Diabetologia। 2017; 60 (8): 1502-1511।
ऑनलाइन 2017 मई 20 प्रकाशित। डोई: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1सार
उद्देश्य / परिकल्पना
आहार वसा के अधिक सेवन से मनुष्यों और कृन्तकों में मोटापा बढ़ता है। मनुष्यों और कृन्तकों में हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क की इनाम प्रणाली की शिथिलता के संदर्भ में वसा की लत शराब, निकोटीन और नशीले पदार्थों की लत के साथ एक आम तंत्र साझा करता है। यह रेखांकित किया गया है कि एक उच्च वसा वाला आहार (एचएफडी) स्ट्रिपटम में सिग्नलिंग डोपामाइन डीएक्सएनयूएमएक्स रिसेप्टर (डीएक्सएनयूएमएक्सआर) को आकर्षित करता है, मस्तिष्क इनाम प्रणाली का एक निर्णायक नियामक है, जिसके परिणामस्वरूप हेडोनिक ओवरटिंग होती है। हमने पहले बताया था कि ब्राउन राइस-विशिष्ट बायोएक्टिव घटक or-oryzanol ने हाइपोथैलेमिक नियंत्रण के माध्यम से एक HFD के लिए प्राथमिकता दी है। इसलिए हमने इस संभावना का पता लगाया कि γ-oryzanol चूहों में मस्तिष्क इनाम प्रणाली के कामकाज को संशोधित करेगा।
तरीके
पुरुष C57BL / 6J चूहों को एक एचएफडी खिलाया जाता है, मौखिक रूप से γ-oryzanol के साथ व्यवहार किया जाता था, और D2R सिग्नलिंग में शामिल अणुओं के स्ट्राइटल स्तर का मूल्यांकन किया गया था। D2R प्रमोटर के डीएनए मेथिलिकेशन पर h-oryzanol के प्रभाव और आहार वसा के लिए वरीयताओं में बाद में बदलाव की जांच की गई। इसके अलावा, 5-aza-2 de-deoxycytidine के प्रभाव, डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ (DNMTs) के एक प्रबल अवरोधक, भोजन की प्राथमिकता, D2RRing और स्ट्रिएटम में DNMTs के स्तर की जांच की गई। DNMTs की गतिविधि पर γ-oryzanol के निरोधात्मक प्रभाव को विट्रो में एंजाइमिक रूप से मूल्यांकन किया गया था।
परिणाम
चूहों से स्ट्रेटम में एक HFD खिलाया जाता है, D2R के प्रमोटर क्षेत्र के डीएनए मिथाइलेशन में वृद्धि के माध्यम से D2Rs का उत्पादन कम हो गया था। -Oryzanol के मौखिक प्रशासन ने DNMTs की अभिव्यक्ति और गतिविधि को कम कर दिया, जिससे स्ट्रिएटम में D2Rs के स्तर को बहाल किया गया। 5-aza-2ition-deoxycytidine द्वारा DNMTs के औषधीय निषेध ने भी आहार वसा के लिए प्राथमिकता को बढ़ाया। इन निष्कर्षों के अनुरूप, इन विट्रो assays में एंजाइमैटिक ने प्रदर्शित किया कि।-Oryzanol DNMTs की गतिविधि को बाधित करता है।
निष्कर्ष / व्याख्या
हमने प्रदर्शित किया कि ates-oryzanol चूहों के स्ट्रेटम में D2R के प्रमोटर क्षेत्र के HFD- प्रेरित डीएनए हाइपरमेथिलेशन को अमलीजामा पहनाता है। हमारे प्रायोगिक प्रतिमान par-oryzanol को एक उपन्यास एंटीजेनिक न्यूनाधिक होने की अलग-अलग संपत्ति के साथ एक आशाजनक एंटीबायोटिक्स पदार्थ के रूप में उजागर करता है।
इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री
इस लेख का ऑनलाइन संस्करण (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) में सहकर्मी-समीक्षा की गई है, लेकिन अनुपलब्ध पूरक सामग्री है, जो अधिकृत उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है।
परिचय
मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों के शेयरों में कम से कम, आंशिक रूप से, शराब, निकोटीन और नशीले पदार्थों की लत वाले सामान्य तंत्र [1]। भूख के हाइपोथैलेमिक और हार्मोनल विनियमन के साथ, मस्तिष्क इनाम प्रणाली, विशेष रूप से डोपामाइन रिसेप्टर सिग्नलिंग में, व्यसनी या हेडोनिक खिला व्यवहार से निकटता से संबंधित है [2]। चूहों में एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि lentivirus की मध्यस्थता वाले छोटे हेयरपिन द्वारा स्ट्रिपेटल डोपामाइन D2 रिसेप्टर (D2R) की खराबी आरएनए को तेजी से प्रेरित लत की तरह इनाम की कमी और मजबूरी जैसे भोजन की मांग में हस्तक्षेप करती है [3]। डीएक्सएनयूएमएक्सआर घनत्व कम होने के कारण, मोटे मनुष्यों और कृन्तकों में दुबला नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में पृष्ठीय स्ट्रैटम भोजन के प्रति कम उत्तरदायी है [3-5]। इस धारणा के अनुसार, द Taqआईए एलील ऑफ द ANKK1 जीन लोकस (XDUMX युक्त DRD2 / ankyrin दोहराने और kinase डोमेन एन्कोडिंग), जो स्ट्राइटल D1R उत्पादन को घटाता है, मनुष्यों में एक मोटे फेनोटाइप के साथ जुड़ा हुआ है ...6], जबकि बैरिएट्रिक सर्जरी के बाद वजन कम होने का प्रभाव एलीवेटेड स्ट्राइटल D2R घनत्व से जुड़ा है [7]। ये डेटा मोटापे के इलाज के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में स्ट्राइटल D2R के महत्व का सुझाव देते हैं। हालांकि, कुछ दवाओं को विकसित किया गया था जो मस्तिष्क इनाम प्रणाली पर काम करते थे, गंभीर मनोरोग समस्याओं सहित काफी प्रतिकूल प्रभाव डालते थे, जिसके परिणामस्वरूप क्लीनिक से उनकी वापसी हुई थी [8].
