(HUMAN) Käyttäytymiseen ja rakenteellisiin vastauksiin krooniseen kokaiiniin tarvitaan etukäteen suuntautuva silmukka, joka sisältää AFosB: n ja kalsium / kalmoduliinista riippuvaisen proteiinikinaasin II Nucleus Accumbens Shellissä (2013)

Transkriptiotekijä AFosB ja aivoin rikastettu kalsium- / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II (CaMKIIa) indusoidaan ytimen accumbensissa (NAc) kroonisella altistumisella kokaiinille tai muille psykostimuloiville lääkkeille, joissa nämä kaksi proteiinia välittävät herkistettyjä lääkevasteita . Vaikka ΔFosB ja CaMKIIα säätelevät sekä AMPA: n glutamaattireseptorin ilmentymistä että toimintaa NAc: ssä, dendriittisen selkärangan muodostumista NAc-keskipitkän piikkisolujen neuroneilla (MSN) ja liikkuvuutta lisäävää herkistymistä kokaiinille, näiden molekyylien välistä suoraa yhteyttä ei ole tähän mennessä tutkittu. Tässä osoitamme, että ΔFosB fosforyloidaan CaMKIIa: lla proteiinia stabiloivassa Ser27: ssa ja että CaMKII on tarvitaan FAO: n kokaiinivälitteiseen kertymiseen rotan NAc: ssä.

Toisaalta osoitamme, että ΔFosB on sekä välttämätön että riittävä kokaiinin indusoimiseksi CaMKIIa-geenin ilmentymiselle in vivo, joka on D-selektiivinen vaikutus.₁-tyyppiset MSN: t NAc-kuoren alialueella.

Lisäksi dendriittisten piikkien induktio NAc: n MSN: llä ja lisääntynyt käyttäytymisvaste kokaiinille AFosB: n yli-ilmentymisen jälkeen ovat molemmat CaMKII-riippuvaisia.

Tärkeää on, että osoitamme ensimmäistä kertaa AFosB: n ja CaMKII: n induktion NAc: ssä ihmisen kokaiiniriippuvaiset, mikä viittaa mahdollisiin kohteisiin tulevaa terapeuttista interventiota varten. Nämä tiedot osoittavat, että ΔFosB ja CaMKII sitoutuvat solutyyppiseen ja aivosalueen spesifiseen positiiviseen etenevään silmukkaan keskeisenä mekanismina aivojen palkitsemispiirin säätämiseksi vasteena krooniselle kokaiinille.

esittely

Lisääntyvä näyttö tukee näkemystä, jonka mukaan geenien ilmentymisen muutokset myötävaikuttavat huumausaineiden väärinkäytön mekanismeihin (Robison ja Nestler, 2011). Näiden muutosten yksi tärkeä välittäjä on FosB, Fos-perheen transkriptiotekijä (Nestler, 2008). Käytännöllisesti katsoen minkä tahansa väärinkäytön aiheuttama krooninen anto aiheuttaa ΔFosB: n pitkäkestoista kertymistä ydinvoimalle (NAc), joka on limbinen alue, joka on välttämätön palkitsevaa käyttäytymistä varten. Such induktio näyttää olevan spesifinen NAc-keskipitkän spin-neuronin (MSN) luokalle, joka ilmentää D1-dopamiinireseptoreita. AFosB: n indusoituva yli-ilmentyminen näissä D1-tyyppisissä NAc-MSN: ssä lisää liikkuvuutta ja palkitsevaa vastetta kokaiinille ja morfiinille (Kelz et ai., 1999; Zachariou et ai., 2006), mukaan lukien kokaiinin itsensä lisääminen (Colby et ai., 2003). Lisäksi ΔFosB-transkription aktiivisuuden geneettinen tai viruksen esto vähentää näiden lääkkeiden palkitsevia vaikutuksia (Zachariou et ai., 2006), mikä osoittaa, että tämä FosB: n jatkuva induktio on kriittisen NAc: n aiheuttamien pysyvien muutosten keskeinen välittäjä kroonisella lääkeaineen antamisella.

AFosB: n epätavallinen stabiilisuus (suhteessa kaikkiin muihin Fos-perheen proteiineihin) on sekä molekyylin luontainen ominaisuus, koska täysipituisessa FosB: ssa esiintyvät degronidomeenit ovat lyhentyneet (Carle et ai., 2007) ja säännelty prosessi. FosB on fosforyloitu vitro ja in vivo Ser27: ssa, ja tämä reaktio stabiloi edelleen AFosB: tä, ~ 10-kerrosta, soluviljelmässä ja NAc: ssä in vivo (Ulery-Reynolds et ai., 2009). Vaikka Ser27-AFosB on osoitettu olevan kaseiinikinaasi-2: n substraatti vitro (Ulery et ai., 2006), sen mekanismi in vivo fosforylaatio on tuntematon.

Kalsium / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II (CaMKII) on erittäin ilmentynyt seriini- / treoniinikinaasi, jonka α- ja β-isoformit muodostavat dodekameerisen homo- ja hetero-holoentsyymit in vivoja ne ovat välttämättömiä neuroplastisuuden monille muodoille (Lisman et ai., 2002; Colbran ja Brown, 2004). CaMKIIa indusoidaan selektiivisesti NAc-kuoressa kroonisella amfetamiinilla (Loweth et ai., 2010) ja CaMKII-aktiivisuuden farmakologinen esto NAc-kuoressa vähentää käyttäytymistä herkistymistä amfetamiinille (Loweth et ai., 2008) ja kokaiini (Pierce et ai., 1998), kun taas CaMKIIa: n viraalinen yli-ilmentäminen tässä NAc-alialueella parantaa liikkeen herkistymistä amfetamiiniin ja itsehoitoa (Loweth et ai., 2010). CaMKIIa voi vaikuttaa palkkakäyttäytymiseen AMPA-glutamaattireseptorin alayksiköiden moduloinnin kautta (Pierce et ai., 1998), koska CaMKIIa-aktiivisuus on pitkään liittynyt AMPA-reseptorifunktioon ja synaptisiin kohdistumiseen useissa neuroplastisuuden muodoissa (Malinow ja Malenka, 2002).

Tämä kirjallisuus osoittaa useita paralleeleja AFosB: n ja CaMKII: n välillä: molemmat ovat välttämättömiä ja riittäviä väärinkäytösten huumausaineiden monille käyttäytymisvaikutuksille. in vivo (Jourdain et ai., 2003; Maze et ai., 2010) ja molemmat käyttäisivät ainakin joitakin käyttäytymisvaikutuksiaan AMPA-reseptorien moduloinnin kautta (Kelz et ai., 1999; Malinow ja Malenka, 2002; Vialou et ai., 2010). Näistä paralleeleista huolimatta ei tunneta funktionaalista yhteyttä AFosB: n ja CaMKII: n välillä. Tässä vahvistamme vastavuoroisen säätelyn AFosB: n ja CaMKII: n välillä ja osoitamme, että nämä kaksi proteiinia muodostavat D1-tyypin MSN-spesifisen syöttösilmukan NAc-kuoressa, jota indusoi kokaiini, ja säätelee joukkoa kokaiinivasteita in vivo.

Siirry:

Materiaalit ja menetelmät

Kokeilu 1: iTRAQ NAc Shellin ja Core-proteiinin proteiinianalyysi kokaiinikäsittelyn jälkeen (Kuva 1A)

Aikuisille (8 viikkoa) urospuolisille rotille annettiin 20 mg / kg kokaiinia tai suolaliuoksen IP-kerta-annosta kerran päivässä seitsemän päivän ajan. 24 hr viimeisen injektion jälkeen, NAc-kuori ja ydin olivat mikrodissektioita (Kuva 1A) ja flash jäädytetään. iTRAQ-analyysit suoritettiin edellä kuvatulla tavalla (Ross et ai., 2004; Davalos et ai., 2010).

Kuva 1

Kokaiinin CaMKII: n Shell-spesifinen induktio NAc: ssä

Koe 2: Proteiinimuutosten kvantifiointi rotan NAc-ytimessä ja Shellissa kokaiinihoidon jälkeen (Kuva 1B – D)

Aikuisille (8 viikkoa) urospuolisille rotille annettiin 10 mg / kg kokaiinia tai suolaliuoksen IP-kerta-annosta kerran vuorokaudessa seitsemän päivän ajan liikkuvissa rekisteröintikammioissa. Lokomotoriset vasteet kokaiinin yhdelle injektiolle (5 mg / kg IP) kirjattiin niille eläimille, joita hoidettiin aiemmin kokaiinilla (nimeltään "krooninen"), ja osa niistä, joita hoidettiin suolaliuoksella (nimeltään "akuutti"), ja liikkuvuuden vasteet suolaliuokseen jäljellä oleviin kroonisiin suolaliuoksiin käsiteltyihin eläimiin (nimeltään "suolaliuos"). Liikunta-aktiivisuuden määritykset suoritettiin kuten on kuvattu (Hiroi et ai., 1997). Lyhyesti sanottuna, aikuiset urosrotit sijoitettiin 18 "× 24" PAS-avoimen kentän tallennuslaatikoihin (San Diego Instruments) 30 min: n saamiseksi tottumiseen, niille annettiin yksi IP-injektio suolaliuosta ja seurattiin ylimääräisen 30-minin ajan, ja niille annettiin 5 mg / kg kokaiinin yksittäinen IP-injektio ja seuranta 30 min.

Tämän viimeisen injektion jälkeen 24 hr rotat dekapitoitiin ilman anestesiaa anestesia-aineiden vaikutusten välttämiseksi neuronaalisten proteiinitasojen ja fosfotilojen suhteen. Aivot leikattiin sarjaan 1.2 mm -matriisissa (Braintree Scientific) ja kohdekudos poistettiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi proteaasin (Roche) ja fosfataasin (Sigma Aldrich) inhibiittoreita, käyttäen 14-mittapuristinta NAc-ytimelle ja 12-mittaristoa jäljellä olevasta NAc-kuoren kudos (katso Kuva 1A) ja pakastetaan välittömästi kuivalla jäällä. Näytteet homogenisoitiin ultraäänikäsittelyllä modifioidussa RIPA-puskurissa: 10 mM Tris-emäs, 150 mM natriumkloridi, 1 mM EDTA, 0.1% natriumdodekyylisulfaatti, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, pH 7.4, proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittorit kuten edellä. Laemmli-puskurin lisäämisen jälkeen proteiinit erotettiin 4-15% polyakrylamaidigradienttigeeleillä (Criterion-järjestelmä, BioRad) ja Western-blottaus suoritettiin käyttäen Odyssey-järjestelmää (Li-Cor) valmistajan protokollien mukaisesti.

