Biol Psiquiatria. 2008 de desembre de 1;64(11):941-50. Epub 2008 de juliol de 26.
Teegarden SL, Nestler EJ, Bale TL.
font
Departament de Biologia Animal, Universitat de Pennsilvània, Filadèlfia, PA 19104-6046, EUA.
abstracte
ANTECEDENTS:
La sensibilitat a la recompensa ha estat implicada com un factor predisposicionador de comportaments relacionats amb l'ús indegut de drogues i l'excés de menjar. No obstant això, els mecanismes subjacents que contribueixen a recompensar la sensibilitat són desconeguts. Es va plantejar la hipòtesi que una disregulació en la senyalització de la dopamina podria ser una causa subjacent d'una sensibilitat de recompensa elevada, en la qual els estímuls recompensats podrien actuar per normalitzar el sistema.
MÈTODES:
Hem utilitzat un model de ratolí genètic d'augment de la sensibilitat a la recompensa, el ratolí que sobreexpressa Delta FosB, per examinar els canvis de la via de la recompensa en resposta a una dieta rica en greixos agradable. Els marcadors de senyalització de recompensa en aquests ratolins es van examinar tant bàsicament com després de 6 setmanes d'exposició a una dieta agradable. Els ratolins es van examinar en una prova de comportament després de la retirada de la dieta alta en greixos per avaluar la vulnerabilitat d'aquest model a l'eliminació d'estímuls gratificants.
RESULTATS:
Els nostres resultats demostren una activació alterada de la via de recompensa al llarg dels circuits de l'àrea tegmental del nucli accumbens-hipotalàmic-ventral resultant de la sobreexpressió de Delta FosB al nucli accumbens i a les regions estriatals.. Nivells de proteïna d'unió a l'element de resposta d'adenosina monofosfat cíclica fosforilada (AMPc) (pCREB), factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF), i la fosfoproteïna regulada amb dopamina i monofosfat d'adenosina cíclica amb una massa molecular de 32 kDa (DARPP-32) al nucli accumbens es va reduir en ratolins Delta FosB, cosa que suggereix una reducció de la senyalització de dopamina. Sis setmanes d'exposició a una dieta alta en greixos van millorar completament aquestes diferències, revelant la potent capacitat gratificant d'una dieta agradable. Els ratolins Delta FosB també van mostrar un augment significatiu de l'activitat locomotora i les respostes relacionades amb l'ansietat 24 hores després de la retirada alta de greixos.
CONCLUSIONS:
Aquests resultats estableixen una sensibilitat subjacent als canvis en la recompensa relacionats amb la desregulació de Delta FosB i la senyalització de dopamina que es pot normalitzar amb dietes agradables i pot ser un fenotip predisposant en algunes formes d'obesitat..
introducció
Malgrat el nostre creixent coneixement dels sistemes neuronals que controlen la gana i la sacietat, les taxes d'obesitat continuen augmentant als Estats Units. Els tractaments farmacològics actuals tenen una eficàcia limitada i les modificacions del comportament pateixen un mínim compliment a llarg termini (1). El consum d'aliments densos calòricament i agradables al paladar s'ha relacionat amb canvis en les vies d'estrès i recompensa al cervell, cosa que suggereix que les propietats gratificants d'aquests aliments poden anul·lar els senyals d'equilibri energètic (2-4). Els aliments rics en greixos actuen com a recompenses naturals, activant els centres de recompensa del cervell d'una manera similar a les drogues d'abús i, com a tal, s'han utilitzat en paradigmes d'autoadministració (5-8). Per tant, és probable que els comportaments i la motivació per menjar en excés i l'abús de drogues comparteixin mecanismes subjacents comuns, que poden obrir noves vies de tractament per a ambdues condicions.
En estudiar la relació entre els aliments saborosos i les vies que regulen la recompensa i l'estrès al cervell, prèviament hem identificat marcadors moleculars i bioquímics de reducció de la recompensa i augment de l'estrès després de la retirada d'una dieta alta en greixos (HF) agradable. De manera similar a les drogues d'abús, l'exposició a una dieta agradable en els nostres estudis va donar lloc a un augment dels nivells del factor de transcripció ΔFosB al nucli accumbens (NAc), una estructura de recompensa cerebral central (9, 10). Els ratolins que sobreexpressen inductiblement ΔFosB mostren una resposta instrumental més gran per a una recompensa alimentària (11), cosa que els converteix en una eina valuosa per examinar el paper de la sensibilitat a la recompensa i la desregulació a llarg termini del sistema de recompensa en les respostes moleculars i bioquímiques a una dieta agradable.
En el present estudi, hem utilitzat els ratolins que sobreexpressen ΔFosB per examinar les alteracions a llarg termini dels marcadors de recompensa en el neurocircuit NAc-hipotàlem-àrea tegmental ventral (VTA) en resposta a una dieta HF agradable. A partir d'estudis anteriors en aquests ratolins sensibles a la recompensa, vam plantejar la hipòtesi que els canvis induïts per ΔFosB en la sensibilitat a la recompensa impliquen una desregulació de la senyalització de la dopamina resultant de la retroalimentació de NAc a la VTA. A més, vam plantejar la hipòtesi que l'exposició a una recompensa natural d'una dieta HF densa energèticament normalitzaria el sistema dopaminèrgic en aquests ratolins, donant lloc a una resposta exagerada a l'estrès de la retirada d'aquesta dieta HF.. L'aspecte únic d'utilitzar una dieta agradable com a substància gratificant ens permet incloure les entrades hipotalàmiques per recompensar els circuits en un fenotip que pot ser predictiu d'una població predisposada a l'obesitat resistent al tractament. Per examinar aquesta hipòtesi, es van estudiar marcadors de neurotransmissió de dopamina, inclosos pCREB, BDNF i DARPP-32 a la NAc i la tirosina hidroxilasa i el transportador de dopamina a la VTA, després de l'exposició a HF. També es van examinar marcadors específics del balanç energètic coneguts per influir en la producció de dopamina, inclosos els receptors de leptina i orexina en l'expressió de VTA i orexina dins de l'hipotàlem lateral.
