Sažetak
Promjena dendritičnih bodlji na dopaminoceptivnim neuronima uzrokovana psihostimulantima uzrokovana psihostimulantima hipotetizirana je kao adaptivni neuronski odgovor koji je povezan s dugotrajnim ovisničkim ponašanjima. NAcc se velikim dijelom sastoji od dvije različite subpopulacije srednje velikih bodljikavih neurona koji izražavaju visoku razinu bilo Dpamn D1 ili D2 receptora. U ovom istraživanju analizirali smo dendritičnu gustoću kralježnice nakon kroničnog liječenja kokainom u različitim D1 ili D2 receptorima koji sadrže srednje velike šiljaste neurone u NAcc. Ove su studije koristile transgene miševe koji su eksprimirali EGFP pod nadzorom promotora D1 ili D2 receptora (Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP). Nakon 28 dana liječenja kokainom i 2 dana povlačenja, gustoća kralježnice povećala se i u Drd1-EGFP- i u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima. Međutim, porast gustoće kralježnice zadržao se samo u Drd1-EGFP-pozitivnim neuronima 30 dana nakon povlačenja lijeka. Značajno, pojačana ekspresija ΔFosB također je primijećena u Drd1-EGFP- i Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima nakon 2 dana povlačenja lijeka, ali samo u Drd1-EGFP-pozitivnim neuronima nakon 30 dana povlačenja lijeka. Ovi rezultati sugeriraju da je povećana gustoća kralježnice primijećena nakon kroničnog liječenja kokainom stabilna samo u neuronima koji sadrže D1-receptor i da je ΔFosB ekspresija povezana s formiranjem i / ili održavanjem dendritičnih bodlji u D1 kao i neuronima koji sadrže D2 u NAcc.
Mezolimbički dopaminergični put sastoji se od neurona u ventralnom tegmentalnom području koji inerviraju jezgru accumbens (NAcc), olfaktornog tuberkla, prefrontalnog korteksa i amigdale (1), budući da nigrostriatalni dopaminergični neuroni u substantia nigra (pars compacta) pružaju uzlaznu projekciju na dorzalni striatum (2). Psihostimulansi povećavaju sinaptičke koncentracije dopamina u NAcc: kokain, blokirajući unos dopamina iz sinaptičke pukotine i amfetamina, promičući oslobađanje dopamina iz živčanih terminala (3-5). Ponavljajuća, povremena primjena psihostimulansa dovodi do pojačanih reakcija u ponašanju (osjetljivosti) na akutne stimulacijske učinke ovih lijekova (6-8). Većina dokaza upućuje na to da su adaptivne promjene u ventralnom tegmentalnom području - NAcc dopaminergičkom sustavu središnje za promjene plastike ovisne o iskustvu koja je u osnovi ponašanja uzrokovanog lijekovima.
Osim dopamina, glutamat je potreban za razvoj senzitizacije u ponašanju kao odgovor na psihostimulanse (9, 10). Šiljasti neuroni srednje veličine (MSN) u ventralnom striatumu dobivaju ekscitacijske glutamatergičke projekcije iz prefrontalnog korteksa koji sinapsiraju na glavama dendritičnih bodlji. MSN-ovi su također glavni cilj dopaminergičnih aksona koji sinapsiraju na vratnim kralježnicama (1, 11, 12). Stoga dendritični bodlji u MSN-u predstavljaju stanični odjeljak u kojem su dopaminergički i glutamatergički prijenos u početku integrirani.