Kokeilu 3: Proteiinimuutosten kvantifiointi rotan NAc-ytimessä ja kuoressa kokaiinin poiston jälkeen (Kuva 1E)

Aikuisille (8 viikkoa) urospuolisille rotille annettiin 10 mg / kg kokaiinia tai suolaliuoksen IP-kerta-annosta kerran päivässä seitsemän päivän ajan. 14-päivät viimeisen injektion jälkeen, suolaliuoksella käsitellyille eläimille annettiin toinen keittosuolaliuos (nimeltään "suolaliuos"), ja kokaiinilla käsitellyille eläimille annettiin toinen suolaliuos (14-päivävienti tai "14d WD") tai yksittäinen kokaiinin injektio ( nimeltään "14d WD Chal" haastetta varten). Yksi tunti viimeisen injektion jälkeen eläimet dekapitoitiin ja Western-blottaus suoritettiin kuten Koe 2.

Kokeilu 4: Proteiinimuutosten kvantifioiminen rotan NAc-ytimessä ja kuoressa kokaiinin itsehallinnon jälkeen (Kuva 2A – C)

Rotat koulutettiin itse antamaan 0.5 mg / kg / kokaiinin infuusio yhden tunnin jaksoissa kiinteän suhteen 1-aikataulussa yhdeksän päivän ajan. Yhdeksän lähtötilanteen jälkeen rotat jaettiin kahteen ryhmään, jotka olivat tasapainossa kokaiinin saannilla kahden viimeisen istunnon aikana. Yhden rotan ryhmän annettiin itse antaa kokaiini (0.5 mg / kg / infuusio) yhden tunnin jaksoissa (lyhyt pääsy, ShA), kun taas toinen rottien ryhmä itse antoi kokaiinia kuuden tunnin istunnoissa (pitkä pääsy, LgA ) kymmenen lisäpäivän ajan (eskalaatiot).

Aivoja leikattiin immunohistokemialle, kuten on kuvattu (Perrotti et ai., 2004). Aivot perfusoitiin 18 – 24 h: n jälkeen viimeisen lääkeaineen altistuksen jälkeen, mikä johti minkä tahansa jäljellä olevan täyspitkän FosB-proteiinin hajoamiseen siten, että kaikki jäljellä oleva immunoreaktiivisuus heijastaa AFosB: tä. Tämä hajoaminen varmistettiin Western-blottauksella, joka ei osoittanut merkittävää värjäytymistä vasta-aineella, joka oli suunnattu täyspitkän FosB: n C-terminaalia vastaan, joka ei tunnista AFosB: tä (tietoja ei ole esitetty). Kun oli leikattu 35 pm: n osiin, AFosB-immunopositiivisten solujen lukumäärä kvantifioitiin sokeutetulla tarkkailijalla kahdessa osassa kunkin rotan NAc: n läpi, ja keskiarvot 40 × -kenttää kohti laskettiin sitten kunkin eläimen alueittain. Kukin eläin katsottiin yksittäiseksi havainnoksi tilastollista analyysiä varten. Kiinnostavat alueet tunnistettiin käyttäen Paxinosia ja Watsonia (Paxinos ja Watson, 2007).

CaMKIIa-immunoreaktiivisuuden kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Licor-järjestelmää, kuten on kuvattu (Covington et ai., 2009). CaMKII: n ja GAPDH: n integroidut intensiteetit määritettiin Odyssey-ohjelmistolla. Tulokset esitetään integroiduina intensiteettiarvoina millimetriä kohti² ja ne esitetään keskiarvona ± sem (n = 4 – 10 per ryhmä). GAPDH: n arvoja käytettiin viitteenä CaMKII-intensiteetin normalisoimiseksi viipaleiden paksuuteen ja olosuhteisiin.

Kuva 2

CaMKII: n induktio itsesääntyvien rottien ja ihmisen kokaiiniriippuvais- ten NAc-kuoressa

Koe 5: proteiinitasojen kvantifiointi kokaiinista riippuvaisissa ihmisissä (Kuva 2D)

menettely

Postmortem-ihmisen aivokudokset saatiin Quebec Suicide Brain Bankilta (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Kanada). Kudoksen säilyttäminen eteni olennaisesti kuvatulla tavalla (Quirion et ai., 1987). Lyhyesti sanottuna, kun se on uutettu, aivot asetetaan märkä jään Styrofoam-laatikkoon ja ryntäsivät Quebec Suicide Brain Bankin tiloihin. Puolipallot erotetaan välittömästi sagitaalisella leikkauksella aivojen keskellä, aivokannan ja aivokuoren keskellä. Verisuonet, käpyrauhan, koroidin plexus, puoli aivopuoli ja puoli aivorunko leikataan tyypillisesti vasemmanpuoleisesta pallonpuoliskosta, joka sitten leikataan sepelvaltimoina 1 cm: n paksuiksi viipaleiksi ennen jäädyttämistä. Jälkimmäinen aivopuoli leikataan sagittaalisesti 1cm-paksuiksi viipaleiksi ennen jäädyttämistä. Kudokset jäädytetään 2-metyylibutaanissa -40 ° C: ssa ~ 60 sek. Kaikki jäädytetyt kudokset pidetään erikseen muovipusseissa -80 ° C: ssa pitkäaikaista varastointia varten. Spesifiset aivojen alueet leikataan jäädytetyistä koronaalisista viipaleista ruostumattomasta teräksestä valmistetulle levylle, jossa on kuiva jäätä ympärillä ympäristön lämpötilan säätämiseksi. Western-blottaus suoritettiin kuten on kuvattu kohdassa Koe 2.

kohortti

Kohortti koostui 37-uros- ja 3-naispotilaista, joiden ikä vaihteli 15 – 66 -vuosien välillä. Kaikki potilaat kuolivat äkillisesti ilman pitkittyneitä agonaalisia tiloja tai pitkittyneitä lääketieteellisiä sairauksia. Kummassakin tapauksessa Quebecin Coroner-toimisto totesi kuolinsyyn, ja kudosnäytteistä tehtiin toksikologinen näyttö, jotta saatiin tietoa lääkkeistä ja laittomasta aineen käytöstä kuoleman aikaan. Kohderyhmä koostui 20-yksilöistä, jotka täyttivät SCID-I-kriteerit kokaiiniriippuvuudesta. Kontrolliryhmä koostui 20-potilaista, joilla ei ollut aikaisemmin kokaiiniriippuvuutta eikä suuria psykiatrisia diagnooseja. Kaikki koehenkilöt kuolivat äkillisesti syistä, joilla ei ollut suoraa vaikutusta aivokudokseen. Ryhmät sovitettiin keskimääräiseen kohteen ikään, jäähdytysviiveeseen ja pH: han. Kaikille koehenkilöille suoritettiin psykologisia autopsioita, kuten edellä kuvattiin (Dumais et ai., 2005), jonka avulla voimme saada yksityiskohtaiset tapaustiedot psykiatrisista ja sairaaloiden historiasta sekä muista asiaankuuluvista kliinisistä ja sosiodemografisista tiedoista. Lyhyesti sanottuna koulutettu haastattelija teki DSM-IV: n rakenteellinen kliininen haastattelu Psykiatriset häiriöt (SCID-I) yhdessä kuoleman yhden tai useamman informantin kanssa. Kliinikoiden paneeli tarkasteli SCID-I-arviointeja, tapausraportteja, koronerin muistiinpanoja ja lääketieteellisiä tietoja, jotta saatiin yksimielisiä psykiatrisia diagnooseja.

Koe 6: kromatiinin immunoprecipitaatio rotan NAc: lle (Kuva 3A – C)

Aikuisille (8 viikkoa) urospuolisille rotille annettiin 10 mg / kg kokaiinia tai suolaliuoksen IP-kerta-annosta kerran päivässä seitsemän päivän ajan. 24 hr viimeisen injektion jälkeen, NAc-kuori ja ydin olivat mikrodissektioita. Chromatin-immunosaostus (ChIP) suoritettiin yhdistämällä kahden tai kahden ydinkohdan kuoren tai ytimen kahdenvälisiä NAc-lyöntejä ryhmästä 14-ryhmiin (98-eläimet yhteensä, 7-kokaiini-altaat, 7-suolaliuokset). Kudokset silloitettiin, pestiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes kromatiini leikkautui sonikoimalla. Leikattua kromatiinia inkuboitiin yön yli vasta-aineilla, jotka oli aiemmin sidottu magneettisiin helmiin (Dynabeads M-280, Invitrogen). Ei-immuuni IgG: tä käytettiin kontrollina. Käänteisen silloittamisen ja DNA-puhdistuksen jälkeen qPCR: ää käytettiin CaMKIIa-promoottorin DNA: n tasojen mittaamiseen. Alukkeet suunniteltiin monistamaan alue, joka sisälsi AP-1-konsensussekvenssin, joka sijaitsee ~ 450 bp: ssä ennen transkription aloituspaikkaa (Eteenpäin: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Kuva 3

CaMKIIa: n solutyypin ja alueen spesifinen AFosB-induktio in vivo

Kokeilu 7: CaMKII-transkription ja proteiinien ilmentymisen mittaaminen solutyypin spesifisellä ΔFosB-yliekspressiolla (Kuva 3D)

Miehistä peräisin olevat urosbitransgeeniset hiiret NSE-tTA (rivi A) × TetOP: hen-ΔfosB (linja 11) ja NSE-tTA (linja B) × TetOP: hen-FLAG-ΔfosB (linja 11) hiiret (Chen et ai., 1998; Kelz et ai., 1999; Werme et ai., 2002; Zachariou et ai., 2006) otettiin käyttöön ja niitä kasvatettiin 100 µg / ml doksisykliinillä AFosB: n ilmentymisen estämiseksi kehityksen aikana. Pentueet jaettiin vieroitusvaiheessa: puolet jäi doksisykliiniin ja puolet vaihdettiin veteen, ja eläimiä käytettiin 8: iin 11 viikkoon myöhemmin, kun ΔFosB: n transkriptiovaikutukset ovat maksimaalisia (Kelz et ai., 1999; McClung ja Nestler, 2003). Transkriptioanalyyseille hiiret purettiin nopeasti ja aivot poistettiin ja laitettiin jäälle. NAc: n leikkaukset otettiin 14-mittari-neulapuristimella ja pakastettiin nopeasti kuivalla jäällä kunnes RNA uutettiin. RNA-eristys, qPCR ja datan analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu (LaPlant et ai., 2009). Lyhyesti sanottuna RNA eristettiin TriZol-reagenssilla (Invitrogen), puhdistettiin edelleen Qiagenin RNAeasy-mikrosarjalla ja tarkistettiin laatu Agilentin Bioanalyzerin kanssa. Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen iScript (BioRad). qPCR suoritettiin Applied Biosystems 7900HT RT PCR -järjestelmällä seuraavilla sykliparametreilla: 10 min 95 ° C: ssa; 40 ° C: n 95-sykli 1 min, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek; luokitellaan lämmitys 95 ° C: een dissosiaatiokäyrien muodostamiseksi yksittäisten PCR-tuotteiden vahvistamiseksi. AFosB: n ja CaMKIIa-proteiinin ilmentymisen immunohistokemialliset analyysit suoritettiin kuten on kuvattu julkaisussa Koe 4.