एपिजेनेटिक संशोधन न केवल विकास और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं, बल्कि इसलिए भी हैं क्योंकि वे पर्यावरणीय परिवर्तनों के परिणामस्वरूप उत्पन्न होते हैं, जिसमें आहार और जीवन शैली शामिल है [9]। डीएनए मिथाइलेशन जीन अभिव्यक्ति की स्थिरता के लिए एक प्रमुख एपिजेनेटिक घटना है [9]। चूहों में, एक उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) के संपर्क में आने से संतानों में केंद्रीय इनाम प्रणाली के भीतर डीएनए मेथिलिकरण हो जाता है, जिससे पिल्स द्वारा एचएफडी की अधिकता होती है [10]। विशेष रूप से, डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ (DNMTs) खिला व्यवहार और शारीरिक गतिविधि दोनों के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं [10, 11], यह सुझाव देते हुए कि डीएनएमटी मोटापे-मधुमेह सिंड्रोम की चिकित्सा के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों का वादा कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, कैफिक एसिड और एपिगैलोकैटेचिन सहित कुछ प्राकृतिक खाद्य-व्युत्पन्न पदार्थ, DNMT अवरोधकों के रूप में कार्य करने के लिए जाने जाते हैं [12, 13].
हमने हाल ही में दिखाया है कि बायोएक्टिव, ब्राउन राइस-विशिष्ट घटक or-oryzanol, फेरुलिक एसिड एस्टर और कई फाइटोस्टेरॉल का मिश्रण है, जो हाइपोथैलेमिक एंडोमैस्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव में कमी के माध्यम से आहार वसा की वरीयता को दर्शाता है [14]। चूहों और खरगोशों में, मौखिक रूप से प्रशासित and-oryzanol आंत से तेजी से अवशोषित हो गया और मुख्य रूप से मस्तिष्क में वितरित किया गया। [15, 16]। इन निष्कर्षों को एक साथ लेते हुए, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर काम करने वाले प्राकृतिक खाद्य-व्युत्पन्न उत्पाद मोटापे में सुरक्षित रूप से बिगड़ा हुआ भोजन व्यवहार करने के लिए एक विकल्प हो सकते हैं। इस संदर्भ में, हमने परिकल्पना का परीक्षण किया कि or-oryzanol मस्तिष्क इनाम प्रणाली में डीएनए मेथिलिकरण स्थिति को बदल देगा, जिसके परिणामस्वरूप चूहों में एचएफडी के लिए वरीयता का क्षीणन होगा।
तरीके
जानवरों
चार्ल्स रिवर लैबोरेट्रीज जापान (कानागावा, जापान) से प्राप्त सात-सप्ताह के पुरुष C57BL / 6J चूहों को 3 ° / 4 प्रकाश / से कम 24 ° C पर विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था। अंधेरा चक्र। Acclimatization के एक सप्ताह के बाद, 12-सप्ताह के चूहों को वजन से मिलान किया गया और प्रत्येक प्रयोग से गुजरने के लिए दो या तीन समूहों में विभाजित किया गया। चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति थी। सभी पशु प्रयोगों को रयूकस विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग आचार समिति (नं। 12, 8 और 5352) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
UM-oryzanol और 5-aza-2γ-deoxycytidine का प्रशासन
एचएफडी के लिए वरीयता का मूल्यांकन करने के लिए, γ-oryzanol (वाको प्योर केमिकल इंडस्ट्रीज, ओसाका, जापान) को खाद्य पसंद परीक्षण के दौरान एक्सएएनयूएमएक्स-सप्ताह पुराने चूहों के लिए प्रशासित किया गया था जैसा कि पहले बताया गया था।14, 17]। अन्य प्रयोगों के लिए, एक HFD (D12079B; रिसर्च डाइट्स, न्यू ब्रंसविक, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) जिसमें 0.4% γ-oryzanol युक्त है को छर्रों के रूप में निर्मित किया गया था। आहार के घटकों को इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री (ईएसएम) तालिका में दिखाया गया है 1। 12 सप्ताह के भोजन के बाद, ऊतक को स्ट्रिएटम और हाइपोथैलेमस से एकत्र किया गया था। चूहों के औसत भोजन सेवन से अनुमानित daily-oryzanol का दैनिक सेवन लगभग 320 μg / g शरीर का वजन था। पहले वर्णित के अनुसार d-oryzanol की खुराक निर्धारित की गई थी।14]। 5-आज़ा-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) अंतःक्षिप्त रूप से इंजेक्शन (0.25 μg / g शरीर का वजन) 12 सप्ताह के लिए एक सप्ताह में तीन बार [18].
