Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr؛ 300 (4): R876 – R884.
نشرت على الانترنت 2011 فبراير 9. دوى: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
ملخص
لقد ذكرنا سابقًا أن إعطاء الأنسولين في النواة المقوسة لوط المهاد يقلل من الحافز للسكروز ، والذي يتم تقييمه من خلال مهمة إدارة ذاتية ، في الجرذان. ولأنه لم يتم تقييم نمط تنشيط الجهاز العصبي المركزي (CNS) بالارتباط مع الإدارة الذاتية للسكروز ، فقد قمنا في الدراسة الحالية بقياس التعبير عن c-Fos كمؤشر للتنشيط العصبي. قمنا بتدريب الجرذان على الضغط على الشراب من أجل السكروز ، وفقًا لجدول ثابت (FR) أو جدول نسبة تقدمية (PR) والتعبير المعبر عن immunoreactivity c-Fos في CNS ، مقارنة مع تعبير c-Fos في أدوات التحكم التي تتم معالجتها. لاحظنا تعبيرًا فريدًا عن c-Fos في منطقة ما تحت المهاد الإنسي (النهايات arcuate، paraventricular، retrochiasmatic، dorsomedial، and ventromedial nuclei) بالترافق مع بداية أداء العلاقات العامة والتعبير عن c-Fos في المهاد الوحشي ونواة السرير من stria terminalis بالتعاون مع بداية FR الأداء. تم زيادة تعبير c-Fos في النواة المتكئة لكل من FR والفئران PR. تؤكد دراستنا على أهمية كل من حلقة توازن الطاقة المثلية والدارات الحوفية في أداء مهمة مكافأة الطعام. بالنظر إلى دور الوطاء المتوسط في تنظيم توازن الطاقة ، تقترح دراستنا أن هذه الدائرة قد تساهم في تنظيم المكافآت ضمن السياق الأكبر لاستتباب الطاقة.
وقد تم تحديد دائر الدوبامينات الدنجامي (DA) ، بما في ذلك المنطقة القطبية البطنية (VTA) والإسقاطات إلى المواقع المخطط والقشرية ، على أنها تلعب دوراً حاسماً في الجوانب المحفزة أو المجزية للعديد من فئات أدوية الإساءة (13, 22-24, 26, 48). تشير الأبحاث الحديثة من مختبرنا وآخرون إلى أن هذه الدوائر تلعب دوراً رئيسياً في الجوانب الغذائية أو المكافئة للأغذية. يقترح التفاعل الوظيفي والتشريحي مع الدارات التي تنظم استتباب الطاقة من خلال تقارير عن تعديل المكافأة الغذائية من خلال الحالة التغذوية للحيوانات (10, 14, 16, 43). يتأثر تعديل المكافأة ، بما في ذلك مكافأة الغذاء ، عن طريق الحالة الغذائية أو الأيضية ، بقوة بالإشارات العصبية والغدد الصماء ، بما في ذلك الأنسولين (15) ، ليبتين (11, 18, 21, 30, 32) ، جريلين (35) ، هرمون تركيز الميلانين (MCH) (45) و orexin (5, 7): تم إثبات وجود المستقبلات ، والفعالية البيوكيميائية والخلوية ، والكفاءة في الجسم الحي أو السلوكية لهذه الإشارات في الجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل كبير في السنوات الأخيرة.
وبالمثل ، فقد تبين للدائرة الحوفيّة الموسّعة أنها تلعب دوراً في التغذية ومكافأة الطعام (2, 19, 28). ومع ذلك ، هناك مواقع CNS إضافية المساهمة. جدير بالذكر أن الوطاء الوحشي (LH) معروف منذ فترة طويلة أنه موقع يتوسط التغذية وسلوكيات التحفيز الذاتي (4, 31). تم تحديد الخلايا العصبية Orexinergic ومشارات leptin في LH باعتبارها مهمة للتغذية ومكافأة الطعام (5, 29, 30). لاحظنا مؤخرًا أن الأنسولين الذي يتم إعطاؤه إما إلى البطين الدماغي الثالث أو إلى النواة المقوسة للوتيبالاموس (ARC) يمكن أن يقلل من تناول السكروز الذاتي ، لكن إعطاء الأنسولين في الـ VTA أو النواة المتكئة لم يكن له أي تأثير على نموذج المكافأة هذا (15). وهكذا ، يبدو أن العديد من مواقع الوطيدين قد تلعب دوراً هاماً في البحث عن الطعام وحيازته ، وبالتوافق مع هذا ، يمكن للمرء أن يفترض أن مناطق الوطوط تنشط إلى حد كبير بالارتباط مع الإدارة الذاتية للغذاء. للبدء في اختبار هذه الفرضية ، قمنا بتعيين تعبير c-Fos في CNS للفئران المدربة في نموذج الإدارة الذاتية للسكروز ، بعد التدريب على نسب ثابتة (FR) ، أو بعد التدريب التدريجي (PR) ، وهي مهمة أكثر صرامة لتقييم الدافع (20).
المواد والطرق
المواضيع.
كان المشاركون في الدراسة هم ذكور جرذان ألبينو (325-425 جم) من سيمونسن (جيلروي ، كاليفورنيا). تم الحفاظ على الفئران على الطعام بالشهرة. تم الحفاظ عليها في دورة مظلمة 12: 12 ساعة مع أضواء مضاءة في الساعة 6 صباحًا وتم تدريبها واختبارها بين الساعة 7 صباحًا وظهرًا ، في حالة ما بعد الأكل وما بعد الامتصاص. اتبعت جميع الإجراءات التي تم إجراؤها على الفئران إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الفرعية لرعاية الحيوان والاستخدام التابعة للجنة البحث والتطوير في نظام الرعاية الصحية VA Puget Sound.
