DeltaFosB posredno regulira aktivnost Cck promotora (2010)

Mozak Res. 2010 svibanj 6; 1329: 10 – 20.

Objavljeno na mreži 2010 ožujka 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ i Colleen A. McClung^{2, *}

Informacije o autoru ► Informacije o autorskim pravima i licenci ►

Konačna uređena verzija izdavača ovog članka dostupna je na Brain Res

Pogledajte ostale članke u PMC-u navodi objavljenom članku.

Sažetak

Čini se da su neke važne biokemijske, strukturne i ponašajne promjene izazvane kroničnim izlaganjem lijekovima zlouporabe posredovane visoko stabilnim transkripcijskim faktorom ΔFosB. Dosadašnji rad je pokazao da prekomjerna ekspresija ΔFosB u miševa za 2 tjedna dovodi do povećanja ekspresije brojnih gena u striatumu, od kojih je većina kasnije smanjena nakon 8 tjedana ΔFosB ekspresije. Zanimljivo je da je veliki broj ovih gena također bio reguliran u miševima koji su prekomjerno eksprimirali transkripcijski faktor CREB. Međutim, iz ove studije nije bilo jasno je li kratkoročni ΔFosB regulirao te gene putem CREB-a. Ovdje nalazimo da 2 tjedna ΔFosB prekomjerne ekspresije povećava izražaj CREB-a u striatumu, efekt koji se raspršuje do 8 tjedana, Rana indukcija povezana je s povećanim vezanjem CREB-a na određene promotore ciljnog gena u ovom području mozga. Iznenađujuće, jedan gen koji je bio sumnjiv CREB cilj na temelju prethodnih izvješća, cholecystokinin (Cck), nije bio pod kontrolom CREB u striatumu. Za daljnje istraživanje propisa CCK nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB, potvrdili smo da kratkotrajna prekomjerna ekspresija ΔFosB povećava i CCK aktivnost promotora i ekspresija gena. Također povećava aktivnost vezanja na pretpostavljenom CREB veznom mjestu (CRE) u CCK promotor. Međutim, dok je CRE mjesto potrebno za normalnu bazalnu ekspresiju CCK, nije potrebna za indukciju ΔFosB od CCK, Uzeti zajedno, ovi rezultati upućuju na to da, iako kratkotrajna indukcija ΔFosB povećava ekspresiju i aktivnost CREB kod određenih promotora gena, to nije jedini mehanizam kojim se geni reguliraju pod tim uvjetima.

ključne riječi: nucleus accumbens, transkripcija, ovisnost

UVOD

Kronična izloženost drogama uzrokuje biokemijske i strukturne promjene u nekoliko područja mozga. Smatra se da te promjene uključuju promjene u profilima ekspresije gena u mezolimbičkom sustavu. Ovaj je sustav sastavljen od dopaminergičkih neurona koji projiciraju iz ventralnog tegmentalnog područja (VTA) u srednjem mozgu do srednjih neurona kralježnice u nucleus accumbens (NAc) (trbušni striatum) kao i brojne druge regije mozga. Izmjene u aktivnosti dvaju transkripcijskih faktora, vezni protein cAMP odgovora (CREB) i ΔFosB (protein Fos obitelji), predložene su kao posrednik u mnogim biokemijskim, strukturnim i ponašajnim promjenama koje se vide kod kronične izloženosti lijekovima zlostavljanja ( pregledao / la Nestler, 2005).

CREB je sveprisutno izražen transkripcijski faktor koji je član CREB / ATF obitelji. CREB homodimeri vežu se za varijacije CRE sekvence (konsenzus: TGACGTCA) koja se nalazi u promotorima mnogih gena. Fosforilacija CREB-a (uglavnom u serinu 133, iako su identificirana druga mjesta) može se stimulirati s nekoliko signalnih kaskada uključujući one nizvodno od dopaminskih receptora (Cole i sur., 1995). Nakon fosforilacije u serinu 133, CREB regrutira ko-aktivatorski CREB vezujući protein (CBP) ili srodne proteine što dovodi do povećane ekspresije gena (pregledano Johannessen et al., 2004). Kronična izloženost opijatima ili psihostimulantima koji uzrokuju zlouporabu uzrokuje prolazno povećanje aktivnosti CREB-a u nucleus accumbens (Barrot i sur., 2002; Shaw-Lutchman i sur., 2002, 2003), misli se na prilagodbu kako bi se smanjila korisna svojstva tih lijekova i doprinijelo negativnom emocionalnom stanju povlačenja droge (Nestler, 2005).

LSmatra se da su onger-trajne prilagodbe na lijekove zlostavljanja djelomično posredovane ΔFosB, visoko stabilnom spojenom varijantom FosB-a (Nestler et al., 1999; McClung i sur., 2004; Nestler, 2008). Članovi obitelji Fos dimeriziraju se s članovima Jun obitelji kako bi se formirao aktivacijski protein 1 (AP-1) kompleks. AP-1 transkripcijski kompleksi vežu se za varijacije AP-1 elementa odgovora (konsenzus: TGACTCA) za regulaciju transkripcije (pregledao Chinenov i Kerppola, 2001). Dok akutna izloženost zlouporabi droga dovodi do kratkotrajne indukcije (sati) članova Fos-obitelji (kao i povećane aktivnosti CREB-a), ponovljena izloženost lijeku dovodi do nakupljanja visoko stabilnog ΔFosB (Hope i sur., 1994; Perrotti i sur., 2008), čiji izraz traje tjednima.

Bi-transgeni miševi koji induciraju prekomjernu ekspresiju ΔFosB ili CREB u striatumu odraslih pokazuju mnoge od biokemijskih i bihevioralnih fenotipa viđenih kod životinja izloženih više puta psihostimulansima ili drugim lijekovima zlouporabe. Analiza promjena ekspresije gena kod ovih transgeničnih životinja identificirala je brojne gene koji su regulirani kratkotrajnom (2 tjedana) prekomjernom ekspresijom ΔFosB, promjene povezane s popratnim smanjenjem nagrade lijeku. Promjene u ekspresiji gena i reakciji ponašanja s kratkotrajnim ΔFosB bile su izrazito slične onima koje se vide u životinja koje su prekomjerno eksprimirale CREB za 2 ili 8 tjedanaMcClung i Nestler, 2003). U iznimnom kontrastu, dugotrajna prekomjerna ekspresija (8 tjedana) ΔFosB smanjila je ekspresiju mnogih istih gena i dovela do povećanja nagrade lijeku (Kelz i sur., 1999; McClung i Nestler, 2003).

