PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Sažetak
Promjene gena izazvane kokainom uzrokuju promjene u morfologiji i ponašanju neurona koje mogu biti osnova ovisnosti o kokainu. Identificirali smo ključnu ulogu za dimetilaciju histonskog 3 lizina 9 (H3K9) i lizin dimetiltransferaze G9a u plastičnoj i bihevioralnoj plastičnosti izazvanoj kokainom. Višekratna primjena kokaina smanjila je globalnu razinu dimetilacije H3K9 u jezgri. Tnjegovo smanjenje metilacije histona posredovano je represijom G9a u ovoj regiji mozga, što je regulirano transkripcijskim faktorom induciranim kokainom ΔFosB. Koristeći uvjetnu mutagenezu i virusno posredovani prijenos gena, ustanovili smo da silazna regulacija G9a povećava dendritičnu plastičnost kralježnice nukleusa i povećava sklonost kokainu, uspostavljajući tako presudnu ulogu za metilaciju histona u dugoročnim djelovanjima kokaina.
Uvod
Ponavljano izlaganje kokainu karakteriziraju uporne promjene u ekspresiji gena i izmijenjena neuronska morfologija unutar jezgre jezgre (NAc), ključne komponente nagradnog kruga mozga (1-2). Pregradnja kromatinom je važna kod aberrantnih transkripcijskih promjena u ovom području mozga koje mogu biti podložne aspektima ovisnosti o kokainu. (3-9). Kokainska regulacija strukture kromatina u NAc djelomično je rezultat izravnih modifikacija kromatinskih enzimskih strojeva izazvanih kokainom, što dovodi do promjena u acetilaciji histona i fosforilaciji (4, 7-9); međutim, uloge enzima koji kontroliraju metilaciju histona još uvijek nisu istražene.
Nedavna analiza promotora koja se širi na genom, a koja koristi imunoprecipitaciju kromatina zajedno s mikroarilima (ChIP-Chip) identificirala je izmijenjene uzorke represivnog histonskog H3 lizina 9 (H3K9) i 27 (H3K27) metilacije na specifičnim promotorima gena u tretiranju koke s NAC-om nakon ponovljenog kočenja, koji se ponavlja u NAC-u nakon ponovljenog tretiranja koke u NAc nakon ponovljene obrade6). Stoga smo profilirali brojne metiltransferaze lizina (KMT) i demetilaze (KDM) za koje se zna da kontroliraju metilaciju H3K9 ili H3K27 (Slika 1A). Samo su dva enzima, G9a i GLP, pokazali trajnu transkripcijsku regulaciju 24 sati nakon ponovljenog davanja kokaina, kada je ekspresija oba gena bila značajno regulirana. Budući da G9a i GLP posebno kataliziraju dimetilaciju H3K9 (H3K9me2), njihova redukcija kokainom je u skladu s smanjenim globalnim razinama euhromatičnih H3K9me2 uočenih u ovom trenutku (Slika 1B). Suprotno tome, globalne razine heterokromatske metilacije H3K27 ostale su nepromijenjene ponovljenim izlaganjem kokainu (S1 u podršci mrežnom materijalu). Zbog visoke razine katalitičke aktivnosti oboje vitro i in vivo (10), namjeravali smo dalje istražiti funkcionalni značaj represije G9a nakon opetovanog izlaganja kokainu u NAc. Razine proteina G9a, poput razine njegove mRNA, značajno su smanjene 24 sati nakon ponovljenog davanja kokaina (Slika S2). Iako je ekspresija mRNA G9a smanjena za 35% u NAc, imunohistokemijska analiza otkrila je skromnije smanjenje 15% nivoa proteina G9a, u skladu s opaženim 21% smanjenjem H3K9me2 nakon ponovljenog davanja kokaina (Slika 1B). Ekspresija mRNA G9a također je smanjena u ovom području mozga 20% nakon opetovane primjene kokaina (Slika S3).