Materials i mètodes
Animals
Els ratolins bitransgènics mascles que sobreexpressen inductiblement ΔFosB en neurones positives per dinorfina al NAc i l'estriat dorsal (Kelz et al., 1999) es van generar en un fons mixt (ICR: C57Bl6/SJL) a la Universitat de Texas Southwestern Medical Center i es van mantenir i mantenir. provat a la Universitat de Pennsilvània. Tots els ratolins es van mantenir amb doxiciclina (100 μg/ml a l'aigua potable) fins a l'arribada a la Universitat de Pennsilvània. Per induir la sobreexpressió, es va eliminar la doxiciclina (n = 23) (12). Els ratolins control (n = 26) van continuar rebent el fàrmac. Els ratolins es van assignar a grups de dieta vuit setmanes després de l'eliminació de la doxicilina, moment en què s'ha demostrat que l'expressió assoleix els nivells màxims (13). Els ratolins es van mantenir en un cicle de llum-foscor de 12:12 (llums a les 0700:XNUMX) amb menjar i aigua disponibles ad libitum. Tots els estudis es van realitzar segons protocols experimentals aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Pennsilvània, i tots els procediments es van dur a terme d'acord amb les directrius institucionals.
Exposició a la dieta
Els ratolins es van mantenir a la casa (n = 16) o es van col·locar a HF (n = 16-17) durant sis setmanes. El menjar de la casa (Purina Lab Diet, St. Louis, MO) contenia 4.00 kcal/g, que consistia en un 28% de proteïnes, un 12% de greixos i un 60% d'hidrats de carboni. La dieta HF (Research Diets, New Brunswick, NJ) contenia 4.73 kcal/g, que consistia en un 20% de proteïnes, un 45% de greixos i un 35% d'hidrats de carboni.
Bioquímica i expressió gènica
Els ratolins es van analitzar després de sis setmanes d'exposició a la dieta. Els cervells es van extreure del crani i es van congelar sencers en gel sec o es van disseccionar el NAc (aproximadament a 0.5-1.75 mm del bregma, a una profunditat de 3.5-5.5 mm) i es van congelar en nitrogen líquid. El teixit es va emmagatzemar a -80 ° C fins que es va analitzar.
Anàlisis bioquímiques
Els mètodes per a Western blots es descriuen en materials suplementaris. Els anticossos utilitzats van ser: Cdk5, CREB i BDNF (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i fosfo-CREB (pCREB) (Ser 133) (1:500, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).
Autorradiografia del receptor
Els mètodes detallats per a autorradiografia es descriuen en materials suplementaris. Els lligands utilitzats van ser 2 nM H3 - SCH 23390 i 5 nM H3 - spiperona (PerkinElmer, Boston, MA).
Hibridació in situ
El processament i la hibridació de teixits es van realitzar tal com es va descriure anteriorment (14). La sonda DARPP-32 va ser amablement proporcionada per P. Greengard (Universitat Rockefeller), i la sonda d'orexina per J. Elmquist (Centre mèdic del sud-oest de la Universitat de Texas). Les diapositives analitzades per a DARPP-32 es van posar a la pel·lícula durant 3 dies i les diapositives analitzades per a l'orexina es van posar a la pel·lícula durant 4 dies. La quantificació de les imatges de pel·lícules es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment (10).
QRT-PCR
L'ARN es va aïllar del VTA i l'expressió de gens individuals es va avaluar mitjançant assajos d'expressió gènica TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Els mètodes detallats i les anàlisis estadístiques es poden trobar en materials suplementaris.
Anàlisis del comportament
Per tal d'examinar els efectes de la sensibilitat a la recompensa en els canvis de comportament induïts per la dieta, es va retirar un subconjunt de ratolins de l'HF després de quatre setmanes d'exposició i es va tornar a menjar a casa (n = 9 de control, n = 8 ΔFosB). Vint-i-quatre hores després de la retirada, els ratolins van ser exposats a la prova de camp obert d'acord amb el nostre paradigma d'abstinència dietètica publicat anteriorment (10). Breument, el ratolí es va col·locar al centre de l'aparell de camp obert i es va controlar durant cinc minuts. Es van mesurar el total de creus de línia, boli fecal, temps al centre i creus al centre.
Estadística
Totes les dades, excepte els Western blots, es van analitzar mitjançant un ANOVA bidireccional seguit de la prova PLSD de Fisher amb tractament amb doxiciclina (expressió ΔFosB) i l'estat de la dieta com a variables independents. Per a les anàlisis RT-PCR, es va utilitzar un valor P reduït per corregir múltiples comparacions dins de grups de gens relacionats (vegeu materials suplementaris). Les taques occidentals es van analitzar mitjançant la prova t d'un estudiant amb tractament amb doxiciclina com a variable independent, comparant les densitats òptiques dins de la mateixa taca. Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM.
Resultats
Diferències bioquímiques basals
Per dilucidar les vies moleculars que subjauen a la sensibilitat millorada de la recompensa en els ratolins que sobreexpressen ΔFosB, es van examinar els nivells de diverses molècules de senyalització clau al NAc. Hi va haver una tendència a augmentar els nivells de Cdk5 en el NAc dels ratolins ΔFosB en comparació amb els animals de control de camarada mantinguda amb doxiciclina (F = 5.1, 0.08, P = 1, 7.4; Fig. 0.05A). Els ratolins ΔFosB van expressar nivells significativament reduïts de pCREB (F = 1, P <5.4; Fig. 0.05B) així com els nivells totals de CREB (F = 1, P = 10.6; Fig. 0.05C). També es va observar una reducció significativa de BDNF en el NAc dels ratolins ΔFosB (F = 1, P <XNUMX; Fig. XNUMXD).
figura 1
Els ratolins que sobreexpressaven ΔFosB van mostrar marcadors bioquímics de senyalització reduïda de dopamina al NAc
Ingesta d'aliments i pes corporal en una dieta alta en greixos
A continuació, vam examinar els efectes d'una dieta HF naturalment gratificant sobre les alteracions de les molècules de senyalització en els ratolins que sobreexpressen ΔFosB. No hi va haver diferències entre els ratolins ΔFosB i els controls en la ingesta d'aliments a casa o HF. Tanmateix, hi va haver una disminució global de la ingesta calòrica normalitzada al pes corporal quan s'exposava a HF que era específica dels ratolins ΔFosB (F = 11.2, P <0.01; Fig. 2A). Al final de les sis setmanes d'exposició a la dieta, els ratolins que van rebre HF pesaven significativament més que els de dieta chow (F = 17.2, 0.001, P < 5.6, 0.05) i els ratolins ΔFosB pesaven menys que els controls (F = 2, 0.05, P < XNUMX, XNUMX; Fig. XNUMXB). Aquest efecte va ser específic de les diferències entre els grups de la dieta chow (P <XNUMX, XNUMX).
figura 2
Els ratolins que sobreexpressen ΔFosB no van mostrar diferències en la ingesta d'aliments ni a la dieta ni a la dieta alta en greixos (HF).
