इंसुलिन हाइपोथैलेमस में इंसुलिन रिसेप्टर्स (InsRs) को भोजन के बाद तृप्ति का संकेत देने के लिए सक्रिय करता है। हालांकि, मोटापे की बढ़ती घटना, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक इंसुलिन का स्तर बढ़ जाता है, का अर्थ है कि इंसुलिन मस्तिष्क के केंद्रों में भी कार्य कर सकता है जो प्रेरणा और इनाम को नियंत्रित करते हैं। हम यहाँ रिपोर्ट करते हैं कि इंसुलिन न्यूक्लियस एक्चुम्बन्स (NAc) में एक्शन पोटेंशियल-डिपेंडेंट डोपामाइन (DA) रिलीज़ को बढ़ा सकता है और इनडायरेक्ट मैकेनिज़्म के माध्यम से एक इनडायरेक्ट-कोलोमैजिक इन्टिरियरनन्स को शामिल करता है, जो इन्सआरआर को व्यक्त करता है। इसके अलावा, चूहों में दो अलग-अलग पुरानी आहार जोड़तोड़, खाद्य प्रतिबंध (एफआर) और एक ओबेसोजेनिक (ओबी) आहार, एफआर में बढ़ाया जवाबदेही के साथ, इंसुलिन के लिए स्ट्रैटल डीए रिलीज की संवेदनशीलता को बदल देता है, लेकिन ओबी में जवाबदेही का नुकसान। व्यवहार अध्ययनों से पता चलता है कि NAC खोल में बरकरार इंसुलिन का स्तर एक जोड़ा ग्लूकोज समाधान के स्वाद के लिए वरीयता के अधिग्रहण के लिए आवश्यक है। साथ में, ये आंकड़े बताते हैं कि स्ट्राइटल इंसुलिन सिग्नलिंग भोजन की पसंद को प्रभावित करने के लिए डीए रिलीज़ को बढ़ाता है।

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि भोजन के दौरान और उसके बाद प्लाज्मा इंसुलिन में एक निरंतर वृद्धि हाइपोथैलेमस में इंसुलिन रिसेप्टर्स (InsRs) को सक्रिय करती है, जो आगे खाने से घटने वाले क्षुधावर्धक सर्किट को नकारात्मक प्रतिक्रिया प्रदान करती है^{1, 2, 3}। मस्तिष्क इंसुलिन मुख्य रूप से अग्नाशयी with कोशिकाओं से प्राप्त होता है, जो प्लाज्मा से मस्तिष्क तक रक्त-मस्तिष्क बाधा पर सक्रिय परिवहन के साथ होता है^{4, 5, 6, 7, 8}, हालांकि न्यूरोनल इंसुलिन संश्लेषण और रिलीज के लिए साक्ष्य बढ़ रहे हैं, साथ ही साथ^{1, 9}। विशेष रूप से, InsRs की अभिव्यक्ति हाइपोथैलेमस तक ही सीमित नहीं है, हालांकि अतिरिक्त-हाइपोथैलेमिक इनसाइट्स का कार्य अनसुलझे हैं^{1, 2, 3}। मोटापा और टाइप II डायबिटीज की बढ़ती घटनाओं को देखते हुए, जिसमें इंसुलिन के परिसंचारी स्तर को लगातार बढ़ाया जाता है और मस्तिष्क इंसुलिन परिवहन और रिसेप्टर संवेदनशीलता कम हो जाती है^{3, 8, 10, 11}, मस्तिष्क क्षेत्रों में इंसुलिन के कार्य को समझना महत्वपूर्ण है जो प्रेरणा और इनाम को नियंत्रित करता है। विशेष रुचि वाले मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूक्लियस एक्चुम्बन्स (NAc) शामिल होते हैं, जो भोजन और दवाओं दोनों के प्रतिफल प्रभावों की मध्यस्थता करते हैं^{12, 13}, और दुम-पुटामेन (सीपीयू), जो आदत-आधारित व्यवहार और लालसा में भूमिका निभाता है¹³। इन क्षेत्रों में एनएएसआर सबसे अधिक घनत्व के साथ व्यक्त किए जाते हैं^{3, 14}; इंसर्न्स को मिडब्रेन में डोपामाइन (डीए) न्यूरॉन्स द्वारा भी व्यक्त किया जाता है, जिसमें उदर संबंधी टेक्टेराल क्षेत्र (वीटीए) और मूल नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनसी) शामिल हैं¹⁵। मस्तिष्क इंसुलिन का स्तर प्लाज्मा इंसुलिन सांद्रता और शरीर की वसा के अनुपात में होता है^{6, 7, 8}, इस परिकल्पना के लिए कि इंसुलिन इन मस्तिष्क क्षेत्रों में भोजन के प्रतिफल को प्रभावित करने के लिए कार्य कर सकता है^{3, 16, 17}.

स्ट्रिपेटल सिनैप्टोसोम, हेटरोलोजस सेल्स, ब्रेन स्लाइस और में पिछले अध्ययन vivo में दिखाया गया है कि इंसुलिन के इंसुलिन सक्रियण से डीए ट्रांसपोर्टर (डीएटी) द्वारा डीए अपटेक में वृद्धि होती है।^{18, 19, 20, 21, 22, 23}। इस प्रक्रिया में PI3 kinase सिग्नलिंग मार्ग शामिल है^{19, 20}, और प्लाज्मा झिल्ली में डीएटी सम्मिलन के परिणामस्वरूप¹⁹। डायबिटीज के पशु मॉडल में और भोजन प्रतिबंध के बाद घटी हुई डीए अपटेक और डीएटी सतह की अभिव्यक्ति के साथ इंसुलिन के स्तर को गतिशील रूप से स्ट्रैटल डीएटी गतिविधि को संशोधित करना।^{20, 21}। डीएटी गतिविधि में इंसुलिन-आश्रित वृद्धि को बढ़ाए गए अतिरिक्त डीए एकाग्रता ([डीए)) को कम करने के लिए दिखाया गया है।_o) में वी.टी.ए.²³, डीए रिलीज और तेज के बीच संतुलन में एक बदलाव को दर्शाता है। संतृप्ति में इंसुलिन की स्थापित भूमिका के अनुरूप, वीटीए में इंसुलिन की तीव्र सूक्ष्मता भोजन के प्रतिफल को कम कर सकती है^{23, 24}, जबकि वीटीए और एसएनसी डीए न्यूरॉन्स में इंसआर की कमी वाले चूहों ने भोजन का सेवन बढ़ाया और मोटे हो गए²⁵। हालांकि इंसुलिन वीटीए डीए न्यूरॉन्स को उत्तेजक इनपुट के दीर्घकालिक अवसाद को प्रेरित कर सकता है²⁴फिर से तृप्ति में एक भूमिका के साथ संगत, इंसुलिन एक्सपोजर भी डीए न्यूरॉन फायरिंग दर को बढ़ा सकता है, संभवतः डीए रिलीज और ऑटोरेसेप्टर-मध्यस्थता निषेध को कम करके²⁵। स्ट्राइटल डीए रिलीज पर इंसुलिन का शुद्ध प्रभाव इसलिए भविष्यवाणी करना मुश्किल है। दरअसल, स्ट्राइटल डीए रिलीज में इंसुलिन के प्रभाव के अध्ययन से परिणाम पूर्व विवो स्लाइस¹⁹ और भोजन के इनाम पर NAc में इंसुलिन के स्थानीय सूक्ष्मजीवों का प्रभाव²⁶ विरोधाभासी प्रतीत होते हैं। इसे हल करने के लिए, हमने अक्षीय डीए रिलीज़ का मूल्यांकन किया और एनएके और सीपीयू के अक्षुण्ण माइक्रोएन्वायरमेंट में आगे निकल गए। पूर्व विवो स्ट्रैट-स्कैन साइक्लिक वोल्टामेट्री (FCV) का उपयोग करके स्ट्राइटल स्लाइस, और इनाम व्यवहार पर NAc में इंसुलिन सिग्नलिंग के प्रभावों को निर्धारित किया vivo में.

हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि NAc और CPu में इंसुलिन का प्राथमिक प्रभाव डीए रिलीज में वृद्धि के बावजूद, डीए रिलीज को बढ़ाने के लिए है। डीए रिलीज़ के इस गतिशील विनियमन में स्ट्राइटल कोलीनर्जिक इंटिरियरन (ChIs) की उत्तेजना में एक इंसुलिन-निर्भर वृद्धि शामिल है, जो निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन (ACh) रिसेप्टर्स (nAChRs) के सक्रियण के माध्यम से डीए रिलीज़ को बढ़ाती है। इंसुलिन द्वारा ChIs और DA रिलीज़ पर इंसुलिन के प्रभाव की मध्यस्थता की जाती है। विशेष रूप से, डीए रिलीज पर इंसुलिन का प्रभाव एफआर चूहों से स्लाइस में प्रवर्धित किया जाता है, लेकिन एक ओबेसोजेनिक (ओबी) आहार पर चूहों में विस्फोट किया जाता है। ये आंकड़े डीए रिलीज़ के प्रवर्धन को दर्शाते हैं पूर्व विवो इंसुलिन द्वारा स्लाइस भविष्यवाणी को जन्म देती है कि इंसुलिन एक इनाम संकेत के रूप में कार्य कर सकता है vivo में। वास्तव में, समानांतर व्यवहार अध्ययन स्वाद-वरीयता कंडीशनिंग में NAC खोल में इंसुलिन के लिए एक भूमिका प्रदर्शित करता है। साथ में, ये निष्कर्ष इंसुलिन के लिए एक इनाम संकेत के रूप में एक नई भूमिका का संकेत देते हैं जो भोजन की पसंद को प्रभावित कर सकता है

InsRs में अभिनय करने वाला इंसुलिन स्ट्राइटल डीए रिलीज़ को बढ़ाता है

स्थानीय रूप से विकसित [डीए] की प्रारंभिक परीक्षा_o में FCV के साथ नजर रखी पूर्व विवो चूहों से स्ट्रिपेटल स्लाइस बिना तैयारी के (AL) भोजन और पानी तक पहुंच ने अप्रत्याशित रूप से भौतिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता की एक सीमा के भीतर इंसुलिन के तीव्र अनुप्रयोग का पता लगाया^{1, 4} बढ़ी हुई एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o (अंजीर। 1a-c), इंसुलिन ईसी के साथ₅₀ मान (एकाग्रता, जिस पर प्रभाव आधा अधिकतम था) 2-12 nM (अंजीर। 1b)। बढ़ा हुआ [DA]_o विशेष रूप से आश्चर्यजनक था, यह देखते हुए कि यह अधिकतम दर में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ था (V_{मैक्स}) प्रत्येक भाग में DAT की मध्यस्थता के लिए (टेबल 1), जिससे पैदा होने वाली प्रतिस्पर्धा में कमी आएगी [DA]_o, जैसा कि पहले बताया गया है^{22, 23}। इसके बजाय, हमने पाया कि विकसित [डीए]_o 20 nM इंसुलिन द्वारा अधिकतम 55-30% बढ़ाया गया था; सबसे बड़ा आनुपातिक प्रभाव वाला क्षेत्र NAc शेल था, जो उच्चतम InsR अभिव्यक्ति के साथ स्ट्राइटल सबग्रेड है^{1, 14}। समान परिस्थितियों में 30 nM इंसुलिन के संपर्क में आने वाले स्लाइस स्ट्रिपेटल डीए सामग्री में कोई परिवर्तन नहीं दिखा (अनुपूरक चित्र। 1a), जिसका अर्थ है कि इंसुलिन डायनेमिक रिलीज़ नियमन को बदल देता है, न कि केवल डीए संश्लेषण को बढ़ाकर। उल्लेखनीय रूप से, इंसुलिन के प्रभाव से उत्पन्न [डीए]_o सुपरस्पेशियोलॉजिकल सांद्रता में खो गया था UM100 nM (अंजीर। 1b)। यह इंसूलिन के प्रभाव के रूप में बढ़ती डीएटी गतिविधि के जारी होने का परिणाम नहीं था V_{मैक्स} इन सांद्रता में भी खो गया था (टेबल 1)। कुल मिलाकर, ये आंकड़े बताते हैं कि अक्षुण्ण स्ट्राइटल माइक्रोएन्वायरमेंट में, इंसुलिन के प्रमुख प्रभाव को विकसित [DA]_o डीए अपटेक में समवर्ती वृद्धि के बावजूद, रिलीज को बढ़ाना है।

  

  