आहार वसा के लिए वरीयता का अनुमान
आहार वसा के लिए वरीयताओं का मूल्यांकन करने के लिए, खाद्य परीक्षणों ने चाउ और एचएफडी (D12450B और D12451; अनुसंधान आहार) के बीच एक विकल्प प्रदान किया, जैसा कि पहले वर्णित है;14]। आहार के घटकों को ईएसएम तालिका में दिखाया गया है 1। संक्षेप में, चूहों को चाउ और एचएफडी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति थी। चाउ और एचएफडी के इंटेक को साप्ताहिक रूप से मापा गया और आहार वसा के लिए वरीयता में बदलाव के लिए विश्लेषण किया गया। एचएफडी वरीयता की गणना सूत्र के अनुसार की गई थी: एचएफडी वरीयता = [(एचएफडी सेवन / कुल भोजन का सेवन) × १००]।
डीएनए मिथाइलेशन के लिए बिसुल्फाइट अनुक्रमण
डीएनए को एक DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। डीएनए समाधान को ताजा तैयार 3 मोल / एल NaOH के साथ मिलाया गया, 37 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया और 5.3 mol / l यूरिया, 1.7 mol / l सोडियम बाइसुलफाइट और 4.9 mmol / l हाइड्रोक्विनोन मिलाया गया। समाधान 15 डिग्री के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 30 चक्रों के अधीन था और 50 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन था। [19]। द्विसूफ़ाइट-उपचारित डीएनए को MinElute PCR शोधन किट (QIAGEN) का उपयोग करके शुद्ध किया गया था और प्रवर्धित क्षेत्र के CpG स्थल के चारों ओर एक KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR किट (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) और प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित क्षेत्र के CpG साइट के लिए प्रवर्धित किया गया था। । प्राइमर सीक्वेंस इस प्रकार थे: फॉरवर्ड प्राइमर, 2 GTA-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-5 were; रिवर्स प्राइमर, 3′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-5 N। इसके बाद, एडेप्टर सीक्वेंस को जोड़ा गया और Agencourt AMPure XP (बेकमैन कल्टर, ब्रे, सीए, यूएसए) का उपयोग करके साफ किया गया। तब नमूने को निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अनुक्रमण के लिए जीएस जूनियर (रोश डायग्नोस्टिक्स, टोक्यो, जापान) पर रखा गया और लोड किया गया। मेथिलिकेशन स्तर को सभी साइटोसिन अवशेषों में मिथाइलेटेड साइटोसिन के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था।
DNMT गतिविधि परख
DNMT एंजाइमैटिक गतिविधि परख निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक एपिक्विक डीएनए मिथाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधि / निषेध परख किट (एपिगेंटेक ग्रुप, ब्रुकलिन, एनवाई, यूएसए) और EPIgeneous Methyltransferase परख किट (सिस्बियो जापान, चिबा, जापान) का उपयोग करके किया गया था।
डीएनए मेथिलिकेशन पर प्रत्येक यौगिक की निरोधात्मक गतिविधि का आकलन करने के लिए S-एडेनोसिल-एल-होमोसिस्टीन (एसएएच) प्रत्येक यौगिक की उपस्थिति में मापा गया था (स्क्रीनिंग assays के लिए 20 μmol / l), S-adenosyl मेथियोनीन (एसएएम; 10 μmol / l) और DNMT सब्सट्रेट (4 एनजी / μl) 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए। माइकलिस-मेन्टेन कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए, DNMT1 (20 μmol / l) को zan-oryzanol, SAM (5 μmol / l) और 37 मिनट के लिए 90 ° C पर पॉली dI-dC की संकेन्द्रित सांद्रता के साथ लगाया गया। DNMT3a (100 μmol / l) और DNMT3b (100 μmol / l) को incub-oryzanol, SAM (5 μmol / l) और 37 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर पाली dG - डीसी की इंगित एकाग्रता के साथ लगाया गया। Assays चौगुनी में प्रदर्शन किया गया। निकाली गई प्रोटीन (0.75 मिलीग्राम / एमएल) एसएएम (5 μmol / l), पाली dI-dC (5 μg / ml), और poly dG · dC (5 μg / ml) के साथ 40 ° C पर 120 min और SAH गठन मापा गया था।
एस्ट्रोजेन-संबंधित रिसेप्टर-ass गतिविधि परख
एस्ट्रोजन-संबंधित रिसेप्टर-γ (ERRed) पर γ-oryzanol की संभावित विरोधी गतिविधि का आकलन निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ह्यूमन एस्ट्रोजन-संबंधित रिसेप्टर गामा रिपोर्टर परख प्रणाली (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप में, गैर-मानव स्तनधारी रिपोर्टर कोशिकाओं ने संवैधानिक रूप से सक्रिय ERR exposed को व्यक्त करते हुए प्रत्येक यौगिक के संकेतित सांद्रता को 24 घंटे के लिए तीन प्रतियों में उजागर किया।
पश्चिमी सोख्ता
यह पहले वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था [20] D2R (1: 500, खरगोश), डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT; 1: 500, खरगोश), टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (TH; 1: 1000, खरगोश) (AB5084P, AB1591P और AB152, मर्क मिलिपोर, बिलीरिका, MA,) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ। यूएसए), सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन के एक्टिवेटर 3α (STAT3α; 1: 1000, खरगोश), DNMT1 (1: 1000, खरगोश), DNMT3a (1: 1000, खरगोश) (8768, 5032 और 3598; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी); टोक्यो, जापान), DNMT3b (1 μg / ml, खरगोश), ERRγ (1: 1000, खरगोश) और bit-actin (1: 10,000, माउस) (ab16049, ab128930 और ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA)
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
पहले वर्णित के रूप में जीन अभिव्यक्ति की जांच की गई थी [14]। mRNA के स्तर को सामान्य किया गया Rn18s (18S rRNA)। मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर सेट को ईएसएम तालिका में संक्षेपित किया गया है 2.