Dopamin djeluje na dvije glavne podskupine receptora, poddružinu D1 (podtipovi D1 i D5) i poddružinu D2 (podtipovi D2, D3 i D4) (13). U dorzalnom striatumu anatomska ispitivanja pokazala su da striatonigralni MSN sadrže visoku razinu D1 receptora (zajedno s tvarima P i dinnorfinom), dok striatopallidalni MSNs pretežno izražavaju D2 receptore (zajedno s enkefalinom) (14-17). Projekcije iz NAcc su složenije nego u dorzalnom striatumu, s tim da ljuska i jezgrani dijelovi NAcc izlaze na različite podregije ventralnog paliduma i na ventralno tegmentalno područje i substantia nigra (18). Dok su D2 receptori i enkefalin izrazito izraženi u projekcijama na ventralni palidum, D1 receptori i supstanca P nalaze se jednako raspoređeni u projekcijama na ventralni palidum i ventralno tegmentalno područje (19). Studije agonista i antagonista selektivnih za D1 ili D2 receptore pokazale su da su za promjene u ponašanju ovisne o D1 i D2 potrebni i receptori DXNUMX i DXNUMX (20-25). Međutim, čini se da su uloge ovih receptora različite. Na primjer, stimulacija D1 receptora smanjuje traženje kokaina izazvanog injekcijama kokainskog prajmiranja i okolišnim znakovima za kokain, dok stimulacija D2 receptora olakšava vraćanje kokaina (26-28).
Poremećaji u ponašanju povezani s psihostimulantskom ovisnošću izuzetno su dugovječni. Stoga je postojao značajan interes za identificiranje dugotrajnih promjena izazvanih lijekovima na molekularnoj i strukturnoj razini u neuronskim krugovima reguliranim dopaminom i glutamatom (29-32). Značajno je da je dugotrajno izlaganje kokainu ili amfetaminu povećalo broj dendritičnih grana i bodlji MSN u NAcc (33-35). Pokazalo se da ove strukturne promjene traju i do ≈1 – 3.5 mjeseci nakon posljednjeg izlaganja lijeku (30, 35) i za koje se sugerira da podnose dugotrajne promjene sinaptičke plastičnosti povezane s izlaganjem psihostimulantima.
Cilj ove studije bio je ispitati strukturne promjene dendritičnih bodlji izazvane kokainom u subpopulacijama akumbalnih MSN-ova koji izražavaju ili D1 ili D2 receptore. U tim smo istraživanjima koristili transgenične miševe bakterijskog umjetnog kromosoma (BAC) koji eksprimiraju EGFP pod kontrolom ili promotora receptora dopamina D1 (Drd1-EGFP) ili D2 (Drd2-EGFP) (36). Rezultati pokazuju da, iako se povećana gustoća kralježnice u početku javlja u MSN-ima koji sadrže D1 receptore i MSN-ovima koji sadrže D2, promijenjena gustoća kralježnice stabilna je samo u neuronima koji sadrže D1 receptore. Nadalje, nalazimo slične promjene u ekspresiji transkripcijskog faktora ΔFosB, sugerirajući da ΔFosB može biti uključen u stvaranje i / ili održavanje dendritičnih bodlji u D1, kao i neurona koji sadrže D2 receptore u NAcc.
Rezultati
Analiza MSN-ova u Drd1-EGFP i Drd2-EGFP BAC transgeničnim miševima.
Projekcijski uzorak MSN-a iz dorzalnog i ventralnog striatuma u transgeničnim miševima Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP BAC karakteriziran je analizom ekspresije GFP-a (36). Diferencijalna ekspresija GFP-a u MSN-ima dorzalnog striatuma općenito odgovara ekspresiji endogenih D1 ili D2 receptora (36). Dalje smo analizirali diferencijalnu ekspresiju GFP-a u NAcc kod Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP miševa (Slika 1a i b). Iako je ≈58% neurona u NAcc izrazio GFP u Drd1-EGFP miševima (Slika 1a), ≈48% neurona u NAcc eksprimira GFP u Drd-2-EGFP miševima (Slika 1b). MSN-ovi predstavljaju 90 – 95% svih neurona u NAcc (12, 37). D1 receptori se eksprimiraju samo u MSN, a D2 receptori su eksprimirani u MSN i u kolinergičkim interneuronima, koji predstavljaju 1 – 3% strijatalnih neurona (37). Uzimajući u obzir ove faktore, rezultati sugeriraju da će, minimalno, ≈10 – 15% MSN u NAcc vjerojatno izraziti i D1 i D2 receptore.