(a) औसत एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o एनएएनएल शेल में, एनएसी कोर और सीपीयू पहले और बाद में इंसुलिन (इनस) एक्सएनएक्सएक्स एनएम के लिए सचित्र; त्रुटि पट्टियाँ छोड़ दी गईं, लेकिन देखें (b); तीर उत्तेजना के समय का संकेत देते हैं। इंसुलिन बढ़ा हुआ [डीए]_o शेल में (55 N 10% द्वारा), कोर (37 N 5% द्वारा) और CPu (20 N 4% द्वारा) (***P<0.001)। (bइंसुलिन का प्रभाव शेल में एक शारीरिक सीमा (1 – 30 nM) पर निर्भर करता था (n= 22-24, F_5,133= 14.471, P<0.001), कोर (n= 36-76, F_5,308= 16.318, P<0.001) और सीपीयू (n= 30-62, F_5,253= 13.763, P<0.001), लेकिन n100 एनएम पर खो गया। (c) शिखर से तैयार की गई रिकॉर्डिंग [DA]_o बनाम दवा इंश्योरेंस (30 nM) के आवेदन के दौरान या इंसुलिन अवरोधक HNMPA (5 μM) की उपस्थिति में जब इंसुलिन के अनुप्रयोग के दौरान NAC कोर में किसी एकल साइट पर बनाम समय। (d) औसत शिखर-विकसित [डीए]_o HNMPA, InsR प्रतिपक्षी S30 (961 μM) और PI1K अवरोध करनेवाला LY3 (294002 μM), लेकिन IGF-1R अवरोध करनेवाला PPP (1MMM) द्वारा इंसुलिन (1 nM) के प्रभाव को दिखाने वाला डेटा नहीं है।n= 29-76; P> 0.9 बनाम इंसुलिन अकेले)। के लिये अंजीर। 1a-d, n= प्रत्येक दवा या इंसुलिन एकाग्रता के लिए 3 – 6 चूहों से प्रति उप-साइट की संख्या; एक तरफ़ा एनोवा, टुकी ईमानदार महत्व परीक्षण (एचएसडी)। देख अनुपूरक चित्र। 1b, सी NAC शेल और सीपीयू डेटा के लिए।

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क्योंकि इंसुलिन इंसुलिन जैसे विकास कारक 1 रिसेप्टर्स (IGF-1Rs) पर भी कार्य कर सकता है, यद्यपि 100 nM (Ref। 1), हमने यह पुष्टि करने की कोशिश की कि विकसित किए गए इंसुलिन का प्रभाव [DA]_o InsR निर्भर था। यह मामला साबित हुआ, क्योंकि प्रभाव को एक इंट्रासेल्युलर InsR अवरोधक, हाइड्रॉक्सी-2-naphthalenylmethylphosphonic acid (HNMPA) द्वारा रोका गया था, और एक InsR प्रतिपक्षी, S961 द्वारा, लेकिन IGF-1R pic के चयनात्मक अवरोधक द्वारा नहीं।²⁴ (पीपीपी; अंजीर। 1c, डी और अनुपूरक चित्र। 1b, सी)। हमने तब PI3 kinase की भागीदारी की जांच की, जो DAT के इंसुलिन-निर्भर विनियमन के लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्ग को आरंभ करता है¹⁹। 1 μM की सांद्रता पर, P13K अवरोध करनेवाला LY249002 अकेले चरम-विकसित [DA] पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।_o or V_{मैक्स} (n= 29-76 साइटें (NAc कोर) प्रति दवा, P> 0.05, विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण (ANOVA); डेटा नहीं दिखाया गया है), फिर भी विकसित इंसुलिन के प्रभाव को रोका [DA]_o सभी हड़ताली उपक्षेत्रों में (अंजीर। 1d और अनुपूरक चित्र। 1b, सी).

डीए अक्षतंतु और ChI पर InsRs का स्थानीयकरण

में वृद्धि देखी गई V_{मैक्स} इंसुलिन के शारीरिक स्तर के साथ डीए अपटेक के लिए डीए अक्षतंतु पर इंसआर की उपस्थिति का अर्थ है, जैसा कि विभिन्न स्ट्राइटल तैयारी में पिछले परिणाम हैं।^{18, 19, 20, 21, 22}। हालांकि मिडब्रेन डीए न्यूरॉन्स पर इन्सआर की कार्यात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है^{15, 23, 24, 25}, स्ट्राइटल डीए अक्षतंतु पर इंसआर अभिव्यक्ति की सूचना नहीं दी गई है। हमने इसे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके संबोधित किया। स्ट्रेटम भर में घने InsR immunoreactivity के दौरान DA axons पर InsR स्थानीयकरण का सीमित मात्रात्मक मूल्यांकन, जो कि DA-सिंथेसाइजिंग एंजाइम, टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (TH) के लिए immunoreactivity द्वारा पहचाना गया था। इसलिए हमने पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल को अपनाया²⁷, जिसमें सामान्य छवि दृश्य में TH + प्रोफाइल के साथ ओवरलैप की गई इन्सआर पंक्टा को गिनना शामिल था और इन्सआर छवि के बाद फिर से गिनती केवल 90 ° द्वारा घुमाई गई थी। यदि InsR और TH + प्रोफाइल के स्पष्ट ओवरलैप्स निरर्थक थे, तो इस प्रक्रिया को सांख्यिकीय रूप से समान गणना देना चाहिए कि क्या चरण के बाहर सामान्य या 90 ° है। हालाँकि, इस विश्लेषण ने 14% 9% के TH + प्रोफाइल के साथ InsR पंक्टा के ओवरलैप में कमी दिखाई (n= 42 फ़ील्ड, P<0.01, दो-पूंछ जोड़े गए t-परीक्षा; डेटा नहीं दिखाया गया है), डीए अक्षतंतु पर InsR उपस्थिति की पुष्टि करता है। अधिक दिलचस्प बात यह है कि, हालांकि, स्ट्रिएटम के इनसआर इम्युनोलैबेलिंग ने बड़े सेल निकायों पर अलग-अलग इंसआर अभिव्यक्ति का पता लगाया, जिन्हें कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (चट) के लिए सह-इम्यूनोलैबेलिंग द्वारा स्ट्राइटल ची के रूप में पहचाना गया था, जो एसीएच संश्लेषण के लिए आवश्यक प्राथमिक एंजाइम है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मानदंडों का उपयोग करना²⁸ प्रारंभिक पूरे सेल-रिकॉर्डिंग अध्ययन में ChI की पहचान करने के लिए, कई न्यूरॉन्स को बायोसाइटिन से भर दिया गया और फिर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित किया गया; ये सभी (4 / 4) InsR और ChAT दोनों के लिए प्रतिरक्षात्मक थे।अंजीर। 2a)। एनसीआर में इनसर्ट और चेट सह-स्थानीयकरण के बाद के मूल्यांकन ने पुष्टि की कि लगभग सभी चट + न्यूरॉन्स ने इंसआर (एक्सएनयूएमएक्स%) को व्यक्त किया; n= 27 / 28 दो चूहों से चार वर्गों में न्यूरॉन्स)।

  

  

(a) बायोसाइटिन से भरा ChI, फिर ChAT के लिए इम्युनोलैबल्ड, और InsR (4 / 4 बायोसाइटिन से भरा ChIs का प्रतिनिधि); मर्ज की गई छवि सह-स्थानीयकरण दिखाती है; स्केल बार, 10 μm। (b-e) इंसुलिन (3 nM) से पहले और बाद में वर्तमान दालों (200-s व्यास; 300, 400 और 120 pA; 30-s अंतराल) को चित्रित करने की एक श्रृंखला के लिए स्ट्राइटल ChIs की प्रतिक्रिया। (b) एक ChI (ऊपरी) में स्पाइक आवृत्ति अनुकूलन वर्तमान इंजेक्शन के दौरान एक्शन पोटेंशिअल (एपी) डिस्चार्ज के नुकसान में देखा जाता है, जबकि स्पाइकिंग इंसुलिन (कम) में वर्तमान पल्स में बनी रहती है; पूरा डेटा सेट दिखाया गया है d। (c) ChI के लिए प्रत्येक वर्तमान चरण के साथ एपी संख्या में इंसुलिन-प्रेरित वृद्धि का प्रतिनिधि समय कोर्स b। (d) इंसुलिन एक्सपोज़र के चरम प्रभाव से पहले और वर्तमान में वितरित दालों के दौरान एपी नंबर का सारांश (n= 21 युग्मित उत्तेजना, 7 न्यूरॉन्स, 5 चूहों) (e) नियंत्रण की स्थिति के तहत इंसुलिन (+ Ins) के प्रभाव को दिखाने वाली प्रतिक्रियाएं (Con; n= 21 युग्मित उत्तेजना, 7 न्यूरॉन्स, ***P<0.001, दो-पूंछ जोड़े गए t-स्टेस्ट), HNMPA (5 μM) की उपस्थिति में (n= 12 युग्मित उत्तेजना, 4 न्यूरॉन्स, 4 चूहों, P>0.05, दो-पूंछ जोड़े गए t-स्टेस्ट), और PPP (1 μM) की उपस्थिति में (n= 18 युग्मित उत्तेजना, 6 न्यूरॉन्स, 6 चूहों, **P<0.01, विलकॉक्सन ने जोड़ी पर हस्ताक्षर किए रैंक टेस्ट)। (f) औसत एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o मेकैमिलमाइन (इंस (30 μM) या DHβE (5 μM) में इंसुलिन (1 nM) से पहले और बाद में NAC कोर को 100% पीक कंट्रोल (n= 20-40 चूहों से 3-4 साइटें प्रति शर्त के अनुसार P> 0.05 बनाम नियंत्रण, अप्रकाशित t-परीक्षा)। (g) औसत एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o विषमलैंगिक नियंत्रण (Het) और से स्लाइस forebrain स्लाइस में चैट इंसुलिन से पहले और बाद में KO चूहों (30 nM), 100% चोटी नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत। इंसुलिन बढ़ा हुआ [डीए]_o नेक खोल में 190 UM 23% द्वारा विषम चूहों में, नेक कोर में 140% 8% और CPu में 137 N 12%n= 15-25 प्रति 3 साइटों से प्रति जीनोटाइप 4-XNUMX चूहों से **P<0.01, ***P<0.001 बनाम नियंत्रण अप्रभावित t-टेस्ट), लेकिन विकसित पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा [डीए]_o के किसी भी हड़ताल में चैट KO चूहों (P> 0.1)।

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इंसुलिन ChI excitability बढ़ाता है

स्ट्राइटल ChIs पर InsR की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए, हमने पूरे सेल करंट-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके ChI excitability पर इंसुलिन के प्रभाव की जांच की। ChI excitability का आकलन 3-s की एक श्रृंखला का उपयोग करके किया गया था, जो वर्तमान दालों को दर्शाती है, एक्शन पोटेंशिअल की एक ट्रेन को हटाने के लिए जो कि स्पाइक फ्रीक्वेंसी अडॉप्टिवली प्रदर्शित करती है (अंजीर। 2b), अक्सर वर्तमान पल्स के अंत तक स्पाइकिंग के नुकसान के साथ। आश्चर्यजनक रूप से, इंसुलिन (30 nM) स्पाइक फ्रीक्वेंसी अडेप्टेशन में शामिल हो गया, जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ एक्शन पोटेंशिअल संख्या में एक प्रगतिशील वृद्धि हुई (अंजीर। 2c), अधिकतम वृद्धि के साथ (अंजीर। 2d, ई) आमतौर पर 20 और 50 मिनरल इंसुलिन एक्सपोज़र के बीच देखा जाता है। इंसुलिन की अनुपस्थिति में, नियंत्रित ChI ने विकसित एक्शन पोटेंशिअल की संख्या में कोई बदलाव नहीं दिखाया (P> 0.05, दो-पूंछ जोड़े गए t-परीक्षा; डाटा नहीं दिखाया गया); जब एक ही समय अंतराल पर नियंत्रण न्यूरॉन्स की निगरानी के साथ तुलना की जाती है, तो इंसुलिन के संपर्क में आने वाले न्यूरॉन्स ने विकसित एक्शन पोटेंशिअल की संख्या में काफी अधिक परिवर्तन दिखाया (नियंत्रण n= चार न्यूरॉन्स, इंसुलिन से एक्सएनयूएमएक्स उत्तेजना जोड़े n= सात न्यूरॉन्स से 21 प्रोत्साहन जोड़े, F_1,25= 5.63, P<0.05, मिश्रित-उपाय दो-तरफ़ा एनोवा; डाटा नहीं दिखाया गया)। एक्शन क्षमता संख्या बढ़ाने पर इंसुलिन के प्रभाव को HNMPA द्वारा रोका गया था लेकिन IGF-1R चयनात्मक अवरोधक PPP (अंजीर। 2e), यह दर्शाता है कि इंसुलिन द्वारा ChI excitability में वृद्धि हुई InsR मध्यस्थता थी।