Jedan gen identificiran u ovim studijama je kolecistokinin (CCK), neuropeptid proizveden u nekoliko područja mozga, uključujući striatum (Hokfelt i sur., 1980). CCK može modulirati dopaminergički prijenos (Vaccarino, 1992), uključen je u nagrađivanje lijekova i pojačanje (Josselyn et al., 1996; Josselyn i sur., 1997; Hamilton i sur., 2000; Beinfeld i sur., 2002; Rotzinger et al., 2002), te je u striatumu induciran kroničnim kokainom (Ding i Mocchetti, 1992). Dodatno CCK Pokazano je da promotor odgovara na CREB i AP-1 komplekse (Haun i Dixon, 1990; Deavall i suradnici: 2000; Hansen, 2001). Od mnogih gena (uključujući CCK) koji su pokazali povećanu ekspresiju nakon CREB i kratkotrajne ekspresije ΔFosB bili su poznati ili se sumnjalo na CREB ciljne gene (McClung i Nestler, 2003), željeli smo odrediti da li kratkotrajna ekspresija ΔFosB dovodi do regulacije ovih gena (s naglaskom na CCK) kroz regulaciju CREB-a ili kroz složenije mehanizme regulacije gena.

REZULTATI

Prekomjerna ekspresija ΔFosB prolazno povećava razine CREB

Upotrijebili smo Western blotting za ispitivanje da li prekomjerna ekspresija ΔFosB povećava razinu CREB proteina u striatumu miševa. Za ovu studiju koristili smo bi-transgene miševe (linija 11A) koji nose i NSE-TTA transgen i TetOp-ΔFosB transgen. U odsutnosti doksiciklina, ovi miševi pokazuju snažno povećanje ekspresije ΔFosB u pozitivnim neuronima dynorphina u striatumu (Kelz i sur., 1999). Ova metoda prekomjerne ekspresije ΔFosB je opsežno dokumentirana i omogućuje regresijski specifičnu prekomjernu ekspresiju, što je paralelno s indukcijom ΔFosB u životinja izloženih kroničnom kokainu (Hope i sur., 1994; Kelz i sur., 1999). Otkrili smo da su kod 11A miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB, razine CREB proteina bile značajno povišene nakon 2 tjedana ekspresije i te su se razine vratile na početnu vrijednost nakon 8 tjedana izražavanja (Slika 1A, n = 8). Da bismo utvrdili mogu li se promjene razina CREB-a s kratkotrajnom prekomjernom ekspresijom ΔFosB ponoviti u drugom sustavu, privremeno smo prekomjerno izrazili ΔFosB u stanicama PC12 i ustanovili da su se razine CREB-a značajno povećale (p <0.05) u usporedbi s kontrolama (Slika 1B, n = 4). Ovi rezultati pokazuju da kratkotrajna ekspresija ΔFosB povećava razine CREB proteina.

CREB razine se povećavaju s prekomjernom ekspresijom ΔFosB. Western blot analiza lizata iz (A) miša striata iz 11A miševa off dox za 2 ili 8 tjedna ili (B) PC12 stanice prekomjerno eksprimiraju ΔFosB. Podaci u sustavu A prikazane su kao postotna promjena u usporedbi s off dox ...

I ΔFosB i CREB vežu se na promotore specifičnih ciljnih gena u striatumu nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB

Koristili smo ChIP (hromatin imunoprecipitacijske) testove striatalnog tkiva kako bismo odredili da li se ΔFosB ili CREB vezanje dogodilo na određenim promotorima ciljnog gena i ako se ovo vezanje povećalo nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB. Analizirali smo obvezujuće podatke za BDNF i CCK promotori, budući da su oba gena visoko regulirana nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB, prekomjerne ekspresije CREB ili kroničnog liječenja kokainom (McClung i Nestler, 2003). Također smo analizirali obvezujuće djelovanje CDK5 promotor, budući da je poznati izravni cilj ΔFosB (Chen i sur., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar i sur., 2005). Naposljetku, mjerili smo vezivanje na prodynorphin promotora, budući da su prethodne studije otkrile da ga mogu vezati i ΔFosB i CREB pod različitim uvjetima (Andersson i sur., 2001; Zachariou i sur., 2006).

ChIP analiza je izvedena na striati iz 11A miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB za 2 tjedana upotrebom antitijela koja prepoznaju CREB ili ΔFosB. U normalnim uvjetima otkrili smo da se ΔFosB veže za CDK5 i prodynorphin promotora, dok se ne može detektirati vezanje na BDNF or CCK promotori (Tablica 1). Nadalje, prekomjerna ekspresija ΔFosB povećala je vezanje ΔFosB na CDK5 promotor, ali ne i na prodynorphin promotor. Zatim smo izmjerili vezivanje CREB-a na tim promotorima i ustanovili da se CREB veže za CDK5, BDNF i prodynorphin promotori, ali ne i CCK promotora, u normalnom striatumu, te da prekomjerna ekspresija ΔFosB za 2 tjedana povećava vezivanje CREB-a na BDNF i prodynorphin promotori, ali ne i CDK5 promotor. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da se ΔFosB i CREB mogu vezati na određene promotore gena kao što su prodynorphin i CDK5međutim, vezivanje CREB je specifično za druge promotore kao što je BDNF, Nadalje, prekomjerna ekspresija ΔFosB dovodi do povećanja vezanja ΔFosB na određenim promotorima, kao što bi se očekivalo, ali i na vezanje CREB-a na specifične promotore, u skladu s indukcijom CREB-om posredovanog ΔFosB opaženom u ovom trenutku.

Vezanje pretpostavljenih regulatornih proteina za različite promotore u miševa koji prekomjerno eksprimiraju ΔFosB tijekom dva tjedna.

Dosadašnji rad je pokazao da su promjene u ekspresiji gena izazvane dugotrajnom prekomjernom ekspresijom ΔFosB povezane s modifikacijama kromatina, posebice acetilacijom histona H3, kod specifičnih promotora gena (Kumar i sur., 2005). Da bi se utvrdilo može li to objasniti promjene u ekspresiji gena nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB, izmjerili smo vezanje acetiliranog histona H3 (histonska modifikacija povezana s transkripcijski aktivnim kromatinom) ili metiliranog histona H3 (Lys9, modifikacija histona povezana s transkripcijskom analizom) neaktivni kromatin). Otkrili smo da je prekomjerna ekspresija ΔFosB za 2 tjedna rezultirala nikakvim promjenama u vezanju acetiliranog H3 na bilo kojem istraživanom genskom promotoru (Tablica 1). Ustanovili smo značajno smanjenje vezanja metiliranog histona H3 na prodynorphin promotor, ali ne i vezanje na CCK promotor i nema promjene u vezanju na CDK5 i BDNF promotori, što sugerira da to nije opći mehanizam kojim ΔFosB, u kratkom roku, regulira ekspresiju gena. Bili smo iznenađeni i zainteresirani za činjenicu da nismo pronašli nikakve razlike u našim ChIP testovima koji bi mogli objasniti povećanje CCK ekspresijom mRNA u 11A miševima nakon 2 tjedana ΔFosB ekspresije i odlučili su dalje istražiti ovaj mehanizam.

KratkoročniDFosB se povećava CCK izraz u više sustava

Karakterizacija mikro-tragova bi-transgenih miševa 11A s prekomjernom ekspresijom ΔFosB u striatumu pokazala je da CCK razine ekspresije povećavaju se nakon 2 tjedana prekomjerne ekspresije, a zatim se postupno smanjuju s dužim razdobljima izražavanja ΔFosB (Slika 2A, n = 3). Potvrdili smo ovaj učinak za CCK upotrebom PCR u stvarnom vremenu na zasebnoj skupini životinja u 2 i 8 tjednima i nađeno je da su rezultati u dvije vremenske točke slični analizi mikromreža (podaci nisu prikazani).

