font
The Nathan Kline Institute, Orangeburg, Nova York, 10962, EUA. [protegit per correu electrònic]
abstracte
Els nens i adolescents estan cada vegada més exposats a psicostimulants, ja sigui de manera il·lícita o per al tractament de malalties neuropsiquiàtriques comunes, com ara el trastorn per dèficit d’atenció amb i sense hiperactivitat. Malgrat l’ús generalitzat d’estimulants psicomotors en grups d’edat més joves, se sap poc sobre les respostes neuroadaptatives moleculars cròniques a aquests agents en el cervell immadur. Aquí demostrem que, després d’administració crònica dels psicoestimulants cocaïna i amfetamina, el factor de transcripció DeltaFosB està regulat al nucli accumbens de periadolescent mice però no en post-deslletament o adult mice. Inducció de DeltaFosB també es produeix exclusivament en el putamen caudat de periadolescent mice després amfetamina Administració. Aquests resultats demostren la plasticitat única en el cervell adolescent d’una molècula crítica que regula l’acció psicoestimulant i suggereix que aquests canvis neuroadaptatius poden estar implicats en la mediació de millorat tendències addictives en l'adolescent en relació amb l'adult.
introducció
Els psicostimulants s’utilitzen en el tractament de trastorns comuns de la infància, com el trastorn per dèficit d’atenció per hiperactivitat. A més, l’abús d’estimulants, incloent amfetamina i cocaïna, és freqüent entre els adolescents, una edat en què hi ha evidències de tendències addictives millorades en relació amb els adults (Estroff et al., 1989; Myers i Anderson, 1991). Malgrat les dades que indiquen efectes conductuals regulats en el desenvolupament, se sap poc sobre les respostes neuroadaptatives moleculars en el cervell immadur que es produeixen en el moment de l'administració d'aquests agents. La cocaïna i l'anfetamina poden produir canvis conductuals duradors en part mitjançant l'estimulació de la dopamina D1receptors i augment dels nivells de factors de transcripció, incloent-hi BFosB, en l'estri dorsal (és a dir, el putamen caudat) i l'estri ventral (és a dir, el nucli accumbens) (Chen et al., 1997). Els augments en els nivells de FosB, potser a través de l’estabilització de productes proteics, es mantenen durant diverses setmanes després de l’exposició crònica a la cocaïna o l’anfetamina i estan regulades almenys en part per la via de transducció de senyals de dopamina (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
El sistema dopaminèrgic central dels animals joves es troba molt canviat a causa del canvi de nivells de molècules crítiques durant el desenvolupament normal, inclosa la dopamina D1receptor DARPP-32 (fosfoproteïna regulada per dopamina i cAMP; Mr de 32 kDa) i cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). L’exposició durant aquest període a psicoestimulants, que milloren la neurotransmissió dopaminèrgica, pot resultar en respostes moleculars quantitatives i / o qualitativament diferents, incloent alteracions de l’expressió .FosB. Per provar la hipòtesi que hi hagi respostes neuroadaptatives dependents de l’edat durant l’exposició crònica a psicostimulants, s’han analitzat tres grups de ratolins en experiments en sèrie: adults (60 d vell a l’inici de les injeccions), periadolescents (33 d vell a l’inici de les injeccions), i post-deslletament (vell 24 a l'inici de la injecció). Aquesta és la primera comparació directa de les respostes neuroadaptatives moleculars a l'exposició psicostimulant crònica en aquests tres grups d'edat. Hem trobat que, després de paradigmes de tractament idèntics, els ratolins periadolescents mostren una major regulació de BFosB en resposta tant a la cocaïna com a l’anfetamina.