विकसित इंसुलिन की वृद्धि [डीए]_o nAChRs और ACh की आवश्यकता है

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ChIs और ACh शक्तिशाली रूप से DA अक्षों पर nAChRs के माध्यम से स्ट्राइटल DA रिलीज़ को नियंत्रित करते हैं^{29, 30, 31, 32, 33, 34}। ChIs पर प्रचुर मात्रा में InsR एक्सप्रेशन और तीव्र इंसुलिन एक्सपोज़र के साथ देखी गई ChI excitability में वृद्धि ने सुझाव दिया कि ये न्यूरॉन्स इंसुलिन के लिए उपन्यास लक्ष्य हो सकते हैं जो डीए रिलीज़ को बढ़ा सकते हैं। इसका परीक्षण करने के लिए, हमने मेकमायलामाइन, एक गैर-चयनात्मक nAChR प्रतिपक्षी, या dihydro-β-erythroidine (DHβE), ins2 सबयूनिट-युक्त (β2 *) nACRRs के लिए एक चयनात्मक विरोधी के रूप में इंसुलिन के प्रभाव की जांच की। डीए एक्सोन³⁵। उतारा गया [DA]_o इन प्रतिपक्षी की उपस्थिति में आसानी से पता चला था, भले ही दोनों दवाओं ने एकल-नाड़ी-विकसित [डीए] के आयाम को कम कर दिया हो_o (उदाहरण के लिए, NAN कोर में 13-26%), जैसा कि पहले बताया गया है^{29, 30, 31, 32}। ACh और nAChRs के लिए एक भूमिका के समर्थन में, इंसुलिन पर प्रभाव का प्रभाव [DA]_o mecamylamine या DH (E द्वारा रोका गया था (अंजीर। 2f)। इंसुलिन-संवर्धित डीए रिलीज में स्ट्राइटल एसीएच सिग्नलिंग की भागीदारी की पुष्टि करने के लिए, हमने इंसुलिन के प्रभाव की जांच की पूर्व विवो चूहों से स्ट्राइटल स्लाइस जिसमें चेट की अभिव्यक्ति आनुवंशिक रूप से अग्रमस्तिष्क संरचनाओं (अग्रमस्तिष्क) में पृथक की गई थी चैट KO चूहों), स्ट्रिएटम सहित³²। हालांकि इन चूहों में ChI बरकरार है, ACh संश्लेषण को समाप्त कर दिया जाता है, जो कम हो जाता है, लेकिन फिर भी आसानी से पता लगाने योग्य एकल-नाड़ी-विकसित [DA]_o, जैसा कि पहले वर्णित है³²। नियंत्रण विषमलैक्टर्स में, इंसुलिन (30 nM) बढ़ा हुआ [DA]_o नेक शेल और कोर और सीपीयू में एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स% (अंजीर। 2g), चूहे के स्ट्रेटम में देखे गए प्रवर्धन से अधिक (उदाहरण के लिए, अंजीर 1)। हालांकि, इंसुलिन के प्रभाव का प्रभाव [DA]_o अग्रमस्तिष्क में स्ट्राइटल कॉम्प्लेक्स में अनुपस्थित था चैट केओ चूहों, यह दर्शाता है कि डीए रिलीज के इंसुलिन की मध्यस्थता बढ़ाने के लिए स्ट्रेटल एसीएच की आवश्यकता होती है, लेकिन ग्लूटामेट जैसे ChIs से सह-जारी ट्रांसमीटर नहीं होते हैं³⁶.

विकसित [डीए] पर इंसुलिन का प्रभाव_o आहार निर्भर है

प्लाज्मा और मस्तिष्क इंसुलिन सांद्रता शरीर की वसा के आनुपातिक हैं^{6, 7, 8}, और इंसुलिन के प्रति मस्तिष्क की संवेदनशीलता में प्रतिपूरक परिवर्तन हो सकता है। इसलिए हमने परिकल्पना का परीक्षण किया कि आहार डीए रिलीज को बढ़ावा देने के लिए इंसुलिन की क्षमता को प्रभावित करता है, एक पुरानी एफआर या ओबी आहार बनाम एएल नियंत्रण पर बनाए गए चूहों से स्ट्राइटल स्लाइस का उपयोग करता है। अपेक्षा के अनुसार, प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर शरीर के वजन के साथ सहसंबद्ध था, एफआर में कम इंसुलिन के साथ एएल या ओबी चूहों में (अंजीर। 3a और टेबल 2)। इंसुलिन के प्रसार में इन अंतरों के बावजूद, शिखर-विकसित [डीए]_o एनएसी शेल और कोर में, और सीपीयू में काफी कम था पूर्व विवो AL के साथ तुलना में दोनों आहार समूहों से स्ट्राइटल स्लाइस (अंजीर। 3b और अनुपूरक चित्र। 2 ए, बी), इंसुलिन शासन के अतिरिक्त उस कारक को लागू करना पूर्ण विकसित [DA]_o। स्ट्राइटल डीए सामग्री आहार समूहों के बीच भिन्न नहीं थी, जो डीए सिंथेसिस के बजाय रिलीज नियमन में बदलाव का संकेत देती है (अनुपूरक चित्र। 2c)। गतिशील विनियमन में परिवर्तन के साथ, इंसुलिन के लिए स्ट्राइटल डीए रिलीज की संवेदनशीलता स्पष्ट रूप से आहार पर निर्भर थी। FR चूहों में, इंसुलिन सांद्रता r1 nM, जिसका AL (कोई प्रभाव नहीं) थाअंजीर। 1b), बढ़ा हुआ [डीए]_o (अंजीर। 3c), ईसी के साथ वृद्धि हुई इंसुलिन संवेदनशीलता को दर्शाता है₅₀ FR स्ट्रैटम (0.4-0.6 nM) में मान जो लगभग कम परिमाण का एक क्रम था जो AL (तुलना में) अंजीर 1b और 3c)। हड़ताली कंट्रास्ट में, ओबी स्ट्रेटम में इंसुलिन का प्रभाव खो गया था; यहां तक ​​कि एक्सएनयूएमएक्स एनएम इंसुलिन, जिसका एएल स्ट्रेटम में अधिकतम प्रभाव था (अंजीर। 1b), ओबी में कोई प्रभाव नहीं था (अंजीर। 3c).

  

  

(a) प्लाज्मा इंसुलिन एकाग्रता सकारात्मक खिला समूहों के साथ शरीर के वजन के साथ सहसंबद्ध है (R= 0.76)। (b) औसत एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o एनएसी कोर में (देखें) अनुपूरक चित्र। 2a, बी NA (शेल और सीपीयू) के लिए FR (38 UM 4%) और OB (25 N 4%) बनाम AL () में कम थाn= 50-60 5 साइटों से - आहार समूह प्रति 6 चूहों, F_2,156= एक्सएनयूएमएक्स, वन-वे एनोवा, टुकी एचएसडी; ***P<0.001); ओबी बनाम एफआर (P<0.08)। (c) विकसित की संवेदनशीलता [डीए]_o इंसुलिन को एफआर में बढ़ाया गया था, लेकिन ओबी में खो गया (n= 21-49 प्रति एकाग्रता में 2 से 4 साइट्स प्रति आहार समूह, एक तरफ़ा ANOVA, Tukey HSD), सभी बनाम (सब) में FR बनाम AL चूहों में अधिक संवेदनशीलता के साथPप्रत्येक क्षेत्र के लिए <0.001; दो-तरफ़ा एनोवा; सी पी यू: F_{(संक्षिप्त × आहार; 3,286)}= 10.253; कोर: F_{(संक्षिप्त × आहार; 3,353)}= 6.166; खोल: F_{(संक्षिप्त × आहार; 3,195)}= 10.735)।

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ये डेटा स्ट्राइटल InsR संवेदनशीलता और शरीर की वसा के बीच एक विपरीत संबंध है। वैकल्पिक रूप से, हालांकि, ये आहार-निर्भर अंतर परिवर्तित nAChR संवेदनशीलता को दर्शा सकते हैं। इसलिए हमने प्रत्येक आहार समूह से एनएके कोर में निकोटीन के लिए एकाग्रता की प्रतिक्रिया निर्धारित की। निकोटीन एनएसीएचआर डिसेन्सिटाइजेशन का कारण बनता है, जिसे [डीए] के अनुपात की तुलना करके निर्धारित किया जा सकता है_o 100 Hz पर पाँच दालों की एक संक्षिप्त ट्रेन द्वारा एकल-पल्स-इवोक की गई [DA]_o (5 p: 1 p अनुपात) nAChR सक्रियण / डिसेन्सिटाइजेशन के सूचकांक के रूप में^{30, 31}। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने NAC कोर में nAChR संवेदनशीलता में आहार समूहों के बीच कोई अंतर नहीं पाया (अनुपूरक चित्र। 3a-c)। इसके अलावा, 5 p को नियंत्रित करें: NAN कोर में आहार समूहों के बीच 1 p अनुपात अलग नहीं था (अनुपूरक चित्र। 3d) या सीपीयू (सचित्र नहीं), जिसका अर्थ है कि आहार nAChR पर निर्भर DA रिलीज़ विनियमन में परिवर्तन नहीं करता है। इस प्रकार, स्ट्रेटल इंसर्ट संवेदनशीलता को एफआर बनाम एएल चूहों में बढ़ाया जाना प्रतीत होता है, लेकिन ओबी चूहों में अनुपस्थित है, इंसुलिन की शारीरिक सांद्रता पर स्ट्राइटल डीए रिलीज के विनियमन के नुकसान के साथ।

NAC शैल इंसुलिन वातानुकूलित स्वाद वरीयता को नियंत्रित करता है

भोजन की प्राथमिकताएं पूर्व और पश्चात के दोनों कारकों द्वारा उत्पन्न होती हैं; प्रत्येक के लिए तंत्र पूरी तरह से हल नहीं हुआ है, लेकिन वर्तमान साक्ष्य दोनों में NAc DA सिग्नलिंग को दर्शाता है^{37, 38}। यह देखते हुए कि परिधीय ग्लूकोज ऊंचाई बढ़ने के बाद प्लाज्मा और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) इंसुलिन का स्तर तेजी से बढ़ता है⁶, और यह कि स्ट्रेटम में इंसुलिन की वृद्धि प्लाज्मा इंसुलिन ऊंचाई के 5 मिनट के भीतर पता लगाया जा सकता है⁷, यह परिकल्पना करने के लिए तर्कसंगत है कि एक भोजन के दौरान परिधीय इंसुलिन रिलीज NA डीए रिलीज को बढ़ा सकता है और पश्चात इनाम तंत्र में योगदान कर सकता है। हमने पहले वर्णित स्वाद-वरीयता प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया³⁷ चूहों में saccharin- मीठा ग्लूकोज समाधान के साथ परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए कि एनएसी में एक इंसुलिन एंटीबॉडी (InsAb) के स्थानीय अनुप्रयोग के माध्यम से अंतर्जात इंसुलिन के प्रभाव को अवरुद्ध करता है, युग्मित स्वाद के लिए वरीयता में कमी करेगा। इंसुलिन के प्रभाव को अवरुद्ध करने में इंसा की प्रभावकारिता का परीक्षण किया गया था इन विट्रो में स्ट्रैटेड सिनैप्टोसोम में डीए अप्टेक की परख। इंसुलिन (30 nM) में उल्लेखनीय वृद्धि हुई V_{मैक्स} एनएपी या सीपीयू से सिनैप्टोसोम में (अनुपूरक चित्र), हमारे साथ संगत V_{मैक्स} स्ट्राइटल स्लाइस से डेटा (टेबल 1) और पिछले अध्ययनों के साथ^{18, 19, 20, 21, 22, 23}। इंसुलिन की अनुपस्थिति में, न तो InsAb और न ही एक नियंत्रण एंटीबॉडी इम्युनोग्लोबुलिन जी (IgG) ने बदल दिया V_{मैक्स} डीए अपटेक बनाम नियंत्रण के लिए। आईजीजी की उपस्थिति में, इंसुलिन अभी भी एक महत्वपूर्ण वृद्धि का कारण बना V_{मैक्स}; हालांकि, इंसुलिन के प्रभाव पर V_{मैक्स} इनसब की उपस्थिति में खो गया था (अनुपूरक चित्र).