Kratkotrajna prekomjerna ekspresija ΔFosB se povećava CCK ekspresija gena. (A) CCK ekspresija mRNA u striatumu nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB u 11A miševa za 1, 2, 4 ili 8 tjedana. Analiza mikroprekidača provedena je na striatalnim uzorcima i CCK razina ...

Daljnje istraživanje sposobnosti ΔFosB da regulira CCK ekspresijom, koristili smo PC12 stanice prolazno transfektirane s a CCKreporterski plazmid -luciferaze i bilo ekspresijski plazmid ΔFosB ili jednaka količina pCDNA. Oba dva (n = 5-9) i tri (n = 11-13) dana ΔFosB prekomjerne ekspresije rezultirala su značajnim povećanjem CCKekspresija -luciferaze. Osim toga, tri dana prekomjerne ekspresije ΔFosB dovelo je do znatno više CCKindukcija fluciferaze u usporedbi s dva dana prekomjerne ekspresije (Slika 2B). Prekomjerna ekspresija ΔFosB nije izazvala ekspresiju luciferarazne konstrukcije bez promotora (podaci nisu prikazani). Ni pod kakvim uvjetima liječenja nije došlo do smanjenja CCK-luciferazna aktivnost očita. Ovi rezultati pokazuju da kratkotrajna ΔFosB ekspresija povećava aktivnost CCK promotor, i ostavlja bez odgovora mehanizam kojim dugotrajna ΔFosB prekomjerna ekspresija suzbija CCK izraz.

ΔFosB prekomjerna ekspresija povećava vezanje na pretpostavljenom mjestu vezanja CREB u CCK pokretač

Naše analize su to utvrdile CCK ekspresija se povećava nakon kratkotrajne ΔFosB ekspresije, međutim, naša ChIP ispitivanja utvrdila su da se ni CREB ni ΔFosB ne vežu na CCK promotor. Da bi se utvrdilo postoje li promjene u vezivanju proteina na CCK promotor nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB, upotrijebili smo testove pomaka elektroforetske pokretljivosti (EMSA) s sondom koja sadrži pretpostavljeno CRE-mjesto na kojem se nalazi unutar CCK promotor. Koristeći nuklearne ekstrakte strijata 11A miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB tijekom 2 tjedana, otkrili smo porast vezanja na pretpostavljeno CRE mjesto u CCK promotor (Slika 3 A, C, n = 4). Zanimljivo je da 11A miševi prekomjerno izražavaju ΔFosB tijekom 8 tjedana, koji pokazuju smanjenje u CCK ekspresija, također je pokazao pojačano vezivanje na ovom mjestu (Slika 3B, C, n = 4). Za usporedbu, ispitali smo vezivanje na konsenzusno CRE mjesto u miševima koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB tijekom 2 tjedana i otkrili smo čvrsto vezanje CRE u strijatalnim ekstraktima, ali nije došlo do povećanja vezanja nakon indukcije ΔFosB (Slika 3F, n = 4). Dakle, unatoč povećanju ukupnih razina CREB uzrokovanih ΔFosB-om u ovom trenutku, ovi rezultati su u skladu s našim ChIP testovima koji otkrivaju da je povećano vezanje CREB na promotore nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB specifično samo za određene gene i nije globalni fenomen , Da biste utvrdili je li CREB vezan za CCK promotor u našoj EMSA analizi, izveli smo supershift test sa CREB specifičnim antitijelom. U dogovoru s našim ChIP testovima, nismo našli nikakvo vezivanje CREB-a za a CCK sonda koja sadrži pretpostavljeno CRE mjesto u testu EMSA, dok je CREB značajno vezao i nadjačao suglasno CRE mjesto (Slika 3D, E, n = 4). Aktivnost vezanja DNA na CCK na promotor također nije utjecalo antitijelo na ΔFosB (podaci nisu prikazani), pod uvjetima prikazanima u nekoliko prethodnih studija za blokiranje vezanja ΔFosB na vjerodostojna mjesta AP-1 (Hope i sur., 1994a, 1994b; Chen i sur., 1995, Hiroi i sur., 1998). Također smo obavili ChIP testove na strijama 11A životinja nakon 8 tjedana ekspresije ΔFosB i još uvijek ne nalazimo vezanje CREB ili ΔFosB na CCK promotor (podaci nisu prikazani). Dakle, ekspresija ΔFosB dovodi do povećanja vezanja proteina na CCK promotor nakon 2 i 8 tjedana ekspresije; međutim, identitet ovih faktora ostaje nepoznat.

Vezanje proteina na CCK promotor. (A, B) Test pomicanja elektroforetske mobilnosti pomoću CCK Mjesto nalik CRE-u s prugastim tkivom životinja koje prekomjerno izražavaju ΔFosB tijekom 2 tjedana (A) ili 8 tjedana (B). U (A), konkurencija s viškom neprijavljenog natjecatelja ...

Pretpostavljeno CRE mjesto u sustavu CCK promotor nije odgovoran za pojačanu promotorsku aktivnost

Budući da smo pronašli povećanje vezanja proteina upotrebom fragmenta CCK promotor, koji sadrži pretpostavljenu CRE stranicu, nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB, željeli smo utvrditi je li ta stranica potrebna za povećano CCK izraz nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB. Da bismo testirali ovu mogućnost, transficirali smo PC12 stanice sa a CCK-luciferazni plazmid koji sadrži njegovo netaknuto mjesto nalik CRE ili onaj koji sadrži mutaciju na mjestu koja bi ukinula bilo kakvu interakciju s CREB-om. Zanimljivo je da je mutacija mjesta nalik CRE smanjila bazalnost CCK aktivnost promotora za 32% (Slika 4A, n = 9), ali nije utjecalo na CCK indukcija promotora prekomjernom ekspresijom ΔFosB (Slika 4B, n = 11-13). To sugerira da, iako CCK promotor zahtijeva intaktno mjesto nalik CRE-u za punu bazalnu aktivnost, pojačana promotorska aktivnost inducirana ΔFosB prekomjernom ekspresijom ne zahtijeva slijed sličan CRE-u.

