Front Psychiatry. 2018; 9: 81.
Julkaistu verkossa 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Yae Eun Park,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* ja Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstrakti
Tausta
Internetin ja online-pelien riippuvuutta aiheuttava käyttö on potentiaalinen psykiatrinen häiriö, jota kutsutaan Internet-pelihäiriöksi (IGD). Muutettuja mikroRNA (miRNA) -ilmentymisprofiileja on ilmoitettu potilailla, joilla on tiettyjä psykiatrisia häiriöitä, veressä ja aivokudoksessa, ja niitä on ehdotettu biomarkkereiksi. Veren miRNA-profiileista IGD: ssä ei kuitenkaan ole ilmoitettu.
Menetelmät
IGD: hen liittyvien miRNA: ien löytämiseksi analysoimme 51-näytteiden (25 IGD ja 26-kontrollit) miRNA-ekspressioprofiileja käyttämällä TaqManin matalan tiheyden miRNA-taulukkoa. Validointia varten suoritimme kvantitatiivisen käänteistranskription PCR: n riippumattomilla 36-näytteillä (20 IGD ja 16-kontrollit).
tulokset
Löytön ja riippumattoman validoinnin avulla tunnistimme kolme miRNA: ta (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p), jotka olivat merkittävästi säädeltyjä IGD-ryhmässä. Henkilöillä, joilla kaikilla kolmella miRNA-muutoksella oli IGD: n riski paljon suurempi kuin henkilöillä, joilla ei tapahtunut muutoksia [kertoimen suhde (OR) 22, 95% CI 2.29 – 211.11], ja OR: t kasvoivat annoksesta riippuen muutettujen miRNA: ien määrästä. Kolmen miRNA: n ennustetut kohdegeenit yhdistettiin hermosoluihin. Tutkimme kolmen alavirran kohdegeenin proteiiniekspressiota Western blot -menetelmällä ja vahvisimme, että GABRB2: n ja DPYSL2: n ekspressio oli merkittävästi korkeampi IGD-ryhmässä.
Yhteenveto
Havaitsimme, että hsa-miR-200c-3p: n, hsa-miR-26b-5p: n ja hsa-miR-652-3p: n ekspressiot säädettiin alas IGD-potilailla. Tuloksistamme on apua IGD: n patofysiologian ymmärtämisessä.
esittely
Internetin ja Internet-pohjaisten pelien riippuvuuskäyttö ei ole pelkästään sosiaalinen ilmiö maissa, joissa on laaja Internet-yhteysinfrastruktuuri, vaan myös potentiaalinen psykiatrinen häiriö, jota kutsutaan Internet-pelihäiriöksi (IGD) (1-3). Epidemiologisten raporttien mukaan IGD: n esiintyvyys murrosikäisillä vaihtelee maissa vaihteleen 0.8: stä 26.7%: iin (4). Erityisesti tutkimukset osoittavat esiintyvyyslukemat yli 10%: n murrosikäisillä monissa Aasian maissa, kuten Etelä-Koreassa, Kiinassa, Taiwanissa, Hongkongissa ja Singaporessa (4). IGD liittyy kognitiivisten, psykososiaalisten suhteiden ja päivittäisen elämän heikkenemiseen; esimerkiksi heikentynyt akateeminen tai ammatillinen suorituskyky (4-7). IGD sisältyy nyt mielenterveyshäiriöiden diagnostiikka- ja tilastollisen käsikirjan (DSM-V) viidennen tarkistuksen osaan III (Lisäolosuhteet) (8). Huolimatta kliinisestä ja sosiaalisesta merkityksestään, IGD: n taustalla olevasta molekyylisestä geneettisestä mekanismista on vähän tietoa.
Viimeaikaiset laajamittaiset kaksoistutkimukset ovat ehdottaneet geneettistä taustaa IGD: lle9, 10). Vink et ai. tutki yksilöllisiä eroja internetin pakollisessa käytössä 5,247-monosygoottisten ja dizygoottisten murrosikäisten kaksosten kanssa Hollannin kaksoisrekisterissä ja kertoi, että 48% eroista selittyi geneettisillä tekijöillä (9). Li et ai. tarkkaili kiinalaisten murrosikäisten kaksosien 825-pareja ja ilmoitti, että geneettiset tekijät selittivät 58 – 66% eroista (10). Niinpä neurotransmisioon, kognitioon ja huomiointiin osallistuvien geenien, kuten dopamiinireseptori D2-geenin, polymorfismit (DRD2), katekoliamiini-O-metyylitransferaasigeeni (COMT), serotoniinin kuljettajageeni (5HTTLPR) ja kolinergisen reseptorin nikotiini-alfa 4 -geeni (CHRNA4) on ilmoitettu liittyvän merkittävästi Internet-riippuvuuteen (11-13). Äskettäin Kim et ai. seulotut variantit yli 100-ehdokasgeeneistä, jotka liittyvät välittäjäaineiden tuotantoon, toimintaan ja aineenvaihduntaan seuraavan sukupolven sekvensointianalyysillä ja kertoivat, että rs2229910 NTRK3 geeni liittyy IGD: hen (14).