ऊतक की क्षति को कम करने और ऊतक लक्ष्य की संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए, विषयों के दो समूहों का परीक्षण किया गया था जिसमें हमने मॉक माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के साथ इंट्रा-एनएके माइक्रोनिनिज़्म को वैकल्पिक किया, बजाय विषयों के एक समूह का उपयोग करने और इनसब के साथ एक सुगंधित समाधान बाँधने के साथ और दूसरा वाहन। नतीजतन, एक-बोतल-कंडीशनिंग सत्रों के दौरान, प्रायोगिक समूह को दो स्वादों में से एक के साथ रखा गया इनसब माइक्रोइंजेक्शन मिला, और बारी-बारी सेशन पर, अन्य स्वादों के साथ मॉक माइक्रिनोजेक्शंस जोड़े गए (अंजीर। 4a, बाएं)। नियंत्रण समूह को फॉस्फेट-बफर सलाइन (पीबीएस) या आईजीजी के माइक्रिनोजेक्शंस के साथ वैकल्पिक रूप से मॉक माइक्रिनोजेक्शन प्राप्त हुए। दोनों सुगंधित समाधानों में कंडीशनिंग के दौरान ग्लूकोज होता है। फ्लेवर के बीच कोई अंतर पसंद नियंत्रण-माइक्रोइंजेक्ट समूह में अपेक्षित नहीं था, जबकि इंसब-माइक्रो-इंजेक्शन समूह में मॉक माइक्रिनिजेन्स-युग्मित स्वाद की ओर शिफ्ट करने की अपेक्षा की गई थी।

  

  

(a) आरेख एक-बोतल कंडीशनिंग (बाएं) और दो-बोतल परीक्षण (दाएं) को दिखाता है। (b) एक-बोतल-कंडीशनिंग सत्र के दौरान खपत (एमएल)। जलसेक कंडीशनिंग सत्र और microinjection उपचार के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत थी (n= 19-20 प्रति समूह चूहे, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 मिश्रित जलसेतु कंडीशनिंग सत्र पर दोहराया उपायों के साथ मिश्रित एनोवा)। तीसरे के दौरान नियंत्रण की तुलना में InsAb microinjection की खपत में काफी कमी आई (t(40) = 3.026, **P<0.01) और चौथा (t(40) = 3.052, **P<0.01, संरक्षित एक-पूंछ t(ट्स) infusions। समूह में खपत पर नकली इंजेक्शन का कोई प्रभाव नहीं पड़ा (F_3,111= 1.110, 2 × 4 ने मॉक कंडीशनिंग सत्र पर दोहराए गए उपायों के साथ ANOVA को मिलाया)। (c) दो-बोतल स्वाद-वरीयता परीक्षण के दौरान खपत की गई मात्रा। कंडीशनिंग के दौरान फ्लेवर और माइक्रोइंजेक्शन उपचार के बीच एक महत्वपूर्ण सहभागिता थी (F_1,37= 5.36, P<0.05, स्वाद पर दोहराया उपायों के साथ दो-तरफ़ा मिश्रित एनोवा)। InsAb समूह ने नकली-स्वाद वाले स्वाद की तुलना में InsAb- युग्मित स्वाद का काफी कम उपभोग किया (t(18) = 2.82, ** पी<0.01, संरक्षित एक-पूंछ t-परीक्षा); नियंत्रण समूह ने कोई स्वाद पसंद नहीं दिखाया (t(19) = 0.803, P> 0.05, संरक्षित t-परीक्षा)। समूहों की तुलना में, InsAb चूहों ने आसव-युग्मित स्वाद का काफी कम पिया (t(40) = 1.96, *P<0.05) और नकली जोड़े के स्वाद का अधिक (t(40) = 1.77, *P<0.05, संरक्षित एक-पूंछ t-test) नियंत्रणों से।

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एक-बोतल कंडीशनिंग सत्र के दौरान, InsAb microinjection ने तीसरे और चौथे उल्लंघन के दौरान वाहन की तुलना में खपत को काफी कम कर दिया (अंजीर। 4b)। इसके विपरीत, दोनों समूहों ने सभी चार नकली इंजेक्शन सत्रों के दौरान समान मात्रा में घोल का सेवन किया (F_3,111= 0.127, P>0.05, मिश्रित टू-वे एनोवा) (अंजीर। 4b)। कुल आठ कंडीशनिंग सत्रों के बाद, दो-बोतल परीक्षण में स्वाद वरीयता का मूल्यांकन किया गया था जिसमें चूहों ने एक साथ दोनों स्वाद वाले समाधानों तक पहुंच प्राप्त की थी;अंजीर। 4a)। सांख्यिकीय विश्लेषण ने स्वाद और कंडीशनिंग के दौरान प्राप्त माइक्रोएनिज़्म उपचार के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत का खुलासा किया (अंजीर। 4c)। InsAb समूह ने नकली-स्वाद वाले स्वाद की तुलना में InsAb- युग्मित स्वाद का काफी कम उपभोग किया (अंजीर। 4c), जबकि वाहन समूह ने कोई स्वाद पसंद नहीं दिखाया (अंजीर। 4c), का अर्थ है कि बरकरार इंसुलिन संकेतन एक मधुर कैलोरी समाधान के चयन में योगदान दिया। वाहन की तुलना में, InsAb-microinjected चूहों ने जलसेक-युक्त स्वाद का काफी कम और नकली-इंजेक्शन-युग्मित स्वाद का काफी कम पिया (अंजीर। 4c)। आईजीजी की सूक्ष्मता (t(9) = 0.792। P>0.05, संरक्षित t-tests) या पीबीएस (t(9) = 0.442। P>0.05, संरक्षित t-tests) स्वाद वरीयता (दिखाया नहीं डेटा) पर कोई प्रभाव नहीं था, इस संभावना के खिलाफ तर्क है कि InsAb microinjection का एक बकवास प्रभाव खपत या स्वाद वरीयता में कमी आई है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि परीक्षण में InsAb समूह की प्राथमिकता कम उपन्यास स्वाद के लिए एक प्राथमिकता नहीं है, क्योंकि InsAb समूह के लिए सत्र और सत्र प्रकार (वास्तविक जलसेक बनाम नकली जलसेक) के बीच कोई बातचीत नहीं थी (F_3,54= 1.584, P> 0.05, टू-वे एनोवा)। अर्थात्, InsAb समूह ने InsAb जलसेक-युग्मित स्वाद के सापेक्ष नकली-जलसेक-युग्मित स्वाद का अधिक सेवन नहीं किया; बल्कि, उपचार समूहों के बीच अंतर केवल जलसेक कंडीशनिंग सत्र के दौरान उभरा। कुल मिलाकर, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि NAC में इंसुलिन एक स्वाद के लिए वरीयता के सुदृढीकरण में एक भूमिका निभाता है जो ग्लाइसेमिक लोड को इंगित करता है।

हम यहाँ रिपोर्ट करते हैं कि इंसुलिन स्ट्राइक डीए रिलीज़ को एनएसीएचआर-डिपेंडेंट तरीके से इंसुलिन के माध्यम से ChI excitability को संशोधित करके बढ़ाता है। हमारे परिणाम यह संकेत देते हैं कि इंसुलिन एक इनाम संकेत के रूप में काम कर सकता है, सिग्नलिंग तृप्ति में इसकी स्थापित भूमिका के अलावा। विशेष रूप से, डीए रिलीज़ पर इंसुलिन का प्रभाव एफआर के बाद इंसुलिन के लिए संवेदनशीलता में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ आहार द्वारा संशोधित किया जाता है, लेकिन एक ओबी आहार पर इंसुलिन-बढ़ाया विनियमन का एक पूरा नुकसान। इन परिवर्तनों से इंसुलर संवेदनशीलता में परिवर्तन दिखाई देते हैं जो कि इंसुलिन के स्तर के परिसंचारी से संबंधित हैं, यह देखते हुए कि प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर आहार पर निर्भर पाया गया था, लेकिन एनएसीएचआर संवेदनशीलता नहीं थी। अंत में, जानवरों के साथ व्यवहार करने में हमारी स्वाद-वरीयता अध्ययन का अर्थ है कि NAc शेल में इंसुलिन सिग्नलिंग भोजन की प्राथमिकता को प्रभावित करता है, जो न केवल भोजन से संबंधित सीखने में इंसुलिन को दर्शाता है, बल्कि एक इनाम संकेत के रूप में इसकी भूमिका की पुष्टि करता है।

नेट [डीए]_o डीए के माध्यम से डीए रिलीज़ और डीए के बीच संतुलन को दर्शाता है। पिछले सबूत दिखाते हैं कि इंसुलिन डीएटी गतिविधि को नियंत्रित कर सकता है^{18, 19, 20, 21, 22, 23} इस भविष्यवाणी के कारण कि इंसुलिन में वृद्धि से पैदा होने वाले शुद्ध में कमी आनी चाहिए [DA]_o के माध्यम से बढ़ा हुआ डीए अपटेक। हालांकि, हमने पाया कि स्ट्रिएटम में, इंसुलिन का प्रभाव इससे अधिक जटिल है। हालांकि इंसुलिन एक्सपोज़र बढ़ गया V_{मैक्स} डीएटी के लिए, इंसुलिन का प्राथमिक प्रभाव डीए रिलीज पर था, डीए अपटेक पर नहीं, विकसित डीए में लगातार वृद्धि के साथ।]_o एनएसी शेल और कोर में और सीपीयू में इंसुलिन सांद्रता की एक शारीरिक सीमा के पार। हालांकि विकसित में वृद्धि [डीए]_o 100 nM के एक सुपरसियोलॉजिकल सांद्रता पर स्तरों को नियंत्रित करने के लिए वापस किया, V_{मैक्स} यह भी नियंत्रण से अपरिवर्तित था, स्पष्टीकरण के रूप में डीएटी पर एक प्रमुख प्रभाव को समाप्त करता है। इसके बजाय, अपटेक पर प्रभाव के नुकसान के साथ-साथ उच्च इंसुलिन सांद्रता पर InsRs के डिसेन्सिटाइजेशन या डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्ग के अपचयन को दर्शाता है। दरअसल, इंसुलिन तेजी से एंडोसाइटोसिस से गुजरता है और परिधीय ऊतकों में इंसुलिन बंधन के बाद गिरावट¹इंसुलिन या उच्च कैलोरी आहार के उच्च स्तर के लिए अल्पकालिक जोखिम के बाद न्यूरोनल इंसर्ट संवेदनशीलता के नुकसान के लिए उभरते सबूत के साथ।^{10, 11, 39}.

स्ट्राइटल डीए रिलीज को बढ़ाने के लिए इंसुलिन का प्रमुख प्रभाव यहां बताया गया है कि हाल ही में दो अन्य परिणामों के साथ विरोधाभास है पूर्व विवो स्लाइस की पढ़ाई। पहले में, इंसुलिन की कमी से विद्युत प्रवाह में कमी आई।³एच] डीए स्ट्रैटल स्लाइस से, हालांकि बढ़ा [³एच] डीए अतिप्रवाह का पता लगाया गया था जब डीएटी को बाधित किया गया था²²। यह देखते हुए कि जारी [³H] DA को डीएटी-मध्यस्थता से बचना चाहिए ताकि ऊतक में सुपरफ्यूजिंग समाधान का पता लगाया जा सके, यह प्रोटोकॉल DAT विनियमन के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है। हमारे परिणाम दिखाते हैं कि इंसुलिन डीए-मध्यस्थता को बढ़ाने के अलावा, ची और एनएसीएचआर सक्रियण के माध्यम से डीए रिलीज को बढ़ाता है, इंसुलिन-वृद्धि में प्रतीत होता है विरोधाभासी वृद्धि को समझाएगा [³एच] डीए अतिप्रवाह देखा जब डीएटी पर प्रतिस्पर्धा के प्रभाव को अवरुद्ध किया गया था²²। वीटीए में सोमाटोडेंड्रिटिक डीए रिलीज़ के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए दूसरे अध्ययन में एफसीवी का इस्तेमाल किया गया, लेकिन डीए अपटेक पर इंसुलिन का एक प्रमुख प्रभाव भी पाया गया, जो कम हो गए [डीए] में परिलक्षित हुआ।_o (रेफरी। 23)। कई कारकों में अंतर, स्थानीय माइक्रोकैक्रिट्री से सोमेटोडेंड्रिटिक बनाम एक्सोनल डीए रिलीज तंत्र⁴⁰, इस क्षेत्रीय अंतर में योगदान दे सकता है। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, हालांकि, विरोधाभासी के बजाय इंसुलिन की क्षेत्रीय निर्भर भूमिकाएं पूरक होने की संभावना है।