Korištenje električnih romobila ističe CCKCRE mjesto poput CRE-a nije potrebno CCK indukcija pomoću ΔFosB. (A) CCKAktivnost -luciferaze mjerena je 2 dana nakon transfekcije bilo normalnom CCK-luciferaza ili ona kod koje je mutirano mjesto nalik na CRE. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos se veže za CCK pokretač

Prethodne studije su to utvrdile cfos mRNA se povećava s kratkoročnom ekspresijom ΔFosB, međutim, nakon duže ekspresije ΔFosB, sposobnost liječenja kokainom da inducira cFos u striatumu smanjuje se (McClung i Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Stoga je moguće da cFos doprinosi povećanju CCK izraz nakon kratkoročne ΔFosB ekspresije. Proveli smo ChIP probe s antitijelom specifičnim za cFos i izmjerili vezanje cFos na CCK promotor sa i bez kratkotrajne ekspresije ΔFosB. Dok smo otkrili da cFos se veže za CCK promotor, ovo vezanje se nije značajno povećalo nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB (Slika 5, n = 5). To sugerira da budući da cFos veže CCK može doprinijeti općoj regulaciji CCK izraz, ali vjerojatno nije uključen u regulaciju CCK promotor pomoću ΔFosB.

cFos se veže za CCK promotor. Ispitivanja imunoprecipitacije kromatinom provedena su s specifičnim antitijelima za cFos pomoću strijatalnog tkiva ΔFosB prekomjerno eksprimirajućih miševa ili na dox-u, ili nakon 2 tjedana dox uklanjanja. PCR analiza u stvarnom vremenu bila je ...

RASPRAVA

Ova studija potvrđuje i proširuje prethodne rezultate koji pokazuju da ΔFosB regulira ekspresiju gena u striatumu i nalazimo da to čini kroz višestruke mehanizme nakon kratkotrajne ekspresije. Pokazali smo da se nakon 2 tjedana prekomjerne ekspresije ΔFosB izravno veže na promotore u određenim genima što dovodi do promjena u ekspresiji (tj. CDK5). Nadalje, povećava razine CREB proteina, učinak uočenih u kultiviranim stanicama, kao iu striatumu, što dovodi do povećanog vezivanja CREB na drugim promotorima gena (tj. dinorfin i BDNF). U prethodnoj studiji, otkrili smo da kratkotrajna prekomjerna ekspresija ΔFosB u striatumu dovodi do mnogih istih promjena ekspresije gena koje se mogu naći kada je CREB prekomjerno eksprimiran i dovodi do sličnih reakcija u ponašanju u mjerama preferencije kokaina (McClung i Nestler, 2003). Stoga, sadašnji nalaz da ΔFosB dovodi do indukcije CREB-a, kao i vezanja CREB-a za određene promotore gena, pomaže da se objasni zašto su mnoge promjene ekspresije gena bile zajedničke za ova dva transkripcijska faktora.

Indukcija CREB-a pomoću ΔFosB je zanimljiva, budući da je pokazano da lijekovi koji uzrokuju zlostavljanje induciraju promjene u serinskim 133-fosforiliranim CREB razinama (Mattson i sur., 2005) i povećati CRE-posredovanu transkripciju (Barrot i sur., 2002; Shaw-Lutchman i sur., 2002, 2003), bez mijenjanja ukupnih razina CREB-a. Moguće je da promjene u razinama CREB-a budu prolazne i stoga lako propuštaju druge studije. U našim rukama vidjeli smo povećanja kRE-a mRNA u pojedinim eksperimentima, međutim, ovaj učinak je vrlo promjenjiv (neobjavljeno promatranje). Budući da i 11A transgenični miševi i PC-12 stanice pokazuju CREB indukciju nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB, to sugerira da je CREB doista induciran ΔFosB (ili metom ΔFosB), pružajući još jedan mehanizam koji objašnjava promjene uzrokovane lijekom u genu izraz.

Iznenađujuće, otkrili smo da se niti CREB ni ΔFosB ne vežu za CCK iako promotor CCK Izraz ekspresije jasno je povećan nakon kratkotrajne ekspresije ΔFosB. Cck je obilan neuropeptid izražen u VTA i NAc (Hokfelt i sur., 1980i vjerojatno je uključen u reakcije ponašanja na zlouporabe droga (Josselyn et al., 1996; Josselyn i sur., 1997; Hamilton i sur., 2000; Beinfeld i sur., 2002; Rotzinger et al., 2002). U analizama stanične kulture, CCK promotor je opširno karakteriziran i pokazalo se da odgovara na članove obitelji CREB i AP-1 (pregledao Hansen, 2001). Haun i Dixon (1990) pokazali su da se kompleksi AP-1 mogu vezati za CCK CRE mjesto poput vitro, a kasnije je pokazano, korištenjem SK-N-MC neuroblastomskih stanica, da mutacija CRE-sličnog mjesta smanjuje reakciju promotora na prekomjerno eksprimiranu cFos / cJun (Rourke i sur., 1999). Doista, mi također smatramo povećanim CCK aktivnost promotora (Slika 2) i obvezujuće na ili oko elementa sličnog CRE-u (Slika 3) nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB, drugog člana obitelji AP-1, ali ne nalazimo nikakvo izravno vezanje ΔFosB na CCK pokretač in vivo or vitro, čak i nakon prekomjerne ekspresije.

Mnogo je rada pokazalo ulogu CREB-a u regulaciji CCK aktivnost promotora. CCK CRE-slično mjesto je sačuvano kod kralježnjaka (Hansen, 2001) i, u nekim analizama stanične kulture, i CREB i AP-1 kompleksi se vežu na ovo mjesto i potrebni su za CCK aktivnost promotora (Haun i Dixon, 1990; Deavall i suradnici: 2000; Hansen, 2001). Osim toga, nekoliko poznatih aktivatora CCK pokazalo se da ekspresija (uključujući bFGF, PACAP, peptone i depolarizaciju) djeluje preko CREB (Hansen i sur., 1999; Deavall i suradnici: 2000; Bernard i sur., 2001; Gevrey i sur., 2002; Hansen i sur., 2004). Naše CCKPodaci o reporterskom genu -luciferaze podržavaju bitnu ulogu CRE-sličnog mjesta u regulaciji CCK aktivnost promotora, budući da mutacija ovog mjesta smanjuje bazalnu CCK aktivnost promotora i CCKEkspresija -luciferaze inducirane s VP16-CREB, konstitutivno aktivnim oblikom CREB-a, gubi se kada je ovo mjesto mutirano (neobjavljeno promatranje). Stoga smo se iznenadili kad smo otkrili da se CREB ne veže za CCK promotora u striatalnim ekstraktima bilo na početnoj liniji ili nakon kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB kada su razine CREB povećane. To dokazuje da su razine CREB-a po sebi nisu jedini čimbenik u određivanju iznosa obvezujuće na ovoj web-lokaciji, a to podržava rad drugih (Cha-Molstad i sur., 2004). Budući da promotori drugih, prethodno identificiranih CREB ciljnih gena, kao što su BDNF i prodynorphin, povezali smo CREB, sigurni smo u naš nalaz da CREB nije obvezujući za CCK promotor u striatnim nuklearnim ekstraktima. Nadalje, indukcija CCK-luciferaza aktivnost ΔFosB nije ovisila o intaktnom mjestu sličnom CRE-u, što ukazuje na to da ΔFosB ne regulira CCK ekspresijom reguliranjem izravnog vezanja CREB na CCK promotor.