Da bismo utvrdili da li su promjene u eukromatskom H3K9me2 u korelaciji s promjenama na genima u ekspresiji gena u NAc, upotrijebili smo analize mikrorasta kako bismo ispitali profile ekspresije gena izazvane doziranom kokainom kod životinja sa ili bez povijesti prethodnog izlaganja kokainu (vidi dopunski popise gena u Tablice S1 – S3). Životinje koje su primale kokain pokazivale su dramatično povećanu ekspresiju gena 1 sat vremena nakon izazivanja kokainom u usporedbi s akutno liječenim životinjama (Slika 1C). Ova povećana ekspresija gena i dalje se pojavila kao odgovor na izazov kokaina nakon 1 tjedna povlačenja iz ponovljenog kokaina. U skladu s prethodnim izvješćima, mali postotak gena (~ 10%) pokazao je desenzibilizirane transkripcijske odgovore nakon opetovane primjene kokaina (Slika 1C; vidjeti Tablica S1) (5). Da bi direktno istražili ulogu snižavanja regulacije G9a u pojačanoj genskoj ekspresiji koja je primijećena nakon ponovljenog kokaina, miševi su primili intra-NAc injekcije vektora Herpes simplex virusa (HSV) koji eksprimiraju ili GFP ili G9a i bili su tretirani fiziološkom otopinom ili ponovljenim kokainom kako bi utvrdili da li je G9a prekomjerna ekspresija bilo je dovoljno za zaustavljanje ponovljenog pojačanja kokaina izazvanog ekspresije gena. Iz skupa 12 nasumično odabranih gena koji pokazuju povišenu razinu ekspresije nakon ponovljenog kokaina, primijetili smo da G9a značajno smanjuje pojačanu ekspresiju 50% ovih gena (Tablica S4).
Da bismo identificirali događaje transkripcije uzvodno koji posreduju u ponovljenoj represiji G9a uzrokovane kokainom, istraživali smo moguću ulogu ΔFosB, visoko stabilnog produkta spajanja neposrednog ranog gena fosB, ΔFosB se akumulira u NAc nakon opetovanog izlaganja kokainu, gdje je povezan s povećanom nagradom kokaina (11). ΔFosB može djelovati kao aktivator transkripcije ili kao represor, ovisno o ciljanom genu (3, 5, 6, 12). Korištenje bitransgenih NSE-iTA × tetOP-ΔFosB miševe, pri čemu se ΔFosB ekspresija može selektivno inducirati u NAc i dorzalnom striatumu odraslih životinja (13), ispitali smo utjecaj ΔFosB ekspresije na regulaciju kokaina H3K9me2 i KMT u NAc. OveFosB prekomjerna ekspresija bila je dovoljna da smanji razine H3K9me2 (Slika 1D) i G9a izraz (Slika 1E) i na taj način oponaša učinke ponovljenog kokaina. Suprotno tome, ΔFosB nije smanjio GLP ekspresiju u ovoj regiji mozga i nije imao utjecaja na SUV39H1 i EZH2, glavne trimetilirajuće enzime za H3K9, odnosno H3K27 (Slika S4). Da bi potvrdili ove podatke pomoću neovisnog sustava ΔFosB za prekomjernu ekspresiju, odrasli miševi divljih tipova primili su bilateralne intra-NAc injekcije vektora koji su povezani s adeno-virusom (AAV) koji izražavaju ili GFP ili ΔFosB. Prekomjerna ekspresija ΔFosB posredovana virusima smanjena je razina ekspresije G9a u ovoj regiji mozga (Slika 1E).
Takva naglašena i specifična regulacija G9a potaknula nas je da istražimo regulira li promjena ekspresije G9a u neurovima NAc regulacije ponašanja na kokain. Wildtype miševi primili su intra-NAc injekcije HSV vektora koji eksprimiraju GFP ili G9a i zatim su analizirani nepristranim paradigmom preferiranog mjesta s kokainom, što omogućava neizravno mjerenje nagrade lijeka. Nakon testiranja u ponašanju potvrđena je virusna prekomjerna ekspresija G9a u NAc neuronima (Slika 2A). Prekomjerna ekspresija G9a značajno je smanjila sklonost kokainu u usporedbi sa životinjama koje su prekomjerno eksprimirale GFP (Slika 2B) i povećane razine H3K9me2 u NAc (Slika 2C). Prekomjerna ekspresija katalitički mrtvog mutanta G9a (G9aH1093K) (14) nije utjecao na sklonost kokainu (Slika 2B) i nije imao utjecaja na razine H3K9me2 u ovoj regiji mozga (Slika 2C).