इससे पहले, डीए सिग्नलिंग के इंसुलिन-निर्भर विनियमन की किसी भी भूमिका को डीए न्यूरॉन्स पर इंसआर की प्रत्यक्ष सक्रियता द्वारा मध्यस्थता माना जाता था। हम यहां दिखाते हैं कि स्ट्राइटल ChI पर InsR भी व्यक्त किए गए हैं, और यह कि इंसुलिन ChI excitability को स्ट्राइटल डीए रिलीज़ को बढ़ाता है, जो आहार पर इंसुलिन के प्रभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। स्ट्रैटैटल ChIs को थैलेमस के इंट्रालामिनर नाभिक के न्यूरॉन्स से अनुमान प्राप्त होते हैं, जो सेल्युलर संवेदी उत्तेजनाओं के जवाब में फट फायरिंग का प्रदर्शन करते हैं और ChIs में ड्राइव बर्स्ट-पॉज स्पाइकिंग पैटर्न में मदद करते हैं जो ध्यान, सुदृढीकरण और साहचर्य सीखने के निर्देशन में महत्वपूर्ण हैं।⁴¹। इसलिए, स्ट्राइटल ChI पर InsRs पर इंसुलिन की कार्रवाई थैलेमिक फायरिंग के लिए स्ट्रैटल रिस्पांसिबिलिटी पर संवेदी भोजन संकेतों के प्रभाव को बढ़ा सकती है, जो एक अंतर्वर्धित भोजन के इनाम मूल्य की बढ़ती धारणा में योगदान करती है। चाई सक्रियण द्वारा स्ट्राइटल डीए रिलीज़ को सीधे बढ़ावा देने से यह सुझाव मिला है कि ची को प्रोत्साहित करने वाले कारकों में डीए रिलीज़ के ट्रिगर के रूप में एक विशेषाधिकार प्राप्त भूमिका होगी।³³। हमारा डेटा इसके लिए पहला सहायक साक्ष्य प्रदान करता है, जिसमें डीए रिलीज़ में इंसुलिन-एन्हांस्ड ChI एक्साइटेबिलिटी और ACh सिग्नलिंग ड्राइविंग डायनामिक वृद्धि होती है।

इंसुलिन की उपस्थिति में उन्नत डीए रिलीज़ एसीएच सिग्नलिंग में एक हद तक वृद्धि के खिलाफ भी तर्क देता है जो एनएसीएचआर डिसेन्सिटाइजेशन या मस्कैरेनिक एसीएच रिसेप्टर (एमएसीएचआर) सक्रियण का कारण बनता है, जिनमें से कोई भी एकल-नाड़ी-विकसित [डीए] को दबा सकता है।_o (refs 29, 30, 31, 42)। इस प्रकार, यहां बताए गए तंत्र mAChRs के ACh सक्रियण से अलग हैं, जो कि विक्षेप और तृप्ति से जुड़ा हुआ है⁴³.

एकल-नाड़ी-विकसित [डीए]_o एएल चूहों की तुलना में एफआर और ओबी दोनों चूहों में कम था; हालांकि ये परिणाम पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं^{44, 45, 46}, हमारे अध्ययनों से निरंतर समय सीमा पर दो आहार समूहों में तीन स्ट्राइटल उपनगरों की पहली व्यवस्थित तुलना प्रदान की जाती है। डीए रिलीज़ में आहार-निर्भर परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट नहीं किया गया है, और वर्तमान अध्ययन के दायरे से परे हैं। हालांकि, यह देखते हुए कि प्लाज्मा इंसुलिन का स्तर एफआर और ओबी आहार द्वारा विपरीत रूप से बदल दिया जाता है, यह संभावना नहीं है कि कम हो गया है [डीए]_o दोनों समूहों में आहार पर निर्भर इंसुलिन के स्तर का परिणाम है।

दूसरी ओर, आहार और परिणामी आहार पर निर्भर प्लाज्मा इंसुलिन के स्तर के साथ इंसआर संवेदनशीलता में परिवर्तन एफआर में इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि और ओबी में इंसुलिन के प्रति जवाबदेही के नुकसान के लिए सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण प्रदान करता है। AL या OB चूहों बनाम AL में परिवर्तित nAChR संवेदनशीलता के वैकल्पिक स्पष्टीकरण के लिए कोई सबूत नहीं था। हालांकि हमारे निष्कर्ष FR के साथ बढ़ी हुई स्ट्राइटल InsR संवेदनशीलता को इंगित करने वाले पहले हैं¹⁸, सीएसएफ में इंसुलिन के स्तर में कमी के साथ वजन घट सकता है⁷, जो एफआर में इंसुलिन के लिए डीए रिलीज की बढ़ी संवेदनशीलता में योगदान देगा। इसके विपरीत, ओबी चूहों में इंसुलिन प्रतिक्रियाशीलता में कमी, मस्तिष्क के कम होने के लिए पिछले साक्ष्य के अनुरूप है, जो वजन बढ़ाने या ओबी आहार से प्रेरित है।^{3, 10, 11}.

हमारे पूर्व विवो स्लाइस डेटा परिकल्पना का समर्थन करता है कि इंसुलिन इनाम के साथ-साथ तृप्ति का संकेत दे सकता है। हमने स्वाद-वरीयता कंडीशनिंग के दौरान NAC खोल में द्विपक्षीय InsAb microinjection के साथ अंतर्जात इंसुलिन के प्रभाव को अवरुद्ध करके इस परिकल्पना का परीक्षण किया। इनाम में एक भूमिका के अनुरूप, इंसुलिन के प्रभाव को अवरुद्ध करने से एक जोड़ा ग्लूकोज युक्त घोल बनाम बरकरार इंसुलिन सिग्नलिंग से जुड़े स्वाद के लिए वरीयता कम हो गई। एनएसी शेल में इंसुलिन को अवरुद्ध करने से एक-बोतल कंडीशनिंग के दौरान एक युग्मित समाधान की खपत में कमी आई, जबकि नकली या नियंत्रण माइक्रोइंजेक्शन का उपभोग पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा। ये आंकड़े बताते हैं कि NAC शेल में इंसुलिन भोजन की प्राथमिकता में भूमिका निभाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एनएसी में बरकरार डीए सिग्नलिंग स्वाद कंडीशनिंग के अधिग्रहण के लिए आवश्यक है^{37, 38}पौष्टिक समाधानों के मजबूत प्रभावों की मध्यस्थता में NA DA के लिए एक भूमिका की पुष्टि करता है। इस प्रकाश में, बरकरार इंसुलिन की उपलब्धता के साथ ग्लूकोज समाधान के लिए वरीयता, NAC शेल में DAT की मध्यस्थता वाले डीए अपटेक पर इंसुलिन के प्राथमिक प्रभाव के खिलाफ तर्क देती है, क्योंकि इससे कमी होने की उम्मीद होगी [डीए]_o और इसलिए नियंत्रण-युग्मित स्वाद की खपत को कम करें। हमारे परिणाम पिछले अध्ययन से भी सुसंगत हैं, जिसमें NAc खोल में इंसुलिन की सूक्ष्मता से समय बढ़ जाता है, जो जानवर मौखिक सुक्रोज स्व-प्रशासन में लगे हुए थे, सुक्रोज की खपत में सीमा वृद्धि के साथ²⁶, जो बढ़े हुए डीए अपटेक के अपेक्षित परिणाम के विपरीत था। कुल मिलाकर, ये व्यवहार संबंधी डेटा स्ट्राइटल ChIs और इंसुलेटेड DA रिलीज़ पर इंसुलिन के पूर्वानुमानित प्रभाव के अनुरूप हैं। हालाँकि, ये परिणाम मॉनिटर किए गए व्यवहारों में स्ट्राइटल माइक्रोकैक्रिट्री के अन्य तत्वों की भागीदारी को शामिल नहीं करते हैं, पूरे स्ट्रैटम में व्यापक रूप से InsR अभिव्यक्ति दी गई है।^{1, 14}.

यहां बताए गए अध्ययन पहला सबूत प्रदान करते हैं कि इंसुलिन कैलोरी मान को संप्रेषित करने में एक भूमिका निभाता है, और इसलिए एक भोजन के पुरस्कृत प्रभाव, जो कम वजन और मोटे दोनों विषयों में इंसुलिन के प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि भोजन के पश्चात प्रभाव, चाहे स्वाद पारगमन पथ बरकरार हैं⁴⁷, एनएसी डीए रिलीज और व्यवहार के सकारात्मक सुदृढीकरण को बढ़ाएं^{37, 47}। इस प्रकार, पोस्ट-एब्सेप्टिव इंसुलिन प्रतिक्रिया भोजन की ग्लाइसेमिक उपज को कूटबद्ध कर सकती है और भोजन की वरीयताओं और व्यवहारों के सुदृढीकरण में योगदान करती है जो उपभोग को सक्षम बनाती हैं। हालांकि, इंसुलिन के स्तर और केंद्रीय InsR संवेदनशीलता के प्रसार में चरम परिवर्तन असामान्य और साथ ही अनुकूली व्यवहार में एक भूमिका हो सकती है। उदाहरण के लिए, एफआर विषयों में हाइपोन्सुलिनाइमिया और इंसपिरेटरी संवेदनशीलता का प्रतिपूरक अपचयन द्वि घातुमान के लिए उनके स्वभाव का कारक हो सकता है⁴⁸। इसके विपरीत, टाइप II डायबिटीज या मोटापे में केंद्रीय इंसुलिन की असंवेदनशीलता, ओबी चूहों में यहां दिखाई देती है, जो घूस के बाद इनाम की कमी की भावना में योगदान कर सकती है, मुआवजे के रूप में उच्च ग्लाइसेमिक इंडेक्स वाले खाद्य पदार्थों का सेवन^{49, 50}। इसलिए, या तो स्ट्रैटल इंसुलिन संवेदनशीलता में वृद्धि या कमी पैथोलॉजिकल खाने में योगदान कर सकती है, जिसके परिणामस्वरूप द्वि घातुमान खाने और / या मोटापा हो सकता है।

कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्ष इनाम के संकेत के रूप में इंसुलिन के लिए एक नई भूमिका को प्रकट करते हैं। इस तरह की भूमिका अपने ज्ञात कार्य के साथ एक तृप्ति संकेत के रूप में विरोधाभासी है, जिसमें हालिया निष्कर्ष शामिल हैं कि वीटीए में इंसुलिन माइक्रोइंजेक्ट किया गया, भोजन के प्रतिफल से जुड़े संकेतों के लिए हेडोनिक खिला और वरीयता में कमी कर सकता है।^{23, 24}। इससे यह सवाल उठता है कि इन डीए-आश्रित कार्यों में इंसुलिन के लिए भूमिका का विरोध कैसे प्रतीत होता है। इसका उत्तर यह हो सकता है कि ये प्रभाव विरोधाभासी होने के बजाय पूरक हैं। वर्तमान परिणाम दर्शाते हैं कि स्ट्रिएटम में इंसुलिन एक अंतर्वर्धित भोजन के इनाम मूल्य का संचार करता है। तृप्ति को इंगित करने में एक दोहरी भूमिका बस इंसुलिन को भोजन को समाप्त करने के महत्वपूर्ण उद्देश्य की पूर्ति करने की अनुमति दे सकती है, साथ ही साथ इसके पोषण और इस तरह से पुरस्कृत गुणों की स्मृति स्थापित करती है, जिससे निगलना व्यवहार को दोहराता है।

जानवरों की संभाल

पशु प्रक्रिया NIH दिशानिर्देशों के अनुसार थी और NYU स्कूल ऑफ़ मेडिसिन एनिमल केयर एंड यूज़ कमेटी द्वारा अनुमोदित थी। सभी जानवर 12 h प्रकाश पर थे: 06 से रोशनी के साथ अंधेरा चक्र: 00 से 18: 00; पूर्व विवो 08: 00 और 12: 00 के बीच स्लाइस तैयार किए गए थे। AL चूहों और चूहों में यंत्रवत अध्ययन किया गया पूर्व विवो जानवरों के स्लाइस जोड़े में रखे गए थे, जबकि चूहों को सभी आहार समूह की तुलना और व्यवहारिक अध्ययन के लिए अकेले रखा गया था।

चूहे आहार आहार लेते हैं

वयस्क नर स्प्राग-डवले चूहों (टैकोनिक) एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स थे, जो आहार आहार के दीक्षा के समय पुराने एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स सप्ताह थे। चूहों को अर्ध-बेतरतीब ढंग से आहार समूहों को सौंपा गया था: विषयों को शुरुआती वजन से रैंक किया गया था, फिर चूहों के प्रत्येक क्रमिक तिकड़ी को आहार समूहों के बीच यादृच्छिक रूप से वितरित किया गया था। एएल चूहों को एफआर या ओबी आहार पर युग्मित चूहों के रूप में उसी अवधि के लिए चूहे के लिए मुफ्त पहुंच थी। सभी चूहों की पानी तक मुफ्त पहुंच थी। खाद्य प्रतिबंध पहले की तरह लागू था⁵¹; संक्षेप में, चूहों को 40-50% मानक मात्रा में चूहे के सेवन का प्रतिदिन प्राप्त हुआ, जब तक कि शरीर का वजन 20% से कम नहीं हो गया, जिसके बाद इस वजन को बनाए रखने के लिए भोजन का शीर्षक दिया गया। OB चूहों को चूहा चाउ और चॉकलेट सुनिश्चित करने के लिए मुफ्त पहुंच थी, मध्यम वसा और चीनी के साथ एक अत्यधिक स्वादिष्ट तरल⁵².

