PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
सार
जीन अभिव्यक्ति में कोकीन-प्रेरित परिवर्तनों के कारण न्यूरोनल आकृति विज्ञान और व्यवहार में परिवर्तन होता है जो कोकीन की लत का कारण बन सकता है। हमने कोकीन-प्रेरित संरचनात्मक और व्यवहारिक प्लास्टिसिटी में हिस्टोन 3 लाइसिन 9 (H3K9) डाइमिथाइलेशन और लाइसिन डाइमिथाइलट्रांसफेरेज़ G9a के लिए एक आवश्यक भूमिका की पहचान की। बार-बार कोकीन के प्रशासन ने न्यूक्लियस एक्बुम्बेंस में H3K9 डाइमिथाइलेशन के वैश्विक स्तर को कम कर दिया। टीहिस्टोन मिथाइलेशन में उनकी कमी इस मस्तिष्क क्षेत्र में G9a के दमन के माध्यम से की गई थी, जिसे कोकीन-प्रेरित प्रतिलेखन कारक ΔFosB द्वारा नियंत्रित किया गया था। सशर्त उत्परिवर्तन और वायरल-मध्यस्थ जीन स्थानांतरण का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि G9a डाउनरेगुलेशन ने न्यूक्लियस एक्म्बेंस न्यूरॉन्स की डेंड्राइटिक स्पाइन प्लास्टिसिटी को बढ़ा दिया और कोकीन के लिए प्राथमिकता बढ़ा दी, जिससे कोकीन की दीर्घकालिक क्रियाओं में हिस्टोन मिथाइलेशन के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका स्थापित हुई।
परिचय
बार-बार कोकीन के संपर्क में आने की विशेषता जीन अभिव्यक्ति में लगातार बदलाव और न्यूक्लियस एक्चुम्बेंस (एनएसी) के भीतर परिवर्तित न्यूरोनल आकृति विज्ञान है, जो मस्तिष्क के रिवार्ड सर्किटरी का एक प्रमुख घटक है (1-2). इस मस्तिष्क क्षेत्र में असामान्य ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों में क्रोमैटिन रीमॉडलिंग महत्वपूर्ण है जो कोकीन की लत के पहलुओं का आधार हो सकता है (3-9). एनएसी में क्रोमैटिन संरचना का कोकीन विनियमन, आंशिक रूप से, क्रोमैटिन एंजाइमेटिक मशीनरी के प्रत्यक्ष कोकीन-प्रेरित संशोधनों से होता है, जिससे हिस्टोन एसिटिलीकरण और फॉस्फोराइलेशन में परिवर्तन होता है (4, 7-9); हालाँकि, हिस्टोन मिथाइलेशन को नियंत्रित करने वाले एंजाइमों की भूमिका की अभी तक जांच नहीं की गई है।
हाल ही में माइक्रोएरे (चिप-चिप) से जुड़े क्रोमेटिन इम्युनोप्रेवेरेशन का उपयोग करते हुए जीनोम-वाइड प्रमोटर विश्लेषण ने बार-बार कोकीन उपचार के बाद एनएसी में विशिष्ट जीन प्रमोटरों पर दमनकारी हिस्टोन एच 3 लाइसिन 9 (एच 3 के 9) और 27 (एच 3 के 27) मिथाइलेशन के परिवर्तित पैटर्न की पहचान की।6). इसलिए हमने कई लाइसिन मिथाइलट्रांसफेरेज़ (KMTs) और डेमिथाइलिसेस (KDMs) की रूपरेखा तैयार की है जो H3K9 या H3K27 मिथाइलेशन को नियंत्रित करने के लिए जाने जाते हैं (अंजीर। 1A). केवल दो एंजाइम, जी9ए और जीएलपी, ने बार-बार कोकीन प्रशासन के 24 घंटे बाद लगातार ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन प्रदर्शित किया, जब दोनों जीन की अभिव्यक्ति काफी हद तक कम हो गई थी. क्योंकि G9a और GLP विशेष रूप से H3K9 (H3K9me2) के डाइमिथाइलेशन को उत्प्रेरित करते हैं, कोकीन द्वारा उनका डाउनरेगुलेशन इस समय देखे गए यूक्रोमैटिक H3K9me2 के वैश्विक स्तर में कमी के अनुरूप है (अंजीर। 1B). इसके विपरीत, बार-बार कोकीन के संपर्क में आने से हेटरोक्रोमैटिक H3K27 मिथाइलेशन का वैश्विक स्तर अपरिवर्तित रहा (ऑनलाइन सामग्री के समर्थन में चित्र S1). इसकी उत्प्रेरक गतिविधि दोनों के उच्च स्तर के कारण इन विट्रो में और vivo में (10), हम एनएसी में बार-बार कोकीन के संपर्क के बाद जी9ए दमन के कार्यात्मक महत्व की और जांच करने के लिए तैयार हैं। G9a प्रोटीन का स्तर, इसके mRNA के स्तर की तरह, बार-बार कोकीन लेने के 24 घंटे बाद काफी कम हो गया था (अंजीर। S2). हालाँकि NAc में G9a mRNA की अभिव्यक्ति 35% कम हो गई थी, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण से G15a प्रोटीन के स्तर में 9% की मामूली कमी का पता चला, जो बार-बार कोकीन प्रशासन के बाद H21K3me9 में देखी गई 2% की कमी के अनुरूप है।अंजीर। 1B). कोकीन के बार-बार स्व-प्रशासन के बाद इस मस्तिष्क क्षेत्र में G9a mRNA अभिव्यक्ति भी 20% तक कम हो गई थी (अंजीर। S3).
यह पहचानने के लिए कि क्या यूक्रोमैटिक H3K9me2 में परिवर्तन एनएसी में जीन अभिव्यक्ति में जीनोम-व्यापक परिवर्तनों के साथ सहसंबद्ध हैं, हमने पूर्व कोकीन जोखिम के इतिहास के साथ या बिना जानवरों में कोकीन की एक चुनौती खुराक से प्रेरित जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच करने के लिए माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग किया (पूरक देखें) जीन सूची में टेबल्स S1-S3). जिन जानवरों को बार-बार कोकीन दी गई थी, उन्होंने गंभीर रूप से इलाज किए गए जानवरों की तुलना में कोकीन चुनौती के 1 घंटे बाद नाटकीय रूप से जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि देखी (अंजीर। 1C). बार-बार कोकीन छोड़ने के 1 सप्ताह के बाद दी गई कोकीन चुनौती के जवाब में यह बढ़ी हुई जीन अभिव्यक्ति अभी भी हुई। पिछली रिपोर्टों के अनुरूप, जीन का एक छोटा प्रतिशत (~10%) बार-बार कोकीन प्रशासन के बाद असंवेदनशील ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित करता है (अंजीर। 1C; देख तालिका S1) (5). बार-बार कोकीन के बाद देखी गई बढ़ी हुई जीन अभिव्यक्ति में G9a डाउनरेगुलेशन की भूमिका की सीधे जांच करने के लिए, चूहों को GFP या G9a व्यक्त करने वाले हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस (HSV) वैक्टर के इंट्रा-एनएसी इंजेक्शन प्राप्त हुए और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या G9a ओवरएक्सिप्रेशन है, खारा या बार-बार कोकीन के साथ इलाज किया गया। जीन अभिव्यक्ति की बार-बार होने वाली कोकीन-प्रेरित वृद्धि को रोकने के लिए पर्याप्त था। बार-बार कोकीन के बाद अभिव्यक्ति के ऊंचे स्तर को प्रदर्शित करने वाले 12 बेतरतीब ढंग से चयनित जीनों के एक सेट से, हमने देखा कि G9a ने इन जीनों में से 50% की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया है (तालिका S4).