Koe 8: Intra-NAc D1- ja D2-dopamiinireseptoriantagonistien vaikutukset kokaiinivälitteisiin proteiinimuutoksiin (Kuva 3H)

Aikuisille (8 viikkoa) urospuolisille rotille annettiin 10 mg / kg kokaiinia tai suolaliuosta ("ajoneuvon" ryhmä) IP kerran päivässä seitsemän päivän ajan. 30 min ennen kutakin kokaiinin injektiota, rotille annettiin IP: tä joko D1-reseptoriantagonistia SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" -ryhmä) tai D2-reseptorin antagonistia etiklopridiä (0.5 mg / kg, "D2 Ant" -ryhmä) tai suolaliuoksen injektio (”kokaiiniryhmä”). 24 h lopullisen injektion jälkeen eläimet dekapitoitiin ja proteiinit kvantitoitiin Western blot -menetelmällä Koe 2.

Kokeilu 9: AAV-välitteisen AFosB: n yli-ilmentymisen vaikutukset proteiinien ilmentymiseen (Kuva 4 A – C)

Stereotaxic leikkaus suoritettiin aikuisilla urosrotilla (8 viikkoa) AAV-GFP: n (vihreän fluoresoivan proteiinin) tai AAV-GFP-AFosB: n injektoimiseksi (Maze et ai., 2010). Kaikkiin leikkauksiin käytettiin 33-gauge-neuloja (Hamilton), joiden aikana 0.5 µl puhdistettua korkea-tiitterivirusta infuusoitiin kahdenvälisesti 5 min -jakson aikana, mitä seurasi lisäksi 5 min -infuusion jälkeinen lepojakso. Kaikki etäisyydet mitataan suhteessa Bregmaan: 10 ° kulma, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14-päivät leikkauksen jälkeen eläimille annettiin yksi IP-injektio 10 mg / kg kokaiinia liikkuvuuden seurantakammioissa ΔFosB-yliekspression käyttäytymisvaikutusten arvioimiseksi. 24 h tämän viimeisen injektion jälkeen rotat dekapitoitiin per Koe 2ja kudoksen mikrodissektio suoritettiin fluoresenssimikroskooppisen ohjauksen avulla GFP-positiivisen NAc-kudoksen saamiseksi. Western-blottaus suoritettiin sitten per Kokeile 2.

Kuva 4

AFosB on sekä välttämätön että riittävä kokaiinivälitteiselle D1-reseptorista riippuvalle CaMKIIa-induktiolle NAc-kuoressa

Koe 10: AAV-välitteisen AJunD: n yliekspression vaikutukset kokaiinista riippuvaan proteiiniekspressioon (Kuva 4 D – F)

AAV-GFP: n tai AAV-GFP-AJunD: n stereotaksinen injektio suoritettiin per \ t Kokeile 8. 14-päivät leikkauksen jälkeen eläimille annettiin 10 mg / kg kokaiinia tai suolaliuoksen IP-kerta-annosta kerran vuorokaudessa seitsemän päivän ajan liikkuvissa rekisteröintikammioissa. Lokomotorinen vaste kokaiinin yhdelle injektiolle (5 mg / kg IP) tai suolaliuos rekisteröitiin. 24 h tämän viimeisen injektion jälkeen rotat dekapitoitiin, kudos kerättiin ja Western blotit suoritettiin kuten Kokeile 9.

Koe 11: In vitro Proteiinikinaasimääritykset (Kuva 5A – D)

Rekombinantti CaMKIIa ja AFosB puhdistettiin hyönteissoluista (Brickey et ai., 1990; Jorissen et ai., 2007) ja proteiinikinaasimääritykset suoritettiin (Colbran, 1993), kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti sanottuna CaMKII: ta esi-inkuboitiin jäällä 2.5 uM (tai osoitettu pitoisuus) AFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 uM kalmoduliini ja 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforylaatio aloitettiin lisäämällä 200 uM ATP: tä, jossa oli tai ei ollut [y-³²P] ATP: n ja annettiin edetä 10 min: n ajan huoneenlämpötilassa (Kuviot 5A ja B) tai 2 min jäällä (Kuva 5C & D). Tuotteet erotettiin Western blotting -menetelmällä (Kuviot 5A ja B) tai autoradiogrammilla ja tuikelaskennalla (kuva B – D).

Kuva 5

AFosB on tehokas substraatti CaMKIIa: lle

Koe 12: Ser27-AFosB-fosforylaation tunnistaminen (Kuva 5E)

In vitro kinaasimääritykset suoritettiin per Koe 11proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla, ja AFosB: tä vastaavat kaistat leikattiin pois ja altistettiin tandemmassaspektrometrialle. Vastaavien ionifragmenttien m / z-määritykset kaikissa paneeleissa on merkitty ionipiikkien päälle. Kaikkia fragmentti-ioneja ei ole merkitty tilan rajoitusten vuoksi. Yleensä fragmentin ioni-etikettien teksti on värjätty musta, paitsi jos ne vahvistavat suoraan tai lisäävät todisteita kiinnostavien fosforylaatiokohtien läsnäolosta, jolloin ne on merkitty punaisella. Todisteet rungon fragmentointituotteista esitetään fosfopeptidin sekvenssin lukemassa ja havaittu fosforylaatiokohdan kohta, joka on merkitty punaisella yhdellä aminohappokirjaimella. Havaittujen fragmenttien ionien numeerinen kuvaus on myös merkitty peptidisekvenssiin b- ja y-ioneiksi. M / z-akselin osien zoomauskertoimet, jotka osoittavat alemman intensiteetin fragmentti-ioneja, on merkitty kunkin fragmentin massaspektrin yläosaan. Paneelissa H esitetyt fragmentti-ionit vahvistavat Ser27-fosforyloidun isoformin läsnäolon kuitenkin muiden fosforyloidun isoformien seoksessa Ser28, Ser31, Ser34 ja Thr37. Pa5: n, pa5-P: n, pb5: n ja pb5-P-ionien läsnäolo vahvistaa yksiselitteisesti Ser27-jäännöksen fosforylaation.

Koe 13: Ser27-fosforylaation kvantifiointi (Kuva 5F)

Standardipeptidit suunniteltiin jäljittelemällä Ser27 ΔFosB: n fosfo- ja ei-fosfo- muotoja. Synteesin ja puhdistuksen jälkeen kukin "raskas" idiotyyppinen peptidi liuotettiin 50 / 50-asetonitriili / vesi-puskuriin ja lähetettiin aminohappoanalyysille absoluuttisen konsentraation määrittämiseksi synteettisessä peptidivarastoliuoksessa. Kukin "raskas" peptidi syötettiin sitten suoraan 4000 QTRAP -massaspektrometriin (MS), jotta voitaisiin määrittää paras törmäysenergia MS / MS-fragmentoitumiselle ja kahdesta neljään MRM-siirtymää. Seuraavaksi siistit "raskas" peptidit altistettiin LCMS: lle 4000 QTRAP: ssä peptidien erottamisen varmistamiseksi. Laitetta ajettiin kolminkertaisessa kvadrupolitilassa, jossa Q1 asetettiin tiettyyn esiasteen m / z-arvoon (Q1 ei skannaa) ja Q3 asetetaan tiettyyn m / z-arvoon, joka vastaa kyseisen peptidin tiettyä fragmenttia. MRM-moodissa mitattiin peräkkäin sarja yksittäisiä reaktioita (esiaste / fragmentti-ionien siirtymät, joissa törmäysenergia viritetään optimoimaan kiinnostuksen kohteena olevien fragmenttionien voimakkuus), ja sykli (tyypillisesti 1-2 sec) silmukoitiin koko ajan HPLC-erotuksen koko ajan. MRM-siirtymät määritettiin olemassa olevien peptidien MS / MS-spektreistä. Sitten valittiin kaksi siirtymää peptidiä kohti, jotka vastaavat korkean intensiteetin fragmentti-ioneja, ja törmäysenergia optimoitiin MRM-siirtymien signaalinvoimakkuuden maksimoimiseksi käyttäen automaatio-ohjelmistoa. Standardipeptideistä ja CaMKII: lle tai kontrollille altistetuista AFosB-näytteistä johtuvia piikkejä verrattiin sitten kunkin peptidimuodon absoluuttisen runsauden määrittämiseksi reaktiossa. LC-MRM-tietojen analysointi suoritetaan AB Multiquant 1.1 -ohjelmistolla.

Kokeilu 14: AFosB: n induktio CaMKII: n yliekspressoivissa hiirissä (Kuva 5G & H)

Siirtogeeniset hiiret, jotka yliekspressoivat T286D CaMKII: ta (Mayford et ai., 1996; Kourrich et ai., 2012) ja villityyppisiä pentueita kasvatettiin ilman doksisykliiniä transgeenin ilmentymisen sallimiseksi. Aikuisille hiirille annettiin 20 mg / kg kokaiinia tai suolaliuosta IP kerran päivässä 14-päivinä. 24 h lopullisen injektion jälkeen eläimet dekapitoitiin ja immunohistokemia ja AFosB: n ilmentymisen kvantifiointi suoritettiin kuten Koe 4.

Kokeilu 15: HSV-välitteisen AFosB: n yliekspression ja CaMKII-inhibition vaikutukset NAc-dendriittisikareihin (Kuva 6A – E)

Aikuisia urospuolisia hiiriä (8-viikkoa) injektoitiin stereotaksisesti NAc: hen HSV-GFP: llä, HSV-GFP-AFosB: llä (Olausson et ai., 2006), HSV-GFPAC3I tai HSV-GFPAC3I-AFosB. Näissä rakenteissa AC3I, joka on peptidipohjainen CaMKII-aktiivisuuden inhibiittori, fuusioidaan GFP: n C-päähän. GFPAC3I kloonattiin PCR: llä käyttäen pMM400-vektoria, joka sisälsi GFPAC3I: n templaattina seuraavilla alukkeilla: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Saatu PCR-tuote insertoitiin p1005 + ja p1005 + -A FosB -vektoreihin käyttäen NheI- ja BspEI-kohtia. Rakenne validoitiin sekvensoimalla. Stereotaksiset koordinaatit olivat: 10 ° kulma, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = −4.4 mm (Barrot et ai., 2002). Perfuusio ja aivojen leikkaus suoritettiin per Koe 4.