अग्रमस्तिष्क चैट अति आकर्षक माइस

एक सशर्त फ्लक्स एलील के साथ चूहे चैट (चैट^flox) के साथ पार किया गया Nkx2.1^Cre ट्रांसजेनिक लाइन चूहों का उत्पादन करने के लिए जिसमें एसीएच संश्लेषण का निषेध मना करने के लिए प्रतिबंधित है³²। गैर-उत्परिवर्ती ट्रांसजेनिक कूड़े के नियंत्रण थे; उनके जीनोटाइप Cre⁺;चैट^{flox / +} और Cre^-;चैट^{flox / flox} 'हेटेरोजाइट्स' के रूप में जाना जाता है। स्लाइस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले वयस्क नर चूहों में थे बिना तैयारी के चाउ और पानी के लिए उपयोग।

पूर्व विवो स्लाइस तैयारी और शारीरिक समाधान

चूहों या चूहों को एक्सएनयूएमएक्स मिलीग्राम किलोग्राम के साथ गहराई से अनावरण किया गया था^-1 पेंटोबार्बिटल (इंट्रापेरिटोनियल (आईपी)) और डीपैटिटेटेड। वोल्टामेट्री के लिए, कोरोनल फॉरब्रेन स्लाइस (300 – 400-μm मोटाई) को एक Leica VT1200S हिल ब्लेड माइक्रोटेम (Leica माइक्रोसिस्टम्स; बन्नॉकबर्न, IL) पर बर्फ़-ठंडी HEPES- बफर आर्टिफ़िशियल CSF (aCSF) युक्त (mM) में रखा गया था। (120); NaHCO₃ (20); ग्लूकोज (10); HEPES एसिड (6.7); KCl (5); HEPES सोडियम सॉल्ट (3.3); CaCl₂ (2); और MgSO₄ (2), 95% O के साथ संतुलित है₂/ 5% CO₂। प्रयोग से पहले 1 h के लिए कमरे के तापमान पर इस घोल में स्लाइस बनाए रखा गया था^{30, 32, 53}। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, एनेस्थेटाइजेशन के बाद, चूहों को आइस-कोल्ड सॉल्यूशन (एमएम में): सुक्रोज (एक्सएनयूएमएक्स) के साथ ट्रांसकार्डियल रूप से छिड़काव किया गया था; KCl (225); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); नः₂PO₄ (1.25); ग्लूकोज (7); एस्कॉर्बेट (1); और पायरुवेट (3), और 95% O के साथ संतुलित₂/ 5% CO₂। इस समाधान में स्लाइस काट दिए गए थे, फिर संशोधित aCSF युक्त एक पुनर्प्राप्ति कक्ष में स्थानांतरित (एमएम में): NaCl (125); KCl (2.5); नः₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); ग्लूकोज (25); एस्कॉर्बेट (1); पाइरूवेट (3); तथा मेरे ओ-inositol (4), 95% O के साथ संतुलित₂/ 5% CO₂; यह समाधान शुरू में 34 ° C पर था, फिर धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दी गई⁵⁴। सभी वोल्टमेट्री और फिजियोलॉजी प्रयोगों को एक्सएनयूएमएक्स एमएल मिनट पर एक्सनमएक्स डिग्री सेल्सियस पर एक निमज्जन रिकॉर्डिंग कक्ष में आयोजित किया गया था^-1 ACSF युक्त (mM में): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); के.एच.₂PO₄ (1.3); और ग्लूकोज (10), और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA, 0.05 – 0.1 mg)^-1) 95% O के साथ संतुलित₂/ 5% CO₂; प्रयोग से पहले 30 मिनट के लिए इस वातावरण में स्लाइस को संतुलित करने की अनुमति दी गई थी।

फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टमैट्री

मस्तिष्क के स्लाइस में एफसीवी का उपयोग करके खाली किए गए डीए रिलीज़ अध्ययन किए गए थे^{32, 53} पुरुष चूहों से तैयार या चैट फोरब्रेन नॉकआउट चूहों और हेटेरोज़ीगोट नियंत्रण (एक्सएनयूएमएक्स-एक्सएनयूएमएक्स सप्ताह)। में अध्ययन करता है चैट नॉकआउट चूहों को अंधा कर दिया गया था, लेकिन चूहे आहार समूहों में स्पष्ट फेनोटाइप थे जो अंधा कर रहे थे। वोल्टामेट्रिक माप एक मिलर वोल्टममीटर (सेंट जूलियन मिलर और रॉयल लंदन स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड डेंटिस्ट्री, लंदन विश्वविद्यालय) में डॉ। जूलियन मिलर के विशेष अनुरोध द्वारा उपलब्ध कराया गया था। एफसीवी के लिए एक पारंपरिक त्रिकोण तरंग का उपयोग किया गया था, जिसमें −0.7 की + 1.3 V (बनाम Ag / AgCl) की स्कैन रेंज के साथ, 800 V की स्कैन दर है^-1, और 100 एमएस का नमूना अंतराल^{30, 32, 53}। डेटा को एक DigiData 1200B ए / डी बोर्ड का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था जिसे क्लैम्पेक्स एक्सएनयूएमएक्स सॉफ्टवेयर (आणविक उपकरण) द्वारा नियंत्रित किया गया था। एक गाढ़ा उत्तेजक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके डीए रिलीज को रोक दिया गया था; उत्तेजना पल्स आयाम 7.0-0.4 mA और अवधि 0.6 μs थी^{30, 32, 53}। स्थानीय एकल-नाड़ी उत्तेजना का उपयोग NA कोर और सीपीयू में किया गया था; हालांकि, एक संक्षिप्त उच्च आवृत्ति वाली पल्स ट्रेन (एक्सएनयूएमएक्स हर्ट्ज पर पांच दालों) का इस्तेमाल उकसाने के लिए किया गया था [डीए]_o NAC खोल में। दोनों उत्तेजना प्रतिमान डीए रिलीज को उत्तेजित करते हैं जो कि कार्रवाई क्षमता और सीए है²⁺ निर्भर, समवर्ती रूप से जारी ग्लूटामेट और गाबा द्वारा अप्रभावित^{42, 55}, और समवर्ती जारी ACH द्वारा सुविधा^{29, 30, 31, 32, 33, 34}। विकसित की गई मात्रा [DA]_o, ACSF में प्रत्येक प्रयोग के बाद और दिए गए प्रयोग के दौरान उपयोग की जाने वाली प्रत्येक दवा की उपस्थिति में 32 ° C पर DA की ज्ञात सांद्रता के साथ इलेक्ट्रोड को कैलिब्रेट किया गया।⁵³.

विकसित किए गए [डीए] पर इंसुलिन के प्रभाव का आकलन करने के लिए वोल्टमेट्री प्रयोग_o दो प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किया गया। इंसुलिन (सिग्मा, I5523) के प्रभाव के समय के पाठ्यक्रम को निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों को डीएके द्वारा विकसित निगरानी द्वारा किया गया था।_o एक ही साइट में हर 5 मिनट। लगातार विकसित होने के बाद इंसुलिन लागू किया गया [डीए]_o प्राप्त किया गया था (आमतौर पर 4-5 माप); 50-60 मिनट के बाद इंसुलिन का प्रभाव अधिकतम था, और फिर [DA] विकसित हुआ_o प्रयोग की अवधि के लिए इस स्तर पर बने रहे (आमतौर पर 90 मिनट कुल इंसुलिन जोखिम; अंजीर। 1c)। इसके बाद, इन्सुलिन के प्रभाव का मूल्यांकन करके रिकॉर्डिंग को रोक दिया गया [DA]_o 4-5 स्लाइस में साइट (असत्यवस्था से + 1.5 मिमी) नियंत्रण शर्तों (aCSF या aCSF प्लस दवा) में से प्रत्येक में और फिर से अधिकतम इंसुलिन प्रभाव (60-80 मिनट से अधिक नमूना) के समय तीन अलग-अलग उपग्रहों में असतत साइटों। प्रत्येक नमूने के लिए ये नमूने औसत थे। स्लाइस की तैयारी के बाद समय के साथ इंसुलिन का प्रभाव कम हो गया; समय को कम करने के लिए पूर्व विवो और पशु उपयोग का अनुकूलन करने के लिए, आम तौर पर, दिए गए जानवर के दो स्लाइस को एक ही समय में रिकॉर्डिंग कक्ष में परीक्षण किया गया था। इंसुलिन के प्रभाव को चुनौती देने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली दवाएं HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM) सहित सुपरफ्यूज़िंग aCSF के माध्यम से इंसुलिन से पहले 15 मिनट लगाई जाती थीं_3; Enzo Life Sciences), S961 (नोवो नॉर्डिस्क), LY294002 (सिग्मा), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) और DHβE (Tocris)। जैसा कि परिणामों में वर्णित है, आहार समूहों के बीच निकोटिनिक ACh रिसेप्टर्स की संभावित परिवर्तित संवेदनशीलता का परीक्षण चोटी के अनुपात [DA] की तुलना द्वारा किया गया था।_o 5 p द्वारा विकसित किए गए 100 p (1 Hz) द्वारा विकसित (5 p: 1 p अनुपात)^{30, 31} 0-500 nM निकोटीन (सिग्मा) की उपस्थिति में NAc कोर में।

का संकल्प V _{मैक्स} विकसित [डीए] से_o स्ट्राइटल स्लाइस में रोगी

डीएटी की मध्यस्थता वाले डीए अपटेक में इंसुलिन-प्रेरित परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए, विकसित डीएके के गिरते चरण का प्रारंभिक भाग।_o घटता को निकालने के लिए माइकलिस-मेन्टेन समीकरण के लिए फिट किया गया था V_{मैक्स} (अधिकतम वृद्धि दर स्थिर)⁵⁶. K_m (जो डीए के लिए डीएटी की आत्मीयता से विपरीत रूप से संबंधित है) 0.2 μM पर तय किया गया था और इसे स्ट्राइटल उप-क्षेत्रों में समान माना जाता है⁵⁷ और इंसुलिन से अप्रभावित (देखें) अनुपूरक चित्र कैप्शन)।

पूरे सेल रिकॉर्डिंग

ब्रेन स्लाइस एक्सएनयूएमएक्स- से एक्सएनयूएमएक्स-डे-पुराने पुरुष चूहों के लिए तैयार किए गए थे; रिकॉर्डिंग की स्थिति डीए रिलीज अध्ययन में इस्तेमाल किए गए समान थे। पूरे सेल वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग पारंपरिक तरीकों का इस्तेमाल किया⁵⁴। स्ट्रिपेटल ChIs को एक ओलिंप BX51WI माइक्रोस्कोप (ओलिंप अमेरिका, सेंटर वैली, PA) का उपयोग करके अवरक्त अंतर-हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी और एक × 40 जल-विसर्जन उद्देश्य के साथ कल्पना की गई थी। विंदुक समाधान निहित (एमएम में): के-ग्लूकोनेट (एक्सएनयूएमएक्स); KCl (129); HEPES (11); MgCl₂ (2); EGTA (1); ना₂-ATP (2); ना₃-GTP (0.3); और KOH के साथ पीएच 7.2 – 7.3 के लिए समायोजित। दर्ज न्यूरॉन्स ChAT immunoreactivity के लिए मूल्यांकन करने के लिए, पिपेट समाधान में 0.3% बायोसिटासिन को शामिल किया गया था और इंट्रासेल्युलर सामग्री के कमजोर पड़ने को कम करने के लिए न्यूरॉन्स को संक्षेप में दर्ज किया गया (~ 5 मिनट)। पिपेट प्रतिरोध ~ 3 – 5 M X था। रिकॉर्डिंग एक एक्सोपॉच 200B एम्पलीफायर (आणविक उपकरण, सनीवेल सीए) और 2 kHz पर कम-पास फ़िल्टर का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। ChI की पहचान स्थापित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मानदंडों द्वारा की गई थी²⁸; ज्यादातर शुरू में सक्रिय रूप से सक्रिय थे, लेकिन पैचिंग के बाद गतिविधि कम हो गई। हालांकि, वर्तमान इंजेक्शन के लिए जवाबदेही आम तौर पर समय के साथ मजबूत और सुसंगत थी, और इसलिए इसका उपयोग ChI excitability (परिणाम देखें) पर इंसुलिन के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था। इस प्रतिक्रिया में InsRs और IGF-1Rs की भूमिका की जांच करने के लिए प्रयोगों में, या तो HNMPA या PPP को कम से कम 20 मिनट के लिए लागू किया गया था इससे पहले कि एक ChI पैच किया गया था। अकेले इंसुलिन के मैक्सिमल प्रभाव आमतौर पर एक्सपोज़र के 16 मिनट के बाद देखे गए, हालांकि कुछ कोशिकाओं में, 50 मिनट या उससे अधिक समय तक वृद्धि अधिकतम नहीं थी। इसके अलावा, पीपीपी में दर्ज छह न्यूरॉन्स में से चार में, इंसुलिन ने स्पाइक संख्या को कम करने और स्पाइक संख्या को शुरू करने से अधिक होने से पहले एक प्रारंभिक कमी का कारण बना। नतीजतन, सभी प्रयोगों में, इंसुलिन आवेदन से तुरंत पहले निकाले गए स्पाइक्स की संख्या के साथ स्पाइक संख्या पर अधिकतम प्रभाव की तुलना करके इंसुलिन का प्रभाव निर्धारित किया गया था। चरम प्रभाव तक पहुंचने के समय में स्पष्ट अंतर कई कारकों को प्रतिबिंबित कर सकता है, जिसमें स्लाइस में दर्ज सेल की गहराई भी शामिल है। तुलनीय एक्शन पोटेंशिअल भी तुलनीय समय बिंदुओं पर इंसुलिन की अनुपस्थिति में ChIs में दर्ज किए गए थे।