السكروز الإدارة الذاتية.
استندت الإجراءات على منهجيتنا المنشورة (15) ونفذت على الفئران التي تغذيها. تضمنت التجربة ثلاث مراحل: autoshaping لبدء التدريب ، والتدريب FR ، والنسب التدريجي (PR) باستخدام خوارزمية العلاقات العامة ريتشاردسون وروبرتس (38). تتطلب خوارزمية العلاقات العامة 1 و 2 و 4 و 6 و 9 و 12 و 16 و 20 و 28 و 36 و 48 و 63 و 83 و 110 و 145 و 191 و 251 و 331 و 437 و 575 و 759 و 999 و 999 ( الخ) رافعة للضغط على النجاحات تسليم مكافأة في غضون دورة (38). تم تدريب الفئران على إعطاء السكريات 5٪ (مكافأة 0.5 ml) في وعاء ذاتي السوائل. كانت صناديق التشغيل ، التي يتحكم فيها نظام Med Associates (جورجيا ، VT) ، تحتوي على ذراعين ، ولكن رافعة واحدة فقط (ذراع نشط قابل للسحب) تعمل على تنشيط مضخة التسريب. تم تسجيل الضغط على الرافعة الأخرى (ذراع ثابت غير نشط) أيضًا. كما لاحظنا سابقًا ، كان عدد المطابع على الذراع الخاملة منخفضًا جدًا (أقل من ضغط / جلسة 10). تم تسليم حل السكروز إلى وعاء قطرة السائل للاستهلاك عن طريق الفم (ميد أسوشيتس ، سانت ألبانز ، VT). تم إجراء التدريب الأولي خلال جلسات 1-h ضمن جدول التعزيز المستمر (FR1: تم تعزيز كل رافعة رافعة). بدأت كل جلسة بإدخال ذراع نشط وإضاءة ضوء البيت الأبيض الذي بقي في الجلسة بأكملها. نغمة 5-s (2900 Hz ، 20 dB فوق الخلفية) والضوء (ضوء 7.5 W الأبيض فوق الذراع النشط) يرافق كل مركب تسليم مكافأة ، مع انتهاء 20-s بداية مع تسليم السكروز. تم إجراء تدريب FR خلال أيام 10 ؛ يتم تحقيق استجابة مستقرة من خلال الدورة الخامسة. تم تنفيذ التدريب على العلاقات العامة لأقصى حد ممكن 3 ح / يوم لمدة 10 أيام. انتهت جلسات PR بعد 30 دقيقة من أي رافعة نشطة اضغط على الاستجابة ، وعند هذه النقطة تم إيقاف ضوء المنزل تلقائيًا وتم سحب الذراع النشطة ؛ تم أخذ الفئران من الغرف وعادوا إلى أقفاصهم المنزلية. "توقف الوقت" ذكرت في الجدول 2 يمثل الوقت الذي تم فيه إيقاف تشغيل النظام ؛ لذلك ، فإن آخر رافعة ذراع نشطة قد حدثت 30 دقيقة قبل وقت التوقف. البيانات السلوكية (الجدول 2) تمثل متوسطات جلسات 6-10 للتدريب FR ، و جلسات 1-9 للتدريب العلاقات العامة. تم أخذ الفئران التي تسيطر عليها السيطرة من غرفة السكن ووضعها في غرفة نظيفة نظيفة مع ضوء المنزل على ل 60 دقيقة ، داخل غرفة العمليات ، لمحاكاة التعامل مع وتجارب الغرفة من الفئران التي تديرها الفئران السكروز. لم يعطوا أي شيء للأكل أو الشرب أثناء وجودهم في صناديق التشغيل ، ولم يكن لديهم إمكانية الوصول إلى أذرع.
في اليوم الأخير ، تم وضع الفئران في الغرف وفقًا لأيام التدريب وتم الاحتفاظ بها في الغرف لمدة 90 دقيقة ، وبعد ذلك تمت إزالتها للتخدير والتروية والكيمياء المناعية اللاحقة. تم إحضار الفئران الضابطة أيضًا إلى غرفة الإجراءات وتم الاحتفاظ بها في غرفة فعالة نظيفة ، وفقًا لأيام التدريب ، لمدة 90 دقيقة ، وبعد ذلك تم تخديرها وإرواءها. مباشرة بعد الجلسة الأخيرة التي استمرت 90 دقيقة ، تم تخدير الفئران بعمق باستنشاق أيزوفلوران وإعطائها 0.9٪ كلوريد الصوديوم متبوعًا بمحلول بارافورمالدهيد بارد 4٪. استند توقيت التخدير والقتل الرحيم إلى الدورة الزمنية المعروفة لتعبير الذروة لبروتين c-Fos عند 90-120 دقيقة بعد الحدث. وبالتالي ، فإن تعبير c-Fos سيعكس تنشيط الجهاز العصبي المركزي في بداية المهمة السلوكية ، بدلاً من أن يكون نتيجة تجربة الحيوانات للمهمة وتناول السكروز. تمت إزالة الأدمغة وتثبيتها في لامتصاص العرق لعدة أيام. بعد ذلك ، تم وضعهم لاحقًا في 20 ٪ سكروز- PBS ، وبعد ذلك تم وضعهم في 30 ٪ محلول سكروز- PBS. تم تقسيم الأدمغة على ناظم ناظم (لايكا CM 3050S ناظم البرد) للكيمياء المناعية.
ج-فوس المناعية والكمي.