Geneettisten tekijöiden lisäksi on myös hyvin tiedossa, että neurobehavioraalisia fenotyyppejä hallitaan epigeneettisesti ei-koodaavilla RNA: lla, mukaan lukien mikroRNA: t (miRNA: t) (15, 16). miRNA-molekyylit ovat pieniä koodaamattomia yksijuosteisia RNA-molekyylejä (noin 20 – 23-nukleotideja), jotka säätelevät negatiivisesti proteiinia koodaavien geenien ilmentymistä hajottamalla mRNA: ita ja ovat kriittisessä roolissa erilaisten sairauksien patofysiologisessa prosessissa (17). Lisenssirivit ovat osoittaneet, että miRNA: ita on runsaasti ihmisen keskushermostoon (CNS) ja toimivat hienosäätääkseen kohdegeeniensä ekspressiotasoja, jotka osallistuvat keskushermostojärjestelmän kehitykseen ja kypsymiseen (15). Äskettäiset tutkimukset ovat todellakin paljastaneet, että miRNA-ekspressioprofiilit muuttuvat psykiatrisia häiriöitä sairastavien potilaiden aivokudoksessa, mikä viittaa siihen, että heidän ekspressioprofiilit voivat olla psykiatristen häiriöiden biomarkkereita (15, 16, 18). Esimerkiksi kuolemanjälkeisen analyysin avulla Lopez et ai. kertoivat, että miR-1202: n ekspressio, joka säätelee metabotrooppisen glutamaattireseptori-4-geenin ilmentymistä ja ennustaa vasteen masennuslääkkeelle, oli alin säätely tärkeimpien masennushäiriöpotilaiden eturauhasen aivokuoren kudoksissa (19). Biomarkkeriseulonnan suhteen tällä lähestymistavalla on selkeä rajoitus, koska CNS-kudoksen biopsian suorittaminen seulontaa varten on mahdotonta. Koska miRNA: t voidaan havaita veressä (plasmassa tai seerumissa), verenkierrossa olevilla miRNA: eilla on selvä etu ei-invasiivisina biomarkkereina neuropsykiatrisissa häiriöissä. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole tehty tutkimuksia miRNA-profiilien kiertämisestä IGD: ssä. Kiertävien miRNA-ekspressioprofiilien parempi ymmärtäminen voisi auttaa selventämään IGD-kehityksen mekanismia ja helpottamaan kliinistä translaatiota.
Tässä tutkimuksessa pyrimme tunnistamaan IGD: hen liittyviä miRNA-markkereita tarkkailemalla erottautuneesti ilmeneviä plasman miRNA: ita IGD: n ja kontrolliryhmien välillä ja tutkimalla niiden biologisia vaikutuksia.
Materiaalit ja menetelmät
Opintoaineet
Tutkimme 3,166-teini-ikäisiä (ikä 12 – 18-vuotiaita) käyttämällä DSM-V IGD -pisteitä. Niistä 251 (168 miehillä ja 83 naisilla) diagnosoitiin IGD: ksi DSM-V-kriteerien mukaan (8). Yhteensä 91-yksilöt (49 IGD ja 42-kontrollit) toimittivat tietoisen suostumuksen tähän tutkimukseen. Heistä neljä henkilöä suljettiin pois sulkemisperusteiden mukaan. Lopuksi 87-yksilöt (45 IGD -henkilöt ja terveet 42-kontrolliryhmät) otettiin mukaan tähän tutkimukseen. Heistä 51-osallistujia (25 IGD -potilaat ja 26-kontrollit) rekrytoitiin löytöjoukkona 2014 - 2016. Muut 36-osallistujat (20 IGD -potilaat ja 16-kontrollit) rekrytoitiin riippumattomaksi validointijoukkoksi 2016: stä. Kaikki osallistujat olivat korealaisia, ilmoittautuneita Soulin Pyhän Marian sairaalasta (Soul, Etelä-Korea) ja Soulin kansallisen yliopiston Boramae -sairaalasta (Soul, Etelä-Korea). Kaikille osallistujille tehtiin psykiatrin jäsennetty haastattelu, joka perustui korealaiseen Kiddie-aikatauluun vaikuttavien häiriöiden ja skitsofrenian suhteen (K-SADS-PL) (20). Kaikki osallistujat suorittivat lasten korealaisen Wechslerin älykkyysasteikon, 4th-painos (K-WISC-IV), Block Design- ja Vocabulary-alatestit (21). Impulsiivisuutta arvioitiin Barratt Impulsiveness Scale (BIS) (22). Käyttäytymisen estojärjestelmän (BInS) ja käyttäytymisen aktivointijärjestelmän (BAS) asteikot mitattiin persoonallisuuden ulottuvuuden arvioimiseksi (23). Poissulkemisperusteisiin kuuluivat aiemmat tai nykyiset suuret sairauden häiriöt (esim. Diabetes mellitus), neurologiset häiriöt (esim. Kohtaushäiriöt, päävamma), psykiatriset häiriöt (esim. Suuri masennus, ahdistuneisuushäiriöt), henkinen jälkeenjääneisyys tai mikä tahansa päihteiden väärinkäyttö (esim. , tupakka, kannabis, alkoholi). Opintoaineiden yleiset ominaisuudet on esitetty yhteenvetona taulukossa Table1.1. Tämän tutkimuksen hyväksyi Korean katolisen yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun instituutioarviointilautakunta (MC16SISI0120). Kaikki osallistujat ja heidän vanhempansa antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen.