G9a अभिव्यक्ति के बार-बार कोकीन-प्रेरित दमन में मध्यस्थता करने वाली अपस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं की पहचान करने के लिए, हमने ΔFosB की संभावित भूमिका की जांच की, जो तत्काल प्रारंभिक जीन का एक अत्यधिक स्थिर ब्याह उत्पाद है। fosB. कोकीन के बार-बार संपर्क में आने के बाद ΔFosB NAc में जमा हो जाता है, जहां इसे बढ़े हुए कोकीन इनाम से जोड़ा गया है (11). ΔFosB शामिल लक्ष्य जीन के आधार पर एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर या रेप्रेसर के रूप में कार्य कर सकता है (3, 5, 6, 12). बाइट्रांसजेनिक एनएसई का उपयोग करना-टीटीए × tetOP-ΔFosB चूहे, जिसमें ΔFosB अभिव्यक्ति को वयस्क जानवरों के NAc और पृष्ठीय स्ट्रिएटम में चुनिंदा रूप से प्रेरित किया जा सकता है (13), हमने NAc में H3K9me2 और KMT के कोकीन विनियमन पर ΔFosB अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच की। ΔFosB ओवरएक्प्रेशन H3K9me2 दोनों के स्तर को कम करने के लिए पर्याप्त था (अंजीर। 1D) और G9a अभिव्यक्ति (अंजीर। 1E), जिससे बार-बार कोकीन के प्रभाव की नकल की जा सके। इसके विपरीत, ΔFosB ने इस मस्तिष्क क्षेत्र में GLP अभिव्यक्ति को कम नहीं किया, और SUV39H1 और EZH2 पर कोई प्रभाव नहीं डाला, जो क्रमशः H3K9 और H3K27 के लिए प्रमुख ट्राइमेथिलेटिंग एंजाइम हैं (अंजीर। S4). एक स्वतंत्र ΔFosB ओवरएक्प्रेशन सिस्टम का उपयोग करके इन डेटा की पुष्टि करने के लिए, जंगली प्रकार के वयस्क चूहों को GFP या ΔFosB को व्यक्त करने वाले एडेनो-संबद्ध वायरस (AAV) वैक्टर के द्विपक्षीय इंट्रा-एनएसी इंजेक्शन प्राप्त हुए। ΔFosB की वायरल-मध्यस्थता अतिअभिव्यक्ति ने इस मस्तिष्क क्षेत्र में G9a अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर दिया (अंजीर। 1E).
G9a के इस तरह के स्पष्ट और विशिष्ट विनियमन ने हमें यह जांचने के लिए प्रेरित किया कि क्या विशेष रूप से NAc न्यूरॉन्स में G9a अभिव्यक्ति को बदलने से कोकीन के प्रति व्यवहार संबंधी प्रतिक्रियाएं नियंत्रित होती हैं। वाइल्डटाइप चूहों को जीएफपी या जी9ए व्यक्त करने वाले एचएसवी वैक्टर के इंट्रा-एनएसी इंजेक्शन प्राप्त हुए और फिर एक निष्पक्ष कोकीन वातानुकूलित स्थान वरीयता प्रतिमान का उपयोग करके विश्लेषण किया गया, जो दवा इनाम का एक अप्रत्यक्ष उपाय प्रदान करता है। व्यवहार परीक्षण के बाद NAc न्यूरॉन्स में G9a की वायरल अतिअभिव्यक्ति की पुष्टि की गई (अंजीर। 2A). G9a की अधिक अभिव्यक्ति से जानवरों की तुलना में GFP की अधिक अभिव्यक्ति से कोकीन की प्राथमिकता काफी कम हो गई (अंजीर। 2B), और NAc में H3K9me2 का स्तर बढ़ा (अंजीर। 2C). G9a (G9aH1093K) के उत्प्रेरक रूप से मृत उत्परिवर्ती की अतिअभिव्यक्ति (14) कोकीन प्राथमिकता को प्रभावित नहीं करता (अंजीर। 2B) और इस मस्तिष्क क्षेत्र में H3K9me2 के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (अंजीर। 2C).
कोकीन के व्यवहारिक प्रभावों में G9a की भूमिका का और अधिक अध्ययन करने के लिए, और विशेष रूप से NAc में G9a अभिव्यक्ति के बार-बार कोकीन-प्रेरित दमन की नकल करने के लिए, वयस्क G9afl/fl चूहे (14) नियंत्रण के रूप में Cre recombinase या GFP को व्यक्त करने वाले AAV वैक्टर के इंट्रा-एनएसी इंजेक्शन प्राप्त हुए। NAc में G9a का AAV-Cre नॉकडाउन, जिसकी इम्यूनोहिस्टोकेमिकल रूप से पुष्टि की गई थी (अंजीर। S5), प्लेस कंडीशनिंग प्रयोगों में कोकीन के प्रभाव में उल्लेखनीय वृद्धि हुई और एनएसी में H3K9me2 के स्तर में कमी आई (चित्र 2डी, ई). G9a और GLP का व्यावसायिक रूप से उपलब्ध औषधीय अवरोधक, BIX01294 (15-16), का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया गया था कि क्या एंजाइम अवरोध कोकीन के प्रति व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं को समान रूप से प्रभावित करता है। वास्तव में, G9a और GLP के औषधीय निषेध ने कोकीन के लिए प्राथमिकता में उल्लेखनीय वृद्धि की और NAc में H3K9me2 में कमी की (चित्र 2एफ, जी).