Naša nemogućnost da otkrijemo CREB interakciju s CCK promotor podržava Renthal i sur. (2009)koji su koristili ChIP-chip pristup kako bi pogledali globalne promjene u fosforiliranom CREB (pCREB) i ΔFosB vezanju u striatumu nakon kronične izloženosti kokainu. U tim eksperimentima, DNA-proteinski kompleksi su imunoprecipitirani s ΔFosB ili pCREB antitijelima, a istaložena DNA, nakon obilježavanja, hibridizirana je s promotorskim mikromrežom. Dok su mnogi prethodno karakterizirani CREB ciljni geni identificirani ovim pristupom (npr. BDNF, prodynorphin), CCK nije identificiran. Dodatno, pokazano je da se vezanje CREB na konsenzus CRE mjesto značajno razlikuje između kultiviranih staničnih linija (Cha-Molstad i sur., 2004). Sve prethodne studije koje su otkrile interakcije CREB - a s CCK Promotor je proveden u staničnoj kulturi (ne u mozgu iz kojeg su izvedeni naši EMSA i ChIP uzorci) i korišteni su testovi promjene gela za istraživanje interakcija protein-DNA. Dok EMSA može procijeniti potencijal faktora da se veže za DNA sekvencu, ChIP testovi daju novi pogled na ove interakcije in vivo, Nadalje, većina podataka pokazuje ili indukciju CCK aktivnost promotora ili vezanje CREB na CCK promotora dobiveni su iz stanica koje su stimulirane čimbenicima kao što su peptoni (Bernard i sur., 2001), depolarizacija (Hansen i sur., 2004), ili niz aktivatora unutarstaničnih signalnih kaskada uključujući cAMP i ERK (Hansen i sur., 1999). U našim je pokusima jedini korišteni "poticaj" bila prekomjerna ekspresija ΔFosB, koja je dovoljna za indukciju CCK izraz. Uzeto zajedno, to sugerira da sposobnost CREB-a da se veže (i potencijalno regulira) CCK promotor je visoko ovisan o tipu stanice i aktivaciji određenih signalnih putova. Osim toga, CCK CRE-slični promotorski element (barem u neinduciranim PC12 stanicama i mišjem striatumu) nije izravni cilj ni CREB ni ΔFosB. Zanimljivo, regulacija FosB ekspresija CREB je također specifična za tip stanice i tip stimulacije. Studija Anderssona dr., otkrili su da injekcija CREB antisense oligonukleotida u mišji striatum djelomično inhibira indukciju FosB nakon primjene kokaina (Andersson i sur., 2001). Međutim, također su otkrili da sposobnost L-Dope inducira FosB na ekspresiju striatuma kod 6-OHDA-a nije utjecala prisutnost CREB antisense oligonukleotida.

Budući da CREB i ΔFosB čini se neizravno reguliraju CCK promotor, a promjene u strukturi kromatina su dokumentirane kao odgovor na različite podražaje koji induciraju ΔFosB (Tsankova i sur., 2004; Kumar i sur., 2005; Renthal et al., 2008), zaključili smo da ΔFosB može posredno modulirati aktivnost promotora mijenjajući strukturu kromatina. Međutim, kod miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB tijekom 2 tjedana nije bilo promjene u histonskoj H3 acetilaciji na CCK promotor (Tablica 1). To podržavaju ChIP-čip podaci Renthal i sur. (2009)koji su izvijestili da nema promjene u acetiliranom vezanju H3 na CCK promotora u miševa izloženih kroničnom kokainu. Od CCK Promotor je aktivan u striatumu, nije se očekivalo niti opažalo vezanje na represivni metilirani histon H3. Zanimljivo je da također nismo vidjeli promjene zbog prekomjerne ekspresije ΔFosB u acetiliranom vezanju H3-a na BDNF promotora (koji je pokazao povećano vezanje CREB-a) ili na CDK5 i prodynorphin promotora (koji pokazuju povećano vezanje ΔFosB). Budući da postoji mnoštvo histonskih modifikacija koje su povezane s promjenama u aktivnosti promotora (koje je pregledao Rando i Chang, 2009), vjerojatno postoje druge modifikacije kromatina koje se povezuju s indukcijom tih gena. Bilo koja pojedinačna modifikacija kromatina, iako često predviđa razinu aktivnosti promotora, ne može se promijeniti tijekom aktivacije određenog gena. U budućem radu bilo bi zanimljivo pogledati i druge potencijalne promjene u strukturi kromatina oko CCK promotor nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB. Zanimljivo, kronični kokain (vjerojatno preko Pokazalo se da indukcija ΔFosB inducira ekspresiju sirtuina 1-a i 2-a, klase III histonske deacetilaze koje, kako se čini, mijenjaju neuronsku fiziologiju, signalizaciju ERK i reakcije ponašanja na kokain (Renthal et al., 2009). Indukcija histonske deacetilaze imala bi sposobnost da istovremeno regulira ekspresiju velikog broja gena preko globalne promjene u strukturi kromatina.

Jedan od mogućih kandidata CCK Regulacija nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB bila je članom obitelji AP-1 cFos. Izraz cFos regulira CREB (Sheng i sur., 1990; Impey i sur., 2004), a prekomjerna ekspresija cFos (sukladna prekomjernoj ekspresiji cJuna veznog partnera) se povećava CCK aktivnost promotora (Rourke i sur., 1999). Stoga, povišene razine CREB-a zbog kratkotrajne prekomjerne ekspresije ΔFosB mogu povećati razine cFos i rezultirati povećanim vezanjem za CCK CRE-like site. c-fos mRNA je inducirana u miševa nakon dva tjedna prekomjerne ekspresije ΔFosB (McClung i Nestler, 2003) i smanjen u miševa koji su izloženi kroničnom kokainu ili dugotrajnoj prekomjernoj ekspresiji ΔFosB (Renthal et al., 2008). Ovdje nalazimo da se cFos veže izravno na CCK promotora u strijalnom tkivu, međutim, pretjerana ekspresija ΔFosB ne povećava značajno vezivanje. Ovo sugerira da iako se cFos može uključiti u regulaciju CCK općenito, promjena u vezivanju samog cFos nije vjerovatno mehanizam kojim ΔFosB regulira CCK izraz. Moguće je, međutim, da ΔFosB može izazvati ili post-translacijske promjene cFos (npr. Izmijenjenu fosforilaciju) ili inducirati ekspresiju veznog partnera (poput cJun) ili proteina koaktivatora. Međutim, s obzirom da je netaknuto mjesto nalik CRE-u (za koje se ranije pokazalo da je obvezujuće mjesto za AP-1 komplekse, vidi Haun i Dixon, 1990) nije potreban za uvećane CCK promotorska aktivnost viđena sa prekomjernom ekspresijom ΔFosB (kako je ocijenjeno u našim pokusnim genskim eksperimentima), može sumnjati da su i drugi trans-djelujući faktori regulirani ΔFosB.