Selkärangan analyysi suoritettiin kuvatulla tavalla (Christoffel et ai., 2011). Lyhyesti sanottuna dendriittisegmentit 50-150 µm poissa somasta valittiin satunnaisesti HSV-infektoiduista soluista, jotka ilmentävät GFP: tä. Kuvat hankittiin konfokaaalisessa LSM 710: ssa (Carl Zeiss) morfologista analyysiä varten käyttäen NeuronStudiota rayburst-algoritmilla. NeuronStudio luokittelee piikit ohuiksi, sieniksi tai tuskiksi seuraavien arvojen perusteella: (1) kuvasuhde, (2) pään ja kaulan välinen suhde ja (3) pään halkaisija. Kaulan piikit voidaan luokitella joko ohuiksi tai sieniksi, ja ne, joilla ei ole merkittävää kaulaa, luokitellaan tylsiksi. Kaulan piikit on merkitty ohuiksi tai sieniiksi pään halkaisijan perusteella.

Kuva 6

CaMKII-aktiivisuuden esto estää AFosB: n morfologiset ja käyttäytymisvaikutukset NAc: ssä

Kokeilu 16: HSV-välitteisen AFosB: n yli-ilmentymisen ja CaMKII-inhibition vaikutus kokaiinivasteisiin (Kuva 6F)

Aikuisille urospuolisille hiirille injektoitiin viruksia per Koe 15ja lokomotoriset vasteet yhdelle 5 mg / kg kokaiinin injektiolle mitattiin per Kokeile 9. Liikuntatiedot ilmaistaan ​​kokonaispalkin katkeamina 30-minuutin kuluttua kokaiinin injektion jälkeen.

lisäinformaatio

Eläinten asuminen

Urospuoliset Sprague Dawley -rotat (250-275 g; Charles River Laboratories) sijoitettiin pariksi. Kahdeksan viikon ikäisiä C57BL / 6J-uroshiiriä (The Jackson Laboratory) pidettiin ryhmässä, jossa oli enintään viisi eläintä häkkiä kohden. Kaikki eläimet otettiin eläinkeskukseen ≥1-viikkoa ennen kokeellisia manipulaatioita ja ne sijoitettiin ilmastoiduissa huoneissa (23 – 25 ° C) 12 hr -valo / pimeässä syklin aikana (valot palavat 7: 00 AM) ja pääsivät ruokaan ja vettä ad libitum. Kokeet suoritettiin Neurotieteen seuran ja Sinai-vuoren institutionaalisen eläinten hoidon ja käytön komitean (IACUC) ohjeiden mukaisesti.

Huumeet

Lääkkeitä annettiin IP: lle ja liuotettiin steriiliin suolaliuokseen, mukaan lukien kokaiini (5 – 20 mg / kg 10 µl hiirille, 1 ml: lle rotille, NIDA) ja SCH 23390 tai etiklopriidihydrokloridi (0.5 mg / kg / 1 ml, Tocris) . Stereotaksisissa leikkauksissa hiiret nukutettiin ketamiinin (100 mg / kg) ja ksylatsiinin (10 mg / kg) (Henry Schein) "cocktaililla" steriilissä suolaliuoksessa.

vasta-aineita

CaMKIIα (yhteensä): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII-fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (yhteensä): Cell Signaling 5G4, 1: 250

ΔFosB-fosfo-Ser27: fosfosoluutiot, 1: 500

GluA1 (yhteensä): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Tilastolliset analyysit

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Prism 6 -ohjelmistopakettia (GraphPad). Opiskelijan t-testejä käytettiin kaikkiin pareittaisiin vertailuihin (ilmoitettu tuloksissa, joissa annetaan t-arvo), ja yksisuuntaisia ​​ANOVA-arvoja käytettiin kaikkiin moninkertaisiin vertailuihin (ilmoitettu tulososassa, jossa F-arvo on annettu).

Siirry:

tulokset

Krooninen kokaiini indusoi CaMKII: n NAc Shellissä

Monissa tutkimuksissa on osoitettu, että NAc-kuoressa ja ytimessä olevat MSN: t ovat erilaiset biokemialliset ja fysiologiset vasteet kroonisesta altistumisesta huumeiden väärinkäytölle (Kourrich ja Thomas, 2009; Loweth et ai., 2010) ja että nämä kaksi osa-aluetta säätelevät eri tavoin huumeiden etsintäkäyttäytymistä (Ito et ai., 2004). Kokaiinin erilaisten vaikutusten määrittäminen NAc-kuoren proteiinikomponentteihin vs. ydin, käytimme multipleksoitua isobarista merkintää (iTRAQ) ja tandemmassaspektroskopiaa (MS / MS). Aikuisilla urosrotilla injektoitiin IP: tä kokaiinilla (20 mg / kg) tai suolaliuoksella päivittäin 7-päivinä; 24 hr viimeisen injektion jälkeen, NAc-kuori ja ydin olivat mikrodissektioita (Kuva 1A) ja flash jäädytetään. Näiden näytteiden proteiinit kvantifioitiin sitten käyttäen iTRAQ: a. Kaikkien neljän CaMKII-isoformin ekspressio lisääntyi suuresti NAc-kuorelle ominaisen kokaiinikäsittelyn jälkeen verrattuna ytimeen. Useat proteiinifosfataasit, mukaan lukien PP1-katalyyttiset ja säätely-alayksiköt ja PP2A, jotka on aiemmin liitetty muihin CaMKII-substraatteihin muissa järjestelmissä (Colbran, 2004), seurasi samanlaista mallia. Nämä havainnot antoivat uusia, puolueettomia todisteita siitä, että CaMKII-signalointireitti on selvästi säädetty kokaiinilla NAc: ssä kuoren suhteen.

Tämän havainnon validoimiseksi kvantitatiivisemmin me käsittelimme edellä mainittuja rotia kokaiinilla (vaihtelevilla annoksilla) tai suolaliuoksella ja mitattiin lokomotorivasteita kokaiinille (5 mg / kg) tai suolaliuoksen annokselle. Toistuva altistus 10 mg / kg kokaiinille johti tyypilliseen liikkuvuuden herkistymiseen (Kuva 1B). Lisä- tutkimukset tämän annosteluohjelman avulla osoittivat, että käyttämällä Western-blottausta toistuva kokaiini indusoi selektiivisesti CaMKIIa: a NAc-kuoressa 24 h lopullisen kokaiinin injektion jälkeen (Kuva 1C ja D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Lisäksi AMPA-reseptorin GluA831-alayksikön kanonisen CaMKII-substraatin Ser1: n fosforylaatio kasvoi merkittävästi NAc-kuoressa eikä ytimessä (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), kun taas CaMKIIa Thr286-autofosforylaatiolla oli voimakas, mutta ei merkittävä suuntaus induktioon vain kuoressa (Kuva 1D). Useita muita glutamaattireseptoreita ei vaikuttanut. Päinvastoin kuin nämä CaMKII: n mittaukset, samat kudosnäytteet osoittivat AFosB: n induktiota molemmissa kuorissa (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) ja ydin (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) (Kuva 1C ja D), joka on aiempien havaintojen mukainen (Perrotti et ai., 2008).

Koska useat aikaisemmat AMPA-reseptorien kokaiinin säätelyä koskevat tutkimukset analysoivat eläimiä ~ 14-päivän poistuessa kroonisesta kokaiinista (ks. Keskustelu), toistimme nämä biokemialliset analyysit tällä hetkellä. Huomasimme, että 14 päivää kokaiinin viimeisen injektion jälkeen AFosB pysyy koholla NAc: ssä (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), kun taas ei CaMKII eikä GluA1 Ser831: n fosforylaatio pysy suuremmaksi (Kuva 1E). Kuitenkin 1 hr yhden 10 mg / kg kokaiinin altistusannoksen jälkeen, koko CaMKII: n tasot (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) ja GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforylaatiot ovat molemmat koholla, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin alkuperäisen kroonisen kokaiinialtistuksen jälkeen (Kuva 1E). Nämä tiedot osoittavat, että NAc-kuoren hermosoluja kromatografoidaan CaMKII-induktiolle pitkien abstinention aikana, ehkä CaMKII-geenipromoottorin suoran alukkeen avulla (katso keskustelu). Lisäksi se seikka, että ΔFosB-induktio on pysyvämpi kuin CaMKII-induktio, viittaa siihen, että on olemassa muita, joko kromatiinipohjaisia ​​tai muuten, mekanismeja, jotka käyttävät "jarrua" CaMKII-säätelyssä, kuten keskustelussa käsitellään.

Näiden havaintojen vahvistamiseksi tutkittiin kokaiinin itsensä antamisen malleja, joihin liittyy tahattomat lääkkeiden saanti. Aikuisille urosrotille annettiin joko lyhyt tai pitkä kokaiinin käyttö; odotetusti (Ahmed ja Koob, 1998), vain pitkät käyttöolosuhteet johtivat lääkkeen itsensä antamisen lisääntymiseen (Kuva 2A). AFosB indusoitiin suuremmalla määrin pitkään vs. lyhyt pääsy kokaiiniin sekä NAc-kuoressa (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) ja ydin (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Sitä vastoin CaMKIIa: ta indusoitiin NAc-kuoressa vain pitkällä kokaiinin saannilla (Kuvio 2B ja C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). On mielenkiintoista verrata keskimääräistä päivittäistä kokaiinin saantia lyhytaikaisten eläinten (~ 12 mg / kg IV), pitkäikäisten eläinten (~ 70 mg / kg IV) ja kokeilijan antamien eläinten (10 mg / kg) ja kysy miksi viimeksi mainittu saa aikaan ΔFosB: n ja CaMKII: n voimakkaan induktion, kun taas lyhytyhteys ei ole. Tämä poikkeama johtuu todennäköisesti kokaiinin huipputason eroista (kokeenin antama kokaiini annetaan yksittäisenä bolus-IP: na, kun taas itse antama kokaiini toimitetaan useiden IV-annosten kautta) tai lääkeaineen altistumisen pituuden eroilla (7 päivää kokeilijalle) 19-päivät itsensä antamiseen).

Huolimatta suuresta kirjallisuudesta ΔFosB: stä ja CaMKII: sta kokaiinitoiminnassa, näissä proteiineissa ei ole tutkimuksia kokaiinin käyttäjistä. Tässä esitellään ensimmäiset todisteet siitä, että sekä ΔFosB: n (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) ja CaMKII: n (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) tasot kohoavat kokaiiniriippuvaisissa ihmisissä (Kuva 2D, Taulukko 1). Nämä tiedot osoittavat, että kokaiinin αFosB- ja CaMKII-induktion tutkimukset jyrsijän NAc: ssä ovat kliinisesti merkityksellisiä ihmisen kokaiiniriippuvuudelle.