कोकीन के बार-बार सेवन से एनएसी मीडियम स्पाइनी न्यूरॉन्स पर डेंड्राइटिक स्पाइन का घनत्व बढ़ जाता है (17), इन न्यूरॉन्स पर उत्तेजक ग्लूटामेटेरिक सिनैप्स में कार्यात्मक परिवर्तनों से जुड़ी एक प्रक्रिया (18-19) और दवा के प्रति संवेदनशील व्यवहारिक प्रतिक्रियाएं (17, 20). इस प्रकार हमने अनुमान लगाया कि बार-बार कोकीन द्वारा NAc में G9a गतिविधि का डाउनरेगुलेशन, NAc न्यूरॉन्स के डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व को विनियमित करने की कोकीन की क्षमता में मध्यस्थता कर सकता है। एक एंटी-जी9ए एंटीबॉडी के साथ क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (चिप) का उपयोग करते हुए, हमने एनएसी में कई अनुमानित जी9ए जीन लक्ष्यों की पहचान की, जिनमें से प्रत्येक को पहले कोकीन-प्रेरित डेंड्राइटिक प्लास्टिसिटी में फंसाया गया है (अंजीर। 3A) (20-26). हमने पाया कि बार-बार कोकीन लेने से इन जीन प्रमोटरों में G9a बाइंडिंग, साथ ही H3K9me2 का स्तर काफी कम हो गया (अंजीर। 3B). इसके विपरीत, तीव्र कोकीन प्रशासन ने तेजी से G9a को इन्हीं जीन प्रमोटरों में से कुछ में भर्ती किया, जो कोकीन की तीव्र खुराक के 9 घंटे बाद NAc में देखी गई बढ़ी हुई G1a अभिव्यक्ति के अनुरूप है (अंजीर। S6). यद्यपि विशिष्ट जीन प्रमोटरों पर G9a का बंधन इसकी अभिव्यक्ति में परिवर्तन के साथ संबंध रखता है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या ऐसी घटनाओं की मध्यस्थता NAC में G9a के परिवर्तित वैश्विक स्तर और/या तीव्र के बाद G9a भर्ती में अंतर के कारण होती है। बनाम बार-बार कोकीन का सेवन।
एनएसी में कई प्लास्टिसिटी-संबंधित जीनों के जी9ए के नियमन के आधार पर, हमने सीधे जांच की कि क्या बार-बार कोकीन उपचार के बाद इस मस्तिष्क क्षेत्र में जी9ए अभिव्यक्ति का रखरखाव कोकीन-प्रेरित डेंड्राइटिक रीढ़ के गठन को अवरुद्ध करने के लिए पर्याप्त था। एनएसी में डेंड्राइटिक स्पाइन इंडक्शन को बढ़ावा देने के लिए पहले प्रदर्शित कोकीन उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग करना (20), हमने एचएसवी-जीएफपी या एचएसवी-जी9ए के इंजेक्शन वाले जानवरों में रीढ़ की हड्डी के घनत्व की जांच की। पिछले निष्कर्षों के साथ सहमति में, हमने कोकीन उपचार के बाद एनएसी में डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, एक ऐसा प्रभाव जो G9a ओवरएक्प्रेशन द्वारा पूरी तरह से अवरुद्ध हो गया था (अंजीर। 3C). कोकीन की अनुपस्थिति में अकेले G9a ओवरएक्प्रेशन, NAc डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व को कम करने के लिए पर्याप्त नहीं था। इन डेटा को पूरक करने के लिए, G9afl/fl चूहों को एचएसवी-सीआरई के इंट्रा-एनएसी इंजेक्शन प्राप्त हुए और रीढ़ की हड्डी के घनत्व की मात्रा निर्धारित की गई और कोकीन की अनुपस्थिति में एचएसवी-जीएफपी प्राप्त करने वाले जानवरों की तुलना की गई। G9a अभिव्यक्ति के ख़त्म होने से NAc मीडियम स्पाइनी न्यूरॉन्स पर रीढ़ की हड्डी का घनत्व काफी बढ़ गया (अंजीर। 3C).
इस सबूत को देखते हुए कि बार-बार कोकीन के बाद एनएसी में जी9ए का विनियमन ΔFosB द्वारा मध्यस्थ होता है, हमने अगली जांच की कि क्या यह प्रतिलेखन कारक एनएसी डेंड्राइटिक स्पाइन के नियमन में भी शामिल है।. हालाँकि ΔFosB को पहले इस तरह की डेंड्राइटिक प्लास्टिसिटी से नहीं जोड़ा गया है, लेकिन Cdk5 और NFκB सबयूनिट्स सहित इसके कई लक्ष्य इतने जुड़े हुए हैं (20-23), और NAc न्यूरॉन्स में ΔFosB की लगातार अभिव्यक्ति बार-बार कोकीन उपचार के बाद डेंड्राइटिक रीढ़ की घनत्व में वृद्धि के साथ संबंधित है (27). सबसे पहले, हमने पाया कि कोकीन की अनुपस्थिति में बाइट्रांसजेनिक चूहों में ΔFosB का समावेश हुआ, जिसने G9a और H3K9me2 अभिव्यक्ति को कम कर दिया (चित्र 1डी, ई), कई प्लास्टिसिटी-संबंधित जीनों के लिए G9a बाइंडिंग को कम कर दिया, जिनमें से कई को ΔFosB के प्रत्यक्ष लक्ष्य के रूप में भी दिखाया गया है (अंजीर। 3D) (3, 6). हमने आगे दिखाया कि NAc में ΔFosB की वायरल ओवरएक्प्रेशन ने बेसल परिस्थितियों में डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व में काफी वृद्धि की है, वैसा ही जैसा बार-बार कोकीन देने के बाद देखा गया (अंजीर। 3E). इसके विपरीत, ΔJunD के NAc में अतिअभिव्यक्ति, एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती प्रोटीन जो ΔFosB ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को रोकता है, ने NAc में डेंड्राइटिक स्पाइन गठन को बढ़ाने के लिए बार-बार कोकीन की क्षमता को अवरुद्ध कर दिया। (अंजीर। 3C).
हमारा अवलोकन कि ΔFosB NAc में G9a अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, और ΔFosB और G9a कुछ समान लक्ष्य जीनों को नियंत्रित करते हैं, हमें ΔFosB और G9a के बीच अन्य इंटरैक्शन की जांच करने के लिए प्रेरित किया। तीव्र कोकीन के बाद, जब G9a का स्तर बढ़ गया, तो G9a का बंधन बढ़ गया fosB जीन में वृद्धि हुई थी, जबकि बार-बार कोकीन के बाद, जब G9a अभिव्यक्ति को दबा दिया गया था, तो G9a को बांध दिया गया था fosB जीन कम हो गया था (अंजीर। 3A). बार-बार कोकीन लेने के बाद G9a बाइंडिंग में ऐसी कमी नहीं देखी गई सी-फॉस, जहां बार-बार कोकीन से G9a बाइंडिंग बढ़ जाती है (अंजीर। S7). यह इस तथ्य के अनुरूप है कि, इसके विपरीत fosB, सी FOS क्रोनिक साइकोस्टिमुलेंट एक्सपोज़र द्वारा दमित है, प्रेरित नहीं है (5). बाइट्रांसजेनिक चूहों में ΔFosB ओवरएक्प्रेशन G9a बाइंडिंग को उल्लेखनीय रूप से कम करने के लिए पर्याप्त था fosb जीन (अंजीर। 3D). इसके अलावा, G9a ओवरएक्प्रेशन बार-बार कोकीन प्रशासन के बाद बढ़ी हुई ΔFosB अभिव्यक्ति को कम करने के लिए पर्याप्त था (तालिका S4). ये डेटा एक ऑटोरेगुलेटरी लूप का सुझाव देते हैं जिसके तहत G9a प्रारंभ में तीव्र कोकीन प्रशासन द्वारा ΔFosB के प्रेरण को सीमित करता है। हालाँकि, चूंकि बार-बार दवा के संपर्क में आने से ΔFosB जमा हो जाता है, यह G9a को दबा देता है और इस तरह अपने स्वयं के आगे के प्रेरण को सक्षम बनाता है।