MATERIALS I MÈTODES
Administració d’animals i drogues. Els ratolins masculins CD-1 (Charles River Laboratories, Kingston, NY) es van allotjar en un cicle fosc / fosc de 12 (6: 00 AM a 6: 00 PM) amb ad libitumaccés a menjar i aigua. Es va permetre als animals acomodar-se a la sala dels animals per obtenir un mínim de 10 d abans de l'inici de les injeccions. Els animals van ser manipulats per dos investigadors que van realitzar totes les injeccions a la mateixa habitació on es trobaven els animals. Tots els animals van ser deslletats a 21 d d’edat. Les injeccions van començar a 24 (post-deslletament), 33 (periadolescent) o 60 (adult) d d’edat. Els animals van rebre 20 mg / kg de cocaïna (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg d'amfetamina (Sigma), o un volum igual de solució salina intraperitoneal entre 4: 00 i 5: 00 PM diàriament per 7 d. Els animals van ser assassinats per decapitació després d'una breu exposició al CO2 a 10: 00 AM el dia després de la injecció final. Els cervells van ser immediatament retirats del crani, i el putamen caudat i el nucli accumbens es disseccionar ràpidament en gel. Totes les disseccions es van realitzar a partir de rodanxes cerebrals coronals per un sol investigador i els extractes de proteïnes es van preparar a partir de teixit fresc sense congelar. Tots els procediments sobre animals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cures i Usos d’Animal i van estar d’acord amb els Instituts Nacionals de Salut Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori.
Anàlisi Western blot. Per a anàlisis de Western blot, es van carregar quantitats iguals de proteïna (40 μg per a putamen caudat i 20 μg per a nucli accumbens) a cada pista d’un gel 10% SDS-poliacrilamida després de mesurar les concentracions de proteïnes amb l’assaig BCA (Pierce, Rockford, IL). La càrrega igual de proteïnes també es va verificar mitjançant la visualització de la proteïna total per Ponceau Red després de la transferència a nitrocelulosa i / o transferència amb anticossos anti-actina (1: 500; Sigma). L’antisero de l’antigen relacionat amb Fos (FRA), que reconeix les isoformes ΔFosB, va ser generosament proporcionat pel Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) i utilitzat en una concentració de 1: 4000. Estudis previs (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), incloent la pre-absorció de l’antisérum FRA amb l’immunogen M-pèptid, va demostrar l’especificitat d’aquest antisuer. L’anticòs monoclonal DARPP-32 5a, que s’utilitza a 1: 10,000, va ser generosament proporcionat pels Drs. Hugh Hemmings i Paul Greengard (la Universitat Rockefeller, Nova York, NY). L’anticòs del transportador de dopamina (DAT) era de Chemicon (Temecula, CA). Els blots van reaccionar amb el sistema de quimioluminiscència NEN-DuPont (Boston, MA) i es van exposar a la pel·lícula. Els valors densitomètrics per a la immunoreactivitat ΔFosB es van obtenir utilitzant ScanAnalysis per Apple (Biosoft, Ferguson, MO). La importància estadística es va determinar utilitzant un ANOVA unidireccional, seguit de post hoc La prova de comparació múltiple de Tukey o un estudiant de dues cues sense parell t prova tal com s'indica a la figura de les llegendes. Per als experiments de tractament farmacèutic, es va realitzar una anàlisi de cada grup d’edat en una transferència separada i, per tant, a cada grup de solucions salines se li va assignar arbitràriament un valor 100% per a la comparació entre grups d’edat. Per als estudis ontogenètics, es van analitzar mostres de tots els grups d’edat en un sol tractament.
