PLoS One. 2014 de juliol de 29;9(7):e102524. doi: 10.1371/journal.pone.0102524. eCollection 2014.
abstracte
L'exposició crònica a la cocaïna tant en addictes humans com en models d'addicció de rosegadors redueix l'activitat cortical prefrontal, que posteriorment desregula el processament de la recompensa i la funció executiva d'ordre superior. L'efecte net d'aquesta alteració del comportament és una major vulnerabilitat a la recaiguda. Anteriorment hem demostrat que els augments induïts per la cocaïna en l'expressió del factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) a l'escorça prefrontal medial (PFC) és un mecanisme neuroadaptatiu que embota l'eficàcia de reforç de la cocaïna. Com que se sap que el BDNF afecta la supervivència neuronal i la plasticitat sinàptica, vam provar la hipòtesi que l'abstinència de l'autoadministració de cocaïna comportaria alteracions en la morfologia neuronal i la densitat sinàptica del PFC. Mitjançant una tècnica nova, tomografia en matriu i tinció de Golgi, es van analitzar els canvis morfològics en el PFC de rata després de 14 dies d'autoadministració de cocaïna i 7 dies d'abstinència forçada. Els nostres resultats indiquen que la ramificació dendrítica global i la densitat sinàptica total es redueixen significativament en el PFC de rata. En canvi, la densitat de les espines dendrítiques primes augmenta significativament a les neurones piramidals de la capa V del PFC. Aquestes troballes indiquen que es produeixen canvis estructurals dinàmics durant l'abstinència de cocaïna que poden contribuir a la hipoactivitat observada del PFC en individus addictes a la cocaïna.
introducció
Es proposa que les alteracions de la plasticitat estructural dins dels circuits de recompensa siguin mecanismes clau que contribueixen a la poderosa capacitat de la cocaïna per mantenir el comportament de recerca de drogues (revisat a [1]). Estudis anteriors han demostrat un augment de l'arborització dendrítica i la densitat de la columna vertebral al nucli accumbens (NAc) [2]-[4], zona tegmental ventral [5]i l'escorça prefrontal (PFC) [6] després de l'exposició a la cocaïna. Si bé la majoria dels estudis s'han centrat en els canvis estructurals associats a l'activitat disfuncional del NAc, molts menys estudis han examinat les alteracions del PFC. Diverses línies d'evidència demostren la disfunció del PFC després de l'exposició crònica a la cocaïna en ambdós addictes humans. [7], [8] i en models d'addicció de rosegadors [9], [10]. Per tant, caracteritzar els canvis estructurals que es produeixen al PFC és rellevant per entendre els esdeveniments moleculars que subjauen a l'addicció.
El PFC regula el control dels impulsos i la presa de decisions i, per tant, té un paper important en la capacitat d'un individu per controlar el comportament, especialment en la dependència de drogues. [8], [11]. Per exemple, en individus addictes a la cocaïna, la disminució de l'activació de l'escorça prefrontal s'associa amb la retirada de drogues i les respostes executives d'ordre superior alterades. [7], [8], que pot augmentar la vulnerabilitat a la recaiguda. En rosegadors, l'augment de l'activitat neuronal del PFC s'associa amb la ingesta de cocaïna [9], [10], comportament compulsiu de recerca de drogues [12], i la reincorporació de la cocaïna després de la retirada [13]-[15]. A més, la biestabilitat de la membrana s'elimina al PFC després de l'administració crònica de cocaïna [16]. Finalment, l'activitat metabòlica induïda per fàrmacs en el PFC es redueix a les rates a les quals se'ls administra una injecció de desafiament durant la retirada de l'autoadministració de cocaïna. [9], [17]. En conjunt, aquests estudis indiquen que la cocaïna crònica indueix canvis funcionals profunds en el PFC que poden estar associats amb un augment del nombre de sinapsis inhibidores i/o una reducció de les sinapsis excitadores del PFC. No obstant això, no s'han dilucidat les alteracions morfològiques que es produeixen en el PFC després del consum crònic de drogues.