निष्कर्ष में, हमने प्रदर्शित किया है कि एनएसी में हिस्टोन लाइसिन मिथाइलेशन कोकीन के जवाब में न्यूरोनल जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में गंभीर रूप से शामिल है। बार-बार कोकीन प्रशासन के बाद G9a और H3K9me2 का दमन, डेंड्राइटिक प्लास्टिसिटी के असामान्य रूपों को विनियमित करने के लिए जाने जाने वाले कई जीनों के ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण के माध्यम से, आंशिक रूप से कोकीन प्राथमिकता को बढ़ावा देता है। ऐसे तंत्रों के माध्यम से विनियमित होने वाले जीन की बेहतर समझ प्राप्त करने से नशीली दवाओं की लत के जटिल जैविक आधार के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार होगा और नशे की लत संबंधी विकारों के अधिक प्रभावी उपचार के विकास में सहायता मिल सकती है।
सामग्री और तरीके
पशु और उपचार
जब तक अन्यथा न कहा जाए, चूहों को एक कॉलोनी में 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र (सुबह 7:00 बजे से शाम 7:00 बजे तक रोशनी) के साथ स्थिर तापमान (23 डिग्री सेल्सियस) पर चार से पांच प्रति पिंजरे में रखा गया था। बिना तैयारी के पानी और भोजन तक पहुंच. सभी पशु प्रोटोकॉल को यूटी साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन दोनों में IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया था।
कोकीन प्रयोगों के लिए [इम्यूनोहिस्टोकेमेट्री, वेस्टर्न ब्लॉटिंग, मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), माइक्रोएरे विश्लेषण और क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (चिप)], 8 से 10 सप्ताह के नर C57BL/6J चूहों का उपयोग किया गया। जानवरों को या तो 'सलाइन' (7 उपचार सलाइन, आईपी), 'तीव्र' कोकीन (6 उपचार सलाइन + एक उपचार 20 मिलीग्राम/किलोग्राम कोकीन-एचसीएल, आईपी) या 'बार-बार' कोकीन (7 उपचार 20 मिलीग्राम/किग्रा) के दैनिक इंजेक्शन दिए गए। कोकीन-एचसीएल, आईपी). अंतिम उपचार के बाद 1 घंटे या 24 घंटे में चूहों की बलि दी गई। माइक्रोएरे अध्ययन के लिए, जानवरों का प्रतिदिन 'सलाइन' (15 उपचार सलाइन, आईपी), 'तीव्र' कोकीन (14 उपचार सलाइन + 1 उपचार 20 मिलीग्राम/किलो कोकीन-एचसीएल, आईपी), 'बार-बार + तीव्र' कोकीन ( 7 उपचार सलाइन + 8 उपचार 20 मिलीग्राम/किलो कोकीन-एचसीएल, आईपी) या 'बार-बार वापसी + तीव्र' कोकीन (7 उपचार 20 मिलीग्राम/किलो कोकीन-एचसीएल + 7 उपचार सलाइन + 1 चुनौती उपचार 20 मिलीग्राम/किलो कोकीन-एचसीएल, आईपी) और अंतिम उपचार के 1 घंटे बाद उनकी बलि दे दी गई। व्यवहारिक प्रयोगों में, चूहों को सर्जरी के बाद अकेले रखा गया और नीचे बताए अनुसार 10 मिलीग्राम/किलोग्राम कोकीन-एचसीएल, आईपी के साथ इलाज किया गया। एचएसवी-जीएफपी और एचएसवी-जी9ए-जीएफपी संक्रमण के बाद डेंड्राइटिक स्पाइन विश्लेषण और माइक्रोएरे सत्यापन के लिए, चूहों का इलाज 'सलाइन' (5 उपचार सलाइन, आईपी) या 'बार-बार कोकीन' (5 उपचार 20 मिलीग्राम/किलो कोकीन-एचसीएल, आईपी) से किया गया। ) 3 दिनों के दौरान, क्योंकि इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल को पहले हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस (एचएसवी) ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की समय सीमा के भीतर न्यूक्लियस एक्चुम्बेंस (एनएसी) न्यूरॉन्स पर रीढ़ की घनत्व बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है।पूरक रेफरी S1). डेंड्राइटिक स्पाइन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किए गए चूहों को अंतिम उपचार के 4 घंटे बाद बलि दे दी गई।
एनएसी न्यूरॉन्स तक सीमित G9a प्रतिलेख के स्थानीय विलोपन को प्रेरित करने के लिए, हमने फ्लॉक्स्ड G9a एलील के लिए समयुग्मजी उत्परिवर्ती चूहों का उपयोग किया, जिनका अन्यत्र विस्तार से वर्णन किया गया है (S2). क्रे-प्रेरित पुनर्संयोजन एक्सॉन 22 से 25 आउट-ऑफ़-फ़्रेम स्प्लिसिंग उत्पन्न करता है जिससे उत्परिवर्तित प्रतिलेख का निरर्थक-मध्यस्थता क्षय होता है। हमने G9a फ़्लॉक्स्ड चूहों का उपयोग किया जो पूरी तरह से C57BL/6J चूहों पर बैकक्रॉस थे। चूहों को 2 से 7 सप्ताह की उम्र के बीच जीएफपी या क्रे-जीएफपी व्यक्त करने वाले एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) वैक्टर (सीरोटाइप 10) के साथ एनएसी में स्टेरोटैक्सिकली-इंजेक्ट किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण का उपयोग क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन की दक्षता को सत्यापित करने के लिए किया गया था (देखें)। पूरक चित्र. S5). हमने सर्जरी के 21 दिन बाद जानवरों को एएवी इंजेक्शन का इस्तेमाल किया क्योंकि प्रकाशित रिपोर्टों के अनुरूप, इस समय-बिंदु पर जी9ए फ्लॉक्स्ड चूहों में पुनर्संयोजन स्थिर और अधिकतम था।S3-S4). G9a और ΔJunD ओवरएक्प्रेशन प्रयोग समान रूप से GFP, वाइल्डटाइप G9a-GFP, उत्प्रेरक रूप से मृत G9aH1093K-GFP या ΔJunD-GFP को व्यक्त करने वाले HSV वायरस वैक्टर का उपयोग करके आयोजित किए गए थे (देखें) S2 G9a निर्माणों के विकास से संबंधित विवरण के लिए)। एचएसवी ओवरएक्सप्रेसिंग चूहों का उपयोग सर्जरी के 3 दिन बाद किया गया क्योंकि इस समय-बिंदु पर ओवरएक्सप्रेसिंग अधिकतम थी, जैसा कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से देखा गया था। एचएसवी अभिव्यक्ति की क्षणिक प्रकृति और एएवी अभिव्यक्ति की काफी अधिक स्थिर प्रकृति के कारण, एचएसवी वैक्टर का उपयोग तेज, अल्पकालिक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता वाले प्रयोगों में किया गया था, जबकि एएवी वैक्टर का उपयोग ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की विस्तारित अवधि की आवश्यकता वाले प्रयोगों में किया गया था। व्यापक पूर्व अध्ययनों में, दोनों वैक्टरों को अभिवाही या अपवाही न्यूरॉन्स के किसी भी संक्रमण के बिना, इंजेक्शन वाले मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर केवल न्यूरोनल कोशिका निकायों को संक्रमित करने के लिए दिखाया गया है।
औषधीय G9a/GLP अवरोधक, BIX01294 (25 ng/μl) का उपयोग करके व्यवहारिक प्रयोगों के लिए, चूहों को दो चमड़े के नीचे के मिनी-पंप, साथ ही द्विपक्षीय गाइड कैनुला के साथ NAc में स्टेरोटैक्सिक रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। इम्प्लांटेशन से 12 घंटे पहले मिनी-पंप सक्रिय किए गए थे, जिससे 0.25 दिनों के लिए वाहन (5 हाइड्रॉक्सीप्रोपाइल β-साइक्लोडेक्सट्रिन) या दवा की निरंतर डिलीवरी (14 μl / घंटा) शुरू की गई थी, इस दौरान व्यवहार मूल्यांकन किया गया था।