استخدمنا منهجيتنا الراسخة لتحديد كم البروتين C-Fos المناعي في أقسام الدماغ (12). تم إجراء الشاشة النوعية المبدئية للمخ بالكامل للحصول على تعبير c-Fos. تم غسل الأقسام 12-μm كاملة الإكليل على التوالي 3 مرات في PBS (أوكسويد ، هامبشاير ، المملكة المتحدة). تم حظر الأقسام بعد ذلك لـ 1 h عند درجة حرارة الغرفة في PBS التي تحتوي على 5٪ من الماعز العادي أو مصل الحمير. تم غسل الأقسام بعد ذلك عدة مرات في PBS وحضنت طوال الليل في 4 ° C في حلول الأجسام المضادة الأولية التي تتكون في PBS. تم غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وحضنت بعد ذلك في الظلام في درجة حرارة الغرفة في حل الأجسام المضادة الثانوية تتكون في برنامج تلفزيوني ل 1 ح. تم غسل الأقسام بعد ذلك مرة أخرى في PBS وتم تركيبها وتعليقها في وسط تصاعد مجموعة Vectashield (Vector Laboratories، Burlingame، CA). تم الحصول على صور رقمية للأقسام باستخدام مجهر نيكون Eclipse E-800 الضوئي المتصل بكاميرا Optiphot وباستخدام برنامج Image Pro Plus (Media Cybernetics، Silver Spring، MD).
في وقت لاحق ، ركزنا على عدد محدود من المجالات التي تظهر اختلافا واضحا بين الشروط ، من أجل القياس الكمي ، وللنمط الظاهري للخلايا العصبية. على وجه التحديد ، ركزنا على النواة المتكئة النواة والقشرة (NAc) ؛ نواة السرير الأمامي والخلفي لسطح المحطة الطرفية (aBNST، pBNST)؛ المناطق الوعائية الطورية [النواة البطئية (VMH) ، المهاد الظهري الظهري (DMH) ، النواة البارافينية (PVN) ، المنطقة الرجعية (RCh) ، و ARC] ؛ المهاد الجانبي (LH) ، بما في ذلك المناطق الظهرية والباطنية ومنطقة بيرفولك (بي إف إف) ؛ VTA. جذر الدماغ [أدنى مستوى للزيتون ، تحت اللسان (nXII) نواة الجهاز الانفرادي ، نواة شبكية جانبية ، و C1 / A1 adrenaline / noradrenaline nuclei]. تم تقييم أقسام 12-μm المتوافقة مع نظام أطلس لتعبير c-Fos وتحديد الكميات في أقسام ومناطق متطابقة ، استنادًا إلى أطلس Paxinos و Watson (34). يرجى الاطلاع الجدول 1 لإحداثيات التجسيمي محددة. كان التركيز الأساسي للمقايسات هو مقارنة كل مهمة سلوكية مع التحكم الخاص بها (PR مقابل PRC ؛ FR مقابل FRC). لتحسين الاختلافات المحتملة على أساس السلوك مقابل ظروف التحكم ، تم اختيار ذروة الأداء من PR و FR المجموعات للتحليل. وهكذا تم تحليل 4 / 12 PR و 3 / 12 FR الجرذان: هذه الجرذان كان لها رقم ضغط فعال للذراع (نقطة النهاية السلوكية الأساسية) التي كانت أكبر من الانحراف المعياري الواحد فوق المتوسط للمجموعة السلوكية الخاصة بكل منها. كما تم تحليل شريحة فرعية من فئران التحكم (5 PRC و 3 FRC rats ، الموجودة في غرفة العمليات في نفس الوقت مثل الجرذان FR أو PR). تم أخذ مجموعة إضافية من الجرذان الثلاثة من خلال إجراء FR ("FRext") لتقليد المدة المضافة لإجراءات العلاقات العامة (أي لمدة إجمالي أيام 20 ، حيث تؤخذ الجرذان PR من خلال FR ثم PR) لتقييم ما إذا كانت كانت الفروق بين FR والعلاقات العامة بسبب المهمة السلوكية أو مدة الإجراء. لم يتم تحليل العقول FRext وفحصها بشكل منهجي ، ولكن تم اختبارها مناطق محددة من الاهتمام مع المجموعات الأربع الأخرى ، للسماح الكميات المقارنة ، كما هو محدد على وجه التحديد في النتائج.
للتقييم (عند تكبير 40 ×) ، تم اختيار المناطق المطابقة للأطلس. تم استخدام برنامج ImagePro Plus (Media Cybernetics) لالتقاط صورة للمنطقة المطلوبة. تم تحديد منطقة للعد ، وتم تحديد حد لتعداد الخلايا الإيجابية. تم استخدام المنطقة المتطابقة والخلفية (العتبة) لأقسام من المجموعات التجريبية المعنية ، وتم تنفيذ عدد البرامج من الخلايا الإيجابية (الكمي) في نفس الجلسة لجميع المجموعات التجريبية ، لمنع التغييرات بين الدورات في إعداد الخلفية. للتحليل الإحصائي ، تم أخذ التعداد من الفئران الفردية فقط إذا كانت المقاطع المقابلة أو كاملة من خلال كل منطقة (على النحو المحدد في الجدول 1) كانت متاحة؛ لم يتم أخذ البيانات الخاصة بمنطقة معينة من الجرذ إذا كان هناك تمثيل ثنائي غير مكتمل لهذه المنطقة.
التحليل المناعي المزدوج التسمية المسمى.