सांख्यिकीय विश्लेषण
डेटा को माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है। एक-तरफ़ा एनोवा और दोहराए जाने वाले उपायों एनोवा द्वारा कई तुलना परीक्षणों (बोनफेरोनी-डन विधि) का उपयोग किया गया था, जहां लागू किया गया था। विद्यार्थी का t परीक्षण का उपयोग दो समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता था p <0.05।
परिणाम
5-aza-dC द्वारा DNMTs के औषधीय निषेध ने चूहों में आहार वसा के लिए प्राथमिकता दी
चूहों में एचएफडी खिलाया, स्ट्रिएटम में D2R के प्रमोटर क्षेत्र में डीएनए मेथिलिकरण चूहों की तुलना में एक चाउ डाइट (अंजीर) खिलाया गया था। (Fig.1a) .1ए)। दूसरी ओर, D2R के प्रमोटर क्षेत्र में हाइपोथैलेमिक डीएनए मिथाइलेशन जाहिरा तौर पर एक चाउ आहार के तहत स्ट्रैटम से अधिक था (p <0.01) (चित्र) (Fig.1a, 1ए, एफ) और एचएफडी (छवि) द्वारा परिवर्तित नहीं किया गया था। (Fig.1f) .1च)। चूहों में एचएफडी खिलाया, स्ट्रिएटम में D2R के प्रमोटर क्षेत्र में संवर्धित डीएनए मेथिलेशन 5-aza-dC, एक शक्तिशाली DNMT अवरोध करनेवाला (अंजीर) के साथ उपचार द्वारा सामान्य किया गया था। (Fig.1a) .1ए)। इसके विपरीत, हाइपोथैलेमस में D2R के प्रमोटर क्षेत्र में डीएनए मेथिलिकरण को 5-aza-dC (अंजीर) के साथ उपचार द्वारा महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदला गया था। (Fig.1f) .1च)। 20 सप्ताह के पुरुष चूहों की स्ट्रेटम में 12 सप्ताह के लिए एचएफडी खिलाया जाता है, डी 2 आर के एमआरएनए और प्रोटीन का स्तर काफी कम हो गया (छवि। (Fig.1b, 1बी, के, एल)। इसके विपरीत, डोपामाइन D1 रिसेप्टर्स के स्तर (D1Rs, द्वारा एन्कोड किया गया Drd1), जो adenylyl cyclase और cAMP- मध्यस्थता इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग पर D2Rs के विपरीत तरीके से कार्य करता है, अपरिवर्तित थे (छवि। (Fig.1c) .1सी)। इसके अलावा, D2R सिग्नलिंग से संबंधित अन्य अणुओं के स्तरों में कोई बदलाव नहीं हुआ, जैसे कि mRNA और / या प्रोटीन स्तर (चित्र) में TH और DAT। (Fig.1d, 1डी, ई, के, एम)। दूसरी ओर, हाइपोथैलेमस में कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं देखे गए, जिनमें D2R (Fig) भी शामिल है। (Fig.1g-एम) .1जी एम)। विशेष रूप से, हाइपोथेलेमस में D2R और TH के प्रोटीन स्तर स्ट्रिएटम (अंजीर) की तुलना में बहुत कम थे। (Fig.1l, 1एल, एम), संभवतः हाइपोथैलेमस की तुलना में मस्तिष्क इनाम प्रणाली में डोपामाइन रिसेप्टर संकेतन के सापेक्ष महत्व को दर्शाता है।
यह जांचने के लिए कि क्या डीएक्सएनयूएमएक्सआर के प्रमोटर क्षेत्र में डीएनए मेथिलिकरण आहार वसा के लिए प्राथमिकता को बदल देगा, एक्सएनयूएमएक्स-एजा-डीसी-इलाज चूहों के खिला व्यवहार का विश्लेषण किया गया था। उम्मीद के मुताबिक, एक्सएनएक्सएक्स-एजा-डीसी ने एचएफडी-फेड चूहों (अंजीर) के स्ट्रिएटम में डीएक्सएनयूएमएक्सआर के लिए एमआरएनए और प्रोटीन का स्तर काफी बढ़ा दिया। (Fig.1b, 1बी, के, एल)। दूसरी ओर, के स्तरों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा Drd1, Th और Slc6a3 स्ट्रैटम में, या के स्तर पर (एन्कोडिंग डीएटी) Drd2, Drd1, गु और Slc6a3 हाइपोथैलेमस में (अंजीर। (Fig.1c-ए, 1सी-ई, जी-एम)। जबकि वाहन-उपचारित चूहों ने एचएफडी को प्राथमिकता दी, एचएफडी के लिए प्राथमिकता एक्सएनयूएमएक्स-एजे-डीसी-उपचारित चूहों (वाहन-उपचार वाले चूहों के लिए मानों का एक्सएनयूएमएक्स%) में काफी कमी आई थी। (Fig.1n) .1एन)। नतीजतन, एक्सएनयूएमएक्स-एजा-डीसी के साथ उपचार ने शरीर के वजन (छवि) में लाभ कम कर दिया। (Fig.11ओ)।
or-ओरजेनॉल एचएफडी-फेड चूहों की स्ट्रेटम में डीएनएमटी के स्तर को कम करता है
जैसा कि हमने पहले बताया था [14], नर चूहों को g-oryzanol के मौखिक प्रशासन ने गैवाज को काफी हद तक वाहन-उपचारित चूहों के लिए HFD (93% मानों) के लिए वरीयता दी है। (Fig.2a), 2ए), जिसके परिणामस्वरूप शरीर के वजन बढ़ने का एक स्पष्ट क्षीणन (अंजीर) है। (Fig.2b) .2ख)। इसलिए हमने स्ट्राइक में D2Rs के एपिगेनेटिक मॉड्यूलेशन पर γ-oryzanol के संभावित प्रभाव का पता लगाया।