Diferències bioquímiques en la dieta alta en greixos
Per determinar com es podrien alterar les diferències basals en la senyalització de NAc per la dieta HF, es van examinar les mateixes proteïnes de senyalització estudiades a la línia de base en animals que havien rebut sis setmanes d'HF. No hi va haver diferències significatives en els nivells de Cdk5 (Fig. 3A). Els nivells de pCREB i de CREB total ja no eren diferents després de sis setmanes d'IC (Fig. 3B, C). Els nivells de BDNF es van elevar significativament en els ratolins ΔFosB després de sis setmanes d'exposició a HF (F = 6.5, P = 0.05; Fig. 3D).
figura 3
La dieta alta en greixos (HF) va millorar les diferències de senyalització observades en el NAc de ratolins que sobreexpressen ΔFosB
Autorradiografia del receptor de dopamina
Hem utilitzat autorradiografia del receptor per avaluar si les alteracions induïdes per ΔFosB en la senyalització de dopamina al NAc estan relacionades amb canvis en l'expressió del receptor de dopamina (Fig. 4A). La dieta alta en greixos semblava augmentar lleugerament la densitat de la unió del receptor de dopamina D1 (P = 0.14), i aquesta diferència era més gran en els ratolins ΔFosB (Fig. 4B). També hi va haver una tendència cap a un augment de l'àrea d'unió D1 després de l'HF (P = 0.06, 0.05), i les proves post hoc van demostrar que això era significatiu en els ratolins ΔFosB (P <4, 1; Fig. 2C). A diferència dels receptors D97.6, no hi ha canvis en la densitat d'unió del receptor D6.9 (chow de control = 101.1 ± 8.2, control HF = 91.6 ± 1.0, ΔFosB chow = 94.8 ± 9.5, ΔFosB HF = 47.3 ± 3.4 de control o àrea d'unió (53.8) Es van observar ± 6.0, control HF = 51.9 ± 3.7, ΔFosB chow = 49.0 ± 3.3, ΔFosB HF = XNUMX ± XNUMX) al NAc.
figura 4
La dieta alta en greixos (HF) va provocar canvis en la unió del receptor de dopamina D1 i l'expressió de DARPP-32 al nucli accumbens (NAc) de ratolins que sobreexpressen ΔFosB
Expressió de DARPP-32 al NAc
La hibridació in situ es va utilitzar per determinar els nivells d'expressió de DARPP-32 al NAc (Fig. 4D). La dieta alta en greixos va augmentar significativament l'expressió de DARPP-32 en aquesta regió del cervell (F = 5.1, P <0.05), i hi va haver una interacció significativa entre la dieta i l'expressió ΔFosB (F = 8.9, P <0.05), amb els ratolins ΔFosB mostrant una major canvi induït per la dieta (Fig. 4E). Es va revelar una diferència basal en l'expressió de DARPP-32 entre els ratolins control i ΔFosB mitjançant proves post hoc (P <0.01, 32), així com un augment significatiu de l'expressió DARPP-0.01 als ratolins ΔFosB a HF (P <XNUMX, XNUMX).
Expressió gènica a la VTA
La QRT-PCR es va utilitzar per avaluar els canvis en l'expressió gènica a la VTA, dirigint-se a diversos gens clau implicats anteriorment en la regulació de la recompensa. Totes les mostres es van normalitzar a β-actina. Per garantir que l'expressió de β-actina no es va alterar pel tractament, es va realitzar un assaig separat per comparar la β-actina amb un segon control intern, GAPDH. No hi va haver diferències significatives en l'expressió de β-actina (valors de ΔCT, β-actina - GAPDH: control de chow = 2.29 ± 0.21, control HF = 2.01 ± 0.04, ΔFosB chow = 2.32 ± 0.49, ΔFosB HF = 2.37).
Es va observar una tendència d'interacció entre l'expressió ΔFosB i el tractament de la dieta per a l'expressió de la tirosina hidroxilasa (F = 3.6, P <0.06; Fig. 5A). Sis setmanes d'exposició a HF semblaven disminuir l'expressió de tirosina hidroxilasa en ratolins control i augmentar l'expressió en ratolins ΔFosB. Es va observar una interacció significativa entre l'expressió ΔFosB i l'exposició a la dieta per a l'expressió del transportador de dopamina (F = 6.7, P <0.03; Fig. 5B). Similar a la tirosina hidroxilasa, l'exposició a HF va reduir l'expressió del transportador de dopamina en els ratolins control i va augmentar significativament l'expressió en els ratolins ΔFosB (P <0.05, 0.16). La diferència basal en l'expressió del transportador de dopamina entre els ratolins control i ΔFosB no va assolir importància (P = 6, 0.05), però després de XNUMX setmanes d'HF, els ratolins ΔFosB van expressar nivells significativament elevats de transportador de dopamina en comparació amb els controls (P <XNUMX, XNUMX).
figura 5
L'exposició a la dieta alta en greixos (HF) i l'expressió ΔFosB van provocar canvis en l'expressió d'una sèrie de molècules clau en el VTA
Hi va haver una tendència que indica un efecte de l'augment de l'expressió ΔFosB per reduir els nivells de TrkB a la VTA (F = 5.7, 0.04, P < 5, 0.08; Fig. 5C). Tot i que no hi va haver efectes principals sobre l'expressió del receptor κ-opioide, hi va haver una tendència cap a una expressió reduïda en ratolins ΔFosB (P = 6.1, 0.03; Fig. 5D). L'expressió del receptor de leptina també es va determinar al VTA. Es va trobar un efecte significatiu de l'exposició a la dieta (F = 1, P <9.0), amb HF reduint significativament els nivells del receptor de leptina en el VTA tant en ΔFosB com en ratolins control (Fig. 0.02E). També es va examinar l'expressió del receptor d'orexina 5 al VTA. Hi va haver un efecte significatiu de la dieta sobre l'expressió del receptor de l'orexina (F = 1, 0.05, P < XNUMX, XNUMX), amb ratolins exposats a HF que expressen nivells més alts en el VTA (Fig. XNUMXF). També hi va haver una tendència que els ratolins ΔFosB expressessin nivells generals més alts del receptor XNUMX d'orexina en aquesta regió del cervell (P <XNUMX, XNUMX).