Taulukko 1
Opintoaineiden yleiset ominaisuudet.
| Löytö | Validation | Yhdistetty | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ohjaus | IGD | P-arvo | Ohjaus | IGD | P-arvo | Ohjaus | IGD | P-arvo | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Ikä (vuotta) | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Internet-viikkotunnit viikossa (h) | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Kotitalouksien kuukausitulot (miljoonaa KRW) | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Koulutus (vuotta) | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: lohkojen suunnittelu | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: sanasto | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| Korit | |||||||||
| Mediaani (min – max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, Internet-pelihäiriöpotilaat; KS, Korean Internet Addiction Proneness Scale; BIS, Barratt-impulssivasteikko; BAS, käyttäytymisen aktivointijärjestelmä; BInS, käyttäytymisen estojärjestelmä; KRW, Korean voitto.
aP <0.05 (Mann – Whitney – Wilcoxon-testi).
TaqMan matalan tiheyden miRNA Array (TLDA) -kokeet
Perifeerinen veri otettiin jokaiselta osallistujalta ja siirrettiin laboratorioon 4 h: n sisällä verisolujen hajoamisen minimoimiseksi. Näytettä sentrifugoitiin nopeudella 3,000 rpm 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Sitten supernatantti (plasmakerros) kerättiin saastuttamatta verisoluja. Kiertävät miRNA: t uutettiin käyttämällä TaqMan miRNA ABC -puhdistuspakkausta (ihmisen paneeli A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 50 ui plasmanäytettä ja 100 ui ABC-puskuria sekoitettiin. Hybridisaation jälkeen kohdespesifisten anti-miRNA-magneettisten helmien kanssa, rajoitetut kiertävät miRNA: t eluoitiin helmistä 100 / ul: lla eluutiopuskuria. Löytövaiheessa 381 miRNA: t tutkittiin 51-plasmanäytteistä (25 IGD ja 26-kontrollit) käyttämällä TaqMan miRNA ABC -puhdistuspakkausta (ihmisen paneeli A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Megaplex-käänteistranskriptio- ja esi-monistusreaktiot suoritettiin cDNA: n määrän kasvattamiseksi miRNA-ekspressioanalyysissä käyttämällä MegaplexPreAmp-alukkeita Human Pool A ja TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific). TLDA-paneeli A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) ajettiin ViiA7 reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Thermo Fisher Scientific) miRNA: ien ekspression arvioimiseksi. Raakadata prosessoitiin käyttämällä ExpressionSuite Software v1.0.4: ää (Thermo Fisher Scientific) kunkin miRNA: n Ct-arvojen määrittämiseksi.
Tietojen analysointi TLDA: lle
Ensin mitattiin kunkin miRNA: n kynnyssyklit (Ct-arvo). miRNA: ita, joiden Ct-arvo oli> 35, pidettiin havaitsematta ja suljettiin pois myöhemmästä analyysistä. Kaikki Ct-arvot normalisoitiin miR-374b: n Ct-arvoon (ΔCt-arvo), joka on yksi stabiilimmin ekspressoituneista miRNA: ista, jotka kiertävät ihmisen plasmassa (24). Lausekkeen log2-taitomuutossuhde (ΔΔCt-arvo) laskettiin käyttämällä kontrollinäytteiden keskiarvoja kalibraattorina HTqPCR-paketissa Bioconductorissa (25). Kunkin miRNA-kohteen suhteellinen kvantifiointi (RQ) määritettiin 2: ksi-ΔΔCt. Kahden ryhmän ilmentymäeron hypoteettiseen testaamiseen sovelsimme korvike-muuttujan analyysiä (SVA) heterogeenisuuksien, kuten erävaikutusten, sieppaamiseksi kokeisiin käyttämällä sto paketti Bioconductorissa (26). miRNAs kanssa P-arvon <0.05 pidettiin merkittävästi erilaisina kahden ryhmän välillä.
