئران التي تغذيها HFD
اختبرنا لاحقًا إمكانية أن يزيد γ-oryzanol من محتوى D2R المخطط من خلال تثبيط DNMTs. في الفئران التي تتغذى فيها HFD ، أدى إعطاء الفم or-oryzanol إلى خفض كبير في نسبة مثيلة الحمض النووي في منطقة المحفز من D2Rs (الشكل. (Fig.5a)، 5أ) ، في حين أنها لم تفعل ذلك في منطقة ما تحت المهاد (الشكل. (Fig.5f) .5F). وفقا لهذه النتائج ، تم زيادة المتبادلة مرنا ومستويات البروتين من D2R (الشكل. (Fig.5b، 5ب ، ز ، ك ، ل). مماثلة للبيانات حول العلاج مع 5-aza-dC (الشكل. (Fig.1)، 1) ، لم تكن هناك آثار واضحة على مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين Drd1, Th و Slc6a3 (DAT) في المخطط ، وليس له آثار على مستويات Drd1, Th و Slc6a3 في منطقة ما تحت المهاد (الشكل. (Fig.5c الإلكترونية، 5c – e، h – k، m).
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن مستويات D2R و DNMT1 ينظمها الإجهاد ER والالتهاب جزئيا على الأقل عبر NF-κB [17, 24, 25]. لذلك قمنا بفحص مستويات الجينات المرتبطة بالإجهاد ER والالتهاب. كما هو موضح سابقا26] ، زاد HFD التعبير عن الجينات التي ترمز بـ TNF-α (Tnfa) ، بروتين جزيء كيميائي أحادي - 1 (MCP-1) (Ccl2) ، C / EBP بروتين مثلي (ختم) ، ER-localized DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) وشكل مفصول من بروتين ربط X-box 1 (Xbp1s) في الوطاء ولكن ليس في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.6) .6). ومن الجدير بالذكر أن مكملات HFD مع γ-oryzanol قللت بشكل ملحوظ من التعبير المعزز لـ Ccl2, ختم, Dnajb9 و Xbp1s حصرا في منطقة ما تحت المهاد ولكن ليس في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.66).
مناقشة
النتائج الرئيسية في هذه الدراسة هي أن γ-oryzanol يعمل كمثبط قوي لـ DNMT في مخطط الفئران ، مما يخفف ، على الأقل جزئيا ، من تفضيل HFD من خلال التعديل اللاجيني للمخطط D2R. في المخطط من الفئران التي تغذت على HFD ، انخفضت مستويات D2R بشكل ملحوظ ، في حين لم تتغير تلك D1R ، TH و DAT (الشكل. (Fig.1b الإلكترونية، 1b – e، k – m). تتوافق هذه المعطيات مع الفكرة القائلة بأن عدم انتظام الجين D2R يؤدي دورا حاسما في إدراك مكافأة الطعام عندما يكون على HFD ، مما يؤدي إلى فرط استهلاك مفرط لـ HFD في الحيوانات السمينة [3]. في هذه الدراسة ، وعلاج الفئران التي تغذت HFD مع 5-aza-DC زيادة كبيرة في مستويات من مخطط D2R (الشكل. (Fig.1b، 1ب ، ك ، ل) ربما من خلال انخفاض في مستوى ميثيل الحمض النووي في منطقة المحفز من D2R (الشكل. (Fig.1a)، 1أ) ، وبالتالي تضعف تفضيل الدهون الغذائية (الشكل. (Fig.1n) .1ن). هذه النتيجة تدعم أيضا دورا حاسما من D2Rs مخطط الجسم في إدراك مكافأة الغذاء عندما يكون على HFD.