Expressió de l'orexina a l'hipotàlem lateral
Hem mesurat els nivells d'orexina a l'hipotàlem lateral, origen de la innervació orexinèrgica del VTA, per hibridació in situ (Fig. 6A). Hi va haver una interacció significativa entre l'expressió ΔFosB i l'exposició a la dieta en l'expressió d'orexina (F = 9.1, P <0.01), amb HF augmentant significativament els nivells d'orexina en ratolins control (P <0.05) i disminuint l'expressió en ratolins ΔFosB (Fig. 6B). Tot i que no hi va haver diferències significatives en l'expressió d'orexina en l'estat basal, després de 6 setmanes d'HF, els ratolins ΔFosB van expressar nivells significativament reduïts d'orexina en comparació amb els controls (P <0.05, XNUMX).
figura 6
La dieta alta en greixos (HF) va tenir efectes diferencials sobre l'expressió d'orexina en els ratolins de control (Ctrl) i sobreexpressant ΔFosB
BeAnàlisis conductuals
Per avaluar les alteracions de l'excitació i l'emocionalitat a causa del canvi en la dieta, els ratolins van ser exposats a la prova de camp obert 24 hores després de la retirada de la dieta HF (10). Els creuaments de línies totals, que es van puntuar com a mesura de l'excitació, es van veure significativament afectats per l'expressió ΔFosB (F = 6.6, P <0.05) i la dieta (F = 4.6, P <0.05; Fig. 7A). Els ratolins ΔFosB eren més actius en el nou entorn que els controls, i les proves post hoc van demostrar que els ratolins retirats de l'HF eren significativament més actius que els exposats a chow (P <0.05, 10). Els boli fecals es van comptar com a mesura del comportament semblant a l'ansietat (10.2). Hi va haver un efecte principal de l'expressió ΔFosB (F = 0.01, 7, P < 24, 14.5), amb ratolins que sobreexpressen ΔFosB produint més boli fecal en el nou entorn, especialment en els grups d'abstinència d'HF i de menjar a casa (Fig. 3.1B). Els ratolins ΔFosB mantinguts amb dieta HF van produir menys boli fecals que els que es van mantenir en menjar i els que es van retirar 18.0 hores abans de la prova. Els ratolins de control no semblaven estar afectats per la dieta. No hi va haver efectes significatius ni de l'expressió de ΔFosB ni de la dieta en el temps passat al centre del camp obert (chow control = 3.2 ± 15.4 s, control HF = 1.9 ± 16.9 s, control W/D = 2.4 ± 13.1 s, ΔFosB chow = 3.9 ± 19.8 s, ΔFosB HF = 2.6 ± XNUMX s, ΔFosB W/D = XNUMX ± XNUMX s).
figura 7
Els ratolins que sobreexpressaven ΔFosB eren més sensibles als efectes de la retirada de la dieta alta en greixos (HF)
Discussion
En el tractament de l'obesitat, hi ha una necessitat crítica d'identificar els factors que influeixen en la susceptibilitat a menjar en excés i l'augment de pes. Les vies de recompensa del cervell tenen un paper important en la motivació i la resposta als aliments agradables i als canvis en la dieta (6, 10, 15, 16). Com que els senyals orexigènics i anorexigènics poden influir directament en la senyalització de la recompensa mitjançant un circuit d'hipotàlem-VTA-NAc, l'elucidació de gens que responen a dietes saboroses riques en energia dins dels centres de recompensa pot proporcionar nous objectius terapèutics en el tractament de l'obesitat (17, 18). Per tant, vam examinar marcadors bioquímics i moleculars de senyalització de recompensa i balanç energètic al llarg del circuit hipotàlem-VTA-NAc en resposta a una dieta HF en ratolins que sobreexpressen ΔFosB com a model de sensibilitat millorada als canvis en la recompensa (13, 19, 20) , i la sensibilitat conductual després de la retirada de la dieta. Vam plantejar la hipòtesi que la desregulació basal de la senyalització de la dopamina en els ratolins ΔFosB es normalitzaria pels efectes gratificants d'una dieta HF, que abastava la intersecció dels senyals d'equilibri energètic i el sistema de dopamina.
Per examinar els marcadors indicatius d'una desregulació de la senyalització de dopamina al NAc, vam examinar els nivells de receptors D1 i els efectors aigües avall. Tot i que no hi va haver diferències significatives en la unió del receptor D1, hi va haver una tendència a l'exposició a HF per augmentar l'àrea d'unió als ratolins ΔFosB. Això és interessant, ja que la inducció de ΔFosB per fàrmacs i recompenses naturals sembla que predomina en el subtipus positiu per dinorfina de les neurones espinoses mitjanes que expressen principalment els receptors D1. (9, 21). Els nivells de pCREB objectiu de senyalització de dopamina aigües avall es van reduir significativament en els ratolins ΔFosB, donant suport a la reducció de l'activació del receptor D1 en aquesta regió del cervell (22, 23). Curiosament, també vam detectar una disminució significativa dels nivells totals de CREB en ratolins ΔFosB, cosa que suggereix una capacitat més reduïda de transducció del senyal de dopamina que pot ser secundària a la retroalimentació resultant d'una disminució prolongada de pCREB (24). L'expressió de BDNF està regulada per pCREB, s'eleva amb l'activació de D1 i és un mediador important de la neuroplasticitat relacionada amb la recompensa al NAc (25, 26). En conseqüència, vam detectar una disminució significativa de la proteïna BDNF al NAc dels ratolins ΔFosB.