स्तनधारियों में, तीन प्रमुख DNMT- DNMT1, 3a और XNXXb हैं। DNMT3 डीएनए मिथाइलेशन बनाए रखने के लिए कार्य करता है, जबकि DNMT1a और 3b डी नोवो डीएनए मिथाइलेशन को सुविधाजनक बनाने में एक भूमिका निभाते हैं [21]। विवो में DNMTs पर γ-oryzanol के संभावित प्रभाव का पता लगाने के लिए, हमने HFD से प्रभावित चूहों के दिमाग में DNMT के स्तर का मूल्यांकन किया। हालाँकि, स्ट्रिपम या हाइपोथैलेमस या तो DNMTs के mRNA और प्रोटीन के स्तर पर प्रति sefD का कोई प्रभाव नहीं था, लेकिन γ-oryzanol के साथ पूरकता ने स्ट्रिपम में DNMTs के स्तर को काफी कम कर दिया था - हाइपोथैलेमस (अंजीर) में नहीं। (Fig.2c-ए, 2सी-ई, जी-आई, के-एन)। ये डेटा इस संभावना को बढ़ाते हैं कि γ-oryzanol DNMTs के स्तर को एक स्ट्रैटम-विशिष्ट तरीके से विनियमित कर सकता है। इसी तरह से, एक्सएनएम्एक्स-एजा-डीसी ने स्ट्रिपटम (ईएसएम छवि) में अधिमानतः DNMT5a और 3b के mRNA स्तर में कमी की। 1एक-घ)।
पिछले अध्ययन के आधार पर यह दर्शाता है कि DNMT1 का mRNA स्तर सकारात्मक रूप से विनियमित किया गया था, कम से कम आंशिक रूप से, परमाणु रिसेप्टर ERRγ [द्वारा22], हमने ERR। गतिविधि पर γ-oryzanol के संभावित प्रभाव की जांच की। गैर-मानव स्तनधारी कोशिकाओं में संवैधानिक रूप से सक्रिय ERR X, 4-hydroxy tamoxifen, ERRγ के एक शक्तिशाली विलोम एगोनिस्ट को व्यक्त करते हुए, स्पष्ट रूप से ERRγ गतिविधि में कमी आई है। ध्यान दें, ER-oryzanol आंशिक रूप से ERR (गतिविधि (जन्मजात मूल्य का लगभग 40% की कमी) (छवि) में कमी आई है। (Fig.3a) .3ए)। महत्वपूर्ण रूप से, ईआरआरly को स्ट्रिएटम में व्यक्त किया गया था लेकिन हाइपोथेलेमस (अंजीर) में नहीं। (Fig.3b-घ) .3बी-घ)। स्ट्रेटम के लिए स्थिति के विपरीत, or-oryzanol ने केवल हाइपोथैलेमस (अंजीर) में DNMT1 के प्रोटीन स्तर में काफी वृद्धि की है। (Fig.2k, 2के, एल)। इन परिणामों को समझाया जा सकता है, कम से कम आंशिक रूप से, हमारी खोज से कि STAT3α, DNMT1 स्तर का एक सकारात्मक नियामक [23], बहुतायत से हाइपोथैलेमस में व्यक्त किया गया था लेकिन स्ट्रेटम (अंजीर) में नहीं। (Fig.33ई-छ)।
आगे विवो में DNMTs की गतिविधि पर or-oryzanol के प्रभाव का आकलन करने के लिए, SAH का गठन, डीएनए मेथिलिकरण का एक बायप्रोडक्ट और DNMTs का एक प्रबल अवरोधक, γ-oryzanol-इलाज चूहों में मूल्यांकन किया गया था HFD को खिलाया। एसएएफ गठन में स्ट्रिपम या हाइपोथैलेमस के बीच एचएफडी-फेड और चाउ-फेड चूहों (छवि) के बीच कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ। (Fig.2f, 2एफ, जे)। विशेष रूप से, γ-oryzanol ने स्ट्रैटम (अंजीर) में SAH गठन को काफी कम कर दिया। (Fig.2f) 2च) लेकिन हाइपोथैलेमस में नहीं (चित्र) (Fig.2j), 2जे), यह सुझाव देते हुए कि γ-oryzanol DNMTs की गतिविधि को एचएफडी-खिलाए गए चूहों में एक स्ट्रैटम-विशिष्ट तरीके से दबा सकता है।
इन विट्रो में DNMTs के लिए zym-oryzanol के निरोधात्मक गुणों पर एंजाइमी विश्लेषण करता है
हमने अगली बार इन विट्रो में DNMTs की गतिविधि पर γ-oryzanol के प्रभाव का आकलन किया। डीएनएमटी के खिलाफ γ-oryzanol, फेरुलिक एसिड, 5-aza-dC, haloperidol (एक प्रतिनिधि D2R प्रतिपक्षी), quinpirole (एक प्रतिनिधि D2R एगोनिस्ट) और SAH के निरोधात्मक शक्ति का मूल्यांकन किया गया। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, SAH ने खुराक-आश्रित तरीके (चित्र) में DNMTs की गतिविधियों को दृढ़ता से देखा। (Fig.4a-च) .4एक-च)। जैसा कि अपेक्षित था, डीएलएमटी (ईएसएम छवि) की गतिविधियों पर हेलोपरिडोल और क्विनपीरोले ने कोई प्रभाव नहीं दिखाया। 2)। विशेष रूप से, γ-oryzanol ने DNMT1 (IC) की गतिविधियों को महत्वपूर्ण रूप से बाधित किया50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC)50 = 22.3 μmol / l) और 3b (अधिकतम अवरोध 57%) (अंजीर)। (Fig.4d-च) .4डी-एफ)। इसके विपरीत, फेरुलिक एसिड की निरोधात्मक गतिविधि, or-oryzanol के मेटाबोलाइट, than-oryzanol (Fig) की तुलना में बहुत कम थी। (Fig.44डी-एफ)।
