Mae ymsefydlu DeltaFosB mewn cortex orbitofrontal yn potensial o sensitifrwydd locomotwyr er gwaetha'r ffaith y bydd y clefyd gwybyddol yn cael ei achosi gan gocên (2009)

2. Dulliau

Cynhaliwyd yr holl arbrofion yn unol â Chanllaw NIH ar gyfer Gofal a Defnydd Anifeiliaid Labordy ac fe'u cymeradwywyd gan y Pwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol yn UT Southwestern.

2.5. Meintioli mRNA

Derbyniodd llygod mawr bigiadau intra-OFC o AAV-GFP neu AAV-ΔFosB, ac yna chwistrelliadau halwynog neu gocên 21 ddwywaith y dydd, yn union fel y disgrifiwyd ar gyfer yr arbrofion ymddygiadol. Defnyddiwyd anifeiliaid 24 h ar ôl y pigiad halwynog neu gocên diwethaf. Lladdwyd llygod mawr trwy analluogi. Cafodd yr ymennydd eu tynnu'n gyflym a chafwyd dyrnu mesurydd dwyochrog 1 mm o drwch 12 o'r NAc a'u rhewi a'u storio ar unwaith ar −80 ° C nes ynysu RNA. Tynnwyd punches o'r OFC hefyd i'w dadansoddi gan DNA microarray a gadarnhaodd fod trosglwyddiad genynnau wedi'i gyfryngu'n firaol yn y rhanbarth hwn (gweler (gweler (Winstanley et al., 2007) am ganlyniadau manylach). Tynnwyd RNA o'r samplau NAc gan ddefnyddio ymweithredydd RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr. Tynnwyd DNA halogedig â thriniaeth DNase (Heb DNA, catalog # 1906, Ambion, Austin TX). Traws-drawsgrifiwyd RNA wedi'i buro yn cDNA (Synthesis Llinyn Cyntaf Superscript, Catalog # 12371-019; Invitrogen). Cafodd trawsgrifiadau ar gyfer genynnau o ddiddordeb eu meintioli gan ddefnyddio qPCR amser real (SYBR Green; Applied Biosystems, Foster City, CA) ar thermocycler Stratxen (La Jolla, CA) Mx5000p 96-well. Cafodd yr holl gyseiniau eu syntheseiddio'n benodol gan Operon (Huntsville, AL; gweler Tabl 1 ar gyfer dilyniannau) a'i ddilysu ar gyfer llinoledd a phenodoldeb cyn arbrofion. Cafodd yr holl ddata PCR eu normaleiddio i lefelau dehydrogenase glyceraldehyde-3-ffosffad (GAPDH), na chafodd ei newid gan driniaeth cocên, yn ôl y fformiwla ganlynol: ΔC_t =C_t(genyn o ddiddordeb) - C_t (GAPDH). Yna cyfrifwyd lefelau mynegiant wedi'u haddasu ar gyfer y llygod mawr AAV-ΔFosB ac AAV-GFP a dderbyniodd gocên, a'r llygod mawr AAV-ΔFosB a dderbyniodd halwynog cronig, mewn perthynas â rheolyddion (grŵp AAV-GFP a roddir halwynog cronig) fel a ganlyn: ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (grŵp rheoli). Yn unol â'r arfer a argymhellir yn y maes (Livak a Schmittgen, 2001), yna cyfrifwyd lefelau mynegiant mewn perthynas â rheolyddion gan ddefnyddio'r mynegiad canlynol: 2^−ΔΔCt.

  

Tabl 1

Dilyniant y primers a ddefnyddir i feintioli lefelau cDNA trwy PCR amser real.