تم أخذ أقسام الدماغ من الفئران التي تم فيها قياس كمية c-Fos ، من أجل الكيمياء المناعية المزدوجة المسمى. نظرًا لأننا لم نرغب في إزعاج الأداء السلوكي للحيوانات ، لم يتم معالجتها مسبقًا بالكولشيسين من أجل تحسين تصور النواقل العصبية الببتيدية. لذلك ، كان تصور الأنماط الظاهرية العصبية التي يتم تنشيطها بالاشتراك مع مهمة الإدارة الذاتية محدودًا. ومع ذلك ، لبدء تقييم الأنماط الظاهرية للخلايا العصبية المنشطة في عدد من مواقع الجهاز العصبي المركزي ، تم التقاط الصور الرقمية (التي تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم أعلاه) عند تكبير 20 × أو 40 × أو 60 × (كما هو موضح في أساطير الشكل) . كان إجراء التلوين المزدوج لغلوتامات ديكاربوكسيلاز (GAD) ، وتيروزين هيدروكسيلاز (TH) ، و CRF ، و Neuropeptide Y (NPY) ، والببتيد المرتبط بـ Agouti (AgRP) ، و tryptophan hydroxylase ، مشابهًا لمقايسة c-Fos-immunoreactivity على الخاصة ، باستثناء أنه تم استخدام خليط من c-Fos-Ab وأحد الأجسام المضادة الأولية الأخرى للحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية ؛ وبالمثل ، كان كلا الأجسام المضادة الثانوية في نفس المحلول واحتضانها لمدة ساعة واحدة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة. تم استخدام 1 دقيقة 20٪ غسيل إيثانول قبل خطوة الحجب لمقايسة orexin. تم إجراء فحوصات التحسين الأولية لتحديد التخفيف المناسب للأجسام المضادة الأولية. كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هي مضاد الأرانب c-Fos (50: 1) (sc-500) والفأر المضاد لـ c-Fos (52: 1) (كلاهما من سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا) ؛ الفأر المضاد لـ GAD (800: 1) ، الفأر المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز (1,000: 1) ، وهيدروكسيلاز الأغنام المضاد للتربتوفان (كلها من Chemicon ، Temecula ، CA) ؛ أرنب مضاد لـ CRF (500: 1) (هدية من الدكتور ويلي فالي ، معهد سالك ، كاليفورنيا) ؛ أرنب مضاد لـ NPY (500: 1) ، أرنب مضاد لـ AGRP (1,000: 1) ، وماعز مضاد للأوركسين A (1,000: 1) كلها من Phoenix Pharmaceutical (St. كانت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة عبارة عن ماعز مترافق مع Cy5,000 مضاد للأرانب أو مضاد للفأر (Jackson Immunoresearch ؛ West Grove ، PA) ، Alexa Fluor 3 ماعز مضاد للفأر أو مضاد للأرنب أو حمار مضاد IgG (مجسات جزيئية ، يوجين ، أو) ؛ تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الثانوية عند 488: 1. تم اختبار المناعة المزدوجة c-Fos / MCH بشكل متسلسل ؛ أولاً ، من أجل MCH (500: 1 جسم مضاد أولي ، ميليبور) مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب من Alexa-2,500-goat (488: 1). تم إعادة غلق الشرائح باستخدام مصل ماعز طبيعي بنسبة 500٪ وتم صبغها لمضاد c-Fos (5: 1) ومضاد الأرنب cy500-goat كجسم مضاد ثانوي. تم استخدام 3 دقيقة 20٪ غسيل إيثانول قبل خطوة الحجب لمقايسة MCH.
تحاليل احصائية.
يتم تقديم بيانات المجموعة كوسائل ± SE في النص والجداول والأرقام. يتم تعريف أهمية كما P ≤ 0.05. يتم إجراء مقارنات إحصائية بين المجموعات التجريبية (FR مقابل PR) أو بين المجموعات التجريبية والضوابط المقابلة (العلاقات العامة مقابل جمهورية الصين الشعبية ؛ FR مقابل FRC) باستخدام الطالب غير المزاوج t-اختبار. تم حساب معاملات ارتباط بيرسون بين مكابس الرافعة النشطة وتعبير c-Fos في مناطق الدماغ المختلفة ، بالإضافة إلى ارتباط تعبير c-Fos بين مناطق الدماغ المختلفة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، باستخدام StatPlus: برنامج التحليل الإحصائي mac LE لإصدار Mac OS 2009 بواسطة AnalystSoft. اختبرنا الارتباطات الخطية (بيرسون R إحصائية) بين تعبير c-Fos في مناطق CNS مختلفة. فحصنا أيضًا الارتباطات بين تعبير c-Fos في مختلف مناطق وسلوك CNS المنشط. تم استخدام بيانات FR و PR من الفئران ، والتي تم إجراء الكميات بها c-Fos ، لهذه الارتباطات.
النتائج
ج-فوس الكميات.