ΔFosB ओवरएक्प्रेशन प्रयोगों के लिए [वेस्टर्न ब्लॉटिंग, क्यूपीसीआर, और चिप], पुरुष बाइट्रांसजेनिक एनएसई-टीटीए × टेटओपी-ΔFosB चूहों का उपयोग किया गया (10 सप्ताह पुराना), जिससे टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्सीसाइक्लिन से 8 सप्ताह की छूट) की अनुपस्थिति में, जानवरों ने ΔFosB की मजबूत स्ट्राइटल प्रतिबंधित संवैधानिक अभिव्यक्ति प्रदर्शित की (S5). इन चूहों में ΔFosB ओवरएक्प्रेशन की पुष्टि qपीसीआर के माध्यम से की गई थी। एनएसई का उपयोग करके निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए-टीटीए × टेटओपी-ΔFosB चूहों, वाइल्डटाइप 8-सप्ताह पुराने C57BL/6J नर चूहों को GFP या ΔFosB-GFP व्यक्त करने वाले AAV वैक्टर के साथ स्टेरोटैक्सिकली-इंजेक्ट इंट्रा-एनएसी दिया गया। इस मामले में, सर्जरी के 8 सप्ताह बाद अधिकतम ΔFosB अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए AAV वैक्टर का उपयोग किया गया, जिससे वायरल संक्रमित और बाइट्रांसजेनिक ΔFosB ओवरएक्सप्रेसिंग चूहों के बीच सीधी तुलना की अनुमति मिल सके। सर्जरी के 8 सप्ताह बाद क्यूपीसीआर का उपयोग करके वायरल ओवरएक्प्रेशन की पुष्टि की गई (इंजेक्शन साइट के नीचे 15-गेज एनएसी पंच विच्छेदित किए गए थे)। एएवी-जीएफपी और एएवी-ΔFosB-जीएफपी ओवरएक्सप्रेसिंग चूहों का उपयोग क्यूपीसीआर के लिए नहीं किया गया था, उन्हें 14 सप्ताह के बाद सेलाइन (14 उपचार सेलाइन, आईपी) या बार-बार कोकीन (30 उपचार 6 मिलीग्राम / किग्रा कोकीन-एचसीएल, आईपी) के साथ इलाज किया गया था। शल्य चिकित्सा। अंतिम उपचार के 4 दिन बाद, मस्तिष्क को 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ ठीक किया गया, एक वाइब्रेटोम पर विभाजित किया गया और डेंड्राइटिक स्पाइन विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया।
वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण
14-गेज एनएसी पंच स्टेनलेस स्टील माउस ब्रेन मैट्रिक्स का उपयोग करके प्राप्त 1 मिमी कोरोनल अनुभागों से लिए गए थे और प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक युक्त 1 एम एचईपीईएस लिसीस बफर (1% एसडीएस) में सोनिकेट किए गए थे। 10-कुल प्रोटीन के 30 μg नमूनों को 18% एसडीएस जैल पर इलेक्ट्रोफोरेस किया गया। प्रोटीनों को पीवीडीएफ झिल्लियों में स्थानांतरित किया गया और या तो एंटी-H3K9me2 (माउस मोनोक्लोनल, 1:500), एंटी-β-ट्यूबुलिन (माउस मोनोक्लोनल, 1:60,000), एंटी-टोटल हिस्टोन H3 (खरगोश पॉलीक्लोनल, 1:5,000) के साथ इनक्यूबेट किया गया। एंटी-जीएफपी (छिद्रित ऊतक में समान वायरल अभिव्यक्ति के सत्यापन के लिए उपयोग किया जाता है) (खरगोश पॉलीक्लोनल, 1:1000), एंटी-एच3के27एमई3 (खरगोश पॉलीक्लोनल, 1:500) या एंटी-एक्टिन एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल, 1:60,000) रात भर में 4°C (सभी झिल्लियाँ 5% दूध या 5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन में अवरुद्ध थीं)। फिर झिल्लियों को पेरोक्सीडेज-लेबल वाले द्वितीयक एंटीबॉडी (1:15,000) के साथ ऊष्मायन किया गया-1:60,000 प्रयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर) और बैंड की कल्पना सुपरसिग्नल वेस्ट ड्यूरा सब्सट्रेट का उपयोग करके की गई थी। बैंड को एनआईएच इमेज जे सॉफ्टवेयर के साथ मात्राबद्ध किया गया था और समान लोडिंग को नियंत्रित करने के लिए H3K9me2 बैंड को या तो एक्टिन या β-ट्यूबुलिन और कुल हिस्टोन H3 में सामान्यीकृत किया गया था। बार-बार कोकीन लेने से एक्टिन के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता (अंजीर। S8) या कुल हिस्टोन 3 (अंजीर। S1) एनएसी में। इसके अलावा, HSV-G9a-GFP और HSV-G9aH1093K-GFP संक्रमण का NAc में β-ट्यूबुलिन के कुल स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (अंजीर। S8).
इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री
जैसा कि पहले बताया गया है, सिंगल या डबल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा विश्लेषण करने से पहले चूहों को क्लोरल हाइड्रेट की घातक खुराक से बेहोश किया गया और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड छिड़का गया।S6). संक्षेप में, पोस्ट-फिक्स्ड दिमागों को 30 μm पर विभाजित करने से पहले 35% सुक्रोज में रात भर कमरे के तापमान पर ऊष्मायन किया गया था (डेंड्रिटिक स्पाइन विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले दिमागों को 100% सुक्रोज की अनुपस्थिति में 30 μm वर्गों पर एक वाइब्रेटोम पर विभाजित किया गया था)। फ्री-फ्लोटिंग एनएसी अनुभागों को 1X पीबीएस से धोया गया, ब्लॉक किया गया (3% सामान्य गधा सीरम, 0.1% ट्राइटनएक्स, 1X पीबीएस) और बाद में एंटी-जीएफपी (चिकन पॉलीक्लोनल, 1:8000) और/या एंटी-जी9ए (खरगोश पॉलीक्लोनल) के साथ इनक्यूबेट किया गया। , 1:500) अवरोधक समाधान में एंटीबॉडी। डेंड्राइटिक स्पाइन के लिए विश्लेषण किए गए अनुभागों को 1:200 पर एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया था। रात भर ऊष्मायन के बाद, एनएसी अनुभागों को 3X पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 1 बार धोया गया, इसके बाद 2 घंटे के लिए 3X पीबीएस अवरुद्ध समाधान में Cy1 और/या Cy2 फ्लोरोसेंट-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया गया। आकृति विज्ञान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुभागों को रात भर कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी में ऊष्मायन किया गया। 1 मिनट के लिए डीएपीआई (1:50,000) युक्त 10X पीबीएस में अनुभागों को इनक्यूबेट करके परमाणु सह-धुंधलाकरण प्राप्त किया गया था। अनुभागों को एक बार फिर से धोया गया, इसके बाद इथेनॉल निर्जलीकरण किया गया और डीपीएक्स के साथ लगाया गया। सभी वर्गों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था।
आरएनए अलगाव और क्यूपीसीआर