Analiza dendritičnih bodlji u Drd1-EGFP i Drd2-EGFP miševima.
GFP ekspresija u Drd1-EGFP i Drd2-EGFP miševima bila je korisna za bojenje tijela neuronskih stanica. Međutim, GFP signal u dendritima i dendritičkim bodlji bio je previše slab da bi mogao omogućiti njihovu analizu nakon imunološkog bojenja s anti-GFP antitijelima. Balistička isporuka fluorescentnih boja posredovana česticama nedavno se koristi za brzo i učinkovito označavanje neuronske populacije (38). Ovom se tehnikom može označiti čitav broj neurona, a čini se da je ta metoda usporediva s Golgi-Coxovom obojenjem. Za analizu dendritičke morfologije neurona u NAcc, fiksne akumbalne kriške označene su lipofilnom fluorescentnom bojom 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocijan perhloratom (DiI) pomoću genskog pištolja. Primjer MSN-obojene MSN prikazan je u Slika 1c, Pod korištenim uvjetima općenito smo promatrali obilježene neurone bez preklapanja dendrita s drugim označenim neuronima. Pri većem uvećanju mogla se primijetiti detaljna dendritička morfologija, uključujući dendritičke bodlje (Slika 1d).
Zatim smo koristili kombinaciju označavanja DiI i imunohistokemije za GFP ili u Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP transgeničnim miševima, što je bilo moguće korištenjem niske koncentracije deterdženta za permeabilizaciju tkiva (vidi Metode). Pažljivom usporedbom ekspresije mrlje od DiI i GFP-a u staničnim tijelima MSN-a, mogli smo prepoznati DiI- i GFP-pozitivne ili DiI-pozitivne i GFP-negativne neurone u Drd1-EGFP (Slika 2a) ili Drd2-EGFP (Slika 2b) miševi. Za slijedeća istraživanja analizirali smo dendritičku morfologiju samo na DiI- i GFP-pozitivne neurone iz Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP miševa.
Kronična obrada kokainom rezultira povećanom gustoćom kralježnice u akumulacijskim MSN-ima koji izražavaju ili Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP.
Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP miševima su četiri puta uzastopno ubrizgavani kokain (30 mg / kg) ili fiziološka otopina (vidjeti Metode). Dva dana (2WD) ili 30 dana (30WD) nakon posljednjeg liječenja lijekovima, mozgovi su obrađeni za označavanje DiI i imunohistokemiju, kako je gore opisano. Prethodna studija izvijestila je da je kronično liječenje amfetaminom povećalo gustoću kralježnice na distalnim, ali ne proksimalnim dendritima MSN-a u NAcc (35). Stoga smo ograničili našu analizu na distalne dendrite (tj. One s granama drugog ili trećeg reda), uključujući terminalne regije. Kada je analizirano na 2WD, utvrđeno je da gustoća kralježnice raste u Drd1-EGFP-pozitivnim MSN-ima (128% u fiziološkoj skupini) (Slika 3a i c) i u manjoj mjeri u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima (115% fiziološke skupine) (Slika 3 b i d). Nakon 30WD, povećana gustoća kralježnice zadržana je u Drd1-EGFP-pozitivnim neuronima (118% fiziološke kontrole) (Slika 3 a i c), ali ne u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima (Slika 3 b i d).
Morfologija dendritičnih bodlji je različita s obzirom na njihovu duljinu i širinu glave kralježnice. Stoga smo klasificirali dendritične izbočine u četiri klase kralježnice (tvrdoglava, gljiva, tanka i filopodija) na 2WD iz kokaina (podaci nisu prikazani). Gustoća tipa gljive (119.7 ± 4.0%, P <0.01) i tanke bodlje (120.0 ± 3.4%, P <0.01) povećana je liječenjem kokaina u Drd1-EGFP-pozitivnim MSN-ima, dok je gustoća tvrdog (182.4 ± 21.6%, P <0.05) i bodljikave gljive (122.5 ± 5.0%, P <0.01) povećan je u Drd2-EGFP-pozitivnim MSN-ima. Nije bilo značajnog povećanja krutosti bodlji u Drd1-EGFP-pozitivnim neuronima ili tankih bodlji u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima.