En el present estudi hem intentat examinar si l'abstinència de cocaïna condueix a canvis estructurals en el PFC. Les alteracions morfològiques es van examinar mitjançant un mètode tradicional, la tinció de Golgi, així com una nova tècnica, la tomografia en matriu. La tomografia en matriu és un mètode únic que combina la secció de teixit ultra prim amb la immunofluorescència i la reconstrucció d'imatges tridimensionals per permetre la quantificació precisa de la densitat de sinapsi específica total i de subtipus. [18], [19]. Utilitzant aquests mètodes, els nostres resultats van indicar una plasticitat substancial en PFC de rata en resposta a l'abstinència de la cocaïna.
Materials i mètodes
Animals i habitatge
Es van obtenir rates Sprague-Dawley mascles (Rattus norvegicus) amb un pes de 250 a 300 g de Taconic Laboratories (Germantown, NY). Els animals van ser allotjats individualment amb menjar i aigua disponibles ad libitum a la seva gàbia domèstica. Tots els protocols experimentals eren coherents amb les directrius emeses pels Instituts Nacionals de Salut dels EUA i van ser aprovats per la Perelman School of Medicine de la Universitat de Pennsilvània i el Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Pennsilvània.
Cirurgia
Abans de la cirurgia, les rates van ser anestesiades amb 80 mg/kg de ketamina i 12 mg/kg de xilazina (ip; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Es va inserir un catèter silàstic permanent (diàmetre interior 0.33 mm, diàmetre exterior 0.64 mm) a la vena jugular dreta i es va suturar al seu lloc. A continuació, es va passar el catèter per via subcutània per sobre de l'omòplat i es va dirigir a una plataforma de muntatge posterior de malla (CamCath, Cambridge, Regne Unit) que es va suturar per sota de la pell directament per sobre de l'escàpula. Els catèters es van rentar diàriament amb 0.3 ml d'antibiòtic Timentin (ticarcil·lina disòdica/clavulanat de potassi, 0.93 mg/ml; Henry Schein, Melville, NY) dissolt en solució salina heparinitzada (10 U/ml). Els catèters es tancaven amb obturadors de plàstic quan no s'utilitzaven.
Autoadministració de la cocaïna
Les rates es van permetre 7 dies per recuperar-se de la cirurgia abans que comencés l'autoadministració de cocaïna. Les rates es van assignar aleatòriament a un dels dos grups: animals que s'autoadministraven cocaïna i controls de solució salina. Cada rata entrenada per respondre a les infusions contingents de cocaïna es va emparellar amb un subjecte jugat que va rebre el mateix nombre i patró temporal d'infusions que les autoadministrades per la rata experimental cocaïna aparellada. La pressió de la palanca per a les rates amb un jou de solució salina no va tenir conseqüències programades.
Inicialment, les rates experimentals amb cocaïna es van col·locar a les cambres operants modulars (Med Associates, St. Albans, VT) i es van permetre pressionar per a infusions intravenoses de cocaïna (0.25 mg de cocaïna/59 µl de solució salina, infusió durant 5 s) ràtio 1 (FR1) calendari de reforç. Una vegada que una rata experimental amb cocaïna va aconseguir almenys 20 infusions de cocaïna en una única sessió operant sota el calendari FR1, el requisit de resposta es va canviar a un calendari de reforç FR5. Per respondre en ambdós programes de proporció fixa, el nombre màxim d'infusions de cocaïna es va limitar a 30 per sessió d'autoadministració diària i un període de temps d'espera de 20 s va seguir cada infusió de cocaïna, durant el qual es van tabular les respostes de palanca activa però no van tenir conseqüències programades. . Es van realitzar sessions operants diàries de 2 h (7 dies/setmana) durant un total de 14 dies. Les respostes fetes a la palanca inactiva, que no van tenir conseqüències programades, també es van registrar durant les sessions d'entrenament FR1 i FR5.
Després de la 14th Sessió operativa diària, les rates de control de cocaïna experimental i salina amb jou van ser retornades a les seves gàbies de casa on van passar 7 dies d'abstinència forçada de drogues. El 7th dia d'abstinència de cocaïna, es van extreure cervells i es va disseccionar el PFC sobre gel. Es van triar set dies d'abstinència de cocaïna per tal de fer comparacions directes amb el nostre estudi publicat anteriorment que examinava els canvis induïts per la cocaïna en l'expressió de PFC BDNF. [20].