Taulukko 1

Ihmisen kokaiiniriippuvaisista ja vertailuryhmästä peräisin olevien näytteiden karakterisointi

ΔFosB säätää CaMKII-transkriptiota valikoivasti NAc Shellin D1-tyypin MSN: ssä

Tuloksena, että kokaiinin sekä CaMKII: n että AFosB: n säätäminen jyrsijän NAc: ssä johti meidät määrittämään, voiko AFosB säätää CaMKII-geenin transkriptiota. Olemme aiemmin raportoineet CaMKIIa: sta ΔFosB: n mahdollisena kohteena NAc: n puolueettomassa microarray-analyysissä (McClung ja Nestler, 2003), mutta tätä havaintoa ei vahvistettu tässä tutkimuksessa. Käytimme ensin kvantitatiivista ChIP-arvoa (qChIP-ChIP, jota seurasi kvantitatiivinen PCR) sen määrittämiseksi, sitoutuuko AFosB aikuisten urosrottien CacKIIa-geenipromoottoriin NAc: ssä, ja havaitsi hämmästyttävän, että tämä sitoutuminen lisääntyy merkittävästi kroonisen kokaiinin antamisen myötä kuoressa ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), mutta ei ydin, osa-alue (Kuva 3A). Jotta ymmärrettäisiin edelleen tämän subregionispesifisen AFosB: n sitoutumisen CaMKIIa-promoottoriin liittyviin mekanismeihin, käytimme qChIP: tä karakterisoimaan histonimodifikaatioiden tilaa tässä genomi-alueella. Aikaisemmat tutkimukset osoittivat H3-asetyloinnin kokaiinin induktion CaMKIIa-promoottorissa hiiren kokonaismäärässä (Wang et ai., 2010). Sen sijaan havaitsimme, että kokaiini vähentää H3-asetylointia CaMKIIa-promoottorissa selektiivisesti NAc-ytimessä (Kuva 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), ilman muutoksia, jotka näkyvät kuoressa, mikä vastaa ala-alueelle ominaisia ​​kromatiinimuutoksia, jotka ylittävät AFosB-sitoutumisen. qChIP repressiivimerkille, dimetyloitu H3-lysiini 9 (H3K9me2), paljasti suuntaukset sekä kuoren että ydinalueen alenemiseen (Kuva 3C).

Sen määrittämiseksi, säätelevätkö AFosB CaMKIIa-transkriptiota in vivo, käytimme kahta bitransgeenistä hiirilinjaa, jotka indusoivat yliherkkiä AFosB: tä erityisesti D1: ssa vs. D2-tyyppiset MSN: t doksisykliinin antamisen avulla juomavedessä (Chen et ai., 1998; Kelz et ai., 1999; Werme et ai., 2002). Aikuiset urospuoliset hiiret, jotka ylittivät AFosB: tä yksinomaan D1-tyyppisissä MSN: issä, olivat merkittävästi lisänneet CaMKIIa-mRNA: n tasoja NAc: ssä (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), jota ei havaittu hiirillä, jotka yliekspressoivat AFosB: tä pääasiassa D2-tyyppisissä MSN: ssä (Kuva 3D). CaMKIIa-mRNA: n lisääntyminen, jota indusoi AFosB: n ilmentyminen D1-tyypin MSN: iin, liittyi samanaikaisesti CaMKIIa-proteiinin lisääntymiseen sekä NAc-kuoressa (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) ja ydin (p = 0.0392; = 2.275, df = 14; Kuviot 3E ja F). Nämä tiedot osoittavat, että ΔFosB kykenee kuljettamaan CaMKIIa-geenin ilmentymistä D1-tyyppisissä MSN: ssä molemmilla osa-alueilla, vaikka Kuva 3B ehdottaa, että kokaiinivälitteiset kromatiinimuutokset CaMKIIa-promoottorissa (esim. pelkistetty asetylaatio) estävät ΔFosB: n nousemasta CaMKII: ta ytimen alialueella kokaiinin jälkeen.

Koska siirtogeeniset hiirtietomme osoittivat, että CaMKII-geeniekspression ΔFosB-indusointi on spesifistä D1-tyyppisille MSN: ille NAc: ssä, etsimme seuraavaksi, vaatiiko kokaiinista riippuvainen CaMKII: n uudelleenregulaatio D1-dopamiinireseptorin aktivaation. Aikuisille urosrotille annettiin kroonista kokaiinia tai suolaliuosta kuten aikaisemmin, mutta 30 minuuttia ennen kutakin injektiota kokaiiniryhmän rotille annettiin suolaliuoksen IP-injektiota, D1-antagonistia SCH 23390 (0.5 mg / kg) tai D2-reseptorin antagonistia etiklopridia. (0.5 mg / kg). Eläimet analysoitiin 24 tuntia viimeisen kokaiininjektion jälkeen. Western-blottaus paljasti, että D1-antagonisti, mutta ei D2-antagonisti, esti kokonaan kokaiinivälitteisen ΔFosB: n lisääntymisen (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kuten aiemmin on raportoitu (Nye et ai., 1995) sekä CaMKII: ssa (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Kuvio 3G ja H). Nämä tiedot tukevat hypoteesia siitä, että kokaiini sitoutuu CaFK-geenin ilmentymisen AFosB-välitteiseen kasvuun NAc-kuoren D1-tyypin MSN: iin. Tulevissa tutkimuksissa olisi tärkeää osoittaa suoraan tämä kokaiinin solutyyppinen spesifinen vaikutus CaMKII: n ilmentymiseen tässä aivojen alueella.

ΔFosB on sekä välttämätön että riittävä CaMKII: n kokaiinin induktiolle NAc Shellissä

Bitransgeenisten hiirien käytön täydentämiseksi tutkittiin seuraavaksi AFOSB: n roolia CaMKIIa: n kokaiinin induktion välittämisessä käyttämällä viruksen välittämää geeninsiirtoa rotilla. Me kaksinkertaisesti injektoimme adeno-assosioituneita virus- (AAV) hiukkasia aikuisten urosrottien NAc-kuoreen (jossa kuori voidaan valikoivasti kohdistaa) yli-ilmentämään AFosB plus GFP tai GFP yksinään. Sitten eläimille annettiin yksi IP-injektio 10 mg / kg kokaiinia. AFosB / GFP: tä yliekspressoivat eläimet osoittivat lisääntynyttä liikkuvuutta koskevaa vastetta verrattuna eläimiin, jotka yliekspressoivat yksinomaan GFP: tä (Kuva 4A). 24 hr yksittäisen kokaiinin injektion jälkeen GFP-positiivinen NAc-kudos leikattiin näistä eläimistä leikkaamalla fluoresoivan valonlähteen alla. Tämän kudoksen Western-blottaus (Kuvio 4B ja C) paljasti voimakkaan AFosB: n yliekspression sekä merkittävän kokonais-CaMKIIa-proteiinin lisääntymisen verrattuna GFP-eläimiin (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), samanlainen kuin kroonisen kokaiinin antamisen yhteydessä havaittu induktio. Lisäksi CaMKIIa-autofosforylaatiota Thr286: ssa (osoittaen entsyymiaktivoitumisen) lisättiin AFosB: n yliekspressiona (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), samoin kuin CaMKII-substraatin, GluA831: n Ser1: n fosforylaatio (p = 0.0540; 2.012; df = 28), jäljitellen uudelleen kroonisen kokaiinin vaikutuksia (Kuva 1C ja D). TYhdessä nämä tiedot antavat lisää todisteita siitä, että ΔFosB: n ilmentyminen NAc-kuoressa on riittävä liikkuvuuden herkistämiseksi kokaiinille ja CaMKII-induktiolle ja aktivoinnille tässä osa-alueella.

Käytimme samanlaista lähestymistapaa sen määrittämiseksi, tarvitaanko AFosB: tä myös CaMKIIa: n kokaiinivälitteiseen induktioon NAc-kuoressa. AAV: ta käytettiin katkaistun JunD-proteiinin yli-ilmentämiseen, jota kutsutaan AJunD: ksi, joka on negatiivinen AFosB-transkriptionaalisen aktivaation säätelijä (Winstanley et ai., 2007) sekä GFP tai GFP yksin. Kaksi viikkoa myöhemmin, kun transgeeniekspressio on maksimaalinen, eläimille annettiin kokaiinia (10 mg / kg) tai suolaliuosta päivittäin 7-päiviä varten ja testattiin liikkuvuuden vasteita kokaiinialtistukseen (5 mg / kg) 24 hr viimeisen kroonisen injektion jälkeen (Kuva 4D). AJunD: n yli-ilmentyminen estäisi liikkuvuuden herkistymistä kokaiinille, ja myös estää CaMKIIa-induktion ja aktivoinnin NAc-kuoressa (Kuva 4E ja F; p = 0.0437; F = 2.997; yhteensä df = 38), mikä osoittaa, että ΔFosB-transkriptionaalinen aktiivisuus on välttämätön CaMKIIa: n kokaiinivälitteiselle induktiolle tässä osa-alueella. Mielenkiintoista huomasimme, että AJunD alensi AFosB: n tasoja sekä suolaliuoksessa että kokaiinilla hoidetuissa olosuhteissa (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), mikä nosti uuden mahdollisuuden, että ΔFosB riippuu AP-1-aktiivisuudesta omille ilmentymistasoilleen.

CaMKII-fosforylaatit AFosB Ser27issa

Käyttäminen vitro proteiinikinaasimääritykset määrittelimme, että puhdistettu ΔFosB on vahva substraatti CaMKIIa: lle. Hänen inkubointi₆-AFosB CaMKIIa: n ja ATP: n kanssa aiheutti ΔFosB: n elektroforeettisen liikkuvuuden nousevan nousun (Kuva 5A); useat tuloksena olevat nauhat ehdottivat useita fosforylaatiokohtia. samankaltainen vitro kinaasimääritykset käyttäen [γ-³²P] ATP osoitti radioleimatun fosfaatin sisällyttämisen siirtyneisiin ΔFosB-kaistoihin (Kuva 5B), joka osoittaa proteiinin suoran fosforylaation. Muodostimme fosfo-spesifisen vasta-aineen aikaisemmin karakterisoidulle AFosB: n Ser27: lle (Ulery et ai., 2006). Vaikka tämä vasta-aine ei tuota signaalia aivosuutteita vastaan, jotka sisältävät Ser27-fosforyloidun AFosB: n (tietoja ei ole esitetty), pystyimme havaitsemaan Ser27-fosforylaation vitro kinaasimääritys CaMKII: lla (Kuva 5B). AFosB: n CaMKII-fosforylaation kineettiset analyysit osoittavat, että se on kinaasin voimakas substraatti (Kuva 5C), jossa on ilmeinen K_M 5.7 ± 2.0µM ja K_KISSA 2.3 ± 0.3min^-1. Nämä tulokset ovat verrattavissa moniin hyvin karakterisoituihin tuloksiin in vivo CaMKII: n substraatit (Colbran ja Brown, 2004). Lisäksi määrittelimme, että CaMKII fosforyloi AFosB: tä stoikiometrisesti 2.27 ± 0.07 mol / mol (Kuva 5D), mikä osoittaa, että Hisissä on ainakin kolme CaMKII-fosforylaatiokohtaa₆-AFosB-proteiini Kuva 5A.