Totes les neurones espinoses mitjanes del NAc expressen DARPP-32 (27). Els seus nombrosos efectors aigües avall el converteixen en un actor vital en les vies de recompensa (28) i ha estat implicat en l'addicció a les drogues i en altres trastorns que impliquen el sistema de dopamina, inclosos els trastorns afectius i l'esquizofrènia. (27, 29). Hem detectat reduccions basals profundes en l'expressió de DARPP-32 al NAc de ratolins ΔFosB. L'expressió de DARPP-32 està regulada per BDNF i, per tant, l'expressió reduïda pot estar directament relacionada amb les reduccions dels nivells de BDNF detectades en ratolins ΔFosB (27, 29, 30). Fins i tot els canvis moderats en l'estat de fosforilació de DARPP-32 poden conduir a alteracions substancials en la senyalització intracel·lular dins del NAc (27). Estudis anteriors no han informat cap canvi en la proteïna DARPP-32 en ratolins ΔFosB després d'una eliminació de 12 setmanes de la doxiciclina quan es va realitzar una avaluació estriatal més àmplia (31). cosa que suggereix que els efectes de ΔFosB sobre DARPP-32 poden ser específics del temps i de la regió.
Vam plantejar la hipòtesi que les reduccions espectaculars dels índexs de senyalització de dopamina en el NAc dels ratolins ΔFosB probablement implicaven canvis en les neurones de projecció de dopamina VTA, tot i que ΔFosB no s'expressa en excés dins d'aquestes neurones.. Per tant, vam examinar l'expressió de gens relacionats amb la dopamina a la VTA, inclosa la tirosina hidroxilasa i el transportador de dopamina. Els nivells de tirosina hidroxilasa i transportador de dopamina es correlacionen positivament amb la producció de dopamina. Hi va haver una tendència que els ratolins ΔFosB presentessin una reducció de la tirosina hidroxilasa i una reducció significativa del transportador de dopamina, d'acord amb la desregulació de la senyalització de la dopamina al NAc.. Com que aquestes reduccions basals dels gens relacionats amb la dopamina a la VTA dels ratolins ΔFosB probablement reflecteixen la retroalimentació alterada del NAc durant la sobreexpressió ΔFosB a llarg termini., vam examinar l'expressió del receptor BDNF, TrkB, com a possible mecanisme de retroalimentació de NAc al VTA (32). Similar a la tirosina hidroxilasa i al transportador de dopamina, l'expressió de TrkB també va mostrar una tendència a reduir-se bàsicament en els ratolins ΔFosB que no van assolir significació quan es van corregir per a múltiples comparacions. El complex BDNF-TrkB es pot transportar retrògradament i actuar dins del VTA per afectar l'expressió gènica local i promoure el creixement i el manteniment cel·lular (33). A més, l'activació de BDNF de TrkB presinàptic dins del NAc pot estimular directament la neurotransmissió de dopamina (32), donant suport a una disminució subjacent de la senyalització de dopamina en aquests ratolins.
L'activació de dinorfina dels receptors κ-opioides regula la senyalització de la dopamina i és un altre mecanisme pel qual el NAc proporciona retroalimentació al VTA (34). Vam trobar que l'expressió del receptor d'opioides κ a la VTA mostrava una tendència a reduir-se en els ratolins ΔFosB. Com que s'ha demostrat que la sobreexpressió ΔFosB disminueix l'expressió de dinorfina al NAc (20), els ratolins ΔFosB probablement tinguin reduccions profundes en VTA κ-activació dels opioides. Tot i que la senyalització de dinorfina normalment exerceix un efecte inhibidor sobre les neurones de dopamina (35), les rates que mostren una autoadministració millorada de drogues d'abús presenten nivells reduïts de dinorfina al NAc, cosa que assenyala un paper per a la senyalització de dinorfina reduïda bàsicament en la millora de la sensibilitat a la recompensa (36). , 37). La desregulació del sistema dinorfina - κ-opioide s'ha relacionat amb l'adquisició i la persistència de l'abús de drogues, donant suport a un equilibri crític de la senyalització dels opioides en la normalització de les vies de la dopamina. (38).
A partir de la capacitat gratificant d'una dieta HF densa energèticament, vam plantejar la hipòtesi que una desregulació de la senyalització de recompenses de dopamina i opioides en ratolins ΔFosB predisposaria aquests ratolins a respostes de recompensa millorades a aquesta dieta, normalitzant així el sistema de recompensa mitjançant l'activació de l'hipotàlem. -Circuit VTA-NAc. Durant l'exposició a la dieta de sis setmanes, no es van observar diferències en la ingesta d'aliments entre ratolins ΔFosB i control, cosa que suggereix que els canvis trobats en els marcadors bioquímics i moleculars de senyalització de recompensa en ratolins ΔFosB no es van deure a diferències en les calories consumides. Com s'esperava, les diferències basals detectades en els nivells de pCREB, CREB total, BDNF, DARPP-32 i receptor d'opioides κ entre ΔFosB i els ratolins control es van atenuar, probablement a causa de l'augment de la producció de dopamina en ratolins ΔFosB a HF (29, 39-41) .
L'examen tant de la tirosina hidroxilasa com del transportador de dopamina al VTA va revelar respostes oposades sorprenents de ΔFosB i ratolins de control després de l'HF. Els ratolins control van mostrar una disminució de l'expressió del transportador de la tirosina hidroxilasa i la dopamina, mentre que els ratolins ΔFosB van mostrar una expressió més gran d'aquests dos gens relacionats amb la dopamina. Curiosament, l'expressió de la tirosina hidroxilasa es veu alterada a la VTA per l'administració crònica de cocaïna o metamfetamina (42-44), cosa que suggereix que els ratolins ΔFosB poden trobar la recompensa natural de l'HF més destacada que els ratolins control.