Daljnje proučavanje uloge G9a u bihevioralnim učincima kokaina, točnije oponašanje ponavljane represije izazvane kokainom G9a u NAc, odrasle osobe G9afl / fl miševi (14) primili intra-NAc injekcije AAV vektora koji izražavaju Cre rekombinazu ili GFP kao kontrolu. AAV-Cre rušenje G9a u NAc, što je imunohistokemijski potvrđeno (Slika S5), značajno povećao učinke kokaina u pokusima s kondicioniranjem mjesta i smanjio nivo H3K9me2 u NAc (Sl. 2D, E). Komercijalno dostupan farmakološki inhibitor G9a i GLP, BIX01294 (15-16) upotrebljava se za utvrđivanje utječe li enzimska inhibicija na sličan način ponašanja na kokain. Zapravo, farmakološka inhibicija G9a i GLP značajno je povećala sklonost kokainu i smanjila H3K9me2 u NAc (Sl. 2F, G).
Ponavljano davanje kokaina povećava gustoću dendritičnih bodlji na NAc srednjim špijunskim neuronima (17), proces povezan s funkcionalnim promjenama ekscitacijskih glutamatergičkih sinapsi na tim neuronima (18-19) i senzibilizirani bihevioralni odgovori na lijek (17, 20). Stoga smo hipotetirali da smanjivanje aktivnosti G9a u NAc ponovljenim kokainom može posredovati u mogućnosti kokaina da regulira dendritičku gustoću kralježnice neurona NAc. Koristeći kromatinsku imunoprecipitaciju (ChIP) sa anti-G9a antitijelom, identificirali smo nekoliko mogućih ciljeva gena G9a u NAc, od kojih je svaki prethodno bio umiješan u dendritičku plastičnost izazvanu kokainom (Slika 3A) (20-26). Otkrili smo da je opetovana primjena kokaina značajno smanjila vezivanje G9a, kao i razine H3K9me2, na ovim genskim promotorima (Slika 3B). Suprotno tome, akutno davanje kokaina brzo je regrutovalo G9a za neke od istih promotora gena, što je u skladu s povećanom ekspresijom G9a uočeno u NAc 1 satu nakon akutne doze kokaina (Slika S6). Iako vezanje G9a na specifične promotore gena korelira s promjenama u njegovoj ekspresiji, ostaje nejasno jesu li takvi događaji posredovani izmijenjenim globalnim razinama G9a u NAc i / ili razlikama u regrutovanju G9a nakon akutne vs opetovana primjena kokaina
Na temelju regulacije G9a brojnih gena povezanih s plastičnošću u NAc, direktno smo ispitali je li održavanje ekspresije G9a u ovoj regiji mozga nakon opetovanog liječenja kokainom dovoljno za blokiranje stvaranja dendritičke kralježnice izazvane kokainom. Korištenje protokola liječenja kokainom prethodno pokazanog za promicanje dendritičke indukcije kralježnice u NAc (20), ispitali smo gustoću kralježnice u životinja koje su ubrizgane ili HSV-GFP ili HSV-G9a. U skladu s prethodnim nalazima, primijetili smo značajno povećanje gustoće dendritičke kralježnice u NAc nakon tretmana kokainom, učinak koji je u potpunosti blokiran prekomjernom ekspresijom G9a (Slika 3C). Samo prekomjerna ekspresija G9a nije bila dovoljna da smanji gustoću dendritičke kralježnice NAc u nedostatku kokaina. Za dopunu ovih podataka, G9afl / fl miševi su primili intra-NAc injekcije HSV-Cre i gustoća kralježnice je kvantificirana i uspoređena sa životinjama koje su primale HSV-GFP u odsutnosti kokaina. Srušenje ekspresije G9a značajno je povećalo gustoću kralježnice na NAc srednjim špijunskim neuronima (Slika 3C).