Kronični kokain izaziva ΔFosB ekspresiju u Drd1-EGFP- ili Drd2-EGFP-pozitivnim MSN-ima u NAcc.
ΔFosB je član Fos obitelji faktora transkripcije. Dok akutna primjena kokaina inducira brzu i prolaznu indukciju nekoliko Fosovih izoforma u NAcc, opetovana izloženost kokainu povećava razinu ΔFosB. Štoviše, porast ekspresije ΔFosB traje u NAcc tjednima do mjesecima nakon prekida izloženosti lijekovima, te se sugerira da je uključen u dugotrajno reguliranje ekspresije gena, čak i nakon prestanka uzimanja lijekova (29, 39, 40).
Da bismo ispitali indukciju ΔFosB u NAcc kod Drd1-EGFP ili Drd2-EGFP miševa nakon tretiranja kokainom, analizirali smo ekspresiju FosB i GFP dvostrukim označavanjem (Slika 4 i Tablica 1) Anti-FosB antitijelo prepoznaje sve oblike FosB, ali pretpostavljamo da povećana imunostaina predstavlja ΔFosB (vidi Metode za daljnju raspravu). U miševima koji su tretirani fiziološkom otopinom, 16% Drd1-EGFP-pozitivnih neurona i 15% Drd2-EGFP-pozitivnih neurona izrazili su FosB imunoreaktivnost s relativno slabim intenzitetom (Slika 4 a i b i Tablica 1). Ponovljeno liječenje kokainom, praćeno 2WD, rezultiralo je značajnim povećanjem broja Drd1-EGFP-pozitivnih neurona koji su koeksprimirali ΔFosB (55% GFP-pozitivnih neurona) (Slika 4c i Tablica 1). Manji, ali još uvijek značajan porast ekspresije ΔFosB nađen je u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima (25% GFP-pozitivnih neurona) (Slika 4d i Tablica 1). Kao i kod promjena u gustoći kralježnice, pojačana ekspresija ΔFosB održavana je u Drd1-EGFP-pozitivnim neuronima (46% GFP-pozitivnih neurona), ali ne i u Drd2-EGFP-pozitivnim neuronima (15% GFP-pozitivnih neurona) nakon 30WD (Slika 4 e i f i Tablica 1). Imajte na umu da pojačani izraz ΔFosB uočen u Slika 4f prisutan je u Drd2-EGFP-negativnim neuronima.
Rasprava
Smatra se da dugotrajne prilagodbe dopaminergičke neurotransmisije podupiru ovisnička ponašanja povezana s psihostimulantnim lijekovima. Konkretno, povećanja gustoće dendritičke kralježnice MSN-a u NAcc uzrokovana psihostimulantima hipotetiraju se da su povezana s reorganizacijom sinaptičke povezanosti (30). NAcc se najvećim dijelom sastoji od dvije različite subpopulacije MSN-a koje iskazuju visoku razinu bilo D1 ili D2 receptora dopamina. U ovom istraživanju analizirali smo gustoću kralježnice u različitim MSN-ovima koji sadrže D1 ili D2 u NAcc nakon kroničnog liječenja kokainom. Dobiveni rezultati pokazuju da, iako se povećana gustoća kralježnice u početku javlja u MSN-ima koji sadrže D1 receptore i MSN-ima koji sadrže D2 receptor, promijenjena gustoća kralježnice stabilna je samo u neuronima koji sadrže D1-receptor. Nadalje, pronašli smo sličan obrazac promjena u ekspresiji transkripcijskog faktora FFosB u MSN-ovima koji sadrže D1 i D2.