Yksittäisten fosforylaatiokohtien tutkimiseksi käytimme MS-analyysejä näytteistämme vitro kinaasimääritykset. Kuva 5E osoittaa FosB-fosforylaatiota aikaisemmin karakterisoidussa Ser27: ssa ja useissa lisäpaikoissa (tietoja ei ole esitetty). Ottaen huomioon Ser27: n aikaisemman funktionaalisen karakterisoinnin, keskityimme tähän kohtaan tuottamalla merkityt synteettiset peptidit, jotka jäljittelivät Ser27: n fosfo- ja ei-fosfotiloja, sitten käytettiin tunnettuja määriä näitä peptidejä standardeina ΔFosB: n MRM-analyyseissä ennen ja jälkeen vitro fosforylaatio CaMKII: lla. Seuraava määritys (Kuva 5F) vahvistaa, että Ser27 on tehokas substraatti CaMKII: lle. Nämä tulokset osoittavat, että monien fosforyloitujen jäännösten joukossa AFosB: ssä Ser27 on erityisen tehokas substraatti CaMKII: lle.

CaMKII välittää kokaiinia ΔFosB: n kertymistä NAc Shelliin

Koska CaMKII voi fosforyloida AFosB: tä vitro sivustossa, joka parantaa merkittävästi sen vakautta vitro ja in vivo (Ulery et ai., 2006; Ulery-Reynolds et ai., 2009), määrittelimme onko CaMKII-aktiivisuus kontrolloi AFosB-tasoja NAc: ssä in vivo. Tämän kysymyksen käsittelemiseksi käytimme ensin hiirilinjaa, joka yliekspressoi kalsium-riippumattoman CaMKIIa-mutantin (T286D) monissa aivojen alueilla, mukaan lukien NAc (Mayford et ai., 1996; Kourrich et ai., 2012). Injektoimme 20-päivien ajan ikärajaisia ​​aikuisten urospuolisia mutantteja ja villityyppisiä pentueita 14 mg / kg kokaiinia tai suolaliuosta kerran, sitten analysoitiin eläimet yhden päivän kuluttua viimeisestä injektiosta. Löysimme, että ΔFosB: n peruspitoisuudet kasvoivat mutanttisissa eläimissä NAc-kuoressa (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), mutta ei ydin (Kuvio 5G ja H). Yllättäen kokaiiniriippuvainen AFosB: n induktio estettiin mutanttisissa eläimissä sekä kuoressa että ytimessä, mikä viittaa siihen, että vaikka CaMKII voi suoraan säätää AFosB: n stabiilisuutta NAc-kuoressa, se voi myös olla ylävirtaan ΔFosB: stä kokaiiniaktivoiduilla reiteillä molemmissa NAc-alialueilla .

CaMKII-aktiivisuus on välttämätön ΔFosB-välitteiselle rakenteelliselle ja käyttäytymiselle muovattavuudelle

Dendriittisten piikkien kokaiinin induktio NAc: ssä MSN: t ovat yksi parhaiten vakiintuneista lääkeaineiden aiheuttamista mukautuksista tässä aivojen alueella, ja tällainen selkärangan induktio on korreloitu herkistettyjen käyttäytymisvasteiden kanssa lääkkeelle (Robinson ja Kolb, 2004; Russo et ai., 2010) ja raportoitu olevan valikoivia D1-tyypin MSN: ille (Lee et ai., 2006). Olemme osoittaneet viime aikoina, että dendriittisten piikkien kokaiinin induktio NAc: ssä riippuu ΔFosB: stä ja sen alavirran transkription ohjelmasta (Maze et ai., 2010). Vaikka on olemassa laaja kirjallisuus, joka koskee CaMKII: n osallistumista dendriittisen selkärangan morfologiaan ja induktioon muissa aivojen alueilla ja kokeellisissa järjestelmissä (Jourdain et ai., 2003; Penzes et ai., 2008; Okamoto et ai., 2009), sen roolia NAc-MSN-selkärangan muodostumisessa ei ole tutkittu. Siksi määritimme, tarvitaanko CaMKII-aktiivisuutta MSN-dendriittisten piikkien AFosB-välitteiseen induktioon käyttämällä HSV-välitteistä CaMKII-inhibiittoripeptidin AC3I yli-ilmentymistä, joka on fuusioitu GFP: hen, joka on aiemmin osoitettu inhiboivan CaMKII-aktiivisuutta in vivo (Zhang et ai., 2005; Klug et ai., 2012). AFosB: n viruksen yli-ilmentyminen aikuisten hiirten NAc-kuoressa aiheutti merkittävän MSN-dendriittisen selkärangan tiheyden kasvun (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Kuvio 6A ja B) kuten aiemmin ilmoitettiin (Maze et ai., 2010), ja tämä kasvu johtui pääasiassa ohuista (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) ja tynkä (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) selkärangan tyypeistä (molempien uskottiin olevan epäkypsiä piikkejä)Kuva 6C – E). Mitään vaikutusta ei havaittu kypsemmillä, sienimuotoisilla piikillä. Kuitenkin, kun GFP-AC3I: tä ekspressoitiin yhdessä, AFosB: n indusointi spines oli kokonaan poistettu (Kuva 6A – E), mikä osoittaa, että CaMKII-aktiivisuus tarvitaan dendriittisten piikkien ΔFosB-induktiolle NAc-kuoressa.

Seuraavaksi käytimme samoja virustyökaluja sen määrittämiseksi, tarvitaanko CaMKII-aktiivisuutta ΔFosB: n vaikutuksiin käyttäytymisherkkyyteen kokaiinille. 72 hr viruksen injektion jälkeen NAc-kuoreen, eläimille annettiin yksi 5 mg / kg kokaiinin injektio ja niiden lokomotorinen aktiivisuus kirjattiin. Kuten aiemmin on esitetty, AAFosB: n AAV: n yli- ilmentyminen on laajempi (Kuva 4A) AFosB: n HSV-välitteinen yli-ilmentyminen lisäsi liikkuvuuden herkkyyttä kokaiinille (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Kuva 6F). Kuten dendriittisten piikkien induktiossa, CaMKII-aktiivisuuden inhibointi GFP-AC3I: n rinnakkaispressoinnin avulla estäisi täysin FosB-välitteisen kokaiinin herkkyyden lisääntymisen, mikä osoittaa, että CaMKII-aktiivisuus vaaditaan ΔFosB-indusoiduille kokaiinin käyttäytymisvaikutusten muutoksille.

Siirry:

Keskustelu

Esillä oleva tutkimus kuvaa uuden syöttömekanismin, jossa kokaiini indusoi ΔFosB: tä NAc: ssä, joka säätää CaMKIIa-geenin transkriptiota selektiivisesti NAc-kuoressa. Tämän jälkeen CaMKIIa fosforyloi ja stabiloi AFosB: tä, mikä johtaa suurempaan AFosB: n kertymiseen ja edelleen CaMKIIa: n induktioon (Kuva 6G). Kahden proteiinin samanaikainen lisääntyminen tasossa kokaiinin kroonisen altistuksen aikana edistää olennaisesti keinoja herkistää käyttäytymismuutoksia lääkkeeseen. Tämä on erityisen houkutteleva hypoteesi, koska sekä ΔFosB että CaMKII ovat aikaisemmin osoittaneet, että niitä tarvitaan lisääntyneisiin käyttäytymisvasteisiin kokaiiniin (Pierce et ai., 1998; Peakman et ai., 2003), ja toistamme tämän havainnon ΔFosB: lle NAc-kuoressa, erityisesti käyttämällä viraalista lähestymistapaa (Kuviot 4 ja and66).

Vaikka transgeeninen AFosB: n yli-ilmentyminen D1-tyyppisissä MSN: issä voi ajaa CaMKII-induktiota sekä NAc-kuoressa että kokaiinin aikaisemmin saamattomien eläinten ytimessä, kokaiinin yhteydessä endogeenisen AFosB: n kertyminen, joka esiintyy kummallakin alialueella, ajaa CaMKII: n induktiota erityisesti NAc-kuoressa . Tämä ero voisi liittyä suurempiin AFosB: n tasoihin, jotka indusoituvat bittransgeenisessä mallissamme, mutta se saattaa myös heijastaa kokaiinin kykyä muuttaa CaMKIIa-promoottoria differentiaalisesti kuoressa vs. ydin MSN: t joko edistämään AFosB: n sitomista ensimmäisessä tai sulkemaan sen jälkimmäiseen osa-alueeseen. Itse asiassa meidän ChIP-tiedot, jotka paljastavat kokaiinivälitteisen histonien deasetyloinnin CaMKIIa-geenipromoottorissa vain NAc-ytimessä, tukevat kromatiinimekanismin mahdollista osallistumista. Tämän hypoteesin mukaisesti DFNUMX-tyypin MSN: iden AFosB: n yli-ilmentyminen pystyi ajamaan CaMKIIa-induktiota NAc-ytimessä ilman kokaiinia (Kuva 3F), mikä viittaa siihen, että CaMKIIa-promoottorilla on aktiivisia muutoksia, jotka estävät tämän induktion kroonisen kokaiinialtistuksen aikana. Kromatiini-maiseman säätäminen CaMKII-promoottorissa voi myös selittää, miksi CaMKII: ta indusoi kokaiinin altistumisannos kroonisen kokaiiniä vetävän rotan NAc-kuoressa (Kuva 1E) mutta ei lääkkeitä aiemmin \ tKuva 1D). Tämä voisi edustaa ΔFosB: n epigeneettistä "geenin priming" -vaikutusta (Robison ja Nestler, 2011), ja se voisi siten olla yksi molekyylimekanismi kokaiinien himoa- \ tPickens et ai., 2011). Kuitenkin, jotta tämä kromatiini muuttuu syy-yhteydeksi himo-inkubointiin, sen olisi kasvava ajan myötä. On mielenkiintoista selvittää, onko näin, ja tutkia, osoittavatko muut geenit, että kokaiinilla on ΔFosB: stä riippuvaista, osa-aluekohtaista sääntelyä. On myös tärkeää huomata, että kuvaamamme syöttösilmukka ei johda CaMKII: n tai ΔFosB: n loputtomaan kertymiseen (Kuva 1E); Tämän vuoksi vastuussa olevan molekyylisen ”jarrun” paljastaminen on tulevien tutkimusten tärkeä tavoite.