3. Canlyniadau

arbrawf 1

Mae gweinyddu cocên cronig yn cynhyrchu sensiteiddio i effeithiau hyperlocomotor cocên acíwt sy'n cael ei ddynwared gan ΔFosB

Fel y byddai disgwyl, gwelwyd sensiteiddio locomotor cadarn mewn anifeiliaid rheoli ar ôl dod i gysylltiad â chocên cronig, gydag anifeiliaid yn cael eu trin yn gronig â chocên yn dangos gorfywiogrwydd cynyddol mewn ymateb i'r her cocên acíwt (Ffig. 1A, triniaeth gronig: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Anifeiliaid yn gor-fynegi ΔJunD, mutant negyddol amlwg o JunD sy'n gweithredu fel antagonydd ΔFosB (Zachariou et al., 2006), yn yr OFC yn wahanol i anifeiliaid rheoli (Ffig. 1C, GFP vs ΔJunD, grŵp: F_{1, 56} = 1.509, NS). Fodd bynnag, roedd anifeiliaid a oedd yn gor-fynegi ΔFosB yn yr OFC a oedd wedi derbyn pigiadau halwynog dro ar ôl tro yn ymddangos yn “cyn-sensiteiddio”: roeddent yn dangos ymateb locomotor gwell i gocên acíwt nad oedd modd ei wahaniaethu oddi wrth ymateb sensitif eu cymheiriaid a gafodd eu trin â chocên cronig (Ffig. 1B, Llawfeddygaeth GFP vs ΔFosB × triniaeth gronig: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; ΔFosB yn unig: triniaeth gronig: F_1,22 = 0.664, NS). Roedd anifeiliaid ΔFosB ychydig yn orfywiog o fewn y munud 15 cyntaf o gael eu rhoi yn y blychau locomotor (GFP vs ΔFosB, llawdriniaeth: F_1,56 = 4.229, p <0.04), ond roedd lefelau gweithgaredd locomotor yn debyg i reolaethau yn y 15 munud cyn rhoi cocên (llawdriniaeth: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Ffig. 1

Sensiteiddio locomotor i gocên. Cynhyrchodd cocên acíwt fwy o gynnydd mewn gweithgaredd locomotor mewn anifeiliaid rheoli sy'n cael eu trin yn gronig â chocên yn erbyn halwynog (panel A). Mewn anifeiliaid sy'n gor-fynegi ΔFosB (panel B), y rhai sy'n cael halwynog dro ar ôl tro (mwy…)

O ystyried, pan roddir cocên iddynt yn ystod yr 5CSRT, bod yr un anifeiliaid yn dangos gallu cymharol well i ddal yn ôl rhag gwneud ymatebion modur cynamserol, mae'r gorfywiogrwydd hwn yn ymddangos yn benodol i locomotif symudol hy y math o symudiad a gofnodir yn nodweddiadol mewn astudiaethau sensiteiddio locomotor. Er y gallai gweithgaredd gwell mewn ymateb i gyffuriau symbylu adlewyrchu proffil anxiogenig, nid yw gor-fynegiant o -FosB mewn-OFC yn cynyddu pryder fel y'i mesurir gan ddefnyddio'r ddrysfa plws uwch neu'r prawf maes agored (ni ddangosir data). Roedd yr anifeiliaid hefyd wedi arfer yn dda â phigiadau IP, ac ni wnaeth pigiadau halwynog newid eu perfformiad gwybyddol (Winstanley et al., 2007), felly ni ellir priodoli'r effaith modur hon i ymateb cyffredinol i bigiad IP. I grynhoi, mae'r canfyddiadau hyn yn dangos bod ymsefydlu ΔFosB yn yr OFC yn ddigonol (ond nid yn angenrheidiol) ar gyfer locomotor sensitif sy'n ymateb i gocên, er bod ΔFosB yn yr un rhanbarth yn achosi goddefgarwch i effeithiau cocên ar gymhelliant ac byrbwylltra (Winstanley et al., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Ni newidiwyd lefelau mRNA FosB yn y NAc gan y naill na'r llall o driniaeth cyffuriau cronig (Ffig. 2A, cyffur: F_1,14 = 1.179, ns) neu fynegiant o ΔFosB yn yr OFC (llawdriniaeth: F_{1, 14} = 0.235, ns). Fodd bynnag, roedd lefelau ΔFosB yn sylweddol uwch mewn anifeiliaid a gafodd eu trin yn gronig â chocên yn unol ag adroddiadau blaenorol (Chen et al., 1997); Ffig. 2B, cyffur: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Yn ddiddorol, roedd y swm o ΔFosB mRNA yn y NAc o anifeiliaid a gafodd eu trin â halen yn is yn y rhai lle'r oedd y ffactor trawsgrifio hwn wedi'i or-fynegi yn yr OFC (cyffur: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Fodd bynnag, mae absenoldeb rhyngweithio cyffuriau × llawfeddygaeth yn dangos bod triniaeth cocên cronig yn cael yr un effaith mewn grwpiau a driniwyd gan AAV-GFP ac AAV-ΔFosB, gan ddyrchafu lefelau ΔFosB yn gyfrannol i'r un graddau (llawfeddygaeth cyffuriau ×: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Ffig. 2