Ove su studije koristile BAC transgene miševe koji eksprimiraju GFP u specifičnim subpopulacijama MSN pod kontrolom bilo promotora receptora D1 ili D2. Nadalje, razvili smo metodu dvostrukog obilježavanja koja je kombinirala imunohistokemiju za GFP s balističkim obilježavanjem neurona pomoću DiI. Prethodne studije su koristile Golgi-Cox metodu za analizu utjecaja psihostimulansa na gustoću kralježnice (34), a ovdje korištena metoda DiI dala je rezultate koji su bili kvantitativno usporedivi. Razvili smo metodu dvostrukog označavanja jer bojenje Golgi-a nije kompatibilno s imunohistokemijom. Imunološko bojenje obično zahtijeva permeabilizaciju tkiva deterdžentima, proces koji obično dovodi do solubilizacije lipofilnih boja iz membrane (38). Međutim, u našim trenutnim studijama za imunološku boju GFP-a nije bila potrebna visoka koncentracija deterdženta za permeabilizaciju tkiva te se stoga mogla koristiti u kombinaciji s označavanjem lipofilnih boja. Naša metoda dvostrukog obilježavanja trebala bi biti općenito korisna za studije strukturnih promjena dendritičnih bodlji, na primjer kada se koristi za analizu BAC transgenih linija miševa gdje je GFP izražen u specifičnim populacijama neurona u korteksu (36).
Iako još uvijek pomalo kontroverzni, vjeruje se da su D1 i D2 receptori uglavnom anatomsko odvojeni na izravne (striatonigralni) i indirektni (striatopallidalni) strijatalni projekcijski neuron,17, 41). Početna karakterizacija lokalizacije GFP-a u Drd1-EGFP i Drd2-EGFP miševima bila je u skladu s ovim zaključkom (36). Štoviše, naša analiza broja GFP-pozitivnih neurona u NAcc iz Drd1-EGFP i Drd2-EGFP miševa u skladu je sa zaključkom da ≈50% MSN-ova izražava samo D1 receptore, da ≈35 – 40% izražavaju samo D2 receptore, i da ≈10 – 15% koeksprimira i D1 i D2 receptore. Ova vrijednost koekspresije slična je onoj koju impliciraju dorzalni striatum koji su kombinirali analizu patch-clamp pojedinih strijatalnih neurona RT-PCR tehnikama za izolaciju i amplifikaciju mRNA (≈17% koekspresije enkefalina i supstance P) (42). Valja napomenuti da se naša trenutna istraživanja ne bave pitanjem ekspresije D3, D4 i D5 receptora, niti se bave pitanjem niske razine ekspresije D1 receptora u MSN-ima koji izražavaju visoku razinu D2 receptora ili obrnuto.
Nekoliko prethodnih studija ispitalo je neuronsku lokalizaciju ekspresije Fos-a i psihostimulansom i ulogu D1 i D2 receptora (43-45). Te su studije poduprle zaključak da je Fos i ΔFosB indukcija posredovana aktivacijom D1 receptora. Međutim, na staničnu lokalizaciju Fosove ekspresije utječe okolišni kontekst u kojem se daju psihostimulantni lijekovi (46, 47). Na primjer, amfetamin ili kokain koji se daju u kavezu u kućanstvu induciraju neposredne rane gene (uključujući Fos) u p-pozitivnim stanicama supstancije koje koeksprimiraju D1 receptore. Suprotno tome, ti lijekovi mogu potaknuti ekspresiju Fos-a i u D1 i u D2 receptorima MSN-ima kada se primjenjuju u novom okruženju. Protokol korišten u našim trenutnim studijama nije uključivao uparivanje ubrizgavanja lijeka s izlaganjem novom okruženju. Međutim, ne možemo isključiti nekakav stres ovisan o kontekstu koji je odgovoran za ekspresiju ΔFosB u MSN-ovima koji sadrže D2 receptore.