उच्च उत्पादन द्रव्य वर्णलेखन

चूहे के स्ट्राइटल स्लाइस (400-)m मोटाई) का डीए सामग्री चुनावी पहचान के साथ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके निर्धारित किया गया था⁵⁸। ACSF में 30 ° C पर 32 मिनट के लिए स्लाइस जोड़े को बराबर किया गया था, और फिर ACSF में 60 ° C पर एक अतिरिक्त 32 मिनट के लिए प्रति जोड़ी एक इनक्यूबेट किया गया, जबकि दूसरे को 10 या 30 nM इंसुलिन के साथ aCSF में लगाया गया था। आहार समूह की तुलना के लिए, 30 – 60 न्यूनतम पोस्ट-रिकवरी के बीच स्ट्राइटल ऊतक एकत्र किया गया था। ऊष्मायन के बाद, स्लाइस से अतिरिक्त एसीसीएफ को सावधानीपूर्वक हटा दिया गया, स्ट्राइटल टिशू (7 – 10 mg) का एक नमूना तौला गया, जिसे सूखी बर्फ पर जमी और फिर at80 ° C पर संग्रहीत किया गया। विश्लेषण के दिन, आर्गन के साथ नमूनों को बर्फ-ठंड, eluent, deoxygenated में सोनिक किया गया था⁵⁸, 2 मिनट के लिए एक microcentrifuge में घूमती है, और सतह पर तैरनेवाला सीधे एचपीएलसी कॉलम (बेस, पश्चिम Lafayette, IN) पर इंजेक्ट किया जाता है; डिटेक्टर 0.7 V बनाम Ag / AgCl में एक आकर्षक कार्बन इलेक्ट्रोड था।

इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग के लिए, चूहों को सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 mg) के अंडे के साथ बदल दिया गया था^-1, आईपी), तो पीबीएस (154 एमएम फॉस्फेट बफर, पीएच 10 में 7.2 एमएम NaCl) के साथ perfused transcardial इस पीबीएस में 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा किया; दिमाग हटा दिए गए थे और कोरोनल सेक्शन (20 )m) को काटकर पारंपरिक रूप से संसाधित किया गया था^{27, 59}। Immunofluorescence छवियों को स्पॉट सॉफ्टवेयर (डायग्नोस्टिक इंस्ट्रूमेंट्स इंक) द्वारा नियंत्रित डिजिटल कैमरा और × 800 उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 100) और एक Zeiss LSM 1.4 confocal खुर्दबीन के साथ × 510 का उपयोग करके डिजिटल कैमरा से लैस निकॉन पीएम 63 कन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था। उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 1.2)। लेज़रों आर्गन (488 एनएम), वह / ने (543 एनएम) और वह / नेन (633 एनएम) थे। प्रत्येक लेजर के लिए उपयुक्त फिल्टर को कंफोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर द्वारा चुना गया था। में प्रयुक्त उद्देश्य और अनुभाग मोटाई के साथ पिनहोल का आकार भिन्न होता है z-स्टैक पीढ़ी; हमने सॉफ्टवेयर द्वारा इंगित इष्टतम पिनहोल मान (आमतौर पर 30 μm) को चुना। डिजिटल फाइलों का विश्लेषण डेकोनेवोल्यूशन सॉफ्टवेयर (ऑटोक्वांट इमेजिंग) के साथ किया गया, जिसमें अंतिम चित्र एडोब फोटोशॉप एक्सएनयूएमएक्स का उपयोग करके संसाधित किए गए थे। सभी छवियों को चमक और कंट्रास्ट के लिए समायोजित किया गया था; इस तरह के समायोजन छवि के सभी भागों में समान रूप से किए गए थे। स्ट्राइटल डीए अक्षतंतुओं को दो TH एंटीबॉडी का उपयोग करके पहचाना गया था: पॉलीक्लोनल AB7.0 खरगोश विरोधी TH (152: 1) और मोनोक्लोनल MAB800 माउस एंटी-TH (318): 1) (दोनों Chemicon से)। तीन InsR एंटीबॉडी का उपयोग किया गया: sc-500 और sc-57342 (09: NNUMX; सांता क्रूज़), और PP1 (फाइजर का एक उपहार)। प्रत्येक की विशिष्टता पहले प्रदर्शित की गई है^{60, 61}, और इसी ब्लॉकिंग पेप्टाइड की उपस्थिति में एंटीबॉडी sc-57342 या PP5 के साथ इम्युनोलैबेलिंग की अनुपस्थिति से वर्तमान अध्ययनों में पुष्टि की गई थी। चट एंटीबॉडी AB144 (1: 200; मिलिपोर) थी, और बायोटिन वेक्टर (1: 200) से थी। द्वितीयक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था जो गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा एक्सएनयूएमएक्स (इनविट्रोजन), या गधा एंटी-खरगोश Cy488 (जैक्सन लेबोरेटरी, बार हार्बर, एमई), गधा विरोधी बकरी Cy2 (जैक्सन और गधा विरोधी Cy3 (जैक्सन)) थे।

TH + axons में InsRs के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए, हमने पहले बताए गए तरीकों का इस्तेमाल किया, जो कि एटीपी-संवेदी के के पोर-गठन सबयुनिट Kir6.2 की उपस्थिति की पहचान करते हैं।⁺ डीए अक्षतंतु में चैनल²⁷। Inscts का प्रतिनिधित्व करने वाले पंक्टा को पूरे समायोजित चित्रों में वितरित किया गया था, जो दर्शाता है कि TH इम्युनोरेक्टिविटी के साथ सुपरइम्पोजिशन संयोग से कुछ हद तक हो सकता है। इस धारणा का परीक्षण करने के लिए, हमने दो चूहों से तीन NAc इम्यूनोलैबल्ड सेक्शन में 42 स्वतंत्र क्षेत्रों में InsR / TH सुपरिमपोसिशन की गणना की। InsR डिजिटल फ़ाइलों को तब 90 ° दक्षिणावर्त घुमाया गया और बार-बार गिना गया; रोटेशन से इन्सआर पंक्टा की संख्या में कमी आई, जो कि ज्यादातर क्षेत्रों में TH के साथ सह-स्थानीयकृत है (परिणाम देखें)। रोटेशन के साथ सुपरइम्पोज़िशन की संख्या में कमी²⁷ डीए अक्षतंतु के साथ जुड़े प्रत्येक स्ट्राइटल क्षेत्र में इंसआर पंक्टा के अनुपात को इंगित करता है।

रक्त ग्लूकोज और इंसुलिन एलिसा

टुकड़ा अध्ययन के लिए सड़न के समय ट्रंक रक्त एकत्र किया गया था। रक्त शर्करा को एक मानक रक्त शर्करा मॉनिटर के साथ तुरंत निर्धारित किया गया था। इंसुलिन के लिए, अतिरिक्त रक्त को EDTA युक्त ट्यूबों में एकत्र किया गया और 1,500 पर सेंट्रीफ्यूज किया गयाg 15 मिनट के लिए; सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा) एकत्र किया गया था और Rat80 ° C पर संग्रहीत किया गया था जब तक कि एक ALPCO Rat इंसुलिन एलिसा किट के साथ प्रसंस्करण नहीं किया गया था।

प्रवेशनी और हिस्टोलॉजिकल सत्यापन

चालीस एक वयस्क नर स्प्रागे-डावले चूहों (टैकोनिक और चार्ल्स रिवर) का शुरू में वजन 350-425 g को केटामाइन (100 mg kg) के साथ anaesthetized किया गया था।^-1, आईपी) और xylazine (10 मिलीग्राम किग्रा)^-1, आईपी) और स्टीरियोटेक्सिक रूप से दो क्रोनिक रूप से इंडवेलिंग गाइड कैन्युला (26 गेज) के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है, जो द्विपक्षीय रूप से 2.0 मिमी पृष्ठीय को NAc औसत दर्जे के खोल में आसव स्थलों पर रखा गया है⁶² (1.6 मिमी पूर्वकाल में ब्रेग्मा; 2.1 मिमी पार्श्व धनु के सिवनी के लिए, युक्तियों ने 8 ° को मिडलाइन की ओर, 5.8 मिमी वेंट्राल को खोपड़ी की सतह की ओर खींचा)। चूहों को केलामाइन (2.0 mg kg) दिया गया^-1, चमड़े के नीचे) संज्ञाहरण और बाद सुबह से वसूली के बाद शल्य चिकित्सा एनाल्जेसिक के रूप में। सर्जरी के एक सप्ताह बाद, चूहों को एफआर (ऊपर वर्णित) पर रखा गया था और अध्ययन के शेष के लिए सर्जिकल रिकवरी वजन के 80% पर बनाए रखा गया था। व्यवहार परीक्षण पूरा होने के बाद कैनुला प्लेसमेंट को हिस्टोलॉजिकल रूप से निर्धारित किया गया था। प्रत्येक चूहे को सीओ के साथ मार दिया गया था₂, विघटित और मस्तिष्क को हटा दिया और 10% बफर फॉर्मलिन में तय किया>> 48 घंटे के लिए। फ्रोजन कोरोनल सेक्शन (40-thicknessm मोटाई) एक रीचर्ट-जंग क्रायोस्टेट पर काट दिया गया था, जिलेटिन-लेपित ग्लास स्लाइड्स पर घुड़सवार, और cresyl वायलेट के साथ दाग। किसी दिए गए चूहे के डेटा का उपयोग केवल तब किया जाता था जब दोनों प्रवेशिका औसत दर्जे का NA खोल के भीतर होती थी⁶² (शेल / कोर या शेल / घ्राण ट्यूबरकल बॉर्डर सहित) (अनुपूरक चित्र); इन मानदंडों के आधार पर, दो चूहों को अंतिम विश्लेषण से बाहर रखा गया था।

स्वाद-प्राथमिकता कंडीशनिंग पूर्व-जोखिम

चूहों ने रात भर (घर के पिंजरे में) और एक्सएनयूएमएक्स% सोडियम सैकरिन (सिग्मा) पूर्व-एक्सपोज़र (चैम्बर में परीक्षण) के छह एक्स-एमएन-मिनट-प्रति-दिन सत्रों के बीच एक 30-h अंतराल के साथ पानी में प्राप्त किया। चूहों ने तब 0.2% सोडियम सेक्रिन में एक्सनमएक्स% सोडियम सैचरिन के संपर्क में आने के दो एक्सएनयूएमएक्स-मिनट-प्रति-दिन सत्रों को प्राप्त किया और पानी में चेरी कूल-एड (क्राफ्ट फूड्स) को अनवीकृत किया। पहले कूल-एड प्री-एक्सपोज़र सेशन के लिए, चूहों में से आधे को चेरी-फ्लेवर्ड सॉल्यूशन मिला, और दूसरे आधे को ग्रे-फ्लेवर्ड सॉल्यूशन मिला। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी चूहों ने प्रत्येक स्वाद का नमूना लिया है, दूसरे कूल-एड प्री-एक्सपोज़र सेशन पर फ्लेवर्स को उलट दिया गया। इंटेक को सभी पूर्व-जोखिम सत्रों के लिए मापा गया था। परीक्षण कक्ष ताजा बिस्तर के साथ स्पष्ट प्लास्टिक के पिंजरे थे। सभी पूर्व-जोखिम सत्रों के लिए, चूहों को कक्ष के दोनों किनारों पर एक ही समाधान तक पहुंच थी। ओवरनाइट एक्सपोज़र सेशन को छोड़कर, किसी भी प्रशिक्षण या परीक्षण से पहले सभी सत्रों का संचालन व्यवहार कक्ष में किया गया था, जिसमें 48-min वास अवधि थी।