AFosB: n ja CaMKII: n tunnetut toiminnot useissa kokeellisissa järjestelmissä ja aivojen alueilla konvergoituvat monilla tasoilla (Kuva 6F). Molemmat molekyylit liittyvät läheisesti dendriittisen selkärangan kasvuun: CaMKII on vuorovaikutuksessa aktiini-sytoskeletonin kanssa (Okamoto et ai., 2009), säätää selkärangan kokoa (Matsuzaki et ai., 2004), ja se on sekä välttämätön että riittävä plastismin aiheuttamille filopodioiden ja synapsien lukumäärän lisääntymiselle hippokampuksen organotyyppisissä viipaleviljelmissä (Jourdain et ai., 2003), wHile ΔFosB on sekä välttämätön että riittävä kokaiinin aiheuttamaan dendriittisen selkärangan muodostumiseen NAc MSN: ssä (Maze et ai., 2010). Lisäksi molemmat molekyylit on liitetty AMPA-glutamaattireseptorien säätelyyn. CaMKII ei säätele AMPA-reseptorien alayksiköiden kokonaismääriä, vaan ajaa AMPA-reseptorien insertoinnin synapseihin ja lisää AMPA-kanavan johtavuutta fosforyloimalla GluA1 Ser831: ssa hippokampus-pyramidi-neuroneissa kulttuurissa ja in vivo (tarkistettu (Malinow ja Malenka, 2002; Colbran ja Brown, 2004)). Tällainen lisääntynyt GluA1-kauppa synapsiin on vaikuttanut myös krooniseen kokaiinitoimintaan (Boudreau ja Wolf, 2005). Lisäksi CaMKIIa: n yliekspressio D1-dopamiinireseptorista riippuvaisella tavalla lisää AMPA-reseptorin aktivaatiota käyttä- vää vastetta NAc: ssä.Singer et ai., 2010). FosB: n pitkäaikainen D1-spesifinen yliekspressio on osoitettu indusoivan GluA2-transkriptiota NAc: ssä (Kelz et ai., 1999), joka vaimentaa GluA1: n välityksellä välitettyjä AMPA-vasteita, kun taas tässä osoitetaan, että lyhyemmällä aikavälillä AFosB: n yliekspressiolla - samoin kuin lyhyemmällä aikavälillä kokaiinialtistuksella - ei ole vaikutusta tähän alayksikköön (kuvio 1). Olemme kuitenkin viime aikoina huomanneet, että lyhyen aikavälin ΔFosB: n yli-ilmentyminen kuitenkin vähentää AMPA-vasteita D1-tyyppisissä MSN: issä NAc: ssä (Grueter et ai., 2013). Nämä tiedot viittaavat ajallisesti erillisiin mekanismeihin, jotka saattavat muodostaa ajasta riippuvaisen sarjan kokaiinin neuroadaptaatioita, jotka perustuvat riippuvuuden etenemisen eri näkökohtiin, joita ei vielä ole ymmärretty. Käyttäytymistasolla sekä CaMKII: ta että ΔFosB: tä tarvitaan kokaiiniin kohdistuvan liikkuvuuden herkistämiseksi (ks. Edellä), ja molemmat vaaditaan kokaiinin itsensä antamiseksi jyrsijöille (Colby et ai., 2003; Wang et ai., 2010), mikä viittaa siihen, että nämä kaksi proteiinia ovat tärkeitä sekä lyhyen että pitkän aikavälin käyttäytymismuutoksille huumeiden altistumiseen, vaikkakin osittain erillisten taustamekanismien kautta. Oletettavasti ΔFosB ja CaMKII säätelevät tällaisia ​​monimutkaisia ​​käyttäytymismuutoksia NAc-synaptisessa toiminnassa tapahtuvien muutosten kautta, vaikka synaptisten ilmiöiden kytkemiseksi suoraan käyttäytymismuutokseen tarvitaan paljon muuta työtä.

CaMKII-holoentsyymi vuorovaikutuksessa samanaikaisesti erilaisten synapseihin liittyvien proteiinien kanssa (Robison et ai., 2005), joiden uskotaan säätelevän sen kohdistumista postsynaptiseen tiheyteen (PSD), ilmiö, joka ehdotetaan olevan tärkeä synaptiselle plastisuudelle. Erityisesti CaMKII: n vuorovaikutus NMDA-tyypin glutamaattireseptorin GluN2B-alayksikön kanssa osoitettiin hiljattain säätelevän sekä synaptista plastisuutta että oppimista (Halt et ai., 2012). Vaikka AC3I-peptidi jäljittelee CaMKII: n autoinhibitantidomeeniä ja siten inhiboi entsyymikatalyyttistä aktiivisuutta, se myös estää useita proteiini-proteiini- vuorovaikutuksia (Strack et ai., 2000; Robison et ai., 2005). Täten tässä raportoitu HSV-GFP-AC3I: n käyttäytymis- ja morfologiset vaikutukset voivat tapahtua CaMKII-kohdeproteiinien fosforylaation vähenemisen, CaMKII-kohdistuksen muutosten tai CaMKII: n ehdottaman rakenteellisen roolin muutoksen myötä synapseissa (Lisman et ai., 2002).

Ehdotetun AFosB-CaMKII-silmukan rajoitus NAc-kuorelle on erityisen huomionarvoista, koska viimeaikainen työ on osoittanut useita fysiologisia eroja NAc-kuoren ja ytimen välillä vastauksena kokaiinin hallinnointiin, käsite, jonka vahvistavat puolueettomat iTRAQ (taulukko S1) -tiedot . NAc-kuoren MSN-arvot osoittavat, että kroonisen kokaiinin jälkeinen ampumakapasiteetti vähenee viikkojen ajan, kun taas samoista eläimistä saadut MSN-ytimet osoittavat ohimenevää (1 – 3-päivä) ampumakapasiteetin nousua, joka palautuu perusarvoihin 2-viikkoinaKourrich ja Thomas, 2009). Lisäksi lukuisat synaptiset proteiinit säännellään eri tavalla NAc-kuoressa vs. krooniseen kokaiiniin altistuvien eläinten ydin, mukaan lukien GluA2 (\ tKnackstedt et ai., 2010). Koska krooninen amfetamiini indusoi CaMKIIa: ta erityisesti NAc-kuoressa (Loweth et ai., 2010), ei ole yllättävää, että löydämme samanlaisen vaikutuksen kokaiinin kanssa. Kuitenkin, koska ΔFosB indusoidaan sekä NAc-kuoressa että ytimessä kroonisella kokaiinilla (Perrotti et ai., 2008ja koska osoitamme, että CaMKIIa-induktio kuoressa on AFosB-riippuvainen, löydöksemme tarjoavat uusia todisteita erillisistä transkriptiomekanismeista CaMKIIa-promoottorissa näiden kahden osa-alueen välillä, jotka ovat vastuussa CaMKIIa: n selektiivisestä induktiosta kuoressa.

Suuri osa viimeaikaisesta työstä on keskittynyt D1- ja D2-tyyppisten NAc-MSN: ien erottamiseen. Vaikka sekä D1- että D2-reseptorit osallistuvat kokaiinin palkitseviin vaikutuksiin (Itse, 2010), Viimeaikainen työ osoittaa, että D1-tyyppisten MSN: ien optogeneettinen aktivointi lisää käyttäytymisvasteita kokaiinille, kun taas D2-tyypin MSN-aktivaatiolla on päinvastainen vaikutus (Lobo et ai., 2010). Näiden havaintojen mukaisesti D1-reseptorin knockout-hiiret ovat puutteellisia kokaiinin itsensä antamisessa (Caine et ai., 2007), kun taas D2-pudotukset eivät ole (Caine et ai., 2002). D1-agonistien antaminen suoraan NAc: hen laukaisee kokaiinin etsintäkäyttäytymisen palautusparadigmeissa (Itse, 2010). Mielenkiintoista on, että tämä vaikutus edellyttää D1-reseptorista riippuvaa CaMKII-aktiivisuuden kasvua NAc-kuoressa, mutta ei ytimessä (Anderson et ai., 2008) tulos, joka sopii yhteen D1- ja shell-spesifisen ΔFosB-CaMKII-silmukan kanssa.

Kerroimme aiemmin, että Ser27 ΔFosB: ssä voidaan fosforyloida kaseiinikinaasi-2: n avulla (Ulery et ai., 2006) Tässä kuitenkin todetaan, että CaMKII fosforyloi AFosB: tä tässä ja muissa paikoissa, joissa on paljon suurempi kinetiikka ja stökiometria, ja se voi replikoida suurempaa ilmeistä M_r havaittu ΔFosB: lle (Kuva 5A) kokaiinialtistuksella in vivo (Nestler, 2008). Tiedämme jo, että Ser27-fosforylaatio lisää AFosB: n stabiilisuutta ja transkription aktiivisuutta (Ulery et ai., 2006; Ulery ja Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et ai., 2009). Tulevassa työssä keskitytään nyt esillä olevan tutkimuksen osoittamien AFosB-fosforylaation uusien sivustojen tunnistamiseen ja toiminnallisiin seurauksiin.

Tässä kuvattu syöttösilmukka tarjoaa uskottavan uuden mekanismin, jolla kokaiinin toistuva antaminen ajaa progressiivisia poikkeavuuksia NAc: ssä. Sellaisena tämä biokemiallinen reitti voi olla tärkeä kohde tuleville terapeuttisille interventioille riippuvuushäiriöissä. Koska CaMKII on kaikkialla läsnä ja sitä tarvitaan moniin perus- neuronaalisiin ja käyttäytymiseen liittyviin toimintoihin, CaMKII-estäjien suoraa käyttöä on vältetty riippuvuushoitona. Tuloksemme viittaavat siihen, että CaMKII-induktion mekanismin herkempi kohdentaminen, joka on spesifinen yksittäiselle solutyypille ja aivojen palkitsemispiirin alialueelle, voisi tarjota terapeuttisen kohteen, joka välttäisi systeemisen CaMKII-inhibition komplikaatiot.

Siirry:

Kiitokset

Tätä työtä tukivat kansallisen huumeiden väärinkäytön instituutin (EJN), NIDA-Yale Proteomics Centerin DA018343in (AJR ja EJN) ja Hartwellin säätiön (AJR) avustukset. Tekijät haluaisivat kiittää Gabby Rundenkoa puhdistetusta ΔFosB: n ja Roger Colbranin lahjasta lahjaksi puhdistetulle CaMKIIa: lle.