كما لاحظنا سابقًا ، كان عدد مكابس الرافعة الفعالة أكبر بشكل ملحوظ لأداء PR مقابل.الجدول 2) ، وكان عدد مكافآت السكروز أكبر خلال أداء FR. كان طول الجلسة للجرذان PR حوالي 90 دقيقة (وقت التوقف - 30). الجدول 3 تسرد c-Fos تعداد الخلايا المناعية في جميع مناطق الجهاز العصبي المركزي حيث تم تنفيذ الكميات. يتم تلخيص نمط تعبير c-Fos للجرذان FR و PR في التين 1. كان هناك تفعيل كبير من الهايبالوتوس الإنسي (MHطفل، مركب من ARC ، PVN ، RCh ، DMH ، و VMH) للفئران التي تعمل في الضغط على الرافعة PR للسكروز ، ولكن لا يوجد تنشيط عام في الفئران التي تشارك في رافعة FR الضغط لسكروز ، مقارنة مع الضوابط المعنية. في داخل المهاد الإنسي من الجرذان PR ، حدث هذا التنشيط في PVN و ARC و VMH (التين 2). ارتبط ضغط ذراع FR ، ولكن ليس بالضغط على PR ، مع التنشيط الكبير داخل LH (يعتمد بشكل أساسي على التنشيط داخل المنطقة المحيطة به). كانت كل من ضغط ذراع نشط وتعبير c-Fos المهاد مقارنة بين المجموعتين FRext و FR (MHطفلو 946 ± 26 و 911 ± 118؛ ARC و 176 ± 18 و 186 ± 10؛ LHطفلو 468 ± 79 و 378 ± 34؛ LHpeF و 200 ± 31 و 173 ± 15 ، على التوالي ، مما يشير إلى أن الاختلاف في نمط التعبير بين FR و مجموعات العلاقات العامة لا يتعلق بمدة التدريب / الخبرة بل بطبيعة المهمة الأساسية. بالنسبة للمجموعة FR ، كان هناك زيادة معنوية في تعبير c-Fos في BNST ، لوحظ في كل من aBNST و pBNST. وارتبط كل من ضغط FR والرافعة العامة مع زيادة الخلايا العصبية-فوس المناعي في قشرة NAc ؛ تم زيادة أعداد c-Fos بشكل ملحوظ في نواة NAc من الجرذان المشتغلة بالضغط على رافعة FR ، مع وجود اتجاه غير مهم نحو زيادة تعبير c-Fos في الجرذان المشتغلات بالضغط PR lever. لم تتم زيادة c-Fos في VTA مع مهمة العلاقات العامة ، على الرغم من أنه لوحظ وجود اتجاه غير واضح نحو زيادة مع مهمة FR. وأخيرًا ، ازدادت بشكل كبير في c-Fos في النواة تحت اللسان (العصب القحفي الثاني عشر) في جذع الدماغ للفئران المدربة للعلاقات العامة ، ولكن ليس للفرنك.
تم ملاحظة تعبير c-Fos في مناطق CNS أخرى ، بما في ذلك اللوزة الدماغية والقشرة الدماغية (التين 3). ومع ذلك ، لوحظ وجود تعبير في كل من ظروف التحكم بالإضافة إلى ارتباطه بمهام العلاقات العامة والفرنسية ، مما يوحي بأن الجوانب غير المحددة في الإجراء (التعامل ، الحركة داخل غرفة العمليات) قد أدت إلى هذا التنشيط. لم يتم تنفيذ الكميات في هذه المناطق. وبالمثل ، لوحظ التنشيط داخل مناطق جذع الدماغ غير nXII ، ولكنه حدث بالارتباط مع كل من ظروف التحكم والمهمة ، كما يشير إلى دور في التنشيط غير الشرعي أو السلوكية.
اختبرنا الارتباطات بين تعبير c-Fos في مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. بدمج البيانات من مجموعات الضغط على الرافعة ، وجدنا علاقة سلبية بين تعبير c-Fos في LH و VMH ؛ وبالتالي ، ارتبط تنشيط VMH بانخفاض التنشيط الكلي لـ LH (Pearson R، −0.7986؛ t = −3.7534 P = 0.0056). أيضًا ، لاحظنا وجود ارتباط إيجابي كبير بين تعبير c-Fos في المنطقة المحيطة بالقرن من LH و VTA (Pearson R، 0.7772؛ t = 3.493؛ P = 0.0082) ، بما يتوافق مع الاتصال أحادي القطب المعروف بين هاتين المنطقتين (انظر المناقشة في Refs. 2 و 13). وجدنا ارتباطًا سلبيًا كبيرًا بين تعبير c-Fos في VTA مقابل غلاف NAc ، سواء تم اختباره بشكل منفصل لأداء FR (Pearson R، −0.9262؛ t = −4.9125 P = 0.008) أو لأداء العلاقات العامة (بيرسون R، −0.9897؛ t = −9.7624 P = 0.0103) ، بما يتفق مع المدخلات المتبادلة المعروفة بين المناطق المخطط لها إلى المادة السوداء و VTA (2, 13). اختبرنا أيضًا الارتباطات بين تعبير c-Fos في مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي والسلوك. بدمج البيانات من مجموعات الضغط على الرافعة ، لاحظنا وجود علاقة إيجابية كبيرة بين c-Fos في ARC ، ومكابس الرافعة النشطة (Pearson R، 0.8208؛ t = 3.8017؛ P = 0.0067).
تحديد الخلايا العصبية المنشط مع تناول السكروز والدافع للسكروز.
في جذع الدماغ ، لم تظهر الخلايا العصبية إيجابية C-Fos أي مناعي إيجابي لـ TH ، وهو إنزيم تحديد معدل للإدرينالين والنورادرينالين (والدوبامين) ؛ وبالتالي ، فإن هذه الخلايا العصبية الكاتيكولامينية لم تظهر لتفعيلها من قبل FR أو PR. ومع ذلك ، أظهرت بعض الخلايا العصبية إيجابية C- فوس immunostaining إيجابية لتريبتوفان هيدروكسيلاز ، مشيرا إلى أنه تم تنشيط مجموعة من الخلايا العصبية السيروتونين. كما هو موضح في التين 4، في ARC ، كانت الأجسام الخلوية إيجابية c-Fos محاطة بألياف AGRP الملطخة ، ولوحظ نمط مماثل لـ NPY fiber / c-Fos immunostaining (غير مبين). في PVN ، ظهرت الخلايا العصبية إيجابية C-Fos لتحيط الخلايا العصبية إيجابية CRF ، ولكن لم يلاحظ أي colocalization (لا تظهر البيانات). التين 5 يظهر immunostaining لكل من orexin و MCH في LH. تم العثور على الخلايا العصبية Orexin في كل من dLH و peLH. على الرغم من أننا لاحظنا وجود خلايا عصبية إيجابية في MCH في الـ peLH ، إلا أنه لم يكن هناك في الأساس أي colocalization مع c-Fos في تلك المنطقة من LH. ومع ذلك ، لاحظنا colocalization C-FOS في الخلايا العصبية إيجابية-orexin داخل peLH (التين 6, تيشرت) ، و cocal col-fos محدود جدا مع MCH في vLH (التين 6, أسفل). يجب إعادة التأكيد على أنه قد يتم التقليل من كل من التوطين ، و colocalization مع c-Fos ، للناقلات العصبية الببتيد مثل CRH ، لأن الفئران لم تسبق معالجتها بالكولشيسين. أخيرا ، داخل النواة المتكئة النواة وقشرة (التين 7) ، تمت ملاحظة c-fos coimmunostaining مع GAD ، الإنزيم الاصطناعي للناقل العصبي GABA ، لكل من FR والفئران PR. كان هناك تلطيخ قوي ل TH في إطار VTA ؛ ومع ذلك ، نادرا ما لوحظت الخلايا العصبية إيجابية C- فوس ، ولا يبدو ل colocalize حصرا مع TH.