एक-बोतल कंडीशनिंग

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इंट्रोमेडियल हाइपोथैलेमस में इंसब की माइक्रोबिनेंस खिला व्यवहार और ग्लूकागन स्राव पर इंसुलिन के प्रभाव को रोक सकती है^{63, 64}। यहां हमने भोजन की पसंद के सुदृढीकरण में इंसुलिन की संभावित भूमिका का आकलन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग किया। चूहों को दो समूहों, नियंत्रण या प्रयोगात्मक (InsAb) में औसत पूर्व-जोखिम सेवन मात्रा के आधार पर अर्ध-बेतरतीब ढंग से सौंपा गया था। नियंत्रण समूह में, चूहों को वाहन (माइक्रोइन्जेक्शन पीबीएस; एक्सएनयूएमएक्स एमएम NaCl और एक्सएनयूएमएक्स एमएम केएलएक्स इन एक्सएनयूएमएक्स एमएम फॉस्फेट बफर) या आईजीजी (एबीकॉम एक्सएक्सएनयूएमएक्स; एक्सएमयूएमएक्स एक्सजीएमजी);^-1 पीबीएस में, के रूप में प्राप्त) दो स्वाद समाधानों में से एक का उपभोग करने से पहले NAC खोल में microinjection, और अन्य स्वाद समाधान का उपभोग करने से पहले एक नकली microinjection। प्रायोगिक समूह में, चूहों ने एनएसीबी एनएसी शेल माइक्रोबिनिज़्म प्राप्त किया (एबीकैम एक्सएक्सएनयूएमएक्स; एक्सएनयूएमएक्स एक्सजीएनएमएक्स एक्सजीयूएमएक्स μl^-1 पीबीएस में, जैसा कि एक स्वाद के समाधान के संपर्क में आने से पहले, और दूसरे के लिए माइक्रोएरिजेंस पूर्व संपर्क में आने से पहले। द्रव माइक्रोनिन्जेशन और मॉक माइक्रिनिजेन्स के बीच वैकल्पिक के साथ विषयों के दो सेटों का उपयोग किया गया था, जिससे कि माइक्रोइंजेक्शन की कुल संख्या चार तक सीमित हो गई, जिससे सूक्ष्म ऊतक साइट पर संभव ऊतक क्षति और संवेदनशीलता का नुकसान कम हो गया।⁶⁵। द्रव माइक्रोएन्जेशन के लिए, नियंत्रण समाधान या InsAb को दो 30-cm लंबाई में PE-50 टयूबिंग में लोड किया गया था, जो एक छोर पर 5 μl हैमिल्टन सिरिंज में आसुत जल से भरा हुआ था और दूसरे छोर पर 31-गेज इंजेक्टर कैनुला में था, जिसने 2.0 मिमी बढ़ाया प्रत्यारोपित गाइड से परे। 0.5 μl आसव खंड 90 μl s की दर से 0.005 s पर वितरित किए गए थे^-1; इंजेक्टर को ~ 60 के प्रसार के लिए समय देने के लिए जगह में छोड़ दिया गया था, फिर इंजेक्टर को स्टाइललेट से बदल दिया गया था।

माइक्रोइंजेक्शन या मॉक माइक्रिनजेन्सी के पूरा होने के 2 मिनट के भीतर चूहों को सीधे व्यवहार कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया। कंडीशनिंग समाधान में 0.2% सोडियम सैचरीन, 0.05% अनचाहे अंगूर या चेरी कूल-एड और 0.8% ग्लूकोज शामिल थे। समाधान पहुंच प्रति सत्र 30 मिनट तक सीमित थी। पीने के उपयोग के साथ चैम्बर की जोड़ीदार स्वाद और पक्ष प्रत्येक समूह में अर्ध-बेतरतीब ढंग से असाइन और असंतुलित थे। Microinjections के बीच अंतराल कम से कम 72 एच था, जो कुल आठ कंडीशनिंग सत्रों के लिए आसव और नकली सत्रों के बीच बारी-बारी से होता था।

दो-बोतल वरीयता परीक्षण

पिछले कंडीशनिंग सत्र के अड़तालीस घंटे बाद, चूहों को दोनों कंडीशनिंग स्वादों के लिए एक साथ उपयोग के साथ कक्षों का परीक्षण करने के लिए रखा गया था; समाधान बिना ग्लूकोज के 0.2% अंगूर या चेरी कूल-एड में 0.05% सोडियम सैचरिन थे। परीक्षण 2 दिनों (प्रति दिन 60 मिनट) पर हुआ। मॉक-युग्मित या जलसेक-युग्मित समाधान वाले पेय ट्यूब की स्थिति को यह सुनिश्चित करने के लिए वैकल्पिक किया गया था कि पिंजरे के दोनों किनारों पर प्रत्येक समाधान की खपत के लिए प्रत्येक चूहे का परीक्षण किया गया था। वरीयता निर्धारित करने के लिए दो परीक्षण दिनों के लिए प्रत्येक सुगंधित समाधान का सेवन औसतन किया गया था।

[³एच] डीएए इनटेक प्रभावोत्पादकता का आकलन करने के लिए स्ट्रिपलेटेड सिनैप्टोसोम में उत्थान करता है

स्ट्राइटल सिनैप्टोसोम^{21, 66} AL चूहों (नर, 350-400 g) से NAc (शेल और कोर) और CPu को अलग-अलग तैयार करके तैयार किया गया था। प्रत्येक क्षेत्र के ऊतक को मोटर-चालित टेफ्लोन मूसल के साथ एक ग्लास होमोजेनाइज़र में एक बर्फ-ठंडा एक्सएनयूएमएक्स एम सुक्रोज समाधान के एक्सएनयूएमएक्स संस्करणों में समरूप किया गया था; रिंसिंग और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, अंतिम गोली को बर्फ के ठंडे 15 M सूक्रोज में फिर से निलंबित कर दिया गया था^{21, 66}। आरंभ करने से पहले [³ज] डीए अपटेक परख⁶⁶, सिन्थेटोसोमल एलिकोट्स की कुल मात्रा में 180 μl के अपटेक बफर को 15 मिनट के लिए 30 ° C में 30 nM इंसुलिन की अनुपस्थिति या वाहन (PBS) में या InsAb (अंतिम कमजोर पड़ने वाले 1) में हिलाया जाता है। , IgG (अंतिम कमजोर पड़ने वाले 500: 1) या वाहन में। ऊपर बफर (एमएम में) निहित: NaCl (500); ना₂HPO₄ (3); नः₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); ग्लूकोज (10), CaCl₂ (1); नियालैमाइड (0.01); ट्रोपोलोन (0.1); और एस्कॉर्बिक एसिड (0.001), पीएच 7.4। के ऊपर [³H] DA को X के-एक्सएमयूएमएक्स μM और [के अलग-अलग सांद्रता वाले 20-well प्लेटों में प्रत्येक सिनैप्टोसोमल सस्पेंशन के 96 μl को तेजी से फैलाने के द्वारा शुरू किया गया था।³एच] डीए (एक्सएनयूएमएक्स एनएम); 5 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लेट-शेकर में 5 मिनट के बाद, ठंड, तेजी से वैक्यूम निस्पंदन द्वारा तेज को समाप्त कर दिया गया था⁶⁶। प्रति कुओं की गणना को दोपहर के भोजन में बदल दिया गया, फिर प्रति मिनट कुल प्रोटीन की मिलीग्राम तक सही किया गया। सभी assays को तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया और कम से कम चार बार दोहराया गया; V_{मैक्स} और K_m बायोसॉफ्ट केल रेडिग सॉफ्टवेयर (कैम्ब्रिज, यूके) का उपयोग करके गणना की गई।

सांख्यिकीय विश्लेषण

डेटा given सेमी के रूप में दिया जाता है; महत्त्व का आंकलन युग्मित या अप्रभावित छात्र के उपयोग से किया गया था t-स्टेस्ट या एनोवा, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए। वोल्टामेट्री डेटा के लिए, n रिकॉर्डिंग साइटों की संख्या है, यह देखते हुए कि साइट-टू-साइट परिवर्तनशीलता एक स्ट्राइटल सबग्रोन के भीतर अंतर-पशु या अंतर-स्लाइस परिवर्तनशीलता से अधिक है^{30, 32, 55, 56}; पशु संख्या प्रत्येक डेटा सेट के लिए नोट की जाती है। चुनाव आयोग ने₅₀ इंसुलिन और निकोटीन के प्रभाव के लिए चरम-विकसित [डीए]_o प्रिज्म 6.0 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए) का उपयोग करके गणना की गई थी। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा के लिए, युग्मित का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व का आकलन किया गया था tप्रिज्म 6.0 में -tests या विलकॉक्सन टेस्ट, या SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) में मिश्रित दो-तरफ़ा एनोवा। स्वाद-वरीयता कंडीशनिंग में इंसुलिन की भागीदारी के मूल्यांकन के लिए, दो पूर्ण अध्ययन प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूरा किए गए थे जो कि वाहन उपचार के अपवाद के साथ समान थे। पहले अध्ययन में, 10 चूहों को PBS के वाहन infusions और 9 को InsAB के infusions प्राप्त हुए। दूसरे अध्ययन में, 10 चूहों ने IgG के वाहन infusions और 10 ने InsAb के infusions प्राप्त किए। आसव-कंडीशनिंग सत्र के दौरान दो वाहन समूहों (पीबीएस या आईजीजी) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (F₁₉= 0.619, इन्फ्यूजन-कंडीशनिंग सत्र पर दोहराए गए उपायों के साथ मिश्रित दो तरह ANOVA) या परीक्षण में (F₁₉= 0.012, स्वाद पर दोहराया उपायों के साथ दो-तरफ़ा मिश्रित एनोवा)। नतीजतन, दोनों प्रयोगों को विश्लेषण के लिए संयुक्त किया गया था। इस विश्लेषण के लिए, एक 2 × 4 मिश्रित ANOVA (जलसेक-कंडीशनिंग दिन पर दोहराए गए उपायों के साथ) का उपयोग कंडीशनिंग के दौरान माइक्रोइंजेक्शन उपचार के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसके बाद संरक्षित किया गया था। t-स्टेस्ट (यह निर्धारित करने के लिए कि कौन सा कंडीशनिंग माइक्रोएनिज़्म ट्रीटमेंट इंटेक वॉल्यूम घटा दिया गया है)। उसी विश्लेषण को मॉक कंडीशनिंग सत्रों के लिए पूरा किया गया। दो-बोतल स्वाद-वरीयता परीक्षण के दौरान कंडीशनिंग उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, मिश्रित दो-तरफ़ा एनोवा (स्वाद पर बार-बार उपाय के साथ), संरक्षित द्वारा डेटा का विश्लेषण किया गया। t-tests (इंसब को वरीयता में कमी होगी कि परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए एक पूंछ)।

इस लेख का हवाला कैसे दें: स्टॉफ़र, एमए एट अल। इंसुलिन स्ट्राइटल डोपामाइन रिलीज को बढ़ाता है, जिससे कोलीनर्जिक इंटिरियरन सक्रिय होता है और जिससे इनाम मिलता है। नेट। commun। 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015)।

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ये अध्ययन NIH अनुदान DA033811 (MER, KDC और MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) और एक NARSAD इंडिपेंडेंट इन्वेस्टिगेटर अवार्ड (KDC) द्वारा समर्थित थे। एसएक्सएनयूएमएक्स डॉ। गेज शेफ़र, नोवो नॉर्डिस्क का एक उदार उपहार था। PP961 एंटीबॉडी Pfizer का एक उदार उपहार था। हम डॉ। चार्ल्स निकोलसन, NYU स्कूल ऑफ़ मेडिसिन को सॉफ्टवेयर को निकालने के लिए धन्यवाद देते हैं V_{मैक्स} FCV डेटा से मान।