द्विपक्षीय 14-गेज एनएसी पंचों को ट्राइज़ोल में समरूप बनाया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार संसाधित किया गया। RNA को RNAesy माइक्रो कॉलम से शुद्ध किया गया और स्पेक्ट्रोस्कोपी ने पुष्टि की कि RNA 260/280 और 260/230 राशन >1.8 थे। फिर बायो-रेड आईस्क्रिप्ट किट का उपयोग करके आरएनए को रिवर्स ट्रांसक्राइब किया गया। सीडीएनए को एसवाईबीआर ग्रीन का उपयोग करके क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित किया गया था। प्रत्येक प्रतिक्रिया को डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में चलाया गया और सामान्यीकरण नियंत्रण के रूप में ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डीहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच) का उपयोग करके पहले वर्णित ΔΔCt विधि का पालन करके विश्लेषण किया गया (S7)। देख पूरक तालिका S5 एमआरएनए प्राइमर अनुक्रमों के लिए।
डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण
माइक्रोएरे अध्ययन के लिए चार समूहों (प्रति समूह 3 स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति) का उपयोग किया गया, कुल 12 माइक्रोएरे। आखिरी कोकीन इंजेक्शन के 1 घंटे बाद, जानवरों का सिर तेजी से काटा गया और मस्तिष्क को निकालकर बर्फ पर रख दिया गया। एनएसी के विच्छेदन को 15-गेज सुई पंच का उपयोग करके लिया गया और आरएनए निकाले जाने तक सूखी बर्फ पर जल्दी से जमा दिया गया। प्रति प्रतिकृति चार जानवरों से द्विपक्षीय घूंसे एकत्र किए गए, प्रति समूह कुल 12 चूहे। आरएनए अलगाव, माइक्रोएरे प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण पहले वर्णित के अनुसार किया गया था (S8). संक्षेप में, जैसा कि ऊपर वर्णित है, आरएनए को अलग और शुद्ध किया गया था और एगिलेंट के बायोएनालाइजर का उपयोग करके गुणवत्ता की जांच की गई थी। यूटी साउथवेस्टर्न के माइक्रोएरे कोर द्वारा मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके इलुमिना माउसWG-6 v2.0 सरणियों में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, प्रवर्धन, लेबलिंग और संकरण किया गया। बीडस्टूडियो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे डेटा को पृष्ठभूमि से घटाया गया और मात्रात्मक रूप से सामान्यीकृत किया गया। सामान्यीकृत डेटा का विश्लेषण जीनस्प्रिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था और पी <1.3 के गैर-कड़े पी-वैल्यू कटऑफ के साथ युग्मित 0.05 गुना परिवर्तन कटऑफ के महत्व मानदंड का उपयोग करके जेनलिस्ट तैयार किए गए थे।
हम कई कारणों से इन आंकड़ों पर उच्च स्तर का विश्वास बनाए रखते हैं। सबसे पहले, सभी जानवरों को एक ही समय में, समान परिस्थितियों में संभाला, इलाज किया गया और मार दिया गया। साथ ही, सभी आरएनए और सरणी प्रसंस्करण एक ही समय में किया गया था। दूसरा, हमने तीन प्रतियों का प्रदर्शन किया और प्रति सरणी नमूने में कई जानवरों को एकत्रित किया, जिससे व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के कारण अंतर कम हो गया और सांख्यिकीय शक्ति बढ़ गई (S9). तीसरा, हमारे अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा विश्लेषण मानदंड माइक्रोएरे गुणवत्ता नियंत्रण परियोजना द्वारा अनुशंसित हैं, क्योंकि इन मानदंडों को उच्च स्तर की इंटरसाइट प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता और अंतर- और इंट्राप्लेटफ़ॉर्म प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता प्रदान करने के लिए मान्य किया गया है (S10-S11).
वायरल वैक्टर का निर्माण
वायरल वेक्टर सम्मिलन आकार की बाधाओं के कारण, वाइल्डटाइप G9a (G9a) या उत्प्रेरक रूप से मृत G9a (G9aH1093K) के लिए कोडिंग अनुक्रमों को मानव तत्काल प्रारंभिक साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर (CMV) (G1005a) के नियंत्रण में GFP व्यक्त करने वाले बाइसिस्ट्रोनिक p9+ HSV प्लास्मिड में सबक्लोन किया गया था। प्रविष्टि का आकार ~ 3.96 केबी था, जो एएवी-2 वैक्टर के लिए अधिकतम प्रविष्टि आकार से अधिक है)। IE4/5 प्रमोटर G9a अभिव्यक्ति को संचालित करता है। ईकोआरआई पाचन के बाद क्लेनो द्वारा उपचारित पीएमईआई और इकोआरआई द्वारा पचाए गए जी1005ए (पीसीडीएनए9 से) और सीआईपी उपचारित पी3.1+ के साथ ब्लंट एंड लिगेशन के माध्यम से टुकड़ों को बाइसिस्ट्रोनिक पी1005+ एचएसवी प्लास्मिड में उपक्लोन किया गया। HSV-ΔJunD-GFP के उत्पादन के लिए, EcoRI प्रतिबंध साइटों से घिरे ΔJunD का कोडिंग अनुक्रम पीसीआर द्वारा EcoRI साइट वाले प्राइमर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। फिर पीसीआर उत्पाद को पी1005+ वेक्टर की इकोआरआई साइट में जोड़ा गया। एनएसी न्यूरॉन्स में क्रे रीकॉम्बिनेज़ की स्थानीय अभिव्यक्ति वायरल-मध्यस्थ जीन डिलीवरी द्वारा एएवी वेक्टर का उपयोग करके प्राप्त की गई थी जैसा कि वर्णित है (S12). जीएफपी या जीएफपी से क्रे के एन-टर्मिनल संलयन को एक पुनः संयोजक एएवी-2 वेक्टर में उप-क्लोन किया गया था जिसमें एक स्प्लिस डोनर स्वीकर्ता अनुक्रम और पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल के साथ सीएमवी प्रमोटर शामिल था। सभी वेक्टर सम्मिलन की पुष्टि डाइडॉक्सी-अनुक्रमण द्वारा की गई थी। जैसा कि पहले वर्णित है, ट्रिपल-ट्रांसफ़ेक्शन, सहायक-मुक्त विधि का उपयोग करके वायरल वैक्टर का उत्पादन किया गया था (S13). शुद्ध किए गए वायरस को -80°C पर संग्रहीत किया गया था। वायरल गुणवत्ता का मूल्यांकन HEK293 कोशिकाओं में मूल्यांकन किए गए संक्रामक टिटर द्वारा किया गया था। AAV-ΔFosB-GFP वायरस इसी तरह तैयार किए गए थे। HSV-Cre के लिए, Cre अभिव्यक्ति को कम करने और न्यूरोनल विषाक्तता को रोकने के लिए, IE4/5 प्रमोटर के विपरीत, Cre अभिव्यक्ति को IRES प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था (देखें) S14 वायरल निर्माण के लिए)। सभी मामलों में, वायरल ओवरएक्सप्रेशन दोनों को मान्य किया गया था इन विट्रो में और विवो में क्यूपीसीआर के माध्यम से, और सर्जरी के बाद एनएसी-प्रतिबंधित अभिव्यक्ति प्रदर्शित करने के लिए वायरस की इम्यूनोहिस्टोकेमिकली पुष्टि की गई।
Stereotaxic surgery