Izrazita karakteristika ovih rezultata bio je paralelni obrazac povećane gustoće kralježnice i ΔFosB ekspresije. Povećana gustoća kralježnice i ΔFosB ekspresija se u početku pojavljuju u MSN-ima koji izražavaju Drd1-EGFP i Drd2-EGFP. Međutim, ove promjene bile su stabilne samo u neuronima koji sadrže D1 receptor. Jedno moguće objašnjenje za opažanje da je povećana gustoća kralježnice i ekspresija ΔFosB privremeno pronađena u neuronima koji sadrže D2 receptore jest da se to dogodilo u malom dijelu MSN-a koji koeksprimira i D1 i D2 receptore dopamina. Prema tome, prolazna priroda ovih povećanja može biti povezana s antagonističkim učincima aktiviranja D2 receptora na signalnim putovima ovisnim o D1 (48). Zanimljivo je da su promjene u gustoći kralježnice i ekspresija ΔFosB bile reverzibilne, što može odražavati sposobnost signalnih putova ovisnih o receptorima D2 da utječu na stabilnost ΔFosB.
Promatranje da postoje paralelne promjene u ekspresiji ΔFosB i gustoći kralježnice u skladu je s idejom da je ΔFosB uključen u početnu formaciju i naknadno održavanje dendritičnih bodlji u neuronima koji sadrže D1 u NAcc. Izražavanje ΔFosB kontrolira signalni put ovisan o D1 / DARPP-32 / PP1 u MSN-ima (49). Nekoliko studija pokazalo je da ΔFosB igra važnu ulogu u djelima psihostimulansa koji potiču i lokomotorno aktiviraju (39), vjerojatno utječući na ekspresiju više gena koji uključuju neurotransmiterske receptore, signalne proteine i proteine koji sudjeluju u regulaciji neuronske morfologije (50). Međutim, specifični molekularni mehanizmi koji su uključeni u kronično stvaranje kokaina izazvane kokainom trenutno nisu poznati. Naše prethodne studije pokazale su da intraakumulativna infuzija inhibitora Cdk5 roskovitina smanjuje gustoću kralježnice izazvane kokainom (51). Štoviše, Cdk5 je ciljni gen za niže procese za ΔFosB i uključen je u kompenzacijske adaptivne promjene povezane s kroničnim liječenjem kokainom (52). Stoga su promjene u fosforilaciji ovisnoj o Cdk5 uvjerljivi mehanizam koji stoji u osnovi stvaranja kralježnice izazvane kokainom i / ili stabilnosti kralježnice. PAK (53), β-katenin (54), PSD-95 (55) i spinofilin (56) supstrati su za Cdk5 i svi su uključeni u regulaciju morfogeneze kralježnice (57-60). Daljnja karakterizacija ovih i drugih Cdk5 supstrata u bodlji će nadamo se svjetlu na mehanizme koji reguliraju stvaranje kralježnice psihostimulansima.
Metode
Životinje.
Miševi koji nose EGFP transgene pod kontrolom bilo D1 ili D2 receptora dopamina generirani su Gensat BAC transgeničkim projektom (36). Transgeni miševi korišteni u ovom istraživanju stari su 4-5 tjedana i bili su u švicarskom-Websterovom podrijetlu. Miševi su održavani u ciklusu 12: 12-h svijetlo / tamno i smješteni su u skupinama 2-5 s ad libitumom hranom i vodom. Svi protokoli za životinje bili su u skladu s Vodičem za skrb i uporabu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravstvo, a odobrio ih je Institucionalni odbor za brigu i upotrebu životinja Sveučilišta Rockefeller.
Liječenje lijekom.