Perfusió
Les rates es van anestesiar (100 mg/kg, pentobarbital sòdic ip) i es van perfondre amb paraformaldehid al 4% amb gel en PB 0.1, 7.4 M, pH 4, 2.5 (PFA). Es va utilitzar un hemisferi de cada cervell per a la tinció de Golgi i l'altre hemisferi per a la tomografia en matriu. Els hemisferis de matriu es van fixar posteriorment en un 2% de PFA amb un 48, 4% de sacarosa durant XNUMX hores i els hemisferis de Golgi es van fixar posteriorment durant XNUMX hores en un XNUMX% de PFA.
Tomografia en matriu
Es van realitzar experiments de tomografia en matriu tal com es va descriure anteriorment [19], [21]. Breument, el teixit fixat amb PFA es va incrustar a la resina i es van tallar seccions coronals (70 nm) al nivell del mPFC i es van recollir com a cinta. Les cintes es van hidratar en glicina 50 mM en Tris i es van bloquejar en solució de bloqueig (0.05% Tween/0.1% albúmina sèrica bovina en tampó Tris (50 mM Tris/150 mM NaCl, pH 7.6). Les cintes es van tenyir amb anticossos primaris, GAD65 ( Chemicon), PSD95 (Cell Signaling) o sinaptofisina (Abcam), en solució de bloqueig durant la nit a 4 ° C. Les cintes es van rentar amb tampó Tris i es van tenyir amb anticossos secundaris a 1![[proporció]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 en solució de bloqueig (farina de cabra anti-ratolí Alexa-488 i cabra anti-conill cy3 o burro anti-conill cy5). Les cintes es van tacar amb DAPI per facilitar la recerca dels mateixos llocs a cada secció. Les imatges d'escaneig de rajoles es van recollir mitjançant un microscopi d'epifluorescència Zeiss AxioImager Z2. Les imatges del mateix lloc de cadascuna de les 20-30 seccions en sèrie per cinta es van adquirir a 63 vegades amb programes automatitzats especialitzats per a la tomografia matriu.
Anàlisi de tomografia en matriu
Les imatges en sèrie de cada cinta es van obrir seqüencialment, es van convertir en una pila i es van alinear amb els connectors MultiStackReg i StackReg (cortesia de B. Busse a la Universitat de Stanford i [21], [22]. Es van utilitzar caixes de cultiu (19.5 µmx19.5 µm) per seleccionar regions d'interès (ROI) al neuropil per a la quantificació. Les seleccions havien d'excloure els cossos cel·lulars neuronals o altres característiques enfosquidores. Per a l'anàlisi automatitzada d'imatges, els cultius d'interès (o ROI) per a la sinaptofisina, l'àcid glutàmic descarboxilasa-65 (GAD65) i PSD95 es van llindar automàticament respectivament amb algorismes automatitzats a ImageJ. Els cultius es van codificar i l'anàlisi es va fer a cegues per a la condició. Es va utilitzar un programa de detecció automatitzat basat en llindars per quantificar el nombre de punts identificats com a sinapsis positives tal com es va descriure anteriorment. [23]. Les densitats de terminals presinàptics, terminals postsinàptics excitatoris i el percentatge de sinapsis GAD positives (inhibidores) es van calcular a partir d'una mitjana de 75 llocs de mostra per animal recollits de dos blocs de teixit diferents del PFC (n).
=5 animals tractats amb cocaïna, 5 animals tractats amb solució salina) per a un total de 29,154 punts postsinàptics i 53,565 punts presinàptics de 818 llocs de mostreig dels 5 animals tractats amb solució salina i 29,662 postsinàptics i 17,034 punts presinàptics dels 588 llocs de mostreig dels 5 animals tractats amb solució salina. Es van calcular els valors mitjans de la densitat de sinapsis i el percentatge de sinapsis inhibidores per animal i es van fer proves t utilitzant les mitjanes animals per comprovar si hi havia una diferència entre les mitjanes del grup.
Mètode Rapid-Golgi
La tinció de Golgi de secció única es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [24], [25]. Breument, el mPFC d'un hemisferi de cada animal es va tallar en seccions coronals de 100 µm i es va fixar posteriorment en tetraòxid d'osmi a l'1% seguit de tres rentats en PB 0.1 M, pH 7.4. Les seccions es van incubar en dicromat de potassi al 3.5% durant la nit, es van rentar breument i es van infiltrar amb nitrat de plata a l'1.5% pel mètode sandvitx. [25]. Les seccions es van muntar sobre diapositives recobertes de gelatina amb un 20% de sacarosa i es van deshidratar mitjançant una sèrie de concentracions d'alcohol seguida de desgreixament en xileno i coberta.