Newidiadau mewn mRNA yn y NAc o anifeiliaid yn gor-fynegi naill ai GFP neu ΔFosB yn yr OFC, a'u trin yn gronig gyda naill ai halwynog neu gocên. Mae data'n dynodi newidiadau plygu llinol mewn mynegiant fel cyfran o'r gwerthoedd rheoli. Mae'r data a ddangosir yn (mwy…)

4. Trafodaeth

Yma rydym yn dangos bod gor-fynegiant o ΔFosB yn llygod mawr sensitif yr OFC i weithredoedd symbylu locomotor cocên, gan ddynwared gweithredoedd gweinyddu cocên cronig. Rydym wedi dangos o'r blaen bod perfformiad yr un anifeiliaid hyn ar y paradeimau 5CSRT a disgowntio disgownt yn cael ei effeithio'n llai gan gocên acíwt, a bod effaith debyg i oddefgarwch yn cael ei arsylwi ar ôl dod i gysylltiad â chocên dro ar ôl tro. Felly, gellir arsylwi sensiteiddio a goddefgarwch i wahanol weithredoedd cocên yn yr un anifeiliaid, gyda'r ddau addasiad yn cael eu cyfryngu trwy'r un moleciwl, ΔFosB, yn gweithredu yn yr un rhanbarth ymennydd. Mae'r ffaith y gellir cymell y ddau ffenomen ar yr un pryd trwy ddynwared un o weithredoedd cocên mewn un locws blaenocortical yn tynnu sylw at bwysigrwydd rhanbarthau cortical yn y sequelae o gymeriant cyffuriau cronig. At hynny, mae'r data hyn yn awgrymu bod goddefgarwch a sensiteiddio yn adlewyrchu dwy agwedd sy'n ymddangos yn wrthgyferbyniol, ond sydd â chysylltiad agos, o'r ymateb i gyffuriau caethiwus.

O ystyried bod mynegiant ΔFosB cynyddol yn y NAc yn chwarae rhan feirniadol yn natblygiad sensiteiddio locomotor, un rhagdybiaeth gredadwy fyddai bod gor-fynegi ΔFosB yn yr OFC yn cyn-sensiteiddio anifeiliaid i gocên trwy gynyddu lefelau ΔFosB yn y NAc. Fodd bynnag, darganfuwyd y canlyniad gwrthdro: roedd lefelau ΔFosB yn y NAc yn sylweddol is mewn anifeiliaid yn gor-fynegi ΔFosB yn yr OFC. Mae'n anodd dehongli canlyniadau ymddygiadol y gostyngiad hwn yn NAc ΔFosB, gan fod atal gweithredoedd ΔFosB trwy or-fynegiant o ΔJunD yn y rhanbarth hwn yn lleihau llawer o effeithiau cocên mewn llygod (Peakman et al., 2003). Mae rhai tebygrwydd yn bodoli rhwng yr arsylwadau hyn a'r rhai a wneir gan gyfeirio at y system dopamin. Er enghraifft, gall disbyddu rhannol dopamin yn y NAc arwain at orfywiogrwydd ynghyd â chymhwyso agonyddion dopamin yn uniongyrchol yn y rhanbarth hwn (Bachtell et al., 2005; Costall et al., 1984; Parkinson et al., 2002; Winstanley et al., 2005b). Yn yr un modd, mae'r ffaith y gall lefelau cortical cynyddol o ΔFosB leihau mynegiant isranciol yn debyg i'r canfyddiad sefydledig bod cynnydd mewn trosglwyddiad dopaminergig rhagarweiniol yn aml yn cyd-fynd â gostyngiad cilyddol yn lefelau dopamin striatal (Deutch et al., 1990; Mitchell a Gratton, 1992). Ar hyn o bryd nid yw'n eglur sut y gall mecanwaith adborth o'r fath weithio ar gyfer moleciwlau signalau mewn-gellog, ond gall adlewyrchu newidiadau yng ngweithgaredd cyffredinol rhai rhwydweithiau niwronau a achosir gan newid mewn trawsgrifio genynnau. Er enghraifft, mae cynyddu ΔFosB yn yr OFC yn arwain at ddadreoleiddio gweithgaredd ataliol lleol, fel y gwelwyd yn y cynnydd yn lefelau'r GABA_A derbynnydd, derbynnydd mGluR5 a sylwedd P, fel y'i canfyddir gan ddadansoddiad microarray (Winstanley et al., 2007). Yna gallai'r newid hwn yng ngweithgaredd OFC effeithio ar weithgaredd mewn meysydd ymennydd eraill, a allai yn ei dro arwain at newid mynegiant lleol o ΔFosB. Mae p'un a yw lefelau ΔFosB yn adlewyrchu newidiadau cymharol mewn gweithgaredd dopamin yn fater sy'n haeddu ymchwiliad pellach.