RESULTATS
La inducció de ΔFosB després de la cocaïna i l'anfetamina es produeix al nucli accumbens de només ratolins periadolescents
L’expressió de ΔFosB es va mesurar al nucli accumbens i al putamen caudat de ratolins post-deslletats, peradolescents i adults després de l'administració de 7 d d’anfetamina o cocaïna. El nucli accumbens és la regió del cervell que es creu que és fonamental per a mediar els efectes gratificants dels psicoestimulants. La immunoreactivitat ΔFosB (35 kDa) va ser induïda selectivament al nucli accumbens d’animals periadolescents després de l’administració crònica d’anfetamina (fig. 1 A) o cocaïna (fig. 1 B). Per contra, els nivells de FosB (35 kDa) no es van alterar significativament al nucli accumbens dels animals post-deslletats o adults (fig.1 A,B). En el putamen caudat, els nivells de ΔFosB (35 kDa) també van ser significativament regulats després de l’administració d’anfetamina crònica només en animals peradolescents (Fig.2 A). Els tres grups d’edat van mostrar un augment significatiu de l’expressió BFosB (35 kDa) al putamen caudat després de l’administració crònica de cocaïna (fig.2 B). Tanmateix, la magnitud de la inducció va ser més gran en els animals periadolescents, especialment en comparació amb els post-deslletaments (fig. 7). 2 B). Altres isoformes de FRA i Fos no van alterar-se en totes les edats (dades no mostrades).
La immunoreactivitat BFosB al nucli accumbens després de l'administració de psicoestimulants crònics. Els ratolins CD-1 van ser injectats una vegada al dia amb solució salina, amfetamina o cocaïna per a 7 d començant el dia 24 (P24; post-deslletament), dia 33 (P33; periadolescent), o el dia 60 (Adult). Els nivells d’immunoreactivitat BFosB (35 kDa) en el nucli accumbens es mostren després d’anfetamina crònica (A) o cocaïna (B) Administració. Immunoblots representatius de salines (S), amfetamina (A), i cocaïna (C) injectat post-deslletat (P24), periadolescent (P33), i els ratolins adults apareixen a la pàgina panells superiors. Panells inferiors mostra el percentatge mitjà ± SEM de l’expressió basal BFosB. n Els valors de cada grup es mostren a la pàgina bars. Es van trobar increments significatius de ΔFosB al nucli accumbens de només els ratolins periadolescents. *p <0.05; **p <0.01 (estudiant t prova; salina vs droga).
ΔForB immunoreactivitat en el putamen caudat després de l'administració de psicoestimulants crònics. Els ratolins CD-1 van ser injectats una vegada al dia amb solució salina, amfetamina o cocaïna per a 7 d començant el dia 24 (P24; post-deslletament), dia 33 (P33; periadolescent), o el dia 60 (Adult). Els nivells d’immunoreactivitat BFosB (35 kDa) en el putamen caudat es mostren després d’anfetamina crònica (A) o cocaïna (B) Administració. Immunoblots representatius de salines (S), amfetamina (A), i cocaïna (C) ratolins periadolescents injectats (P33) es mostren a la pàginapanells superiors. Panells inferiors mostra el percentatge mitjà ± SEM de l’expressió basal BFosB. n Els valors de cada grup es mostren a la pàgina bars. S'han trobat increments significatius induïts per l'anfetamina en la immunoreactivitat BFosB al putamen caudat de només ratolins periadolescents (A). L’administració crònica de cocaïna ha produït increments de ΔFosB en els tres grups d’edat (B). *p <0.05; **p <0.01 (estudiant t prova; salina vs droga).
Els nivells DAT i DARPP-32 no s'alteren després de cocaïna crònica o amfetamina
Diverses molècules clau expressades per neurones dopaminèrgiques i / o dopaminoceptives, incloent DARPP-32, la D1 receptor de dopamina i DAT, contribueixen a respostes agudes i cròniques als psicoestimulants (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Dades de DARPP-32, D1 els ratolins receptor i DAT nuls i DAT indiquen una relació complicada entre els seus nivells, la regulació de l'activitat dopaminèrgica i les respostes als psicoestimulants. De fet, la inducció de FosB no ocorre en ratolins nuls DARPP-32 que reben cocaïna crònica (Fienberg et al., 1998). En ratolins adults, però, l’exposició de 7 a 20 mg / kg de cocaïna no altera els nivells totals de DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). La regulació de la proteïna DAT no s'ha informat prèviament de ratolins exposats crònicament a psicoestimulants, tot i que en algunes espècies s'ha detectat alteració de la unió a la radioliganda al transportador de dopamina després de l'exposició a psicoestimulants.Letchworth et al., 2001). Aquí hem mesurat els nivells de proteïna DARPP-32 i DAT per determinar si l’expressió d’aquestes proteïnes s’ha alterat després de l’administració de psicoestimulants crònics en qualsevol de les tres edats de ratolins. Els nostres resultats indiquen que no hi va haver canvis significatius en els nivells de DARPP-32 total o DAT a tot el putamen caudat o nucli accumbens després de l’administració crònica de cocaïna o amfetamina en qualsevol dels tres grups d’edat. 1).