Anàlisi de Golgi
Les diapositives de Golgi es van codificar i analitzar a cegues per a la condició i totes analitzades pel mateix experimentador. Es van recollir imatges i traços neuronals i imatges representatives de les espines dendrítiques mitjançant un microscopi vertical BX51 Olympus amb un escenari motoritzat integrat (Prior Scientific, Rockland, MA) amb un objectiu de 20 × 0.7, 7 NA. Per a l'anàlisi de ramificació dendrítica, es van seleccionar 5 neurones per a l'anàlisi per animal. Hem mesurat la longitud i la complexitat de les neurites mitjançant les macros NeuronJ i Advanced Sholl Analysis, respectivament. Es va mesurar i comparar entre grups el nombre d'interseccions (punts de ramificació) dins de cercles concèntrics amb radis entre 250 i 4 µm (incloses les dendrites basals i apicals). Per a l'anàlisi de la densitat de la columna vertebral, es van analitzar 5-20 segments d'almenys 5 µm de longitud de dendrites basals de tercer ordre per neurona de 7-2 neurones per animal mitjançant un microscopi d'epifluorescència Zeiss AxioImager Z63 amb un objectiu d'immersió en oli de XNUMXx. La morfologia de la columna es va classificar tal com es va descriure anteriorment [26]. Es va comparar entre grups la densitat lineal de la columna vertebral per a cada segment dendrític i la morfologia de la columna (prima, rechoncha, bolet, en forma de copa) de cada columna vertebral. Es va utilitzar programari de codi obert dels National Institutes of Health (ImageJ) per a l'anàlisi de dades de tomografia de Golgi i matriu.
Resultats
L'abstinència de cocaïna redueix la densitat total de la sinapsis
La tomografia en matriu es va utilitzar per mesurar els canvis tant en les sinapsis excitatòries com les inhibidores per tal de determinar les alteracions morfològiques específiques que es produeixen en el PFC en resposta a l'abstinència de l'autoadministració de cocaïna. La tomografia en matriu és un mètode d'alt rendiment que permet la quantificació precisa de sinapsis totals, inhibitòries i excitatòries en estructures massa petites per identificar-se o localitzar correctament amb els mètodes tradicionals de microscòpia confocal. [19]. Com que tant les sinapsis inhibidores com les excitatòries són components essencials dels circuits de recompensa de fàrmacs [13], [27], [28] hem utilitzat aquesta nova metodologia per avaluar els canvis morfològics en el PFC durant l'abstinència de cocaïna. Setanta nm seccions de PFC d'un hemisferi cerebral de 5 rates amb solució salina i 5 rates experimentades amb cocaïna es van tacar amb anticossos contra PSD95, un marcador excitador postsinàptic, sinaptofisina, un marcador presinàptic i GAD65, que van etiquetar neurones inhibidores i sinaps. Les densitats de sinapsis i el percentatge de sinapsis inhibidores es van determinar a la capa cortical V (Figura 1A i 1B). Els nostres resultats indiquen que durant l'abstinència de cocaïna es va produir una disminució significativa de la densitat de sinaptofisina (Figura 1C), que mesura tots els terminals presinàptics [t(7)=2, p<0.05]. No hi va haver una disminució significativa de la densitat de sinapsi excitatòria [t (8)=0.48, pàg=0.32] mesurat comptant PSD95 punt (Figura 1D). Curiosament, hi va haver una tendència no significativa cap a un augment del percentatge de sinapsis inhibidores positives de GAD65 [t (8)=−1.39, pàg=0.9] (Figura 2E).