Siirry:

Viitteet

1. Ahmed SH, Koob GF. Siirtyminen kohtalaisesta liiallisesta huumeiden saannista: muutos hedonisessa asetuspisteessä. Science. 1998, 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, kuuluisa KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biokemiallinen silta, joka yhdistää accumbens-dopamiini- ja glutamaattijärjestelmät kokaiinin etsimiseen. Nat Neurosci. 2008, 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Käyttäytymiseen liittyvä herkistyminen kokaiiniin liittyy AMPA-reseptorin pinnan lisääntyneeseen ilmentymiseen ydinasemassa. J Neurosci. 2005, 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ca2 + / kalmoduliiniriippuvaisen proteiinikinaasin II alfa-alayksikön ilmentäminen ja karakterisointi käyttäen bakuloviruksen ilmentämisjärjestelmää. Biochem Biophys Res Commun. 1990, 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Dopamiini-D2-kaltaisten reseptorien rooli kokaiinin itsensä antamisessa: tutkimukset D2-reseptorin mutanttihiirillä ja uudella D2-reseptorilla antagonisteja. J Neurosci. 2002, 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Kokaiinin itsensä antamisen puute dopamiini-D1-reseptorin knock-out-hiirissä. J Neurosci. 2007, 27: 13140-13150. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasomeista riippuvaiset ja riippumattomat mekanismit FosB: n epävakaudelle: FosB-degronidomeenien tunnistaminen ja vaikutukset DeltaFosB-vakauteen. Eur J Neurosci. 2007, 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgeeniset eläimet, joilla on indusoituva, kohdennettu geeniekspressio aivoissa. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB-kinaasi säätelee sosiaalisen tappion stressiä aiheuttamaa synaptiikkaa ja käyttäytymiseen liittyvää plastisuutta. J Neurosci. 2011, 31: 314-321. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
10. Colbran RJ. Ca2 + / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II inaktivoituu perusautofosforylaation avulla. J. Biol. Chem. 1993, 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteiinifosfataasit ja kalsium / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II: sta riippuva synaptinen plastisuus. J Neurosci. 2004, 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Kalsium / kalmoduliinista riippuva proteiinikinaasi II ja synaptinen plastisuus. Curr Opin Neurobiol. 2004, 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. DeltaFosB: n voimakas solutyyppispesifinen yli-ilmentyminen lisää kokaiinin kannustimia. J Neurosci. 2003, 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Histonideasetylaasi-inhibiittorien antiepressiiviset vaikutukset. J Neurosci. 2009, 29: 11451-11460. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhhan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Caveolin-1-säädeltyjen proteiinien kvantitatiivinen proteomiikka: polymeraasin i ja transkriptiota vapauttavan tekijän / CAVIN-1 IN: n endoteelisolujen karakterisointi. Mol Cell Proteomics. 2010, 9: 2109-2124. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Suuren masennuksen itsemurhan loppuun saattamisen riskitekijät: tapaus-kontrollitutkimus impulsiivisesta ja aggressiivisesta käyttäytymisestä miehiä. Olen J Psykiatria. 2005, 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB moduloi suoraan ydintekijöiden suoraa ja epäsuoraa polun toimintaa. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 lehdistössä. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. CaMKII: n sitoutuminen GluN2B: hen on kriittinen muistin konsolidoinnin aikana. EMBO J. 2012, 31: 1203 – 1216. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB-mutanttihiiret: Fosiin liittyvien proteiinien kroonisen kokaiinin induktion menetys ja lisääntynyt herkkyys kokaiinin psykomotorille ja palkitseville vaikutuksille. Proc Natl Acad Sci, USA A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Ydinmagneettinen ydin ja kuori ytimessä kontrolloivat kokaiinin etsimisestä. Nat Neurosci. 2004, 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisaatio ja transkriptiotekijän DeltaFosB DNA: ta sitovat ominaisuudet. Biokemia. 2007, 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / kalmoduliinista riippuva proteiinikinaasi II edistää aktiivisuudesta riippuvaa filopodian kasvua ja selkärangan muodostumista. J Neurosci. 2003, 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Transkriptiotekijän deltaFosB: n ilmentyminen aivoissa kontrolloi herkkyyttä kokaiinille. Nature. 1999, 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. CaMKII: n geneettinen inhibitio dorsaalisissa striaalia sisältävissä keskisuurissa neuroneissa Vähentää funktionaalisia ärsytyssynapseja ja parantaa luontaista ärsytystä. PLoS One. 2012, 7: e45323. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Kokaiinin itsensä antamisen jälkeinen sukupuuttoharjoittelu indusoi glutamatergistä plastisuutta estämään kokaiinin etsimistä. J Neurosci. 2010, 30: 7984-7992. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Samankaltaiset neuronit, vastakkaiset mukautukset: psykostimulaattorikokemus muuttaa tasaisesti ampuma-ominaisuuksia accumbens-ytimessä kuoren suhteen. J Neurosci. 2009, 29: 12275-12283. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-riippumattoman Striatal alphaCaMKII: n vaikutus Edistää kokaiinipalkinnon herkistymistä. J Neurosci. 2012, 32: 6578-6586. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Ydintekijän kappaB: n rooli munasarjojen hormonivälitteisessä stressin yliherkkyydessä naaraspuolisilla hiirillä. Biol Psychiatry. 2009, 65: 874-880. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokaiinin aiheuttama dendriittisen selkärangan muodostuminen D1- ja D2-dopamiinireseptoripitoisissa keskipitkissä piikkisolmuissa ytimessä. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399 – 3404. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. CaMKII-funktion molekyylipohja synaptisessa ja käyttäytymismuistissa. Nat Rev Neurosci. 2002, 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. BDNF-signaloinnin solutyyppispesifinen häviö jäljittelee kokaiinipalkkion optogeneettistä kontrollia. Science. 2010, 330: 385-390. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. CaMKII: n inhibitio ytimen accumbens-kuoressa pienentää tehostettua amfetamiinin saantia herkistetyissä rotissa. Neurosci Lett. 2008, 444: 157-160. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamiini H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Alfa-Ca2 + / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II: n ohimenevä yli-ilmentyminen ydinkerroskuoressa parantaa amfetamiinin käyttäytymistä. J Neurosci. 2010, 30: 939-949. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. AMPA-reseptorikauppa ja synaptinen plastisuus. Annu Rev Neurosci. 2002, 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Yksittäisten dendriittisten piikkien pitkäaikaisen potentiaation rakenteellinen perusta. Nature. 2004, 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Muistinmuodostuksen säätely CaMKII-transgeenin säätelyn avulla. Science. 1996, 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Histonimetyylitransferaasin G9a: n olennainen rooli kokaiinin aiheuttamassa plastisuudessa. Science. 2010, 327: 213-216. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. CREB: n ja DeltaFosB: n geenien ilmentymisen ja kokaiinipalkinnon säätäminen. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Arvostelu. Riippuvuuden transkriptionaaliset mekanismit: DeltaFosB: n rooli. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-3255. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologiset tutkimukset kokaiinin kroonisen FOS: een liittyvän antigeenin induktion säätelystä striatumissa ja ytimessä. J Pharmacol Exp Ther. 1995, 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. CaMKII: n ja F-aktiinin roolit dendriittisten piikkien rakenteellisessa plastisuudessa: synaptisen tunnisteen mahdollinen molekyyli-identiteetti? Fysiologia (Bethesda) 2009, 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB ytimen ytimessä säätelee elintarvikkeiden vahvistamaa instrumentaalikäyttäytymistä ja motivaatiota. J Neurosci. 2006, 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Rotan aivot stereotaksisissa koordinaateissa. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducible, c-Junin dominoivan negatiivisen mutantin aivojen alueen spesifinen ilmentyminen siirtogeenisissä hiirissä vähentää herkkyyttä kokaiinille. Brain Res. 2003, 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergent CaMK ja RacGEF signaloivat dendriittisen rakenteen ja toiminnan. Trends Cell Biol. 2008, 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. DeltaFosB: n indusointi palkkioon liittyvissä aivorakenteissa kroonisen stressin jälkeen. J Neurosci. 2004, 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB: n induktiokohtia aivoissa väärinkäytösten avulla. Synapsi. 2008, 62: 358-369. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Huumeiden himoamisen inkuboinnin neurobiologia. Trendit Neurosci. 2011, 34: 411-420. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Kalsiumvälitteiset toiset lähettimet moduloivat käyttäytymisherkkyyden ilmentymistä kokaiiniin. J Pharmacol Exp Ther. 1998, 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Ihmisen aivojen reseptorin autoradiografia käyttäen koko puolipallon osia: yleinen menetelmä, joka minimoi kudosartikkelit. Synapsi. 1987, 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Rakenteellinen plastisuus, joka liittyy altistumiseen huumeisiin. Neuropharmacology. 2004, 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkriptionaaliset ja epigeneettiset riippuvuusmekanismit. Nat Rev Neurosci. 2011, 12: 623-637. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Kalsium / kalmoduliinista riippuva proteiinikinaasi II: n moniarvoiset vuorovaikutukset postsynaptisten tiheysproteiinien NR2B, densiini-180 ja alfa-aktiniini-2 kanssa. J. Biol. Chem. 2005, 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksoitu proteiinin määritys Saccharomyces cerevisiaessa käyttäen amiinireaktiivisia isobarisia merkintäreagensseja. Mol Cell Proteomics. 2004, 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Riippuvainen synapsi: synaptisen ja rakenteellisen plastisuuden mekanismit ytimen accumbensissa. Trendit Neurosci. 2010, 33: 267-276. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
56. Itse DW. Julkaisussa: The Dopamine Receptors. Neve KA, toimittaja. New York: Humana Press; 2010. s. 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Alfa-kalsium / kalmoduliiniriippuvainen proteiinikinaasi II: n ohimenevä viruksen välittämä yli-ilmentyminen ytimen accumbens-kuoressa johtaa alfa-amino-3-hydroksyyli-5: n pitkäkestoiseen funktionaaliseen ylösregulaatioon -metyyli-4-isoksatsoli-propionaatti-reseptorit: dopamiinityyppi-1-reseptori ja proteiinikinaasi-A-riippuvuus. Eur J Neurosci. 2010, 31: 1243-1251. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. N-metyyli-D-aspartaatti-reseptorin NR2B-alayksikköön kohdistuvan kalsium- / kalmoduliiniriippuvaisen proteiinikinaasi-II: n mekanismi ja säätely. J. Biol. Chem. 2000, 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. DeltaFosB: n fosforylaatio välittää sen stabiilisuutta in vivo. Neuroscience. 2009, 158: 369-372. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. DeltaFosB-transkription aktiivisuuden säätäminen Ser27-fosforylaation avulla. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. DeltaFosB-stabiilisuuden säätäminen fosforylaatiolla. J Neurosci. 2006, 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et ai. Aivojen palkitsemispiirien DeltaFosB välittää joustavuutta stressiin ja masennuslääkkeisiin. Nat Neurosci. 2010, 13: 745-752. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Krooninen kokaiinilla indusoitu H3-asetylointi ja CaMKIIalphan transkriptionaalinen aktivointi ytimessä accumbens on kriittinen tekijä lääkkeen vahvistumisen motivaatiossa. Neuropsychopharmacology. 2010, 35: 913-928. [PMC vapaa artikkeli] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB säätelee pyörän toimintaa. J Neurosci. 2002, 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. DeltaFosB-induktio orbitofrontalisessa kuoressa välittää toleranssia kokaiinin aiheuttamaan kognitiiviseen toimintahäiriöön. J Neurosci. 2007, 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. DeltaFosB: n olennainen rooli morfiinitoiminnassa olevissa ytimissä. Nat Neurosci. 2006, 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Price EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Kalmoduliinikinaasi II: n esto suojaa rakenteellisilta sydänsairuilta. Nat Med. 2005, 11: 409-417. [PubMed]