Za kronično liječenje kokainom (30 mg / kg dnevno) objavljeno je da proizvodi snažno povećanje gustoće kralježnice MSN-a u jezgri i ljusci NAcc-a od štakora, ali niža doza (15 mg / kg) povećala je gustoću kralježnice samo u školjka (61). Stoga smo koristili veću dozu kokaina za izazivanje strukturne modifikacije u oba dijela NAcc. Miševi su primali jednu injekciju (ip) 30 mg / kg kokaina-HCl (ili fiziološku otopinu) svaki dan uzastopno, 5, nakon čega su bili dani bez injekcije 2, a taj se postupak ponovio u 4 uzastopnim tjednima. Injekcije su provedene u kućnom kavezu. 2WD ili 30WD, mišji mozgovi su obrađeni za DiI označavanje i / ili imunohistokemiju.
Balističko označavanje s fluorescentnim bojama DiI.
Miševi su anestezirani s 80 mg / kg natrijevog pentobarbitala i perkardno perfuzirani s 5 ml PBS-a, nakon čega je uslijedila brza perfuzija s 40 ml 4% paraformaldehida u PBS-u (20 ml / min). Mozgovi su brzo uklonjeni iz lubanje i postfiksirani u 4% paraformaldehidu tokom 10 min. Moždane kriške (100 µm) označene su balističkom isporukom fluorescentne boje DiI (Molekularne sonde), kako je opisano u ref. 38, Razvijena je kombinirana metoda označavanja DiI – imunohistokemija s malom koncentracijom deterdženta. DiI-označeni dijelovi su permealizirani s 0.01% Triton X-100 u PBS-u tijekom 15 min, a zatim su inkubirani u 0.01% Triton X-100 i 10% normalnog kozjeg seruma u PBS-u za 1 h da se minimizira nespecifično obilježavanje. Presjeci tkiva su zatim inkubirani 1% normalnim kozjim serumom / 0.01% Triton X-100 i anti-GFP antitijelom (Abcam, Cambridge, MA) tokom 2 h na sobnoj temperaturi, isprani i inkubirani u 1: 1,000 razrjeđivanju FITC- konjugirano sekundarno antitijelo (Molekularne sonde). Odjeljci su postavljeni na dijapozitive mikroskopa i prekriveni pričvrsnim medijem. Balistička metoda obilježavanja omogućila je detaljnu analizu dendritičke strukture kralježnice, a dobiveni rezultati bili su kvalitativno i kvantitativno usporedivi s prethodnim studijama korištenjem metode impregnacije Golgi-Cox u križima mozga štakora (34). Međutim, za razliku od prethodnih studija, rijetko smo opazili dvoglave bodlje u DiI obojenim neuronima. Ova razlika može biti uzrokovana osjetljivošću metoda bojenja ili varijabilnošću miša (ovo istraživanje) u odnosu na tkivo štakora (34).
Imunohistokcmija.
Životinje su anestezirane i perfuzirane kako je gore opisano. Mozgovi su uklonjeni i pohranjeni preko noći u 4% paraformaldehidu na 4 ° C. Mozgovi su preneseni u 30% saharozu u otopini PBS-a radi krioprotekcije. Koronalni presjeci (12 μm) rezani su na smrzavajućem mikrotomu (Leica), a zatim obrađeni za imunohistokemiju. Odjeci mozga su zatim permealizirani u 0.3% Triton X-100 u PBS-u tokom 15 min i dvaput isprani PBS-om. Odjeljci su prethodno inkubirani u 10% normalnog kozjeg seruma u PBS-u 1 h na 37 ° C, izloženi su primarnim antitijelima (razrijeđenim u 1% normalnom kozjem serumu u PBS-u) preko noći na 4 ° C, a zatim isprani u PBS-u i inkubirani sa sekundarnim antitijela za 1 h na 37 ° C. Korištena su sljedeća antitijela: zečji anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), mišji anti-NeuN (Chemicon), zečji anti-GFP, FITC-konjugirani anti zečji IgG i rodamin- konjugirani anti-mišji IgG (Molekularne sonde). Za trostruko obilježavanje (ΔFosB, NeuN i GFP), odsjeci mozga su najprije imunostanirani anti-pan FosB antitijelom i anti-NeuN antitijelom, a zatim su inkubirani sa sekundarnim antitijelima (rodamin konjugiranim anti zečjim IgG i cijano konjugiranim anti-mišjim IgG ). Duplo obojeni dijelovi mozga dalje su obrađeni za GFP imuno obojavanje primjenom Zenonove tehnologije obilježavanja (Zenon Alexa Fluor 488, Molekularne sonde). Anti-pan-FosB antitijelo je podignuto na N kraj FosB i prepoznaje ΔFosB i FosB pune duljine (62). Na temelju prethodnih studija koje su pokazale da se ΔFosB, ali ne i FosB ili drugi antigeni povezani s Fosom, stabilno eksprimira nakon kroničnog liječenja kokainom, pretpostavljamo da dugotrajno povećanje imunoreaktivnosti predstavlja stabilnu ekspresiju ΔFosB. Međutim, identitet imunoreaktivnog FosB signala opaženog kod miševa tretiranih fiziološkom otopinom nije poznat. Statistička analiza u Tablica 1 upotrijebio Student's t Test.