L'abstinència de cocaïna redueix la ramificació dendrítica mentre augmenta de manera transitòria la densitat de la columna vertebral al PFC
El mètode de Golgi es va utilitzar per examinar alteracions en la ramificació neuronal i la densitat de la columna dendrítica per tal de confirmar els canvis ultraestructurals observats en la densitat de la sinapsis (figura 1). Vam realitzar una impregnació ràpida de Golgi en una sola secció en un subconjunt de neurones del PFC dels altres hemisferis dels mateixos animals que es van utilitzar per als estudis de tomografia de matriu. Es van avaluar la ramificació dendrítica, el recompte de la columna dendrítica i la morfologia de la columna vertebral. Es mostren dues neurones piramidals representatives del PFC d'un control salí de jou i una rata exposada a cocaïna. Figura 2A. La trama de Sholl va mesurar el nombre d'interseccions (punts de ramificació) dins de cercles concèntrics amb radis entre 5 i 250 µm. Els nostres resultats demostren que després de 7 dies d'abstinència forçada de l'autoadministració de cocaïna es va produir una reducció significativa de la complexitat dendrítica (Figura 2B). L'anàlisi ANOVA de mesures repetides bidireccionals de les dades de la trama sholl va revelar efectes principals significatius del tractament [F(1,738)=30.59, p<0.0001] i radi [F(245, 738)=289.6, p<0.0001] (Figura 2B), confirmant una pèrdua de dendrites que coincideix amb la pèrdua de sinapsis mesurada en estudis de matriu (Figura 1C). L'anàlisi de les dendrites basilars de segon i tercer ordre va revelar un augment significatiu de les espines dendrítiques després de 7 dies d'abstinència de cocaïna [t (6)=−3.12, p<0.05] (Figura 2D). Més concretament, l'abstinència de l'exposició a la cocaïna va augmentar el nombre de subtipus de columna prima, sense tenir cap efecte significatiu en altres subtipus de columna (Figura 2E), tal com es va revelar mitjançant mesures repetides de dues vies ANOVA amb efectes principals del tractament [F(1,30)=11.9, pàg=0.0017], subtipus de columna [F(4,30)=57.7, p<0.0001], i una interacció significativa de tractament x subtipus columna vertebral [F(1, 4, 30)=8.8, p<0.0001].
Discussion
En el present estudi demostrem que hi ha canvis estructurals i sinàptics pronunciats a la capa V del PFC després de 7 dies d'abstinència forçada de l'autoadministració de cocaïna. Concretament, hi ha una disminució significativa de la ramificació dendrítica de les neurones piramidals i una pèrdua general de la densitat de la sinapsis mesurada per la disminució de la densitat dels botons presinàptics globals marcats amb sinaptofisina. Malgrat la pèrdua de densitat presinàptica, les dendrites basals de les neurones piramidals de la capa V van experimentar un augment de la densitat de la columna dendrítica, especialment de les espines fines i plàstiques. Com que no vam detectar canvis significatius en la densitat de PSD95, es pot especular que la disminució dels terminals presinàptics, però l'augment de la densitat de la columna vertebral pot ser degut a un augment del nombre de botons multisinàptics. A més, també val la pena assenyalar que vam observar una tendència cap a un augment de les sinapsis inhibidores en el PFC. Atès que les espines primes estan implicades en la plasticitat [29], l'augment d'aquestes espines podria representar una plasticitat compensatòria per mantenir les entrades sinàptiques en aquestes neurones denervades que han perdut branques dendrítiques.
Estudis anteriors van demostrar que la cocaïna augmenta l'arborització dendrítica i la densitat de la columna vertebral al NAc [2]-[4]. Recentment, Dumitriu et al., 2012 [30] va demostrar que la cocaïna altera dinàmicament les espines proximals al nucli i la closca de NAc. Concretament, a la closca, la retirada de la cocaïna va augmentar les espines fines, mentre que va disminuir la densitat del cap de la columna vertebral dels bolets a la closca NAc. [30]. En contrast amb els estudis del NAc, només hi ha uns quants estudis que han examinat els efectes de la cocaïna sobre la morfologia neuronal del PFC. [6], [31]. Les nostres dades són coherents amb un estudi recent que demostra que la cocaïna indueix un augment de la densitat de la columna vertebral en el PFC [31]. En particular, els ratolins que van tenir un major augment de les espines persistents i estables, és a dir, les espines presents 3 dies després de la retirada, a les dendrites apicals van mostrar puntuacions més altes de preferència de llocs condicionats per cocaïna i hiperactivitat induïda per