مناقشة
في الدراسة الحالية ، استخدمنا تعبيرًا عن الجينة المبكرة الفورية ، c-Fos ، لتقييم نمط التنشيط الحاد للجهاز العصبي المركزي المرتبط ببداية نشاط ضغط ذراع الإدارة الذاتية للسكروز ، إما كمهمة غير مهيأة نسبيًا (FR) أو مهمة تفكيرية أكثر تحديًا تعكس التفكير الدوافع لمكافأة ، مثل السكروز ، وإشراك الدائرة الحركية بقوة (22, 24, 49) (العلاقات العامة). اختلفت أنماط التنشيط الوهمي بين المهمتين ، مع الاستمرارية في LH / limbic activation في مهمة FR والتنشيط الوطائي / الحوفي الوسطي السائد في مهمة العلاقات العامة (انظر التين 1). هناك العديد من الأسباب المحتملة لهذا الغرض. أولاً ، قد "تصور" هذه النماذج كتجارب مختلفة نوعياً في الجهاز العصبي المركزي. ستتوقع الفئران التي تم تدريبها في أداء FR فعالية سهلة ومكافأة عالية. ينبغي أن يؤثر توقع الغذاء المجزي بشدة على نمط c-Fos الذي لوحظ في الجرذان FR. يشير الاختلاف النوعي الظاهر في نمط التنشيط إلى أن الاحتمال الثاني - أن حيوانات العلاقات العامة لديها خبرة أكثر في المهمة - أقل احتمالًا ، وقد تم دعم ذلك من خلال قياسنا لـ c-Fos في منطقة ما تحت المهاد للفئران التي تلقت جلسات 20 FR والتي أظهرت نشاطًا مشابهًا لمجموعة FR وليس مجموعة PR. يمكن اختبار كل من هذين الاحتمالين من خلال زيادة صعوبة التدريب FR وتقييم التغيرات في تفعيل CNS ، وفي هذه الحالة ، يتوقع المرء تغير نوعي في نمط التنشيط. ومع ذلك ، في حين أن عدد تجارب التدريب قد لا يمثل نمط تفعيل CNS ، فإن متوسط عدد مكافآت sucوزر في جلسة ما قد يكون: قد يتم تعلم مهمة العلاقات العامة ببساطة كتجربة "أقل مكافأة" ، وقد يرتبط هذا بشكل وظيفي مع عدم تفعيل LH. وهكذا ، قد يعكس نمط تنشيط الجهاز العصبي المركزي في بداية الدورة حالةً متداخلةً ، مثل حالة نموذج المكان المشروط: ترتبط قوة التنشيط داخل الدائرة الحوفية بالتعلم والدوافع. لاحظنا تباين التعبير c-Fos في منطقة ما تحت المهاد الإنسي في حيوانات FRC. بشكل خاص داخل PVN ، قد يكون هذا التباين تنشيطًا للقناع في الجرذان FR ، حيث لوحظ وجود اتجاه نحو زيادة الفئران c-Fos مقابل FRC (الجدول 3). ومع ذلك ، لم تختلف التنشيط الوطائي المتوسط الإنسي بين حيوانات FR و FRC.
وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن هدفنا هو تحديد مواقع CNS التي تساهم في بداية السلوك ، فإن القرار الزمني هو نوع من التفكير. كما نوقش أدناه ، من المقدر الآن أنه يتم توسط مختلف المكونات الفرعية للسلوكيات المفيدة أو النشطة من خلال تفعيل مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية (13, 23, 33, 49). لا يمكننا الاستبعاد تمامًا من أن التنشيط بسبب الضغط أو الضغط على المكافآت قد يكون ساهم إلى حد ما في أنماط التنشيط التي لاحظناها. توفر نتائجنا الأساس لمزيد من التحقيق في أدوار مواقع CNS محددة في جوانب أو مكونات مختلفة لمهمة الإدارة الذاتية ، وبالنسبة لهذه الدراسات ، يتم قياس الجينات المبكرة الآخرى ذات المواعيد المختلفة "on" و "off" (36) سيكون مفيد جدا.