Geenikomplektien rikastuvuusanalyysi
Geenikomplektien rikastamisanalyysissä käyimme ToppFun-sovellusta ToppGene Suite -ohjelmassa (27) päätellä merkittävästi rikastettua geeniontologiaa (GO) (28) termit, polku ja sairaustermit. Lähestymistapana tähän lähestymistapaan käytimme ehdokas miRNA: ien 1,230-ennustettuja kohdegeenejä. Pathway-analyysiä käytettiin KEGG: n, BioCarta, Reactome, GeneMAPP: n ja MSigDB: n mukaisten ennustettujen kohdegeenien merkittävien reittien löytämiseen ToppGene-reiteillä. Funktionaalisen rikastamisen ehtojen merkitys määritettiin Bonferronilla mukautetun perusteella P-arvo.
Kvantitatiivisen käänteistranskription PCR: n (qRT-PCR) validointi ja replikaatio
Löytövaiheessa eri tavalla ekspressoituneiden 10 miRNA: iden validoimiseksi qRT-PCR suoritettiin käyttämällä TaqMan MicroRNA -määritystä (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3-X 000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423; miR-5; -002340p, #483 ja miR-5-002338p, #652) ja ViiA3-järjestelmä (Life Technologies) valmistajan ohjeiden mukaan. Kymmenen nanogrammaa kokonais-RNA: sta muutettiin ensimmäisen juosteen cDNA: ksi miRNA-spesifisillä alukkeilla käyttämällä TaqMan MicroRNA käänteistranskriptiosarjaa (#002352, Life Technologies), jota seurasi reaaliaikainen PCR TaqMan Koettimilla. Kunkin miRNA: n RQ määritettiin 7: ksi-ΔCt, jossa ΔCt on kyseisen näytteen kynnyssyklien ero, normalisoituna endogeenisen miRNA: n suhteen (miR-374b-5p, #001319). Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena ja niiden Ct-arvoista laskettiin keskiarvo. Lasimme log2-taitosmuutosuhteen (ΔΔCt) jokaiselta miRNA: lta samalla tavalla kuin taulukkoon perustuvassa analyysissä. Ei-parametrinen Mann – Whitney – Wilcoxon-testi suoritettiin miRNA: ien ekspressiotasoerojen testaamiseksi kahdessa ryhmässä, jolla on kynnysarvo P-arvo 0.05.
Western blot -analyysi
Jokaisesta seeruminäytteestä poistettiin ensin erittäin runsaasti 14-proteiineja (albumiini, immunoglobuliini G, immunoglobuliini A, serotransferriini, haptoglobiini, alfa-1-antitrypsiini, fibrinogeeni, alfa-2-makroglobuliini, alfa-1-happo-glykoproteiini, immunoglobuliini , apolipoproteiini A-II, komplementti C3 ja transthyretin) käyttämällä MARS-14-pylvästä (4.6 x 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) ennen Western blot -analyysiä. MARS-14-pylväästä saatu sitoutumaton fraktio konsentroitiin käyttämällä Amicon Ultracel-3 -sentrifugaalisuodatinta (3 kDa -raja), ja sitten proteiinikonsentraatio määritettiin bikinoniinihappomenetelmällä. Samat määrät (10: stä 30 ug: iin) kontrolli- ja IGD-seeruminäytteistä erotettiin 4 – 20% Mini-PROTEAN TGX -elementtigeelillä (Bio-Rad, CA, USA) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvoon. Seuraavaksi membraani estettiin TBS-T: ssä (190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 ja 0.05% Tween 20) 5% rasvattomalla kuivalla maidolla huoneenlämpötilassa 30 min. Sitten kalvoja inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) ja CNR1 (1: 100, , Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) ja PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) TBS-T: ssä 5: n kanssa % rasvatonta kuivamaitoa 4 ° C: ssa yön yli ja sitten sopivilla sekundaarisilla vasta-aineilla joko naudan anti-hiiri (1: 1,000, Santa Cruz Biotechnology) tai vuohen anti-kani (1: 1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA) ) konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin huoneenlämpötilassa 1 h. Signaalin havaitseminen suoritettiin käyttämällä kemiluminesenssia ECL-reagenssilla (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Kvantifioimme Western blot -tulokset käyttämällä TotalLab 1D -analyysiohjelmistoa (epälineaarinen Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK). Sitten tiheysmittaussuhteen arvo laskettiin jakamalla kunkin näytteen tiheysmittariarvo muualla kuvatulla tavalla (29). Normaalisoinnin kontrollina käytettiin jokaisessa kokeessa seeruminäytettä, joka yhdistettiin 46 IGD: stä ja kontrollinäytteistä. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä ei-parametrista Mann – Whitney – Wilcoxon-testiä kynnyksellä P-arvo 0.05.