Per tal d'examinar com l'entrada hipotalàmica potencial al VTA pot transmetre senyals que reflecteixen l'equilibri energètic, també es va examinar l'expressió del receptor de leptina i el receptor-1 d'orexina. Els nivells de leptina circulants augmenten per HF i, al seu torn, la leptina pot actuar a la VTA per alterar la senyalització de la dopamina (18, 45). L'expressió del receptor de leptina VTA es va reduir de manera similar per HF tant en ΔFosB com en ratolins control, d'acord amb un augment de pes i una ingesta de dieta similars mentre es trobava amb HF. L'alt greix també va augmentar l'expressió del receptor d'orexina-1 en el VTA tant de ΔFosB com de ratolins control. L'orexina activa les neurones de dopamina a la VTA, afavoreix la plasticitat de la VTA i augmenta els nivells de dopamina a la NAc (46-48). S'ha demostrat que la dieta alta en greixos augmenta l'expressió d'orexina en ratolins, d'acord amb les nostres observacions (49, 50). Així, l'augment de l'expressió del receptor de l'orexina, així com els canvis en la senyalització de la leptina a la VTA podrien promoure la recompensa de la dieta tant en ΔFosB com en ratolins de control, donant suport a una dissociació entre les vies que transmeten senyals de balanç energètic i les vinculades directament a la recompensa.
Per examinar els efectes que provoquen l'estrès de la retirada de la recompensa, es van examinar els ratolins en una prova de camp obert 24 hores després de l'eliminació de l'HF. Els ratolins ΔFosB eren més sensibles als efectes aguts de la retirada de la dieta preferida, mostrant una major activitat d'excitació i producció de boli fecals a la nova arena oberta en comparació amb tots els altres grups de control i dieta. Els ratolins ΔFosB també van mostrar un patró de comportament interessant en aquesta prova que suggereix la recompensa i la sensibilitat a l'estrès, amb la dieta HF inicialment reduint la producció de boli fecal en relació amb el menjar, i la retirada torna a augmentar aquesta resposta relacionada amb l'ansietat. Aquest augment observat de l'activitat de camp obert no es va correlacionar amb els canvis en l'expressió de l'orexina, cosa que suggereix una relació amb l'excitació induïda per l'estrès que no és només un efecte dels canvis en la senyalització mediada per l'orexina. En general, aquestes dades donen suport a la nostra hipòtesi que els ratolins ΔFosB serien més sensibles als efectes aguts de la retirada de la dieta preferida a causa de la seva major sensibilitat a la recompensa..
Com la sobreexpressió a llarg termini de ΔFosB al NAc condueix a aquests canvis en el comportament i la senyalització de recompensa? Hem proposat un model de detecció coincident de VTA en què la retroalimentació alterada del NAc i l'hipotàlem transmet senyals sobre l'estat de recompensa per determinar la regulació del sistema de dopamina que pot donar suport a un vincle entre la desregulació de la via de recompensa i una predisposició a l'obesitat (Fig. 8). Durant l'exposició a HF, múltiples entrades que reflecteixen tant el balanç energètic com l'estat de recompensa convergeixen al VTA. Els augments de la senyalització de leptina i orexina, així com la retroalimentació alterada del NAc a l'hipotàlem lateral poden afectar com aquests senyals orexigènics responen a l'HF en els ratolins ΔFosB (17, 18, 45, 47, 51-53). Les elevacions de BDNF induïdes per una dieta alta en greixos poden proporcionar retroalimentació de recompensa al VTA, promovent encara més els canvis en l'expressió gènica relacionada amb la dopamina.
figura 8
La dieta alta en greixos (HF) normalitza la senyalització de recompensa desregulada en ratolins ΔFosB
Aquests resultats delineen els marcadors moleculars de la sensibilitat a la recompensa i indiquen que la desregulació a llarg termini del sistema de dopamina pot predisposar un individu a l'addicció i l'obesitat. A més, aquestes dades proporcionen un pas important cap a la identificació de nous objectius terapèutics potencials en el tractament i la prevenció de l'obesitat i altres trastorns que es poden centrar en el sistema de recompensa. En el futur, serà important investigar com respon aquest sistema a l'eliminació de la dieta HF, així com investigar les diferències de sexe en la sensibilitat a la recompensa i l'exposició a una dieta alta en greixos.
Material complementari
Sup. Mètodes
Feu clic aquí per veure'l.(61K, doc)
Agraïments
Els autors volen agrair a Cathy Steffen l'ajuda amb la cria i la transferència d'animals. Aquest treball va comptar amb el suport d'una subvenció del Centre de Diabetis de la Universitat de Pennsilvània (DK019525) i de les subvencions de l'Institut Nacional de Salut Mental (R01 MH51399 i P50 MH66172) i l'Institut Nacional d'Abús de Drogues (R01 DA07359).
Notes al peu
Divulgacions financeres: Tots els autors declaren que no tenen interessos financers biomèdics ni conflictes d'interès potencials.