Valors de densitometria relativa de DARPP-32 i DAT en ratolins P24, P33 i ratolins adults tractats amb anfetamina i cocaïna en relació amb els valors de solució salina, arbitràriament fixats a 100%
Els nivells basals de FosB estan regulats pel desenvolupament
Hem examinat l’ontogènia de ΔFosB, ja que els ratolins adults amb una expressió genèticament augmentada de ΔFosB a l’estudi tenen una resposta comportamental elevada als psicoestimulants (Kelz et al., 1999). Hem trobat que els nivells basals de FosB van ser significativament més baixos en animals joves en comparació amb l’adult en el putamen caudat i el nucli accumbens (Fig.3 A). Nivells de marcadors funcionals del sistema de dopamina, incloent DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996), i receptors de dopamina (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) també estan regulats pel desenvolupament. Els informes anteriors en ratolins CD-1 indiquen un pic en DARPP-32 estriatal en el dia postnatal 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). En el putamen caudat de la rata i el nucli accumbens, D1nivells de receptors màxims de P28 a P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), però no s’han realitzat estudis similars al ratolí. Per contra, aquí vam trobar que els nivells de proteïna DAT al putamen caudat i el nucli accumbens eren constants entre el dia postnatal 24 i l'edat adulta (fig. 3 B). Així, les proporcions relatives entre D1 els receptors, DAT, DARPP-32 i ΔFosB difereixen entre els grups d'edat, potencialment resultant en diferències en D1 activitat del receptor que podria influir en el grau d’inducció de BFosB.
Expressió del desenvolupament de ΔFosB i DAT. A, ΔFosB (35 – 37 kDa) immunoreactivitat en el putamen caudat i el nucli accumbens de ratolins CD-1 ingenus en funció de l'edat. Els immunoblots representatius es mostren a la panells superiors.Panells inferiors mostra els mitjans ± SEM de tres ratolins per grup. *p <0.05, adult versus P24; #p <0.05, adult versus P36 (prova de comparació múltiple de Tukey després d'ANOVA). BEls valors densitomètrics de l’immunoreactivitat DAT al putamen caudat i al nucli accumbens per a ratolins CD-1 ingenus en funció de l’edat. Els nivells de DAT no van diferir entre els tres grups d’edat.
DISCUSSIÓ
Els efectes del comportament dels estimulants psicomotors depenen de l'edat. Les tendències addictives són més elevades en l’adolescència, quan l’ús d’explotacions de substàncies il·lícites augmentaEstroff et al., 1989; Myers i Anderson, 1991). De fet, els nens més petits esdevenen freqüentment disfòrics quan estan exposats a psicoestimulants, mentre que els adolescents i els adults experimenten eufòria (Rapoport et al., 1980). En els models de rosegadors, alguns estudis suggereixen que els animals periadolescents tenen nivells més alts d’activitat (de base).Llança i fre, 1983) i va alterar les respostes als psicoestimulants en relació amb els animals més joves i majors. Per tant, mostren menys estimulació locomotora i la recerca de novetats en resposta a l'administració aguda de baixes dosis de psicoestimulants en relació amb els animals deslletats i adults, però amb un augment de la hiperactivitat després d'un tractament alt. Amb l'administració crònica, la sensibilització a la locomoció induïda per la cocaïna és més gran en les rates periadolescents en comparació amb els adults, mentre que la sensibilització a la estereotip és menor. A més, les dades de microdiàlisi han revelat diferències entre les rates periadolescents i les adultes pel que fa a la sensibilització a l'alliberament de dopamina induïda per l'anfetamina (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani i Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). No obstant això, hi ha estudis contradictoris quant a la reactivitat a llarg termini de la cocaïna després de l'administració de metilfenidat a rates adolescents (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Aquests dos darrers informes posen de manifest la dificultat de comparar estudis quan s'utilitzen diferents paradigmes experimentals. Els intents de comparar estudis de comportament en animals joves es confonen encara més per l’ús de diferents espècies i soques.