tulokset
Opintoaineiden ominaispiirteet
Tutkittavien demografiset ja kliiniset piirteet on esitetty taulukossa Table1.1. Kun vertailimme IGD- ja kontrolliryhmiä Korean Internet Addiction Proneness -asteikon (K-Asteikko) kuten muualla on kuvattu (20, 30), IGD-ryhmä osoitti merkittävästi korkeamman mediaanin K-asteikon arvon kuin kontrolliryhmä (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Pöytä (Table1) .1). IGD-ryhmässä Internet-pelaamiseen käytetty mediaaniviikko viikossa oli huomattavasti pidempi kuin kontrolleilla (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Kun taas K-WISC: n, BIS: n, BInS: n ja BAS: n ikä, kotitalouden kuukausitulot, koulutuksen kesto, lohkosuunnittelu ja sanastojen alatestitulokset eivät olleet merkittäviä eroja kahden ryhmän välillä.
IGD: n ja säätimien välillä eri tavalla ilmentyneet miRNA: t
IGD: hen liittyvien miRNA: ien löytämiseksi otimme käyttöön kaksivaiheisen (löytö ja riippumaton validointi) lähestymistavan. Tutkimuksen suunnittelu ja kokonaisstrategia on esitetty lisämateriaalin kuvassa S1. Löytövaiheessa analysoimme 51-näytteiden miRNA-ekspressioprofiileja (25 IGD ja 26-kontrollit) käyttämällä miRNA-taulukkoa, joka sisälsi 384 miRNA: ita. 10 miRNA: ien ekspressiotasojen havaittiin olevan merkittävästi erilaisia IGD: n ja kontrolliryhmien välillä (taulukko (Table2) .2). Näiden 10 miRNA: ien suhteelliset ekspressiotasot on esitetty kuvassa Figure1.1. Niiden joukossa kahta (hsa-miR-423-5p ja hsa-miR-483-5p) säädettiin ylös ja kahdeksan (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3b, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p ja hsa-miR-652-3p) säädettiin alas ryhmässä IGG.
Taulukko 2
Eri tavalla ekspressoituneet mikroRNA: t (miRNA: t) ja laskosten muutokset.
| miRNA | Löytö | Validation | Yhdistetty | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-arvo | Taita muutos | P-arvo | Taita muutos | P-arvo | Taita muutos | |
| HSA-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| HSA-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA: t muuttuivat merkittävästi sekä löytö- että validointijoukkoissa johdonmukaisella tavalla.
qRT-PCR-validointi ehdokas-miRNA: t
10-ehdokas-miRNA: iden validoimiseksi suoritimme qRT-PCR: n riippumattomalla validointijoukolla (20 IGD: t ja 16-kontrollit) (taulukko S1 lisämateriaalissa). Kolme näistä miRNA: ista (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ja hsa-miR-652-3p) säädettiin merkittävästi alas validointijoukon IGD-ryhmässä (taulukko (Table2) .2). Kolme muuta miRNA: ta (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b ja hsa-miR-423-5p) säädettiin myös alas IGD-ryhmässä, mutta ei merkitsevästi. Jäljellä olevat neljä miRNA: ta (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p ja hsa-miR-423-5p) ekspressoitiin vastakkaisella tavalla validointijoukossa. Kun yhdistimme löytö- ja validointijoukot (yhteensä 45 IGD -henkilöt ja 42-kontrollit), kolme validoitua miRNA: ta olivat jatkuvasti merkitseviä (taulukko (Table2) .2). Yksityiskohtaiset tiedot, kromosomaaliset sijainnit, kypsät sekvenssit ja ekspressiotasot näiden kolmen miRNA: n CNS: ssä ovat saatavissa lisämateriaalin taulukossa S2.
Kolmen miRNA: n samanaikaisen muutoksen synergistinen vaikutus IGD-riskiin
Kolmen miRNA: n yhdistetyn vaikutuksen arvioimiseksi havaitsimme neljän alaryhmän (0-, 1-, 2- tai 3-miRNA-muutoksilla) kertoimet (OR). miRNA-muutos määritettiin RQ-arvolla, kuten on kuvattu osiossa “Materiaalit ja menetelmät"Koska kaikkia kolme miRNA-markkeria säädettiin alas IGD-ryhmässä, miRNA: n, jonka RQ-arvo oli alle yksi, uhrattiin muuttuneeksi. Yksityiskohtaiset tiedot kunkin tutkittavan RQ-arvosta kolmelle miRNA: lle on saatavana taulukossa S3 lisämateriaalissa. Kullekin alaryhmälle kertoimet laskettiin kontrollien lukumäärän ja IGD: ien suhteena, sitten jokainen OR laskettiin jakamalla kunkin alaryhmän kertoimet alaryhmän kertoimilla ilman miRNA-muutoksia. Henkilöillä, joilla oli kolme miRNA-muutosta, riski 22 oli suurempi kuin henkilöillä, joilla ei ollut mitään miRNA-muutosta (TAI 22, 95% CI 2.29 – 211.11). OR: t osoittivat kasvavaa trendiä muuttuneiden miRNA: ien lukumäärän ollessa 0 - 3 (r2 = 0.996) (Kuva (Figure22).