हमने आगे DNMTs पर γ-oryzanol के निरोधात्मक गुणों की जांच की। SAH के गठन को इन विट्रो में DNMTs पर or-oryzanol की निरोधात्मक गतिविधि का आकलन करने के लिए मापा गया था। डीएनएमटी की मध्यस्थता वाले डीएनए मिथाइलेशन के दौरान एसएएच के गठन पर डेटा –-oryzanol (Fig) की उपस्थिति और अनुपस्थिति दोनों के लिए माइकलिस-मेन्टेन कैनेटीक्स का एक संतृप्त पैटर्न दर्शाता है। (Fig.4g-i) .4जी i)। DNMT1 की मध्यस्थता वाले डीएनए मेथिलिकरण में, ईडी-होफ्स्टी विश्लेषण ने प्रदर्शित किया कि zan-oryzanol ने कोई प्रभाव नहीं दिखाया V मैक्स SAH गठन (वाहन, 597 pmol / मिनट; or-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / मिनट; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / मिनट), जबकि γ-oryzanol जाहिरा तौर पर बढ़ा K m (वाहन, 0.47 μg / ml;,-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; /-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (अंजीर)। (Fig.4j) .4जे)। ये परिणाम बताते हैं कि results-oryzanol DNMT1 को कम से कम आंशिक रूप से प्रतिस्पर्धी तरीके से रोकता है। दूसरी ओर, DNMT3a- और 3b की मध्यस्थता वाले डीएनए मिथाइलेशन के लिए, yl-oryzanol की कमी हुई V मैक्स SAH (DNMT3a: वाहन, 85.3 pmol / मिनट; SA-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / मिनट; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: वाहन, 42.3 pmol / मिनट; -ओरिज़ानॉल 2 μmol / l; 28.0 pmol / मिनट, or-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / मिनट) और, इसी तरह, K m इस प्रतिक्रिया के लिए (DNMT3a: वाहन, 0.0086 μg / ml; or-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: वाहन, 0.0122 μg / ml; γ- M oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; y-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (अंजीर)। (Fig.4k, 4के, एल)। ये परिणाम बताते हैं कि results-oryzanol DNMT3a और 3b को कम से कम आंशिक रूप से गैर-प्रतिस्पर्धी तरीके से रोकता है।
fed-ओरजेनॉल एचएफडी-फेड चूहों के स्ट्रिएटम में डीएक्सएनयूएमएक्सआर के स्तर को बढ़ाता है
हमने अगली संभावना का परीक्षण किया कि।-Oryzanol DNMTs के निषेध के माध्यम से स्ट्राइटल D2R सामग्री को बढ़ाएगा। एचएफडी-खिलाया चूहों में, D-oryzanol के मौखिक प्रशासन ने D2Rs (चित्र) के प्रवर्तक क्षेत्र में स्ट्रैटल डीएनए मेथाइलेशन को काफी कम कर दिया। (Fig.5a), 5a), जबकि हाइपोथेलेमस (अंजीर) में ऐसा नहीं किया। (Fig.5f) .5च)। इन निष्कर्षों के अनुसार, D2R के mRNA और प्रोटीन के स्तर में पारस्परिक रूप से वृद्धि हुई (चित्र)। (Fig.5b, 5बी, जी, के, एल)। 5-aza-dC (अंजीर) के साथ उपचार पर डेटा के समान। (Fig.1), 1), आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं थे Drd1, Th और Slc6a3 स्ट्रैटम में (डैट), और के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं Drd1, Th और Slc6a3 हाइपोथैलेमस में (अंजीर। (Fig.5c-ए, 5सी-ई, एच-के, एम)।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि D2R और DNMT1 का स्तर ER तनाव और सूजन से कम से कम आंशिक रूप से NF-partB [के माध्यम से नियंत्रित होता है]17, 24, 25]। इसलिए हमने ईआर तनाव-संबंधी और सूजन-संबंधी जीन के स्तरों की जांच की। जैसा कि पहले दिखाया गया था [26], HFD TNF-α एन्कोडिंग जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई (Tnfa), मोनोसाइट किमोएट्रैक्टेंट प्रोटीन- 1 (MCP-1) (Ccl2), सी / ईबीपी सजातीय प्रोटीन (काटना), ईआर-स्थानीयकृत DJJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) और एक्स-बॉक्स बाइंडिंग प्रोटीन 1 का मसालेदार रूप (Xbp1s) हाइपोथैलेमस में लेकिन स्ट्रिएटम (अंजीर) में नहीं। (Fig.6) .6)। विशेष रूप से, with-oryzanol के साथ HFD के पूरक ने संवर्धित अभिव्यक्ति को काफी कम कर दिया Ccl2, काटना, Dnajb9 और Xbp1s विशेष रूप से हाइपोथेलेमस में लेकिन स्ट्रेटम में नहीं (चित्र)। (Fig.66).