cocaïna. [31]. Un estudi anterior en neurones de la capa II-III de PFC de rata va informar valors d'aproximadament 3 espines per µm de dendrita tant en dendrites apicals com basals, un nivell d'espines sorprenentment dens que es podia modificar per l'estrès. [32]. Els nostres valors en rates control de ∼2 espines/10 µm de segments dendrítics són més baixos, fet que pot ser degut a la diferent població neuronal analitzada (dendrites basals de capa V) o a la diferència de tècnica d'imatge. En el present estudi hem utilitzat el mètode de tinció ràpida de Golgi d'una secció, mentre que Radley i els seus col·legues van utilitzar injeccions iontoforètiques de colorant groc Lucifer combinades amb imatges confocals. [32] per visualitzar la morfologia neuronal i dendrítica. A més, les nostres troballes també destaquen la importància de la durada de l'abstinència de l'autoadministració de cocaïna que condueix a canvis estructurals al cervell. Un informe publicat anteriorment va demostrar un augment de l'arborització dendrítica després de la retirada a llarg termini (24-25 dies) de la cocaïna en rates femelles. [6], en contrast amb la nostra disminució observada després de 7 dies d'abstinència forçada en rates mascles. Malgrat aquestes diferències metodològiques i les diferències en les dades de ramificació, es va observar un augment del nombre d'espines en ambdós estudis, confirmant la reorganització del circuit a gran escala durant l'abstinència de cocaïna. Estudis futurs dilucidaran el curs temporal d'aquests esdeveniments per tal de determinar si aquests canvis estructurals són transitoris o de llarga durada.
Els nostres resultats indiquen que l'abstinència forçada de l'autoadministració de cocaïna indueix canvis estructurals dinàmics i provoca una reorganització sinàptica al PFC. Aquests resultats poden explicar la hipoactivitat del PFC que es produeix com a conseqüència de l'exposició repetida a la cocaïna [8], [33]. A més, les nostres troballes donen suport a estudis anteriors que demostren la desactivació del PFC [7], [8], i un augment del GABA extracel·lular a la PFC medial durant la retirada de cocaïna [34]. Així, els mecanismes que expliquen la hipoactivitat de PFC després de l'exposició crònica a la cocaïna [8], [10] pot incloure (1) un augment de GABAergic, (2) reducció del glutamatèrgic i/o (3) reducció de l'entrada sinàptica dopaminèrgica al PFC. El present estudi demostra que l'abstinència de cocaïna redueix significativament la densitat global de la sinapsis, tal com indica una reducció del nombre de punts sinaptics positius de sinaptofisina. Aquestes dades suggereixen que hi ha una reducció de la resposta postsinàptica en el PFC, possiblement mediada per la disminució de l'entrada de glutamat o dopamina. De fet, hi ha estudis que indiquen que la cocaïna indueix reduccions del to glutamatèrgic [35], [36]. Tanmateix, utilitzant el mètode de Golgi, vam observar un augment del nombre d'espines dendrítiques primes a les dendrites basals de les neurones piramidals, cosa que suggereix un augment de l'entrada excitatòria en el PFC a les neurites restants. Aquestes dades aparentment conflictives poden reflectir una pèrdua global de sinapsis associada a la gran pèrdua de dendrites que observem amb una resposta compensatòria, possiblement mediada per un augment de BDNF, tal com es mostra a les nostres troballes anteriors. [20], per augmentar la densitat de les espines dendrítiques a les neurites restants.
Col·lectivament, els nostres resultats indiquen una reorganització dinàmica del PFC durant l'abstinència de cocaïna. Concretament, hi ha una reducció significativa de la connectivitat sinàptica, pèrdua de ramificació dendrítica i un augment del nombre d'espines primes a la PFC de rata després de 7 dies d'abstinència forçada de drogues de l'autoadministració de cocaïna. Aquests resultats poden proporcionar la base estructural de la hipoactivitat observada observada en el PFC dels consumidors crònics de cocaïna i potser explicar la pèrdua de control cognitiu que es produeix durant l'addicció a la cocaïna.
Agraïments
Els autors volen agrair a Gavin Sangrey la seva ajuda amb la preparació de les càpsules incrustades.
Declaració de finançament
Aquest treball va comptar amb el suport de les subvencions NIDA DA22339 i DA033641 (RCP i GSV) i DA18678 (RCP). HDS va comptar amb el suport d'un premi K01 individual (DA030445). Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi, la recollida i l'anàlisi de dades, la decisió de publicar o la preparació del manuscrit.
referències
;