Ehdokas miRNA: n kohdegeenien GO- ja polkuanalyysi
Saadakseen käsityksen kolmen miRNA-markkerin toiminnoista, jotka ovat merkittävästi aliarvioitu IGD-ryhmässä, niiden kohdegeeneille ennustettiin käyttämällä miRWalk 2.0-tietokantaa (31). Neljä algoritmia (miRWalk, miRanda, RNA1,230 ja Targetscan) ennustivat jatkuvasti kokonaan 22-geenejä alavirran kohteina käyttämällä miRWalk-tietokantaa (32-34) (Taulukko S4 lisämateriaalissa). Geenijoukkojen rikastamisanalyysi käyttämällä ToppFun-sovellusta ToppGene Suite -sovelluksessa osoitti, että näiden miRNA: ien kohdegeenit liittyivät merkitsevästi hermokehityspolkuihin, kuten “Axon-ohjaus” ja GO-termeihin, kuten “neurogeneesi” (taulukko S5 lisäaineistossa).
Ennustettujen kohdegeenien ilmaisu
Kolmen miRNA: n alavirran kohdegeeneistä 140 ennustettiin samanaikaisesti kahdelle tai useammalle miRNA: lle (taulukko S4 lisämateriaalissa). Jotta voimme tutkia, ovatko alavirran kohdegeenien proteiiniekspressiotasot erilaisia IGD: n ja kontrolliryhmien välillä, valitsimme 2-geenit (DUSP4 ja PI15), joiden ennustetaan kaikkien 3 miRNA: ien ja ylimääräisten 3-geenien alavirran kohteina (GABRB2, DPYSL2ja CNR1) niiden perusteella, joista ennustettiin 2 miRNA: t, ja suorittivat Western blot -analyysin 28 IGD: n plasmanäytteillä ja 28-kontrolleilla, jotka olivat käytettävissä kokeelle. Vertasimme viiden kohteen ilmaisuja IGD: n ja kontrolliryhmien välillä mittaamalla kaistan voimakkuuden ja alueen muualla kuvatulla tavalla (29). Niistä DPYSL2: n ekspressiotasot (28 IGD: t ja 28-kontrollit, P = 0.0037) ja GABBR2 (27 IGD: tä ja 28 kontrollia, P = 0.0052) olivat merkitsevästi korkeammat IGD-ryhmässä (kuva (Figure3) .3). Emme kuitenkaan voineet havaita CNR1: n differentiaalisia lausekkeita (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) ja PI15 (P = 0.6346).
Keskustelu
On todettu, että miRNA: t osallistuvat hermosolujen kehitykseen (35, 36), ja aivojen miRNA: ien erilaista ilmentymistä havaitaan psykiatrisissa sairauksissa, kuten skitsofrenia (37). Siksi on uskottavaa, että kiertävät miRNA-profiilit voivat olla hyödyllisiä biomarkkereita IGD: lle. Kiertäviä miRNA: ita on ehdotettu biomarkkereina erilaisille neuropsykiatrisille häiriöille (38-40); IGD: n kehityksen taustalla olevat molekyylimekanismit ovat kuitenkin edelleen suurelta osin tuntemattomia huolimatta sen kliinisestä ja sosiaalisesta merkityksestä. Erityisesti IGD: hen liittyviä miRNA: ita ei ole tutkittu. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kaksi. Ensin yritimme löytää IGD: hen liittyviä plasma miRNA: ita. Toiseksi arvioimme miRNA-ehdokkaiden biologista vaikutusta tutkimalla alavirran kohdegeenien proteiiniekspressiota ja GO: ta. MiRNA-ekspressioprofiilien genomin laajuisen seulonnan ja ehdokkaiden validoinnin myötä, havaitsimme, että kolmen miRNA: n (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ja hsa-miR-652-3p) ekspressio oli merkitsevästi alhaisempi IGD-potilailla kuin kontrollilla. Vaikka muiden seitsemän miRNA-ehdokkaan ilmentymismalleja ei toistettu validoinnissa, se voi olla väärin negatiivinen johtuen pienestä näytteen koosta tässä tutkimuksessa. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti mahdollisuudesta, että veren miRNA-ekspressioprofiilit voivat olla hyödyllisiä biomarkkereita IGD: lle. Kolmen miRNA-markkerin yhdistelmä voisi toimia minimaalisesti invasiivisena työkaluna IGD: n vaarassa olevien ihmisten varhaiseen tunnistamiseen.