Dangosodd pob anifail gynnydd sylweddol yn lefelau mRNA ΔFosB yn y NAc yn dilyn triniaeth cocên cronig, yn unol ag adroddiadau blaenorol o lefelau protein uwch (Chen et al., 1997; Hope et al., 1992; Nye et al., 1995). Fodd bynnag, canfu adroddiad diweddar nad oedd lefelau ΔFosB mRNA bellach wedi'u dyrchafu'n sylweddol 24 h ar ôl triniaeth amffetamin cronig, er y gwelwyd cynnydd sylweddol 3 h ar ôl y pigiad terfynol (Alibhai et al., 2007). Gall yr anghysondeb hwn fod oherwydd y gwahaniaeth yn y cyffur seicostimulant a ddefnyddir (cocên vs amffetamin), ond o ystyried hanner oes byrrach cocên, byddai'n rhesymol disgwyl y byddai ei effeithiau ar fynegiant genynnau yn normaleiddio'n gyflymach na rhai amffetamin, yn hytrach nag i'r gwrthwyneb. Rheswm mwy credadwy dros y gwahanol ganlyniadau hyn yw bod anifeiliaid yn yr astudiaeth gyfredol wedi'u chwistrellu â dos cymedrol o gyffur ddwywaith y dydd am ddiwrnodau 21 o gymharu ag un pigiad dos uchel am ddiwrnodau 7 (Alibhai et al., 2007). Gallai'r regimen triniaeth estynedig fod wedi arwain at y newidiadau mwy amlwg a welwyd yma.

Er bod y newidiadau mewn mynegiant genynnau a welwyd yn y NAc yn dilyn cocên cronig yn cytuno'n gyffredinol â chanfyddiadau a adroddwyd yn flaenorol, mae maint yr effeithiau yn llai yn yr astudiaeth gyfredol. Un rheswm posib am hyn yw bod anifeiliaid wedi cael eu haberthu dim ond 24 h ar ôl y pigiad olaf o gocên, ond mae mwyafrif yr astudiaethau wedi defnyddio meinwe a gafwyd bythefnos ers yr amlygiad diwethaf i gyffuriau. Mae astudiaethau sy'n archwilio cwrs amser sensiteiddio locomotor yn dangos bod newidiadau mwy amlwg mewn ymddygiad a mynegiant genynnau / protein yn cael eu gweld ar yr adeg ddiweddarach hon. Er ein bod yn nodi cynnydd bach mewn mRNA ar gyfer y dopamin D.₂ derbynnydd yn y NAc, y consensws cyffredinol yw bod lefelau mynegiant y D.₂ neu D₁ ni chaiff y derbynnydd ei newid yn barhaol ar ôl datblygu sensiteiddio locomotor, er bod D yn cynyddu ac yn gostwng₂ adroddwyd ar rif y derbynnydd ychydig ar ôl diwedd y drefn sensiteiddio (gweler (gweler (Pierce a Kalivas, 1997) i'w drafod). Mae ein harsylwad bod GluR1 a GluR2 mRNA yn ddigyfnewid yn dilyn triniaeth cocên cronig ar yr amser cynnar hwn yn yr un modd yn unol ag adroddiad blaenorol (Fitzgerald et al., 1996), er bod cynnydd mewn GluR1 mRNA wedi'i ganfod ar adegau diweddarach ar ôl i driniaeth seicostimulant cronig ddod i ben (Churchill et al., 1999).