केटामाइन (100 मिलीग्राम/किग्रा)/ज़ाइलाज़िन (10 मिलीग्राम/किग्रा) एनेस्थीसिया के तहत, चूहों को एक छोटे-जानवर स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में रखा गया था, और कपाल की सतह को उजागर किया गया था। तैंतीस गेज सिरिंज सुइयों का उपयोग 0.5 μl/मिनट की दर से 10° कोण (एपी + 1.6; एमएल + 1.5; डीवी - 4.4) पर एनएसी में 0.1 μl वायरस को द्विपक्षीय रूप से डालने के लिए किया गया था। एचएसवी इंजेक्शन प्राप्त करने वाले जानवरों को सर्जरी के बाद 2 दिनों तक ठीक होने की अनुमति दी गई थी, जबकि एएवी वैक्टर प्राप्त करने वाले व्यवहार परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों को प्लेस कंडीशनिंग के अधीन होने से पहले 20 दिनों तक ठीक होने की अनुमति दी गई थी। ये समय दो वैक्टरों के लिए अधिकतम वायरल-मध्यस्थता ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की अवधि के अनुरूप हैं। BIX01294 इन्फ्यूजन के लिए, दो मिनी पंपों में से प्रत्येक को माउस की पीठ पर चमड़े के नीचे स्थित किया गया था। एनएसी के ऊपर दो छोटे कपाल छिद्रों को ड्रिल करके, और ब्रेग्मा (एपी + 1.5; एमएल + 1.0; डीवी - 5.4) से कैनुला की डिलीवरी द्वारा कैनुला प्लेसमेंट हासिल किया गया था। जैसा कि नीचे बताया गया है, चूहों को कोकीन की कंडीशनिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले 4 से 5 दिनों के लिए सर्जरी से उबरने की अनुमति दी गई थी।
वातानुकूलित स्थान वरीयता
स्थान कंडीशनिंग प्रक्रिया निम्नलिखित संशोधनों के साथ पहले वर्णित अनुसार आयोजित की गई थी (S7). संक्षेप में, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP या HSV-GFP के इंट्रा-एनएसी इन्फ्यूजन के 1093 दिन बाद, चूहों को कंडीशनिंग कक्षों में रखा गया, जिसमें तीन अलग-अलग वातावरण शामिल हैं। जिन चूहों ने दोनों कंडीशनिंग कक्षों में से किसी एक के लिए महत्वपूर्ण प्राथमिकता दिखाई, उन्हें अध्ययन से बाहर रखा गया (सभी जानवरों का <10%)। कंडीशनिंग समूहों को तब किसी भी चैम्बर पूर्वाग्रह के लिए समायोजित करने के लिए संतुलित किया गया था जो अभी भी मौजूद हो सकता है। बाद के दिनों में, जानवरों को सलाइन का इंजेक्शन लगाया गया और दोपहर में 30 मिनट के लिए एक कक्ष में सीमित रखा गया और फिर कोकीन (10 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी) का इंजेक्शन लगाया गया और शाम को 30 दिनों (दो) के लिए 2 मिनट के लिए दूसरे कक्ष में सीमित रखा गया सलाइन और दो कोकीन की जोड़ी)। परीक्षण के दिन, चूहों को 20 मिनट के लिए उपचार के बिना उपकरण में वापस रखा गया और मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया कि वे किस पक्ष को पसंद करते हैं। दवा उपचार की प्रभावशीलता सुनिश्चित करने के लिए कोकीन-युग्मित कक्षों में बीम ब्रेक के माध्यम से कोकीन के प्रति लोकोमोटर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया था। AAV और BIX01294 CPP प्रयोगों के लिए, थोड़ा संशोधित प्रोटोकॉल नियोजित किया गया था। जानवरों को फिर से सेलाइन या कोकीन (10 मिलीग्राम/किग्रा, आईपी) का इंजेक्शन दिया गया और 30 मिनट के सत्र के लिए विशिष्ट कक्षों तक सीमित रखा गया, लेकिन इसके बजाय उन्हें 4 दिनों के लिए दिन में केवल एक बार कंडीशन किया गया, इसके बाद 5वें दिन परीक्षण किया गया (जानवरों को कंडीशन किया गया) शाम को और कंडीशनिंग उपचार बारी-बारी से किए गए)। सभी समूहों के लिए, सलाइन के जवाब में बेसलाइन हरकत का मूल्यांकन यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि हरकत वायरल या अवरोधक उपचार से प्रभावित नहीं थी।
अंतःशिरा कोकीन स्व-प्रशासन
प्रयोग की शुरुआत में 230-250 ग्राम वजन वाले नर किशोर लॉन्ग-इवांस चूहे प्राप्त किए गए। उन्हें 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र (सुबह 9:00 बजे रोशनी बंद) पर आर्द्रता और तापमान-नियंत्रित वातावरण में रखा गया था। बिना तैयारी के भोजन और पानी तक पहुंच. चूहों को उनके नए वातावरण में अभ्यस्त होने की अनुमति दी गई और प्रयोग शुरू होने से पहले 1 सप्ताह तक प्रतिदिन उनकी देखभाल की गई। सभी प्रक्रियाएं प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की गाइड के अनुसार आयोजित की गईं और माउंट सिनाई की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित की गईं। लोकोमोटर व्यवहार को मापने के लिए स्व-प्रशासन उपकरण को इन्फ्रारेड बीम से सुसज्जित किया गया था। स्व-प्रशासन पहले वर्णित अनुसार किया गया था (S15-S16) आइसोफ्लुरेन (2.4-2.7%) एनेस्थीसिया के तहत दाहिने गले की नस में प्रत्यारोपित कैथेटर के साथ। कैथेटर को 0.1 यू हेपरिन और एम्पीसिलीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) युक्त 50 मिलीलीटर खारा समाधान के साथ प्रवाहित किया गया था। सर्जरी से ठीक होने के एक सप्ताह बाद, प्रकाश/अंधेरे चक्र के अंधेरे चरण के दौरान स्व-प्रशासन प्रशिक्षण शुरू हुआ। जानवरों को एक निश्चित अनुपात-3 (एफआर0.75) सुदृढीकरण कार्यक्रम के तहत कोकीन (1 मिलीग्राम/किग्रा/जलसेक) तक प्रतिदिन 1 घंटे की पहुंच की अनुमति दी गई थी, जहां 1 सक्रिय लीवर प्रेस के परिणामस्वरूप दवा का एक ही जलसेक होता था। चूहों ने 6 दिनों के बाद अपने कोकीन सेवन को स्थिर कर दिया (<लगातार 15 दिनों में प्रतिक्रिया दर में 3% भिन्नता, कम से कम 75% ने प्रबलित लीवर पर प्रतिक्रिया दी)। अंतिम स्व-प्रशासन सत्र के 24 घंटे बाद, चूहों को जल्दी से सिर काट दिया गया, मस्तिष्क को तेजी से हटा दिया गया और आरएनए अलगाव और क्यूपीसीआर के लिए संसाधित किया गया।
क्रोमैटिन इम्यूनोप्रूवेरिएशन (चिप)