Tässä tutkimuksessa tunnistettujen miRNA: ien on ilmoitettu osallistuvan moniin erilaisiin neuropsykiatrisiin häiriöihin. Hsa-miR-200c: n ilmentymisen veressä on ilmoitettu olevan säänneltyä monissa psyykkisissä häiriöissä, kuten skitsofreniassa (41) ja suuret masennusjaksot (42). miR-200c: n ilmoitettiin ekspressoituvan voimakkaammin synaptisissa fraktioissa kuin kokonaisessa aivossa (43) ja liittyä myös hermosolujen kuolemaan (44). Näiden aikaisempien raporttien perusteella miR-200c osallistuu hermokehitykseen ja voi liittyä neuropsykiatrisiin häiriöihin, jos sen ilmentyminen on häiriintynyt. Useat tutkimukset ovat ehdottaneet yhteyttä miR-652: n ja neuropsykiatristen häiriöiden riskin välillä. Lai et ai., Samanlainen lähestymistapanamme veren biomarkkereiden tunnistamiseen skitsofreniaa varten. suoritti TLDA-analyysin skitsofreniapotilailla ja normaaleilla kontrolleilla, ja havaitsi, että seitsemän miRNA: ta, mukaan lukien hsa-miR-652, ekspressoitiin eri tavalla skitsofreniapotilailla (45). Seuraavassa tutkimuksessa he suunnittelivat ennustemallin miRNA-ekspressiotietoja käyttämällä ja erottivat skitsofrenian onnistuneesti normaalista kontrollista (46). Hsa-miR-652: n muuttunutta ilmentymistä havaittiin myös alkoholisteissa (47). Hsa-miR-26b: n havaittiin aktivoituvan hermosolujen erilaistumisen aikana (48). Perkins et ai. kertoivat, että hsa-miR-26b: n säätely oli alhainen skitsofreniapotilaiden prefrontaalisessa aivokuoressa (49).
Vaikka näiden miRNA: ien häiriintyneen ilmentymisen ja IGD: n patofysiologian välisestä suhteesta ei ole suoraa näyttöä, voimme päätellä, että näiden miRNA: ien epäsääntely voi liittyä IGD: n patofysiologiaan perustuen useisiin aiempiin raportteihin alavirran geeneistä, jotka ennustimme . Jotkut kolmen miRNA: n alavirran geeneistä, kuten GABRB2, CNR1, NRXN1ja DPYSL2 niiden on ilmoitettu liittyvän neuropsykiatrisiin häiriöihin. Gamma-aminovoihappo (GABA) on tärkeä keskushermostoa estävä välittäjäaine. GABA-reseptorin häiriintyminen liittyy neuropsykiatrisiin häiriöihin, mukaan lukien riippuvuus, ahdistus ja masennus (50), jotka ovat myös IGD: n (8). GABA-reseptorigeenien geneettisten polymorfismien on ilmoitettu liittyvän alkoholiriippuvuuteen ja skitsofreniaan (51, 52). Dihydropyrimidinaasimäinen 2 (DPYSL2) on kollasiini-vastevälittäjäproteiiniperheen jäsen, jolla on merkitys mikrotubulusten kokoonpanossa, synaptisissa signaloinnissa ja aksonaalisen kasvun säätelyssä. Tämän seurauksena tätä molekyyliä on ehdotettu psykiatristen häiriöiden biomarkkeriksi (53, 54). Polymorfismi DPYSL2 geenin ilmoitettiin liittyvän myös alkoholin käyttöhäiriöön (55). Aikaisemmat raportit ja tietomme viittaavat siihen, että GABRB2: n ja DPYSL2: n yliekspressiolla, jotka ovat alareguleitujen miRNA: ien alavirran kohteita, on vaikutusta neuropsykiatristen häiriöiden, mukaan lukien IGD, patogeneesiin. Kannabinoidireseptori tyyppi 1 (CNR1) on presynaptinen heteroreseptori, joka moduloi välittäjäaineiden vapautumista, ja kannabinoidien signaloinnin häiriöt liittyvät erilaisiin neuropsykiatrisiin häiriöihin (56). Geenin polymorfismi CNR1 geenin tiedetään liittyvän aineiden riippuvuuteen valkoihoisilla (57). Rotamallissa ventraalisen hippokampuksen CNR1: n aktivointi häiritsee normaalia sosiaalista käyttäytymistä ja kognitiota (58). NRXN-perheen geneettisen muutoksen tiedetään liittyvän moniin erilaisiin neuropsykiatrisiin häiriöihin, mukaan lukien riippuvuus (59).