أظهرت مقايسةنا في المختبر أن النشاط المثبط لـ γ-oryzanol ضد DNMTs كان على ما يبدو أقوى من حمض المستقلب ferulic acid (الشكل. (Fig.4d-و)، 4d – f) ، مما يشير إلى أهمية البنية الكاملة لـ or-oryzanol بسبب عملها المثبط على DNMTs. تشير الفحوصات التي أجريناها في الفئران التي تغذيناها HFD إلى أنه بعد تناوله عن طريق الفم ، يصل γ-oryzanol إلى الدماغ كهيكل كامل ويقلل من مستويات وأنشطة DNMTs بشكل تفضيلي في المخطط المخطط ، مع ما يترتب على ذلك من انخفاض في ميثيل الحمض النووي في منطقة المحفز D2R في المخطط. علاوة على ذلك ، أثبتت دراساتنا في المختبر أن γ-oryzanol يعمل كمضاد جزئي ضد ERRγ ، والذي يعمل بشكل أساسي كمنظم إيجابي لإنتاج DNMT1 [22] ، وبالتالي انخفض نشاط DNMT1 (الشكل. (Fig.3a) .3ا). من ملاحظة ، تم التعبير عن ERRγ بشكل كبير في المخطط ولكن ليس في الوطاء في الفئران (الشكل. (Fig.3b) .3ب). تشير هذه البيانات إلى أن γ-oryzanol لديه القدرة على تقليل مستوى mRNA من DNMT1 ، على الأقل جزئيًا ، من خلال تثبيط ERRγ. على النقيض من المخطط ، لم يظهر γ-oryzanol أي تأثير على مستوى D2R في منطقة ما تحت المهاد من الفئران التي تغذيها HFD (الشكل. (Fig.5g، 5ز ، ك ، ل).
من ناحية أخرى ، أظهرنا أن γ-oryzanol زاد بشكل ملحوظ من مستويات DNMT1 في منطقة ما تحت المهاد ولكن ليس في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.2k، 2ك ، ل). وقد تبين أن STAT3 يزيد من محتوى DNMT1 في خلايا الأورام اللمفاوية التائية [23]. جدير بالذكر ، لقد أوضحنا سابقًا أن or-oryzanol يزيد بشكل كبير من فسفرة STAT3 التي يسببها لبتن في منطقة ما تحت المهاد من الفئران التي تغذيها HFD [14]. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه تم التعبير عن STAT3α بشكل كبير في منطقة ما تحت المهاد ولكن ليس في المخطط في الفئران (الشكل. (Fig.3e-ز) .3ه-ز). تجذبنا هذه البيانات إلى التكهن بأن الفرق الظاهر في تأثير γ-oryzanol على مستويات DNMT1 بين الوطاء والمخطط المخطط يمكن أن يعزى ، جزئيا على الأقل ، إلى المحتوى المحدد للمنطقة من STAT3α و ERRγ في دماغ الفئران ( تين. (Fig.3b-ز) .3ب-ز). بشكل جماعي ، يبدو أن هناك نمطًا تبادليًا للتعبير عن ERRγ و STAT3α بين المخطط و hypothalamus في الفئران. وبناءً على نتائجنا ، من المعقول أن نتوقع أنه في المخطط ، حيث يكون إنتاج ERRγ وافراً ، قد يخفض or-oryzanol بشكل تفضيلي مستوى mRNA ونشاط إنزيم DNMT1 كمنظم سلبي لـ ERRγ. على النقيض من ذلك ، في المهاد ، حيث يكون إنتاج STAT3α مهيمنًا ، قد يزيد γ-oryzanol من مستويات DNMT1 بشكل تفضيلي.
أظهرت دراسة حديثة أن توهين إشارات D2R المخططة التي يسببها HFD يعطل سلوك التغذية.3] ، مما يشير إلى الأهمية المحتملة لتثبيط DNMTs المخططة لعلاج السمنة. من ناحية أخرى ، أظهرت دراسة سابقة إمكانية أن حالة مثيلة الحمض النووي لجين مستقبلات melanocortin 4 المعبر عنها في نويات ما تحت المهاد محددة يمكن أن تعدل أشكال السمنة عبر الأجيال في الفئران الصفراء القابلة للحياة27]. على الرغم من أن هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات لتوضيح الآليات الأساسية ، فإن هذه الدراسات تشير إلى أهمية مثيلة الحمض النووي للأنسجة ، والجينوم المتسلسل الخاص في الفيزيولوجيا المرضية للسمنة الناجمة عن HFD.
أبلغنا مؤخرًا أن HFD قد رفع مستوى D2R في جزر بنكرياس الفئران [17, 24]. من المحتمل أن تتم عملية التوسيط هذه ، على الأقل جزئيًا ، عن طريق الإجهاد ER والالتهاب عبر NF-κB ، نظرًا لوجود العديد من عناصر NF-κB-responsive في منطقة المحفز D2R [17, 24]. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة حديثة أن TNF-α و IL-1β يزيدان مستوى ونشاط DNMT1 في الأنسجة الدهنية من الفئران التي تغذيها HFD [25]. الأهم من ذلك ، أظهرت الدراسة الحالية أن HFD يسبب الإجهاد ER والالتهاب تفضيلية في الوطاء ولكن ليس في المخطط المخطط (الشكل. (Fig.6) .6). يجب أن تنتظر الآليات المتعمقة لمثبطات الحمض النووي للنسيج ، والمنطقة ، وموقع معين ، و demethylation في نموذجنا التجريبي مزيدًا من البحث.