Korištenje električnih romobila ističe CCK fragment promotora korišten u našim eksperimentima s luciferaznim reporter genima sadrži sačuvano mjesto vezanja Sp1 i E-okvir (recenzirao Hansen, 2002). Pokazalo se da su e-box sekvence koje vežu brojne transkripcijske faktore (pregledao Forrest i McNamara, 2004). Koristeći PC12 stanice, vidjeli smo da se mutacija E-okvira smanjuje CCK aktivnost promotora, ali ne mijenja odgovor promotora na ΔFosB (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da CCK-luciferazni izvjestitelj koji sadrži mutacije i na CRE mjestu i u E-kutiji nema bazalnu aktivnost koja se može otkriti i ne reagira na prekomjernu ekspresiju ΔFosB (neobjavljeno promatranje). Još jedan potencijalni posrednik akcije ΔFosB na CCK promotor su ATF, za koje se zna da se neki oblici induciraju u striatumu kroničnom izloženošću psihostimulantima (Green i sur., 2008). Međutim, nismo pronašli dokaze za ΔFosB indukciju ovih ATF-a (podaci nisu prikazani), a ne očekuje se da bi se ATF-ovi vezali na mutirano CRE-mjesto na CCK promotor.

Jedno upozorenje ove studije je da koristimo bi-transgeni sustav da prekomjerno izražavamo ΔFosB i stoga moramo biti konzervativni u povlačenju paralela između ove paradigme i primjene kroničnog kokaina. Međutim, transgeni miševi 11A pružaju jedinstvenu priliku da se pogledaju specifični efekti ΔFosB u striatumu, budući da je prekomjerna ekspresija ograničena na ovo područje mozga (Chen i sur., 1998), dok primjena kokaina izaziva promjene u velikom broju drugih područja mozga koje tada mogu posredno utjecati na striatum. Nadalje, nekoliko studija dokumentiralo je slične bihevioralne i molekularne fenotipe kod miševa 11A u usporedbi s netrogenim životinjama liječenim kroničnim kokainom (Kelz i sur., 1999; McClung i Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Dodatno, Bibb i sur. (2001) izvijestili o sličnim razinama striatal Cdk5 mRNA i indukcija proteina u istom tom 11A soju u usporedbi s kogene, ne-transgenijim legloma, kao i slične promjene u CDK5 ciljevima, p35 i DARPP-32.

Zaključno, nalazimo da kratkotrajna ΔFosB ekspresija dovodi do indukcije gena u striatumu kroz više mehanizama. Oni uključuju izravno vezivanje promotora, indukciju CREB proteina i aktivnost, modifikaciju kromatina, osim putova koji tek treba utvrditi.

EKSPERIMENTALNE PROCEDURE

Životinje

U ovom istraživanju korišteni su bi-transgeni životinje 11A mužjaka (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB), a karakterizirani su u Kelz i sur., 1999, Da bi se prekomjerno eksprimirao ΔFosB, miševi su uklonjeni iz doksiciklina između 3 i 6 tjedana starosti, dok su kontrolni miševi održavani na doksiciklini. Svi su miševi bili smješteni u skupini i održavani su u ciklusu 12: 12 svijetlo / tamno, svjetla u 7 ujutro i svjetla u 7 pm, s improvizirano pristup hrani i vodi. Svi eksperimenti s mišima bili su u skladu s protokolima koji je odobrio Odbor za njegu i upotrebu životinja Sveučilišta Texas Texas Southwestern Medical Center u Dallasu.

Reportorski i ekspresijski plazmidi

Wildtype (WT) CCK Reporter promotora-luciferaze pripremljen je umetanjem približno 200 bp PCR fragmenta u pGL3-luc vektor (Promega). Ovaj fragment je dobiven iz mišje genomske DNA (primera: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' uzvodno, i 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' nizvodno) i u početku je ubačen u pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360). Fragment promotora zatim je kloniran na mjesta restrikcijskog enzima Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Da biste stvorili mutaciju CRE točke u CCK promoter, mutageni primer usmjeren protiv prethodno prijavljenog CRE-mjesta (osjetni primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3 . Ovo pretvara prijavljeno web mjesto nalik na CRE (ACTGCGTCAGC) u ACTGAGCTCC. Svi reporterski plazmidi potvrđeni su DNA sekvenciranjem. Ekspresijski plazmid ΔFosB sadrži sekvencu ΔFosB pune dužine umetnutu u višestruko mjesto kloniranja pCDNA 3.1 i prethodno je opisanUlery i Nestler, 2007).

Stanična kultura i transfekcija DNA

Stanice feohromocitoma (PC12) održavane su u Dulbeccoovom modificiranom Eagleovom mediju F-12, nadopunjenom s 10% konjskog seruma, 5% fetalnog goveđeg seruma i 1% penicilina / streptomicina na 37 ° C i 5% CO₂. Stanice su transficirane elektroporacijom uporabom BTX 360 elektroporatora (350V, 0 ohma i 850 μF) u 800 μL Dulbeccove fiziološke otopine puferirane u fosfat u kiveti od 4 mm s 10 μg reportera i 5 μg ekspresijske konstrukcije. Prazni vektorski plazmid (pCDNA) korišten je za normalizaciju ukupnih količina DNA. Nakon transfekcije, stanice su uzgajane na posudama obloženim kolagenom od 35 mm tijekom naznačenog vremena.

Analize luciferaze

Dva ili tri dana nakon transfekcije, stanice su isprane 3 puta u Dulbeccovoj fiziološkoj otopini puferiranoj s fosfatom, lizirane (koristeći 25 mM glicilglicina, 15 mM MgSXNUMX)₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), sakupljeni su i očišćeni centrifugiranjem. 30 μL lizata je kombiniran s puferom za ispitivanje luciferaze 140 μL (25 mM glicilglicin, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kalijev fosfat, 1 mM koenzim A, pH 7.8). Aktivnost luminescence mjerena je korištenjem FLx-800 čitača fluorescencije na mikroploči nakon automatizirane injekcije 40 μL 1 mM luciferina po jažici. Aktivnost luciferaze normalizirana je na ukupni udio proteina kako je utvrđeno BioRad testom proteina.

Analiza elektroforetske pokretljivosti

Nuklearni ekstrakti obostranih kriški striatuma iz bi-transgeničnih miševa 11A (koji se drže u doksiciklinima ili izvan njih tijekom 2 ili 8 tjedana) (McClung i Nestler, 2003) pripremljeni su prema Huang i Walters (1996). ³²Dvolančane oligonukleotidne sonde s P oznakom pripremljene su korištenjem protokolarnog sustava Promega Gel Shift Assay (#E3300), a sonde su pročišćene pomoću Roche Quick Spin Stupaca. Konsenzusne sekvence CRE i AP-1 sonde bile su iz Promega (#E328A i E320B, respektivno) i CCK CRE sekvence su bile (Cck-CRE smisao: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Reakcije vezivanja i elektroforeza izvedene su korištenjem modifikacija postupka Promega Gel Shift Assay sustava (#E3300). 50,000 CPM označene sonde kombiniran je s 10 μg strijatalnim nuklearnim ekstraktom. Prije uvođenja radioaktivno obilježenih sondi dodani su hladni konkurentski DNA ili antitijela. Za eksperimente prenamjene, korišten je 2 μg CREB antitijela (Upstate Biotechnology # 06-083). Reakcije su elektroforezirane na 4% poliakrilamidnim gelovima, osušene i izložene filmu (koristeći pojačane zaslone tijekom 1 sata do 2 dana).