Fodd bynnag, gwelsom gynnydd bach yn mRNA PSD95 yn y NAc o anifeiliaid a gafodd eu trin yn gronig â chocên. Mae PSD95 yn foleciwl sgaffaldiau, ac mae'n un o'r prif broteinau o fewn dwysedd postynaptig synapsau excitatory. Mae'n angori sawl derbynnydd glwtamad a phroteinau signalau cysylltiedig yn y synaps, a chredir bod cynnydd mewn mynegiant PSD95 yn adlewyrchu mwy o weithgaredd synaptig a mwy o fewnosod a sefydlogi derbynyddion glwtamad mewn synapsau (van Zundert et al., 2004). Awgrymwyd yn flaenorol rôl ar gyfer PSD95 yn natblygiad sensiteiddio locomotor (Yao et al., 2004).

Mae cynnydd mewn mynegiant Arc hefyd wedi'i gysylltu â chynnydd mewn gweithgaredd synaptig. Fodd bynnag, er y gwelwyd cynnydd mewn mynegiant Arc yn y NAc 50 min ar ôl cael ei chwistrellu ag amffetamin (Klebaur et al., 2002), mae ein data yn dangos nad yw rhoi cocên yn gronig yn gor-reoleiddio Arc yn y NAc yn fwy parhaol, er y gwelwyd cynnydd yn Arc 24 h ar ôl dosio cronig gyda chyffuriau gwrth-iselder (Larsen et al., 2007) ac amffetamin (Ujike et al., 2002). Gwelir cynnydd mewn ffosfforyleiddiad CREB hefyd yn y NAc ar ôl rhoi cocên acíwt ac amffetamin (Kano et al., 1995; Konradi et al., 1994; Hunan et al., 1998), ond efallai nad yw'n syndod na welwyd cynnydd yn mRNA CREB yn dilyn rhoi cocên cronig. Credir bod signalau trwy'r llwybr CREB yn bwysicach yng nghamau cychwynnol cymryd cyffuriau, gyda ffactorau trawsgrifio fel ΔFosB yn dod i ddominyddu wrth i ddibyniaeth fynd yn ei flaen (McClung a Nestler, 2003). Er bod CREB wedi bod yn gysylltiedig ag effeithiau buddiol cocên (Carlezon et al., 1998), ni chafwyd unrhyw adroddiadau bod mynegiant CREB cynyddol yn effeithio ar sensiteiddio locomotor, er bod cynnydd firaol-gyfryngol yn antagonydd negyddol dominyddol mewndarddol CREB, y protein atalydd cynnar cAMP inducible neu ICER, yn cynyddu gorfywiogrwydd a achosir gan chwistrelliad acíwt o amffetamin (Green et al., 2006).

I grynhoi, er bod mwyafrif y newidiadau a achoswyd gan gyffuriau a welsom yn gydnaws â rhagfynegiadau o'r llenyddiaeth, ni chanfuom unrhyw newidiadau mewn mynegiant genynnau yn y NAc a allai esbonio'r ymateb locomotor sensitif i gocên a welwyd mewn anifeiliaid naïf cyffuriau a gafodd eu trin gydag AAV-ΔFosB mewn-OFC. Mae hyn yn codi'r posibilrwydd na fydd cynyddu ΔFosB yn yr OFC yn effeithio ar sensiteiddio moduron trwy'r NAc, er y gallai llawer o enynnau eraill, na chawsant eu hastudio yma, fod yn gysylltiedig. Mae tystiolaeth sylweddol yn awgrymu y gall modiwleiddio'r cortecs rhagarweiniol medial (mPFC) newid gweithgaredd striatal a thrwy hynny gyfrannu at sensiteiddio ymddygiadol i seicostimulants (Steketee, 2003; Steketee and Walsh, 2005), er bod llai yn hysbys am rôl rhanbarthau rhagarweiniol mwy fentrol fel yr OFC. Mae'r NAc yn derbyn rhai rhagamcanion gan yr OFC (Berendse et al., 1992). Fodd bynnag, nododd astudiaeth fwy diweddar a manwl ychydig iawn o ragamcanion OFC-NAc uniongyrchol: gwelwyd labelu tenau o ran fwyaf ochrol y gragen NAc yn dilyn pigiadau o olrhain anterograde i ardaloedd ochrol a fentrolateral yr OFC, a'r OFC mwyaf fentrol. rhanbarth yn anfon rhagamcanion lleiaf posibl i graidd NAc (Schilman et al., 2008). Mae'r caudate-putamen canolog yn derbyn mewnoliad llawer dwysach. Yng ngoleuni'r dystiolaeth anatomegol hon, ni fyddai'r mwyafrif o'r meinwe NAc a ddadansoddwyd yn ein hymatebion PCR wedi cael ei fewnfudo'n uniongyrchol gan yr OFC, gan leihau'r siawns y byddai unrhyw newidiadau mewn mynegiant genynnau yn cael eu canfod yn llwyddiannus.