El ratolí s'està convertint en un model animal cada vegada més important en l’estudi de l’ús i l’abús dels psicoestimulants, i aquesta és la primera anàlisi sistemàtica de respostes neuroadaptatives moleculars en tres edats del desenvolupament del ratolí o de qualsevol altra espècie única. Estudis previs dels quals hem derivat els nostres paradigmes de tractament han demostrat un augment de ΔFosB en l’esquena dorsal i ventral aïllada de rates adultes de tipus salvatge després de l’administració crònica de cocaïna i anfetamina (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) però només en l’estriat combinat dorsal i ventral o en l’estriat dorsal aïllat de ratolins adults de tipus salvatge després de cocaïna crònica (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Ara demostrem una diferència espacial i quantitativa en ΔFosB induïda pels psicosimulants en ratolins post-deslletats, peradolescents i adults. L’observació d’una major resposta en els animals periadolescents en comparació amb els adults i els post-deslletaments es veu reforçada pel fet que la resposta és similar als ratolins tractats amb cocaïna i amfetamina. Els psicoestimulants de cocaïna i anfetamina incrementen la dopamina sinàptica, la serotonina i la norepinefrina, però per diferents mecanismes. La cocaïna s'uneix als transportadors de plasmalèmia per la dopamina, la serotonina i la norepinefrina i inhibeix la seva recaptació en terminals presinàptics. En canvi, l'anfetamina promou l'alliberament d'aquests transmissors. La inducció selectiva de FosB al nucli accumbens de només el grup d’edat periadolescent després d’administració de 7 d d’estimulants i la inducció relativament elevada de ΔFosB en el putamen caudat pot ser una representació neurobiològica o causa de l’augment de la tendència observada anteriorment a abusar de psicoestimulants grup d'edat (Estroff et al., 1989; Myers i Anderson, 1991) i altres canvis a llarg termini en l’expressió gènica, que difereixen entre els grups d’edat (Andersen et al., 2002). A més, aquestes diferències poden estar regulades intrínsicament per alteracions del desenvolupament dels nivells de molècules clau, incloent-hi BFosB mateix. Les implicacions potencials de les diferències en els nivells basals de FosB entre els grups d’edat són anàlogues a les proposades quant a diferències entre soques de rata (Haile et al., 2001). De fet, anticipem que es trobaran diferències de tensió similars entre els ratolins endins. També és possible que els ratolins de diferents edats mostrin adaptacions moleculars diferents en àrees del cervell que no siguin el nucli accumbens. Les anàlisis addicionals que utilitzen ratolins periadolescents amb alteracions genètiques en nivells de molècules clau i observacions de comportament concurrents provaran posteriorment aquestes hipòtesis.
Notes al peu
- Rebut Abril 8, 2002.
- Revisió rebuda Agost 6, 2002.
- acceptat Agost 8, 2002.
Aquest treball va comptar amb el suport dels Instituts Nacionals de Salut / Institut Nacional de Trastorns Neurològics i Accidents d’ictus NS41871 (MEE i EMU) i l’Institut Nacional sobre l’abús de drogues P30-DA13429 (EMU).
La correspondència s'hauria d'adreçar a la Dra. Michelle E. Ehrlich, a la Universitat Thomas Jefferson, a Curtis 310, al carrer 1025 Walnut, a Filadèlfia, PA 19107. Correu electrònic: [protegit per correu electrònic].
- Copyright © 2002 Society for Neuroscience
;