جنبا إلى جنب مع تقريرنا السابق الذي يوضح أن γ-oryzanol يضعف تفضيل HFD من خلال تنظيم ما تحت المهاد للضغط ER في الفئران14] ، γ-oryzanol يمثل أيضا خاصية فريدة من نوعها لتحسين كل من dysregulation heatonic والتمثيل الغذائي للسلوك التغذية. لأن بعض الأدوية المضادة للبدانة التي تم تطويرها من المعروف أنها تسبب تأثيرات ضائرة بالغة الأهمية8] ، ومن المتوقع اتباع نهج قائم على الغذاء الطبيعي نحو نظام مكافأة الدماغ لعلاج السمنة ومتلازمة السكري بأمان [16]. في هذا النموذج ، γ-oryzanol هو مرشح لمكافحة السمعة واعدة مع خاصية مميزة من كونه المغير اللاجينية.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لـ S. Okamoto (جامعة Ryukyus ، اليابان) لمراجعة المخطوطة. نشكر M. Hirata، H. Kaneshiro، I. Asato and C. Noguchi (University of the Ryukyus، Japan) للمساعدة في مجال السكرتارية.
الاختصارات
| 5-عزة العاصمة | 5-عزة-2'-deoxycytidine |
| D1R | مستقبل دوبامين D1 |
| D2R | مستقبل دوبامين D2 |
| DAT | ناقلة الدوبامين |
| DNMT | الحمض النووي methyltransferase |
| ER | الشبكة الإندوبلازمية |
| ERR | مستقبلات مرتبطة بالاستروجين |
| HFD | حمية عالية الدهون |
| SAH | S-Adenosyl-ل-الحمض الاميني |
| SAM | Sأدينوزيل ميثيونين |
| STAT3α | محول إشارة ومنشط النسخ 3α |
| TH | هيدروكسيلاز التيروزين |
ملاحظة
توافر البيانات
تتوفر مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها و / أو تحليلها خلال الدراسة الحالية من المؤلف المناظر بناءً على طلبات معقولة.
التمويل:
تم دعم هذا العمل جزئياً من خلال برنامج المنح الدراسية من جمعية اليابان لتعزيز العلوم (JSPS ، KAKENHI Grant Numbers 15K19520 و 24591338) ، ومجلس العلوم والتكنولوجيا والابتكار (CSTI) ، برنامج الترويج الاستراتيجي للوزارات عبر الوزارات (SIP) "تقنيات لإنشاء الجيل التالي من الزراعة والغابات ومصايد الأسماك" ، ومؤسسة لوت ، والمؤسسة اليابانية للإنزيمات التطبيقية ، ومنظمة تنمية الطاقة الجديدة والتكنولوجيا الصناعية (NEDO) ، ومشروع تشكيل شبكة العلوم الحياتية (حقل الصيدلانية ) (محافظة أوكيناوا ، اليابان) ومشروع الترويج للتجمعات الطبية في محافظة أوكيناوا باليابان ، إلى جانب منحة من محافظة أوكيناوا للترويج للطب المتقدم (محافظة أوكيناوا ، اليابان).
ازدواجية الفائدة
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد ازدواجية في المصالح مرتبطة بهذه المخطوطة.
بيان المساهمة
تصميم CK و HM البحث. قام CK و TK بإجراء التجارب وتحليل البيانات. ساهمت المعارف التقليدية و CS-O و CT و MT و MM و KA في تفسير البيانات. كتب CK و HM المخطوطة. ساهم جميع المؤلفين في تفسير البيانات. انضم جميع المؤلفين في مراجعة المخطوطة ووافقوا على نسختها النهائية. إن HM هو الضامن لهذا العمل ، وله حق الوصول الكامل إلى جميع البيانات ويتحمل المسؤولية الكاملة عن سلامة البيانات ودقة تحليل البيانات.
الحواشي
مواد تكميلية إلكترونية
تحتوي النسخة الإلكترونية من هذه المقالة (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) على مواد تكميلية لمراجعة الزملاء ولكنها غير متاحة ، وهي متاحة للمستخدمين المعتمدين.
مراجع حسابات
;