imunoblatin

Za stanice PC12, 35 mm ploče transficiranih stanica isprane su u ledeno hladnoj Dulbeccovoj fiziološkoj otopini puferiranoj s fosfatom, a lizati su pripremljeni u ledeno hladnom RIPA puferu za lizu (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksiholat, 1 % Triton X-100, 0.1% natrijev dodecil sulfat) koji sadrži inhibitore proteaze. Nakon ultrazvučne obrade, čišćenja i Bradfordove analize proteina, lizati su u potpunosti denaturirani i 50 μg svakog uzorka je elektroforezirano na 10% SDS poliakrilamidnim gelovima. Proteini su preneseni na PVDF membranu, blokirani na 1 sat u 3% nemasnom suhom mlijeku u fiziološkoj otopini puferiranoj Tris-om koja sadrži 0.1% Tween-20 (TBS-T mlijeko) i sondirani preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelima (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, korišteno u omjeru 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, upotrijebljeno u omjeru 1: 80,000), razrijeđeno u TBS-T mlijeku. Nakon višestrukog pranja u TBS-T, mrlje su ispitivane jedan sat na sobnoj temperaturi, koristeći sekundarna antitijela konjugirana s alkalnom fosfatazom (Sigma) razrijeđena 1: 5,000 u TBS-T mlijeku. Nakon višestrukog pranja fiziološkom otopinom u puferu s Trisom, reakcija boje izvedena je prema uputama BioRad (# 170-6432). Membrane su sušene preko noći, skenirane na ravnom skeneru i denzitometrija izvedena pomoću ImageJ (vidi dolje).

Za strijatalne ekstrakte provedena je analiza Western blotta kao što je prethodno objavljeno (Hope i sur., 1994). Tkivo je uklonjeno iz obrubljenih glava miševa, stavljeno na led i odsječeno na matrici mozga debljine 1 mm. Udarci tkiva su zatim uzeti i zamrznuti na -80 ° C do upotrebe. Tkivo je ultrazvučeno na ledu u modificiranom puferu na bazi deterdženta koji sadrži i fosfatazu i inhibitore proteaze (Roche, Sigma). Nakon ultrazvuka uzorci su denaturirani u kipućoj vodi i centrifugirani na 15,000xg tokom 15 minuta; supernatant je nakon toga sakupljen i obrađen; Količine proteina koncentracije tada su kvantificirane pomoću Bradfordovog testa (Bio-Rad). Uzorci su vođeni na 10% akrilamid / biksakrilamidnom gelu, prebačeni su na PVDF membranu, blokirani u 5% mlijeku i inkubirani s primarnim antitijelima (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Blats su naknadno vizualizirani pomoću hemiluminescence sustava (Pierce). Svi su uzorci normalizirani na GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Izvedene su standardne krivulje kako bi se osiguralo da smo u linearnom rasponu ispitivanja.

Analiza denzitometrije

Za PC12 imunoblote provedena je denzitometrijska analiza pomoću ImageJ s kalibracijom šipke. Za svako mjerenje oduzet je prosječni pozadinski signal, a za svaki uzorak izračunat je omjer CREB i GAPDH signala. Za strijatalne imunoblote i EMSA analizu, Scion Image 1.62c korišten je s oduzimanjem pozadine.

Kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)

ChIP ispitivanja provedena su u skladu s metodama Tsankova i sur. (2004) i Kumar i sur. (2005). Ukratko, bilateralni striatni uzorci miševa od 11A koji su zadržani na ili izvan doksiciklina umreženi su s 1% formaldehidom, a umrežavanje je ugašeno glicinom (konačna koncentracija 0.125 M). Ti su uzorci uzeti iz cijelih moždanih kriški uzeti na razini jezgre gomile s uklonjenom korteksom. Kromatin je odrezan na otprilike 0.2 do 1 kb fragmenata ultrazvukom, pročišćen zrncima proteina G (Thermo Scientific # 22852) i ulaznim uzorcima smrznutim na -80 ° C. Za svaku se oborinu koristi između 60 i 100 μg kromatina. Upotrijebljeno je 5-10 μg svakog primarnog antitijela (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilirani H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilirani H3 (LYS9): Cell Signalling Technology, cFos: Biotehnologija Santa Cruz # SC-7202x). Kompleksi antitijela i kromatina imunoprecipitirani su s proteinima G plus kuglicama prema uputama proizvođača (Thermo Scientific # 22852). Nakon obrnutog umrežavanja ulaznih i istaloženih uzoraka, svaki je uzorak podvrgnut kvantitativnoj PCR (qPCR). Upotreba svih ovih antitijela za ChIP opsežno je potvrđena (Tsankova i sur., 2004; Kumar i sur., 2005; Renthal et al., 2009).

Razine vezanja proteina na svakom promotoru gena od interesa su određene mjerenjem količine povezane DNK pomoću qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Ulaz ili ukupna DNA (neimunoprecipitirana) i imunoprecipitirana DNA su amplificirane u triplikatu u prisutnosti SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Ct vrijednosti iz svakog uzorka dobivene su pomoću softvera Sequence Detector 1.1. Relativna kvantifikacija DNA uzorka izvedena je metodom ΔΔCt (Tsankova i sur., 2004). Korišteni prajmeri: BDNF promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA promotor CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prominorfin promotor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistička analiza

Svi su podaci prikazani kao sredstva ± standardna pogreška srednje vrijednosti. Statistička razlika utvrđena je Studentovim dvostranim t-testom (p <0.05). Kad su napravljene višestruke usporedbe, p-vrijednosti prilagođene su pomoću Bonferronijeve korekcije.

Zahvale

Željeli bismo zahvaliti Willu Renthelu i Arvindu Kumaru za korisne rasprave. Također želimo zahvaliti NIDA-i na financiranju tih eksperimenata.

fusnote

Izjava izdavača: Ovo je PDF datoteka neobjavljenog rukopisa koji je prihvaćen za objavljivanje. Kao uslugu našim klijentima pružamo ovu ranu verziju rukopisa. Rukopis će biti podvrgnut kopiranju, slaganju i pregledu rezultirajućeg dokaza prije nego što bude objavljen u konačnom obliku. Imajte na umu da se tijekom proizvodnog procesa mogu otkriti pogreške koje mogu utjecati na sadržaj, a sve pravne izjave koje se odnose na časopis pripadaju.