Dendritična analiza kralježnice.
Pojedine MSN-ove u NAcc odabrane su za analizu kralježnice na temelju nekoliko kriterija. (i) Bilo je minimalnog ili nikakvog preklapanja s drugim obilježenim stanicama kako bi se osiguralo da procesi iz različitih stanica ne bi bili zbrkani. (ii) Najmanje tri primarna dendrita potrebna su da bi bili vidljivi za stanice koje bi se mogle koristiti za analizu. (iii) Ispitani su distalni dendriti (terminalni ili blizu krajnjeg dendrita). Analizirani su dendriti iz oba MSN-a u jezgri i ljusci NAcc. Iako smo promatrali slabo zabodene MSN-ove (bodljikavi tip II), analizirali smo samo gusto upletene MSN-ove (bodljikavi tip I). Da bi se izračunala gustoća kralježnice, utvrđena je duljina dendrita (> 20 μm dugog) korištenjem konfokalnog mikroskopa (Zeiss LSM 510) s uljnom uronskom lećom (× 40). Sve slike dendrita snimljene su različito z razine (intervali dubine 0.5 – 1 μm) za ispitivanje morfologije dendritičnih bodlja. Sva mjerenja izvršena su softverom za analizu metamorfnih slika (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistička analiza koristila je test Kolmogorov-Smirnov.
Izrasline iz dendrita klasificirane su u četiri vrste prema njihovoj duljini kao što je opisano u br. 63 i 64. Izbočine klase 1, zvane i strme izbočine, bile su duljine <0.5 μm, nedostajala im je velika glava kralježnice i nije se činilo da imaju vrat; bodlje klase 2 ili gljive bile su dugačke između 0.5 i 1.25 μm, a karakterizirali su ih kratki vrat i velika glava kralježnice; klasa 3, ili tanke bodlje, kretale su se između 1.25 i 3.0 μm i imale su izdužene vratove kralježnice s malim glavama; klasa 4, ili filopodijalni nastavci, bile su dugačke nitaste izbočine u kojima nije bilo uočljive glave kralježnice.
Zahvale
Ovaj rad su pomogli Grant DA10044 (za PG i ACN) Sjedinjenih Država i Fondacija Simons, zaklada Peter J. Sharp, zaklada Picower i zaklada FM Kirby.
Kratice
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- srednje velik šiljasti neuron
- BAC
- umjetni kromosom bakterija
- Drd1
- D1 promotor-vođen dopaminskim receptorima
- Drd2
- D2 promotor-vođen dopaminskim receptorima
- DII
- 1,1'-diotadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbocijan perhlorat
- 2WD
- 2 dana nakon posljednjeg liječenja lijekom
- 30WD
- 30 dana nakon posljednjeg liječenja lijekom.
Reference
;