ترتبط الارتباطات التي وجدناها في تعبير c-Fos بين مناطق مختلفة من الدماغ بتوصيل وظيفي معروف للمناطق الحوفية الأساسية والحادة لمهمة المكافأة هذه ، مثل بين LH و VMH ، وبين المنطقة الصحية في LH و VTA (انظر المناقشة في المرجعيات. 2 و 13). فحصنا أيضًا الارتباطات بين تعبير c-Fos في مختلف المناطق النشطة والسلوك. يرتبط الارتباط بين c-Fos في ARC والضغط الفعال للرافعة بالدور المحدد جيدا لنشاط ARC في المدخول الغذائي (1)؛ مع الملاحظة السابقة لدينا أن حقن الأنسولين على وجه التحديد في ARC انخفضت السكروز الإدارة الذاتية (15)؛ مع تقارير سابقة عن الدور الحاسم لـ ARC ، وعصبوناتها endorphinergic ، في اكتساب وأداء الإدارة الذاتية للكوكايين (40-42)؛ ومع التوقعات المحددة من ARC إلى NAC (17). وبالتالي ، من المرجح أن يلعب مركز البحوث الزراعية دورا رئيسيا في السلوك المحفّز للبحث عن أنواع كثيرة من المحفزات المكافئة والحصول عليها ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الغذاء. وأخيرا ، لاحظنا التنشيط الكبير لل PVN و VMH مع بداية البحث عن السكروز. ويتسق هذا مع الأدوار المتميزة لهذه النوى الوهادية الوسطى في تنظيم استهلاك الغذاء ، والتوصيل المباشر للمشابك مع ARC ، وتحديد التوصيلات مع الدوائر الحوفية (1, 27, 37).
وجدنا علاقة سلبية كبيرة بين تعبير c-Fos في VTA مقابل NAc-shell ، سواء تم اختباره لأداء FR أو PR. كان من المفاجئ إلى حد ما أن التنشيط VTA الأقوى لم يُلاحَظ بالارتباط مع الإدارة الذاتية للوزن النسبي PR أو السكروز (في مقابل كل ضوابط). ربما تعكس هذه النتيجة توقيت قياسنا ، مع التركيز على مواقع CNS المحتملة النشطة في بداية المهمة ، والتي تم تدريب هذه الحيوانات عليها بشكل جيد. هذا من شأنه أن يكون متسقًا مع ملاحظات وأطروحة شولتز (44) ، أن تفعيل الخلايا العصبية الدوبامين بمثابة علامة للمحفزات غير متوقعة أو المكافآت ، وهذا التنشيط يتناقص بالتعاون مع التدريب. ومع ذلك ، فقد تبين أن إطلاق الدوبامين المخطط خلال عملية أخذ السكروز في الحيوانات المدربة يحدث كحدث دقيق للغاية ودقيق (39). وبالتالي ، من الممكن أن تكون الاتجاهات التي لاحظناها ذات أهمية كبيرة مع مجموعة دراسة أكبر (أي قوة إحصائية أكبر). لقد لاحظنا تفعيل NAc بالتعاون مع بداية كل من FR و السكروز. تم الإبلاغ عن كل من تنشيط وتثبيط الخلايا العصبية NAc بالاشتراك مع أداء المكافأة الفعال ، ونمط التنشيط / النشاط يعتمد على التدريب والبيئة ، ويرتبط بمكونات مختلفة من السلوك (على سبيل المثال ، التوجه ، النهج ، المدخول) (6, 33, 50). كما نوقش أعلاه ، لن يقيس قياس c-Fos مثل هذا النشاط المحدد. وقد اقترح Carlezon أن "مكافأة" ترتبط في الغالب مع انخفاض في نشاط الخلايا العصبية NAC ، أي الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة (3). هذا لا يتماشى مع ملاحظاتنا - المعززة بشكل كبير NAc c-Fos مقارنة مع ضوابط التعامل والعصبونات الموجبة c-Fos colocalized مع GAD ، بما يتماشى مع تنشيط الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة (GABAergic) - ولكننا لم نقم بالتحديد بتثبيط NAc العصبي ". قد يحدث تنشيط وتثبيط NAc خلال مهام مفيدة ، مع كل من الخصوصية التشريحية والزمنية. من وجهة نظر هذه الدراسة ، يمكن للمرء أن يخلص إلى أن NAc تشارك في بداية تناول السكروز الفعال ، مع مساهمة NAc الأساسية في التنشيط الحركي وقوة NAc تسهم في كل من الجوانب الحركية والتحفيزية للمهمة.
لاحظنا أيضا تفعيل كل المناطق الرئيسية من BNST (الأمامي والخلفي) في الجرذان FR. و BNST هو جزء من الدوائر الحوفي الذي ينظم استجابات الغدد الصم العصبية لتجارب التحفيز المتكررة (8, 9) ، وبمعنى أكبر ، يرتبط مع التعلم عن المنبهات المتكررة. على الرغم من أن دورها قد تم شرحه بشكل أشمل فيما يتعلق بتجارب الإجهاد المتكررة ، إلا أن النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى دور أوسع لـ BNST: قد تقوم BNST بتعديل استجابات الجهاز العصبي المركزي للمحفزات الإيجابية ، وكذلك السلبية أو المجهدة المتكررة. منذ لاحظنا هذا التنشيط في بداية FR ، ولكن ليس PR ، والأداء ، قد يكون ربط BNST التوظيف إلى زيادة مكافآت السكروز للتدريب FR. إن ملاحظتنا لعدم التنشيط المباشر لعصبونات CRF تشير إلى أن الاستجابة الفعالة للسكروز ليس من عوامل الضغط الرئيسية ؛ ومع ذلك ، فإن تعبير c-Fos في الخلايا العصبية PVN الأخرى متوافق مع تعديل دارة الضغط (46). في الواقع ، ذكر أولريتش-لاي وزملاؤه أنه باستخدام نموذج نظام غذائي / تغذية مختلف ، فإن تناول السكروز ينظم وظيفة PVN (47). وأخيرًا ، لاحظنا تنشيط نواة العصب تحت اللسان بالتزامن مع العلاقات العامة وليس مع أداء FR. لا يمكن التكهن بأهمية هذا إلا ؛ أحد الاحتمالات هو أن علاقة الذوق بسكروز يمكن أن تزداد في الفئران التي تستوعب عدد أقل من مكافئات السكروز.