Kolmen miRNA-ehdokkaan biologisen vaikutuksen tutkimiseksi suoremmalla tavalla tutkimme niiden alavirran kohdegeenien proteiiniekspressiota. Koska 140-yleisten ehdokkaiden (ennustetaan olevan alavirtaan 2: stä tai useammasta miRNA: sta) plasmanäytteiden rajoitetun saatavuuden vuoksi, tutkimme 5-kohteita (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 ja PI15) Western blot -tekniikalla ja vahvistimme GABRBUMX: n ekspression. ja DPYSL2 oli merkittävästi korkeampi IGD-ryhmässä. Aikaisemmat raportit ja tietomme viittaavat siihen, että GABRB2: n ja DPYSL2: n yliekspressiolla, jotka ovat alareguleitujen miRNA: ien loppupään kohteita, voi olla vaikutuksia neuropsykiatristen häiriöiden, mukaan lukien IGD, patogeneesiin. GO: n ja hermokehityspolkujen polututkimuksen tulokset tukevat myös miRNA-markkerien neurobiologista vaikutusta. Toinen mielenkiintoinen havainto oli miRNA: ien samanaikaisen muuttamisen synergistinen vaikutus. Henkilöillä, joilla kaikkien 2 miRNA: ien säätely oli alhainen, oli 3 kertaa suurempi riski kuin henkilöillä, joilla ei ollut alaregulaatiota, ja OR: t kasvoivat annoksesta riippuvalla tavalla. Vaikka CI näissä kolmessa muutoksessa oli leveä otoksen rajoitetun koon vuoksi, selvä positiivinen korrelaatio (r2 = 0.996) tukee kolmen miRNA: n synergististä vaikutusta.
Vaikka löysimme IGD: hen liittyviä miRNA-markkereita ja henkilöillä, joilla kaikilla kolmella miRNA-muutoksella oli riski 22-kertaa suurempi kuin henkilöillä, joilla ei ollut miRNA-muutoksia, tässä tutkimuksessa on useita rajoituksia. Ensinnäkin pieni näytteen koko lisäsi todennäköisyyttä puuttua muista merkittävistä miRNA-markkereista. Toiseksi, koska tietomme eivät riittäneet selventämään, ovatko plasma-miRNA-profiilit joko syy tai seuraus, emme voi vahvistaa näiden ei-invasiivisten markkerien biologisia roolia kliinisessä ympäristössä. LisämRNA-profilointi ja niiden alavirran geenianalyysi käyttämällä ihmisen aivokudosta aivokudospankista voivat antaa suoremman vastauksen. Aivokudoksen analyysi pelaamishäiriöiden eläinmallilla olisi myös hyödyllinen. Kolmanneksi, plasmanäytteiden rajoitetun saatavuuden vuoksi tutkimme vain viittä alavirtaan ehdokasmolekyyliä. Tutkimalla enemmän loppupään kohteita suuremmalla näytejoukolla on hyötyä IGD: n molekyylimekanismin ymmärtämiselle edelleen.
Yhteenvetona, genomin laajuisen miRNA-ekspressioprofiilien seulonnan ja riippumattoman validoinnin avulla löysimme kolme IGD: hen liittyvää miRNA: ta (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p ja hsa-miR-652-3p). Monien heidän alavirran geeniensä on ilmoitettu osallistuvan monimuotoisiin neuropsykiatrisiin häiriöihin, ja näiden alavirran geenien muuttuneen ekspression kokeellinen validointi tukee tässä tutkimuksessa tunnistettujen miRNA: ien vaikutusta. Havaitsimme, että henkilöillä, joilla kaikkien kolmen miRNA: n sääntely on alhainen, on suuri IGD-riskin riski. Yhdessä tunnettujen kliinisten tai ympäristöriskien ja diagnostisten kriteerien kanssa havainnomme voivat helpottaa varhaista puuttumista ihmisiin, joilla on suurempi IGD-riski.
Etiikka
Tämän tutkimuksen hyväksyi Korean katolisen yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun instituutioarviointilautakunta (MC16SISI0120). Kaikki osallistujat ja heidän vanhempansa antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen.
Tekijänoikeudet
ML ja HC osallistuivat yhtä lailla tähän kirjoitukseen. ML, D-JK ja Y-JC suunnittelivat tutkimuksen. SJ, S-MC, YP, DC ja JL suorittivat kokeita ja datanmuodostusta. J-WC, S-HP, J-SC ja D-JK keräsivät verinäytteitä ja kliinistä tietoa. ML, HC, S-HY ja Y-JC analysoivat tiedot. ML, HC, S-HY ja Y-JC kuvasivat käsikirjoituksen. Y-JC valvoi projektia.
Eturistiriidat
Kirjoittajat toteavat, että tutkimus toteutettiin ilman sellaisia kaupallisia tai taloudellisia suhteita, joita voitaisiin pitää mahdollisena eturistiriitana.
alaviitteet
Rahoitusta. Tätä työtä tuettiin aivotutkimusohjelman myöntämällä avustuksella Korean kansallisen tutkimuskeskuksen (NRF) kautta, jota rahoitti tiede- ja viestintätekniikan ja tulevaisuuden suunnitteluministeriö (NRF-2015M3C7A1064778).
Oheismateriaali
Tämän artikkelin lisämateriaali löytyy verkosta http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Viitteet
;