चर्चा
वर्तमान अध्ययन में प्रमुख खोज यह है कि finding-oryzanol चूहों की स्ट्रेटम में एक शक्तिशाली DNMT अवरोधक के रूप में कार्य करता है, जिससे कम से कम आंशिक रूप से, स्ट्रिपेट D2R के एपिगेनेटिक विनियमन के माध्यम से एचएफडी के लिए प्राथमिकता होती है। एचएफडी-खिलाए गए चूहों से स्ट्रेटम में, D2R का स्तर काफी कम हो गया था, जबकि D1R, TH और DAT को नहीं बदला गया था (अंजीर। (Fig.1b-ए, 1बी-ई, के-एम)। ये आंकड़े इस धारणा के अनुरूप हैं कि एचएफ़डी पर जब एचएफ़डी पर एचडीडी की अतिवृद्धि होती है, तो भोजन के प्रतिफल की धारणा स्ट्राइटल डीएक्सएनयूएमएक्सआर भोजन की महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है [3]। वर्तमान अध्ययन में, 5-aza-dC के साथ एचएफडी-खिलाया गया चूहों का उपचार स्ट्राइटल D2R (अंजीर) के स्तर में काफी वृद्धि हुई है। (Fig.1b, 1बी, के, एल) संभवतः डीएक्सएनयूएमएक्सआर (अंजीर) के प्रवर्तक क्षेत्र में डीएनए मेथिलिकेशन स्तर में कमी के माध्यम से। (Fig.1a), 1a), और फलस्वरूप आहार वसा (अंजीर) के लिए प्राथमिकता दी। (Fig.1n) .1एन)। यह खोज एक HFD पर भोजन के प्रतिफल की धारणा में स्ट्राइटल D2Rs की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करता है।
हमारे इन विट्रो परख ने दर्शाया कि DNMTs के खिलाफ or-oryzanol की निरोधात्मक गतिविधि स्पष्ट रूप से अपने मेटाबोलाइट फेरुलिक एसिड (Fig) की तुलना में अधिक मजबूत थी। (Fig.4d-च), 4d-f), DNMTs पर इसकी निरोधात्मक कार्रवाई के लिए or-oryzanol की पूरी संरचना के महत्व का सुझाव। एचएफडी-फेड चूहों में, हमारे अध्ययन से पता चलता है कि, मौखिक प्रशासन के बाद, or-oryzanol पूरी संरचना के रूप में मस्तिष्क तक पहुंचता है और स्ट्रिपम में DNMTs के स्तर और गतिविधियों को कम कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रमोटर क्षेत्र में डीएनए मेथिलिकरण में कमी होती है। स्ट्रिएटम में D2R। इसके अलावा, हमारे इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि our-oryzanol ERR serves के खिलाफ एक आंशिक विरोधी के रूप में कार्य करता है, जो मुख्य रूप से DNMT1 उत्पादन के लिए एक सकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है [22], और परिणामस्वरूप DNMT1 (अंजीर) की गतिविधि में कमी आई है। (Fig.3a) .3ए)। ध्यान दें, ERR note को स्ट्रिएटम में बहुत अधिक व्यक्त किया गया था लेकिन चूहों (अंजीर) में हाइपोथैलेमस में नहीं। (Fig.3b) .3ख)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि zan-oryzanol में ERM inhib के निषेध के माध्यम से DNMT1 के mRNA स्तर को कम से कम आंशिक रूप से कम करने की क्षमता है। स्ट्रिएटम के विपरीत, γ-oryzanol ने एचएफडी-फेड चूहों (अंजीर) से हाइपोथैलेमस में डीएक्सएनयूएमएक्सआर के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। (Fig.5g, 5जी, के, एल)।
दूसरी ओर, हमने दिखाया कि हाइपोथेलेमस में X-oryzanol ने DNMT1 के स्तर में काफी वृद्धि की है, लेकिन स्ट्रिएटम (अंजीर) में नहीं। (Fig.2k, 2के, एल)। यह दिखाया गया है कि STAT3 घातक T-lingoma कोशिकाओं में DNMT1 की सामग्री को बढ़ाता है [23]। विशेष रूप से, हमने पहले दिखाया था कि D-oryzanol ने एचएफडी-फीडेड चूहों से हाइपोथैलेमस में लेप्टिन-प्रेरित STAT3 फॉस्फोराइलेशन में काफी वृद्धि की है [14]। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि STAT3α को हाइपोथैलेमस में काफी हद तक व्यक्त किया गया था, लेकिन चूहों (अंजीर) में स्ट्रिएटम में नहीं। (Fig.3e-छ) .3ई-छ)। ये आंकड़े हमें अनुमान लगाने के लिए प्रेरित करते हैं कि हाइपोथेलेमस और स्ट्रिएटम के बीच DNMT1 के स्तर पर or-oryzanol के प्रभाव में स्पष्ट अंतर, चूहों के मस्तिष्क में STAT3α और ERRγ के क्षेत्र-विशिष्ट सामग्री के लिए, कम से कम आंशिक रूप से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है ( अंजीर। (Fig.3b-छ) .3बी-छ)। सामूहिक रूप से, चूहों में स्ट्रिएटम और हाइपोथैलेमस के बीच ERR ST और STAT3α की अभिव्यक्ति का एक पारस्परिक पैटर्न प्रतीत होता है। हमारे परिणामों के आधार पर, यह स्पष्ट करना उचित है कि स्ट्रेटम में, जहां ERRγ उत्पादन प्रचुर मात्रा में है, zan-oryzanol अधिमानतः ERR level के नकारात्मक नियामक के रूप में DNMT1 के mRNA स्तर और एंजाइम गतिविधि को कम कर सकता है। इसके विपरीत, हाइपोथैलेमस में, जहां STAT3α का उत्पादन प्रमुख है, γ-oryzanol DNMT1 के स्तर को अधिमानतः बढ़ा सकता है।
हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि एचएफडी द्वारा प्रेरित स्ट्राइटल डीएक्सएनयूएमएक्सआर सिग्नलिंग का एक क्षीणन नए व्यवहार को खराब करता है []3], मोटापे के उपचार के लिए स्ट्रिपेटल DNMTs के निषेध के संभावित महत्व का सुझाव दे रहा है। दूसरी ओर, एक पिछले अध्ययन ने एक संभावना का प्रदर्शन किया कि विशिष्ट हाइपोथैलेमिक नाभिक में व्यक्त मेलेनोकोर्टिन रिसेप्टर एक्सएनयूएमएक्स जीन के डीएनए मेथिलिकरण की स्थिति, एगैबिलिबल पीले चूहों में मोटापे के ट्रांसजेनरेशनल रूपों को संशोधित कर सकती है [27]। यद्यपि आगे के अध्ययनों को अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए वारंट किया जाता है, ये अध्ययन एचएफडी-प्रेरित मोटापे के रोग-विकृति विज्ञान में ऊतक-, जीन- और अनुक्रम-विशिष्ट डीएनए मेथिलिकेशन के महत्व का सुझाव देते हैं।