يجب اعتبار البحث عن السكروز وأخذ السكروز بمثابة تجربة متعددة الوسائط ، ديناميكية في الوقت المناسب ، حيث أن الابتلاع قد ينتج عنه إشارات محيطية مرتبطة بالمحتوى الحراري للسكروز ، وكذلك التعود والتخدير خلال الدورة الواحدة (25). بينما ركزت أبحاثنا على تأثير إشارات الغدد الصماء المحيطية ، أي الأنسولين والليبتين ، لتعديل المكافأة الغذائية ، قد تتأثّر آثارها بدورها بشكل مركزي وسطًا عن طريق المرسلات والببتيدات العصبية التي تلعب دورًا في المدى القصير أو الطويل التغذية أو مكافأة الطعام (انظر المناقشة في المرجع. 14). توفر الدراسة الحالية بعض التبصر في هذا ؛ لاحظنا بعض التنشيط من الخلايا العصبية التي تعبر عن MCH أو orexin ، وهما neuropeptides التي هي orexigenic. في الواقع ، قد تقلل هذه النتائج من دور MCH أو orexin في المكافأة الغذائية ، حيث أن كيمياء المناعة في الفئران التي لم يتم علاجها من الكولشيسين تحد بلا شك من تصور كل من هذه الببتيدات العصبية. إن تحديد الخلايا العصبية الأويكسينية النشطة في LH متناسق بشكل عام مع الدراسات العديدة التي تورط الخلايا العصبية orexin في التغذية ومكافأة الطعام ومكافأة التحفيز الأكثر عمومية (مثل 5 و 7 و 29). لاحظنا تفعيل الخلايا العصبية peFLH orexin. استون جونز وزملاؤه (5) قاموا بتشريح أدوار مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية أوركسين LH في سلوك المكافأة وتورطوا في الخلايا العصبية أوميكسين peFLH في الإثارة ، بدلا من مكافأة في حد ذاتها. وبالتالي ، توحي نتائجنا بدور LH orexin في الإثارة ، وربما التوجه نحو الرافعة النشطة أو الإشارات لأخذ السكروز.
يستحق النظر في المستقبل هو تفرد أو تعميم السكروز كمحفز مجزية. ما إذا كان نمط تنشيط CNS المبكر الذي نبلغ عنه هنا محددًا للأغذية كحافز ، أو يعمم على محفزات مجزية أخرى ، فلا يزال يتعين تحديده. كما لوحظ أعلاه ، خاصة في مهمة FR ، من المتوقع أن يكون تناول عدد من مكافئات السكروز له نتائج استقلابية ، مع تعديل إفراز هرمون (على سبيل المثال ، كوليسيستوكينين ، جريلين ، أنسولين) والتغيرات في التنشيط العصبي المحيطي والجهاز العصبي المركزي. من غير المتوقع أن تلعب هذه التغييرات دورًا مباشرًا في أنماط تنشيط CNS الأولى التي قمنا بقياسها ولكن قد تلعب دورًا في التعلم عن مكافأة السكروز أثناء التدريب. مرة أخرى ، قد تكون neuropeptides مثل orexin متورطة بشكل حاسم.
تمثل دراستنا ، على حد علمنا ، أول مظاهرة لتفعيل نوى تحت المهاد الأنسية في بداية الإدارة الذاتية للسكروز ، بما في ذلك كل من PVN ، المتورطين في الاستتباب و استجابة الإجهاد ، و ARC ، وهو أمر حاسم لاستتباب الطاقة ، استشعار المغذيات ، وتنظيم الاستهلاك الغذائي. والأهم من ذلك ، أننا لاحظنا تفعيل ما تحت المهاد الإنسي و NAc ، بالاشتراك مع بداية العلاقات العامة ، مما يشير إلى أن كل من المواقع التماثلية وبعض المواقع الحوفي تلعب دورا في بدء إدارة السكروز الذاتية. قد يتم تعيين مواقع الدوائر الحوفي إضافية في وقت لاحق في المهمة.
وجهات نظر وأهمية
في حين ، من الناحية التاريخية ، فإن الدراسات المتعلقة بالسلوكيات التحفيزية والمكافأة ستؤثر بقوة أكبر على الدوائر الحوفيّة CNS ، وقد تراكمت مجموعة كبيرة من الأدلة التي تؤكد على التفاعل الوظيفي الحرج بين دارة توازن الجسم الحوفي والطاقة. تشير الدراسة الحالية الآن إلى الأهمية المحتملة لنواة ما تحت المهاد الأنسية في العمل المحفّز للسكروز. استقراء من هذه الدراسة ، يمكن للدراسات المستقبلية تقييم ما إذا كان دور ما تحت المهاد الإنسي هو ضروري وما إذا كان تفعيلها متورط في السعي وراء دوافع أخرى مثل تعاطي المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نتائج هذه الدراسة توفر الأساس المنطقي لدراسة تغيرات السلوكيات الدوافع في الظروف المصاحبة للفيزيولوجيا الوطمية الوسيطة المتغيرة ، كما هو الحال في السمنة.
GRANTS
تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة DK40963. الدكتورة ديان فيجوليكز لاتيمان هي عالمة أبحاث أولية في مجال البحوث ، وهي برنامج أبحاث المختبرات الطبية الحيوية ، وزارة شؤون المحاربين القدامى ، Puget Sound Health System System ، سياتل ، واشنطن. د. سيبولس مدعوم من مجلس العلوم اللاتفية غرانت 04.1116.
شكر وتقدير
نشكر الدكاترة. Yavin Shaham، Stephen Benoit، Christine Turenius، and JE Blevins للحصول على المشورة والمناقشات المفيدة.
المراجع