referències
1. Wadden TA, Berkowitz RI, Womble LG, Sarwer DB, Phelan S, Cato RK, Hesson LA, Osei SY, Kaplan R, Stunkard AJ. Assaig aleatoritzat de modificació de l'estil de vida i farmacoteràpia per a l'obesitat. N Engl J Med. 2005;353(20):2111–20.[PubMed]
2. Blendy JA, Strasser A, Walters CL, Perkins KA, Patterson F, Berkowitz R, Lerman C. Reduced nicotine reward in obesity: cross-comparation in human and mouse. Psicofarmacologia (Berl) 2005
3. Franken IH, Muris P. Les diferències individuals en la sensibilitat a la recompensa estan relacionades amb el desig de menjar i el pes corporal relatiu en dones sanes. gana. 2005;45(2):198–201.[PubMed]
4. Kelley AE, Berridge KC. La neurociència de les recompenses naturals: rellevància per a les drogues addictives. J Neurosci. 2002;22(9):3306–11.[PubMed]
5. Cagniard B, Balsam PD, Brunner D, Zhuang X. Els ratolins amb una dopamina elevada crònicament presenten una motivació millorada, però no un aprenentatge, per obtenir una recompensa alimentària. Neuropsicofarmacologia. 2006;31(7):1362–70.[PubMed]
6. Liang NC, Hajnal A, Norgren R. Sham alimentant oli de blat de moro augmenta la dopamina accumbens a la rata. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2006;291(5):R1236–9.[PubMed]
7. Mendoza J, Angeles-Castellanos M, Escobar C. L'arrossegament per un àpat agradable indueix l'activitat anticipatòria d'aliments i l'expressió de c-Fos a les zones del cervell relacionades amb la recompensa. Neurociència. 2005;133(1):293–303.[PubMed]
8. Schroeder BE, Binzak JM, Kelley AE. Un perfil comú d'activació cortical prefrontal després de l'exposició a indicis contextuals associats a la nicotina o la xocolata. Neurociència. 2001;105(3):535–45.[PubMed]
9. Nestler EJ, Barrot M, Self DW. DeltaFosB: un interruptor molecular sostingut per a l'addicció. Proc Natl Acad Sci US A. 2001;98(20):11042–6. [Article gratuït de PMC][PubMed]
10. Teegarden SL, Bale TL. La disminució de la preferència dietètica produeix un augment de l'emocionalitat i el risc de recaiguda en la dieta. Biol Psiquiatria. 2007;61(9):1021–9.[PubMed]
11. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Nestler EJ, Taylor JR. dFosB al nucli accumbens regula el comportament i la motivació instrumentals reforçats amb aliments. Revista de Neurociència. 2006;26(36):9196–9204.[PubMed]
12. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animals transgènics amb expressió gènica inducible i dirigida al cervell. Mol Pharmacol. 1998;54(3):495–503.[PubMed]
13. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto Senyor, Nestler EJ. L'expressió del factor de transcripció deltaFosB al cervell controla la sensibilitat a la cocaïna. Naturalesa. 1999;401(6750):272–6.[PubMed]
14. Bale TL, Dorsa DM. Diferències de sexe i efectes dels estrògens sobre l'expressió d'àcid ribonucleic missatger del receptor d'oxitocina a l'hipotàlem ventromedial. Endocrinologia. 1995;136(1):27–32.[PubMed]
15. Avena NM, Long KA, Hoebel BG. Les rates dependents del sucre mostren una millor resposta al sucre després de l'abstinència: evidència d'un efecte de privació de sucre. Comportament de Physiol. 2005;84(3):359–62.[PubMed]
16. Will MJ, Franzblau EB, Kelley AE. Els mu-opioides Nucleus accumbens regulen la ingesta d'una dieta alta en greixos mitjançant l'activació d'una xarxa cerebral distribuïda. J Neurosci. 2003;23(7):2882–8.[PubMed]
17. Zheng H, Patterson LM, Berthoud HR. La senyalització d'orexina a l'àrea tegmental ventral és necessària per a la gana alta en greixos induïda per l'estimulació opioide del nucli accumbens. J Neurosci. 2007;27(41):11075–82.[PubMed]
18. Hommel JD, Trinko R, Sears RM, Georgescu D, Liu ZW, Gao XB, Thurmon JJ, Marinelli M, DiLeone RJ. La senyalització del receptor de leptina a les neurones de dopamina del cervell mitjà regula l'alimentació. Neurona. 2006;51(6):801–10.[PubMed]
19. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. La sobreexpressió específica del tipus de cèl·lula estriatal de DeltaFosB millora l'incentiu per a la cocaïna. J Neurosci. 2003;23(6):2488–93.[PubMed]
20. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Un paper essencial per a DeltaFosB al nucli accumbens en l'acció de la morfina. Nat Neurosci. 2006;9(2):205–11.[PubMed]
21. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Formació de la columna dendrítica induïda per la cocaïna en neurones espinoses mitjanes que contenen receptors de dopamina D1 i D2 al nucli accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103(9):3399–404. [Article gratuït de PMC][PubMed]
22. Blendy JA, Maldonado R. Anàlisi genètica de l'addicció a les drogues: el paper de la proteïna d'unió a l'element de resposta cAMP. J Mol Med. 1998;76(2):104–10.[PubMed]
23. Nestler EJ. Mecanismes moleculars de la drogodependència. Neurofarmacologia. 2004;47 1:24–32.[PubMed]
24. Tanis KQ, Duman RS, Newton SS. Unió i activitat del CREB al cervell: especificitat regional i inducció per convulsions electroconvulsives. Biol Psiquiatria. 2007
25. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. La remodelació de la cromatina és un mecanisme clau subjacent a la plasticitat induïda per la cocaïna a l'estriat. Neurona. 2005;48(2):303–14.[PubMed]
26. Graham DL, Edwards S, Bachtell RK, Dileone RJ, Rios M, Self DW. L'activitat dinàmica del BDNF al nucli accumbens amb l'ús de cocaïna augmenta l'autoadministració i la recaiguda. Nat Neurosci. 2007;10(8):1029–37.[PubMed]
27. Svenningsson P, Nairn AC, Greengard P. DARPP-32 media les accions de múltiples drogues d'abús. Aaps J. 2005;7(2):E353–60. [Article gratuït de PMC][PubMed]