हमने हाल ही में रिपोर्ट किया कि HFD ने चूहों के अग्नाशय के आइलेट्स में D2R के स्तर को बढ़ा दिया [17, 24]। यह संभावना है कि इस तरह की वृद्धि की मध्यस्थता की जाती है, कम से कम आंशिक रूप से, ईआर-areB के माध्यम से ईआर तनाव और सूजन से, क्योंकि D2R के प्रमोटर क्षेत्र में कई NF-κB- उत्तरदायी तत्व हैं [17, 24]। इसके अलावा, हाल ही के एक अध्ययन से पता चला है कि TNF-α और IL-1D HFD- फीडेड चूहों से वसा ऊतक में DNMT1 के स्तर और गतिविधि को बढ़ाते हैं [25]। महत्वपूर्ण रूप से, वर्तमान अध्ययन से पता चला कि एचएफडी ने ईआर तनाव और सूजन को हाइपोथेलेमस में अधिमानतः प्रेरित किया, लेकिन स्ट्रिएटम (अंजीर) में नहीं। (Fig.6) .6)। हमारे प्रायोगिक प्रतिमान में ऊतक-, क्षेत्र- और साइट-विशिष्ट डीएनए मिथाइलेशन और डीमेथिलेशन में गहराई से तंत्र को आगे की जांच का इंतजार करना चाहिए।
साथ में हमारी पिछली रिपोर्ट दिखाती है कि γ-oryzanol चूहों में ER तनाव के हाइपोथैलेमिक विनियमन के माध्यम से एक HFD के लिए वरीयता को दर्शाता है [14], unique-oryzanol भी खिला व्यवहार के hedonic और चयापचय रोग के दोनों ameliorating की एक अनूठी संपत्ति का प्रतिनिधित्व करता है। क्योंकि विकसित किए गए कुछ एन्टीबायोटिक दवाओं को गंभीर प्रतिकूल प्रभाव का कारण माना जाता है [8], मस्तिष्क इनाम प्रणाली की ओर एक प्राकृतिक खाद्य-आधारित दृष्टिकोण मोटापा-मधुमेह सिंड्रोम का सुरक्षित रूप से इलाज करने के लिए अनुमानित है []16]। इस प्रतिमान में, γ-oryzanol एक होनहार एंटीबॉस्टीशियन उम्मीदवार है जो एपिजेनेटिक मॉड्यूलेटर होने का एक अलग गुण है।
आभार
हम पांडुलिपि की समीक्षा के लिए एस। ओकामोटो (रयूकस, जापान विश्वविद्यालय) के आभारी हैं। हम सचिवीय सहायता के लिए एम। हिरता, एच। कनेशिरो, आई। असताओ और सी। नोगुची (रयूकस विश्वविद्यालय, जापान) को धन्यवाद देते हैं।
लघुरूप
| 5-aza-डीसी | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | डोपामाइन D1 रिसेप्टर |
| D2R | डोपामाइन D2 रिसेप्टर |
| DAT | डोपामाइन ट्रांसपोर्टर |
| DNMT | डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ |
| ER | जालिका |
| अं | एस्ट्रोजेन से संबंधित रिसेप्टर |
| HFD | बहुत वसा वाला खाना |
| एसएएच | S-Adenosyl-एल-होमोसिस्टीन |
| सैम | S-एडोनोसिल मेथियोनीन |
| STAT3α | सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन के सक्रियकर्ता 3α |
| TH | Tyrosine hydroxylase |
नोट्स
डेटा उपलब्धता
वर्तमान अध्ययन के दौरान उत्पन्न और / या विश्लेषण किए गए डेटासेट उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक से उपलब्ध हैं।
निधिकरण
इस काम को जापान सोसायटी से विज्ञान संवर्धन (JSPS; KAKENHI ग्रांट संख्या 15K19520 और 24591338), विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद (CSTI), क्रॉस-मिनिस्ट्रियल स्ट्रेटेजिक इनोवेशन प्रमोशन प्रोग्राम के लिए समर्थन दिया गया था। (SIP) 'नेक्स्ट-जेनेरेशन एग्रीकल्चर, फॉरेस्ट्री एंड फिशरीज बनाने के लिए टेक्नोलॉजीज', लोटे फाउंडेशन, जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एंजायोलॉजी, न्यू एनर्जी एंड इंडस्ट्रियल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट ऑर्गनाइजेशन (NEDO), प्रोजेक्ट फॉर फॉर्मेशन ऑफ लाइफ साइंस नेटवर्क (फार्मास्युटिकल फील्ड) ) (ओकिनावा प्रीफेक्चर, जापान) और ओकिनावा प्रीफेक्चर, जापान के मेडिकल क्लस्टरिंग का प्रमोशन प्रोजेक्ट, साथ ही एडवांस मेडिसिन (ओकिनावा प्रीफेक्चर, जापान) को बढ़ावा देने के लिए ओकिनावा प्रीफेक्चर से अनुदान।
रूचि का द्वंद्व
लेखक घोषणा करते हैं कि इस पांडुलिपि के साथ जुड़े ब्याज की कोई द्वंद्व नहीं है।
योगदान बयान
सीके और एचएम ने रिसर्च को डिजाइन किया। सीके और टीके ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया और डेटा का विश्लेषण किया। TK, CS-O, CT, MT, MM और KA ने डेटा की व्याख्या में योगदान दिया। सीके और एचएम ने पांडुलिपि लिखी। सभी लेखकों ने डेटा व्याख्या में योगदान दिया। सभी लेखक पांडुलिपि को संशोधित करने में शामिल हुए और इसके अंतिम संस्करण को मंजूरी दी। एचएम इस काम का गारंटर है, जिसके पास सभी डेटा तक पूरी पहुंच थी और डेटा की अखंडता और डेटा विश्लेषण की सटीकता के लिए पूरी जिम्मेदारी लेता है।
फुटनोट
इलेक्ट्रॉनिक पूरक सामग्री
इस लेख का ऑनलाइन संस्करण (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) में सहकर्मी-समीक्षा की गई है, लेकिन अनुपलब्ध पूरक सामग्री है, जो अधिकृत उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है।
संदर्भ
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