ताजा एनएसी पंचों को फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉस-लिंक किया गया था और चिप के लिए तैयार किया गया था जैसा कि पहले बताया गया है (S17-S18) मामूली संशोधनों के साथ। संक्षेप में, प्रति जानवर 4 14-गेज एनएसी पंच (प्रति नमूना 5 जानवर एकत्र किए गए) एकत्र किए गए, 1% फॉर्मेल्डिहाइड के साथ क्रॉस-लिंक किया गया और -2 डिग्री सेल्सियस पर जमने से पहले 80 एम ग्लाइसीन के साथ बुझाया गया। नमूना सोनिकेशन से 1 दिन पहले, भेड़ विरोधी खरगोश/माउस (वर्षा एंटीबॉडी के आधार पर) आईजीजी चुंबकीय मोतियों को उपयुक्त चुंबकीय मोतियों को एंटी-जी9ए (खरगोश पॉलीक्लोनल चिप ग्रेड) या एंटी-एच3के9मी2 (माउस मोनोक्लोनल चिप ग्रेड) के साथ इनक्यूबेट करके तैयार किया गया था। ब्लॉक समाधान में निरंतर घुमाव के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी। ऊतक सोनिकेशन और क्रोमैटिन कतरनी को पहले वर्णित अनुसार किया गया था (S17). सोनिकेशन के बाद, क्रोमेटिन की समान सांद्रता को नई ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया और अंतिम उत्पादों का ~ 5% 'इनपुट' नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए सहेजा गया। पूरी तरह से धोने और संयुग्मित मनका/एंटीबॉडी मिश्रण को फिर से निलंबित करने के बाद, प्रत्येक क्रोमैटिन नमूने में समान मात्रा में एंटीबॉडी/मनका मिश्रण (~ 7.5 μg एंटीबॉडी/नमूना) जोड़ा गया और 16 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर रोटेशन के तहत ~ 4 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया। पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके डीएनए शुद्धिकरण से पहले नमूनों को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर धोया गया और रिवर्स क्रॉस-लिंक किया गया। डीएनए शुद्धिकरण के बाद, नमूनों को क्यूपीसीआर के अधीन किया गया और उन्हें उनके उपयुक्त 'इनपुट' नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया गया, जैसा कि पहले बताया गया है (S17). सिग्नल प्रवर्धन के उचित संवर्धन को नियंत्रित करने के लिए माउस पॉलीक्लोनल एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी का उपयोग करके सामान्य माउस आईजीजी इम्युनोप्रेसीपिटेशन भी किया गया। एडेनिन फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ (एपीआरटी) का उपयोग कोकीन और ΔFosB ओवरएक्प्रेशन प्रयोगों के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। देखना पूरक तालिका S5 प्रमोटर प्राइमर अनुक्रमों के लिए।
डेंड्राइटिक स्पाइन विश्लेषण
विवो में न्यूरोनल आकृति विज्ञान के नियमन में G9a की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, हमने निम्नलिखित संशोधनों के साथ पहले वर्णित विधियों का उपयोग किया (S1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (सभी वायरस वाइल्डटाइप C57Bl/6J चूहों में उपयोग किए गए थे), या HSV-Cre-GFP (G9a में प्रयुक्त) के इंजेक्शन के तीन दिन बादfl/fl चूहों), जब वायरल अभिव्यक्ति अधिकतम थी, चूहों को सुगंधित किया गया, मस्तिष्क को क्रायोप्रोटेक्ट किया गया और बाद में एक वाइब्रेटोम पर 100 माइक्रोन पर विभाजित किया गया। जैसा कि ऊपर वर्णित है, अनुभागों को जीएफपी के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रतिरक्षित किया गया था (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री देखें)। रीढ़ की संख्या पर G9a ओवरएक्प्रेशन और नॉकआउट के प्रभावों के साथ-साथ ΔJunD ओवरएक्प्रेशन के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हमने प्रति न्यूरॉन लगभग 1-2 न्यूराइट्स पर स्पाइन की संख्या को मापा, जो GFP-व्यक्त NAc माध्यम से कम से कम 299 μm माध्यमिक डेंड्राइट के बराबर है। स्पाइनी न्यूरॉन्स (एमएसएन)। यह देखते हुए कि एमएसएन एनएसी में अन्य न्यूरोनल आबादी से रूपात्मक रूप से भिन्न हैं, साथ ही पिछली रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि एचएसवी मुख्य रूप से इस मस्तिष्क क्षेत्र में डीएआरपीपी-32 व्यक्त न्यूरॉन्स को संक्रमित करता है (S19), हमें विश्वास है कि इन अध्ययनों में एमएसएन का विशेष रूप से मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक जानवर के लिए, हमने प्रति समूह (6 समूह) 8-3 जानवरों में ~4-7 न्यूरॉन्स की जांच की, जिसके बाद सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रत्येक जानवर के लिए एक औसत मूल्य प्राप्त किया गया। NAc स्पाइन घनत्व पर ΔFosB ओवरएक्प्रेशन के प्रभावों की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोग ऊपर वर्णित के समान ही किए गए थे, इस अपवाद के साथ कि AAV वैक्टर का उपयोग विस्तारित अवधि (8 सप्ताह) के लिए GFP या ΔFosB-GFP को व्यक्त करने के लिए किया गया था। सभी एचएसवी छवियों को 100X तेल-विसर्जन उद्देश्य के साथ एक कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किया गया था (एएवी छवियां 63X तेल-विसर्जन उद्देश्य के साथ कैप्चर की गई थीं)। छवियाँ 1 मनमानी इकाई और 1024 × 1024 फ़्रेम आकार पर पिनहोल सेट के साथ प्राप्त की गईं। एनआईएच इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेंड्रिटिक लंबाई को मापा गया था, और रीढ़ की हड्डी की संख्या को प्राथमिक प्रयोगकर्ता द्वारा अंधाधुंध गिना गया था, क्योंकि प्रयोगात्मक स्कैनिंग से पहले स्लाइड को कोड किया गया था। डेंड्राइट के प्रति 10 माइक्रोन स्पाइन की औसत संख्या की गणना की गई।
सांख्यिकीय विश्लेषण
दो से अधिक समूहों के साथ वातानुकूलित स्थान वरीयता और डेंड्राइटिक रीढ़ विश्लेषण के महत्व को निर्धारित करने के लिए एक- और दो-तरफ़ा एनोवा का प्रदर्शन किया गया। छात्र के टी परीक्षणों का उपयोग क्यूपीसीआर, वेस्टर्न ब्लॉटिंग, डेंड्राइटिक स्पाइन विश्लेषण सहित अन्य तुलनाओं के लिए किया गया, जिसमें एचएसवी-जीएफपी की तुलना जी9ए में एचएसवी-सीआरई से की गई।fl/fl चूहे, माइक्रोएरे विश्लेषण (ऊपर देखें) और क्रोमैटिन इम्युनोप्रेसेपिटेशन प्रयोग। दवा उपचार और वायरस के महत्वपूर्ण मुख्य प्रभावों की पुष्टि के साथ ΔFosB ओवरएक्प्रेशन के बाद डेंड्राइटिक रीढ़ की घनत्व के दो-तरफा एनोवा विश्लेषण के बाद नियोजित छात्र के टी-परीक्षणों का उपयोग किया गया था। चित्र किंवदंतियों में शामिल सभी मान माध्य ± SEM (*p ≤ 0.05; **p < 0.001) दर्शाते हैं। के लिए विस्तृत सांख्यिकीय विश्लेषण अंजीर। 1-3 मुख्य पाठ में दिए गए हैं: सांख्यिकी सहित विस्तृत चित्र किंवदंतियाँ।
फुटनोट
मैं प्रमाणित करता हूं कि पांडुलिपि में शामिल कोई भी सामग्री हकदार नहीं है कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी में हिस्टोन मिथाइलट्रांसफेरेज़ G9a की आवश्यक भूमिका इंटरनेट सहित अन्यत्र पहले ही प्रकाशित हो चुके हैं या विचाराधीन हैं।
जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी कार्य टेक्सास यूनिवर्सिटी साउथवेस्टर्न मेडिकल सेंटर और माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन दोनों में संस्थागत और आईएसीयूसी दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किए गए थे।
संदर्भ और नोट्स
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