Mae'r OFC yn rhagamcanu'n drwm i ranbarthau sydd â chysylltiad cryf â'r NAc, megis y mPFC, amygdala basolateral (BLA), putamen caudate a niwclews subthalamig (STN). Cwestiwn agored yw a allai newidiadau yn yr OFC fodiwleiddio gweithrediad y NAc yn anuniongyrchol trwy ei ddylanwad yn y meysydd hyn. Dangoswyd bod gweithgaredd yn y BLA yn cael ei newid ar ôl briwiau OFC, a bod hyn yn cyfrannu'n sylweddol at y diffygion mewn dysgu gwrthdroi a achosir gan ddifrod OFC (Stalnaker et al., 2007), ond ni adroddwyd eto am unrhyw effeithiau o fewn meysydd fel y NAc. Efallai y byddai'n fwy cynhyrchiol canolbwyntio sylw ar feysydd eraill sydd â chysylltiad cryfach â'r OFC ac sydd hefyd â chysylltiad helaeth â rheoli moduron. Mae'r STN yn darged arbennig o addawol, oherwydd nid yn unig y mae briwiau o'r STN a'r OFC yn cynhyrchu effeithiau tebyg ar fyrbwylltra a dysgu Pavlovaidd (Baunez a Robbins, 1997; Chudasama et al., 2003; Uslaner a Robinson, 2006; Winstanley et al., 2005a), ond mae sensiteiddio locomotor a achosir gan seicostimulant yn gysylltiedig â chynnydd mewn mynegiant c-Fos yn y rhanbarth hwn (Uslaner et al., 2003). Mae angen arbrofion yn y dyfodol a ddyluniwyd i archwilio sut mae newidiadau a achosir gan gyffuriau mewn mynegiant genynnau yn yr OFC yn effeithio ar weithrediad ardaloedd i lawr yr afon fel y STN. Mae'r OFC hefyd yn anfon rhagamcaniad bach i'r ardal segmentol fentrol (Geisler et al., 2007), rhanbarth y gwyddys ei fod yn chwarae rhan feirniadol yn natblygiad sensiteiddio locomotor. Mae'n bosibl y gall gor-fynegiant o ΔFosB yn yr OFC felly ddylanwadu ar sensiteiddio locomotor trwy'r llwybr hwn.

Mae union natur y berthynas rhwng newidiadau a achosir gan gyffuriau mewn swyddogaeth wybyddol a sensiteiddio locomotor yn aneglur ar hyn o bryd, ac rydym hyd yma wedi canolbwyntio ar yr OFC. O ystyried y canfyddiadau hyn, mae'n bosibl y gallai newidiadau mewn mynegiant genynnau sy'n gysylltiedig â datblygu sensiteiddio locomotor mewn rhanbarthau ymennydd eraill gael rhywfaint o effaith ar yr ymateb gwybyddol i gocên. Gall arbrofion sy'n archwilio'r cydadwaith rhwng ardaloedd cortical ac isranciol ar ôl rhoi cyffuriau caethiwus daflu goleuni newydd ar sut mae'r wladwriaeth gaeth yn cael ei chynhyrchu a'i chynnal, a'r rolau rhyngweithiol a chwaraeir gan sensiteiddio a goddefgarwch yn y broses hon.

Cyfeiriadau