28. Palmer AA, Verbitsky M, Suresh R, Kamens HM, Reed CL, Li N, Burkhart-Kasch S, McKinnon CS, Belknap JK, Gilliam TC, Phillips TJ. Diferències d'expressió gènica en ratolins seleccionats de manera divergent per a la sensibilitat a la metamfetamina. Mamm Genoma. 2005;16(5):291–305.[PubMed]
29. Bogush A, Pedrini S, Pelta-Heller J, Chan T, Yang Q, Mao Z, Sluzas E, Gieringer T, Ehrlich ME. AKT i CDK5/p35 medien la inducció del factor neurotròfic derivat del cervell de DARPP-32 en neurones espinoses de mida mitjana in vitro. J Biol Chem. 2007;282(10):7352–9.[PubMed]
30. Benavides DR, Bibb JA. Paper de Cdk5 en l'abús de drogues i la plasticitat. Ann NY Acad Sci. 2004;1025:335–44.[PubMed]
31. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Els efectes de l'exposició crònica a la cocaïna estan regulats per la proteïna neuronal Cdk5. Naturalesa. 2001;410(6826):376–80.[PubMed]
32. Blohl A, Sirrenberg C. Les neurotrofines estimulen l'alliberament de dopamina de les neurones mesencefàliques de rata mitjançant els receptors Trk i p75Lntr. J Biol Chem. 1996;271(35):21100–7.[PubMed]
33. Berton O, McClung CA, Dileone RJ, Krishnan V, Renthal W, Russo SJ, Graham D, Tsankova NM, Bolanos CA, Rios M, Monteggia LM, Self DW, Nestler EJ. Paper essencial del BDNF en la via mesolímbica de la dopamina en l'estrès de la derrota social. Ciència. 2006;311(5762):864–8.[PubMed]
34. Nestler EJ, Carlezon WA., Jr El circuit de recompensa de dopamina mesolímbica en la depressió. Biol Psiquiatria. 2006;59(12):1151–9.[PubMed]
35. Ford CP, Beckstead MJ, Williams JT. Inhibició opioide Kappa dels corrents postsinàptics inhibidors de la dopamina somatodendrítica. J Neurophysiol. 2007;97(1):883–91.[PubMed]
36. Nylander I, Vlaskovska M, Terenius L. Sistemes de dinorfina i encefalina cerebrals en rates Fischer i Lewis: efectes de la tolerància a la morfina i la retirada. Cervell Res. 1995;683(1):25–35.[PubMed]
37. Nylander I, Hyytia P, Forsander O, Terenius L. Diferències entre rates que prefereixen l'alcohol (AA) i que eviten l'alcohol (ANA) en els sistemes de prodinorfina i proenkefalina. Alcohol Clin Exp Res. 1994;18(5):1272–9.[PubMed]
38. Kreek MJ. Cocaïna, dopamina i sistema opioide endogen. J Addict Dis. 1996;15(4):73–96.[PubMed]
39. Carlezon WA, Jr, Duman RS, Nestler EJ. Les múltiples cares del CREB. Tendències Neurosci. 2005;28(8):436–45.[PubMed]
40. Dudman JT, Eaton ME, Rajadhyaksha A, Macias W, Taher M, Barczak A, Kameyama K, Huganir R, Konradi C. Els receptors de dopamina D1 medien la fosforilació CREB mitjançant la fosforilació del receptor NMDA a Ser897-NR1. J Neurochem. 2003;87(4):922–34.[PubMed]
41. Self DW. Regulació de les conductes de presa i recerca de drogues per neuroadaptacions en el sistema de dopamina mesolímbica. Neurofarmacologia. 2004;47 1:242–55.[PubMed]
42. Beitner-Johnson D, Nestler EJ. La morfina i la cocaïna exerceixen accions cròniques comunes sobre la tirosina hidroxilasa a les regions dopaminèrgiques de recompensa del cervell. J Neurochem. 1991;57(1):344–7.[PubMed]
43. Lu L, Grimm JW, Shaham Y, Hope BT. Neuroadaptacions moleculars a l'àrea tegmental accumbens i ventral durant els primers 90 dies d'abstinència forçada de l'autoadministració de cocaïna en rates. J Neurochem. 2003;85(6):1604–13.[PubMed]
44. Shepard JD, Chuang DT, Shaham Y, Morales M. Efecte de l'autoadministració de metamfetamina sobre els nivells de transportador de tirosina hidroxilasa i dopamina en les vies de dopamina mesolímbic i nigrostriatal de la rata. Psychopharmacology (Berl) 2006;185(4):505–13.[PubMed]
45. Fulton S, Pissios P, Manchon RP, Stiles L, Frank L, Pothos EN, Maratos-Flier E, Flier JS. Regulació de la leptina de la via de la dopamina mesoaccumbens. Neurona. 2006;51(6):811–22.[PubMed]
46. Narita M, Nagumo Y, Miyatake M, Ikegami D, Kurahashi K, Suzuki T. Implicació de la proteïna cinasa C en l'elevació induïda per l'orexina dels nivells extracel·lulars de dopamina i el seu efecte gratificant. Eur J Neurosci. 2007;25(5):1537–45.[PubMed]
47. Narita M, Nagumo Y, Hashimoto S, Khotib J, Miyatake M, Sakurai T, Yanagisawa M, Nakamachi T, Shioda S, Suzuki T. Implicació directa dels sistemes orexinèrgics en l'activació de la via mesolímbica de la dopamina i conductes relacionades induïdes per morfina. J Neurosci. 2006;26(2):398–405.[PubMed]
48. Borgland SL, Taha SA, Sarti F, Fields HL, Bonci A. L'orexina A al VTA és fonamental per a la inducció de la plasticitat sinàptica i la sensibilització del comportament a la cocaïna. Neurona. 2006;49(4):589–601.[PubMed]
49. Park ES, Yi SJ, Kim JS, Lee HS, Lee IS, Seong JK, Jin HK, Yoon YS. Canvis en l'expressió d'orexina-A i neuropèptid Y a l'hipotàlem de les rates alimentades amb dieta en dejuni i alta en greixos. J Vet Sci. 2004;5(4):295–302.[PubMed]
50. Wortley KE, Chang GQ, Davydova Z, Leibowitz SF. Pèptids que regulen la ingesta d'aliments: l'expressió del gen de l'orexina augmenta durant els estats d'hipertrigliceridèmia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;284(6):R1454–65.[PubMed]
51. Zheng H, Corkern M, Stoyanova I, Patterson LM, Tian R, Berthoud HR. Pèptids que regulen la ingesta d'aliments: la manipulació accumbens que indueix la gana activa les neurones de l'orexina hipotalàmica i inhibeix les neurones POMC. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003;284(6):R1436–44.[PubMed]
52. Baldo BA, Gual-Bonilla L, Sijapati K, Daniel RA, Landry CF, Kelley AE. Activació d'una subpoblació de neurones hipotalàmiques que contenen orexina/hipocretina per inhibició mediada pel receptor GABAA de la closca del nucli accumbens, però no per exposició a un entorn nou. Eur J Neurosci. 2004;19(2):376–86.[PubMed]
53. Harris GC, Wimmer M, Aston-Jones G. Un paper de les neurones d'orexina hipotalàmica lateral en la recerca de recompenses. Naturalesa. 2005;437(7058):556–9.[PubMed]
;