Pojmovi klasifikacije:

Odjeljak: #1 Stanična i molekularna biologija živčanog sustava

Reference

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. vezni protein cAMP odgovora potreban je za dopamin-ovisnu ekspresiju gena u intaktnom, ali ne i dopamin-denerviranom striatumu. J Neurosci. 2001; 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Oluja DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Aktivnost CREB-a u ljusci nucleus accumbens kontrolira provođenje ponašajnih odgovora na emocionalne podražaje. Proc Natl Acad Sci US A. 2002, 99: 11435-40. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Tretman kokainom povećava izvanstanični kolecistokinin (CCK) u ljusci nucleus accumbens budnih, slobodno pokretnih štakora, što je učinak koji se pojačava kod štakora koji su senzibilizirani na kokain. J Neurochem. 2002; 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptoni stimuliraju transkripciju intestinalnog cholecystokinin gena cikličkim adenozin monofosfatom. Endokrinologiju. 2001; 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Učinci kronične izloženosti kokainu regulirani su proteinom neurona Cdk5. Priroda. 2001; 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Vezanje specifičnog tipa stanica transkripcijskog faktora CREB na element cAMP-odgovora. Proc Natl Acad Sci US A. 2004, 101: 13572-7. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulacija delta FosB i FosB-sličnih proteina elektrokonvulzivnim napadima i liječenjem kokainom. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene životinje s inducibilnom ciljanom ekspresijom gena u mozgu. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Indukcija kinaze ovisne o ciklinu 5 u hipokampusu pomoću kroničnih elektro konvulzivnih napadaja: uloga ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Bliski susreti mnogih vrsta: Fos-Jun interakcije koje posreduju specifičnost regulacije transkripcije. Oncogene. 2001; 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronska adaptacija amfetamina i dopamina: molekularni mehanizmi regulacije gena prodinorfina u striatumu štakora. Neuron. 1995; 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrola transkripcije CCK gena pomoću PACAP u STC-1 stanicama. J J Physiol Gastrointest. 2000; 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergijska regulacija sadržaja mRNA kolecistokinina u striatumu štakora. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id obitelj transkripcijskih faktora i formiranje vaskularne lezije. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Zahtjev za cikličkom AMP- i kalcij-ovisnom proteinskom kinazom za transkripcijsku aktivaciju kolecistokininskog gena proteinskim hidrolizatima. J Biol Chem. 2002; 277: 22407-13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Indukcija aktiviranja transkripcijskih faktora (ATFs) ATF2, ATF3 i ATF4 u nucleus accumbens i njihova regulacija emocionalnog ponašanja. J Neurosci. 2008; 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Prelijevanje dopamina i kolecistokinina u nukleusu štakora štakora kao odgovor na akutnu primjenu lijeka. Sinapsa. 2000; 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogenom aktivirana protein kinaza i protein kinaza A signalni putevi stimuliraju transkripciju kolecistokinina aktivacijom cikličkog adenozin 3 ', 5'-monofosfat odgovornog proteina koji veže element. Mol endokrinola. 1999; 13: 466-75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulacija transkripcije gena neuronskog kolecistokinina. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Transkripcija gena genocistokinina: elementi promotora, transkripcijski faktori i signalni putovi. Peptidi. 2001; 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, FC Nielsen. KCl i forskolin sinergistički pojačavaju ekspresiju kolecistokinin gena putem koordinatne aktivacije CREB i ko-aktivatora CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Transkripcijski pojačivač esencijalan za ekspresiju gena kolecistokinina štakora sadrži sekvencu identičnu -296 elementu humanog c-fos gena. J Biol Chem. 1990; 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Bitna uloga gena fosB u molekularnim, staničnim i ponašajnim aktivnostima kroničnih elektrokonvulzivnih napadaja. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Dokazi za suživot dopamina i CCK u mezo-limbičkim neuronima. Priroda. 1980; 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Tretman kroničnim elektrokonvulzivnim napadajima (ECS) rezultira ekspresijom dugotrajnog kompleksa AP-1 u mozgu s izmijenjenim sastavom i karakteristikama. J Neurosci. 1994; 14: 4318-28. [PubMed]
Nada BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Indukcija dugotrajnog AP-1 kompleksa sastavljenog od izmijenjenih Fos-sličnih proteina u mozgu kroničnim kokainom i drugim kroničnim tretmanima. Neuron. 1994; 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergijska regulacija aktivnosti vezanja transkripcijskog faktora AP-1 u striatumu štakora. Neuroscience. 1996; 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definiranje CREB regulon: genomska analiza regulatornih regija transkripcijskog faktora. Stanica. 2004; 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Na što CREB? Signal ćelije. 2004; 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Suprotan učinak CCK (A) i CCK (B) antagonista na razvoj uvjetovane aktivnosti kod štakora. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Dokazi za uključivanje CCK (A) receptora u stjecanje uvjetovane aktivnosti proizvedene kokainom kod štakora. Brain Res. 1997; 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Ekspresija transkripcijskog faktora deltaFosB u mozgu kontrolira osjetljivost na kokain. Priroda. 1999; 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Remodeliranje kromatina je ključni mehanizam koji podupire plastičnost kokaina u striatumu. Neuron. 2005; 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. CREB fosforilacija izazvana kokainom u nukleusnim akumbensima štakora osjetljivih na kokain omogućena je pojačanom aktivacijom izvanstanične signalno povezane kinaze, ali ne i protein kinaze A. J Neurochem. 2005; 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekularni prekidač za dugotrajnu adaptaciju u mozgu. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: molekularni posrednik dugotrajne neuralne i bihevioralne plastičnosti. Brain Res. 1999; 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Postoji li zajednički molekularni put za ovisnost? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkripcijski mehanizmi ovisnosti: uloga DeltaFosB-a. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-55. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različiti obrasci indukcije DeltaFosB u mozgu pomoću droga zlostavljanja. Sinapsa. 2008; 62: 358-69. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Pogledi na kromatin u cijeloj genomu. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB posreduje u epigenetskoj desenzibilizaciji gena c-fos nakon kronične izloženosti amfetaminu. J Neurosci. 2008; 28: 7344-9. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Čakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genomska analiza regulacije kromatina kokainom otkriva ulogu sirtuina. Neuron. 2009; 62: 335-48. [PMC slobodan članak] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modulacija kolecistokinina u mezolimbičkoj funkciji dopamina: regulacija motiviranog ponašanja. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativna kooperativnost između jukstapoziranih E-kutija i cAMP / TPA odgovornih elemenata u promotoru gena kolecistokinina. FEBS Lett. 1999; 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Oluja D, Nestler EJ. Regionalno i stanično mapiranje CRE-posredovane transkripcije tijekom naltrekson-precipitiranog morfinskog povlačenja. J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Oluja D, Nestler EJ. Regulacija CRE-posredovane transkripcije u mišjem mozgu amfetaminom. Sinapsa. 2003; 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Depolarizacija membrane i kalcij induciraju c-fos transkripciju putem fosforilacije transkripcijskog faktora CREB. Neuron. 1990; 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Histonske modifikacije na regijama promotora gena u hipokampusu štakora nakon akutnih i kroničnih elektro konvulzivnih napadaja. J Neurosci. 2004; 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulacija transkripcijske aktivnosti DeltaFosB fosforilacijom Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224â € „30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens dopamin-CCK interakcije u psihostimulant nagrada i srodnih ponašanja. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Bitna uloga ΔFosB u nucleus accumbens u djelovanju morfija. Priroda Neurosci. 2006; 9: 205-11. [PubMed]