S obzirom na dokaze da redukcija G9a u NAc nakon ponovljenog kokaina posreduje ΔFosB, dodatno smo ispitali je li ovaj transkripcijski faktor također uključen u regulaciju dendritičnih bodova NAc. Iako ΔFosB prethodno nije uzročno povezan s takvom dendritičkom plastičnošću, nekoliko njegovih ciljeva, uključujući Cdk5 i NFκB podjedinice, bilo je tako implicirano (20-23), i trajna ekspresija ΔFosB u neuronima NAc korelira s povećanom gustoćom dendritičke kralježnice nakon opetovanog liječenja kokainom (27). Prvo smo otkrili da je indukcija ΔFosB kod bitrangenih miševa u nedostatku kokaina, što je smanjilo ekspresiju G9a i H3K9me2 (Sl. 1D, E), smanjeno vezanje G9a za brojne gene vezane uz plastičnost, od kojih su se mnogi pokazali i kao izravne mete samog ΔFosB (Slika 3D) (3, 6). Dalje smo pokazali da virusna prekomjerna ekspresija ΔFosB u NAc značajno povećava dendritičku gustoću kralježnice u bazalnim uvjetima, slično kao kod ponovljenog davanja kokaina (Slika 3E). Suprotno tome, prekomjerna ekspresija u NAc ΔJunD, dominantnog negativnog mutantnog proteina koji antagonizira aktivnost ΔFosB na transkripciji, blokira sposobnost ponovljenog kokaina da poveća dendritičku kralježnicu u NAc (Slika 3C).
Naše opažanje da ΔFosB regulira ekspresiju G9a u NAc i da ΔFosB i G9a reguliraju neke iste ciljne gene, dovelo nas je do ispitivanja drugih interakcija između ΔFosB i G9a. Nakon akutnog kokaina, kad su razine G9a porasle, vezivanje G9a na fosB gen je povećan, dok je nakon opetovanog kokaina, kada je ekspresija G9a potisnuta, vezivanje G9a za fosB gen je smanjen (Slika 3A). Nije opaženo takvo smanjeno vezanje G9a nakon ponovljenog kokaina c-fos, pri čemu se vezanje G9a povećava ponovljenim kokainom (Slika S7). To je u skladu s činjenicom da, za razliku od toga fosB, c-fos potiskuje, nije inducirano, kroničnim izlaganjem psihostimulantima (5). Pretjerana ekspresija ΔFosB kod bitransgenih miševa bila je dovoljna da značajno smanji G9a vezivanje za fosb gen (Slika 3D). Nadalje, prekomjerna ekspresija G9a bila je dovoljna za smanjenje povećane ekspresije ΔFosB nakon opetovane primjene kokaina (Tablica S4). Ovi podaci sugeriraju autoregulacijsku petlju kojom G9a u početku ograničava indukciju ΔFosB akutnom primjenom kokaina. Međutim, kako se ΔFosB akumulira uz opetovano izlaganje lijekovima, on potiskuje G9a i na taj način potencira vlastitu daljnju indukciju.
Zaključno, pokazali smo da metilacija histona lizinom u NAc kritično sudjeluje u regulaciji ekspresije gena neurona u odgovoru na kokain. Represija G9a i H3K9me2 nakon opetovane primjene kokaina potiče preferiranje kokaina, dijelom, transkripcijskim aktiviranjem brojnih gena za koje je poznato da reguliraju aberantne oblike dendritičke plastičnosti. Stjecanje boljeg razumijevanja gena koji se reguliraju takvim mehanizmima poboljšat će naše znanje o složenim biološkim osnovama ovisnosti o drogama i moglo bi pomoći u razvoju učinkovitijeg liječenja ovisničkih poremećaja.
Materijali i metode
Životinje i tretmani
Ako nije drugačije navedeno, miševi su bili smješteni četiri do pet po kavezu u koloniji s 12 satnim svjetlosnim / tamnim ciklusom (svijetli od 7: 00 AM do 7: 00 PM) pri konstantnoj temperaturi (23 ° C) s ad libitum pristup vodi i hrani. IACUC je odobrio sve životinjske protokole i u UT Jugozapadnom medicinskom centru i na Medicinskom fakultetu Mount Sinai.
Za eksperimente s kokainom [imunohistokemija, blotting, kvantitativni PCR (qPCR), mikroarray analiza i imunoprecipitacija kromatina (ChIP)], 8- mužjaci C10BL / 57J stari tjedni 6-7J. Životinje su svakodnevno primale injekcije bilo 'fiziološke otopine' (6 tretmani fiziološkom otopinom, ip), 'akutnog' kokaina (20 tretman fiziološka otopina + jedan tretman 7 mg / kg kokaina-HCl, ip) ili 'ponovljenog' kokaina (20 tretmani 1 mg / kg kokain-HCl, ip). Miševi su žrtvovani bilo tokom 24 sata ili 15 sati nakon završnog tretmana. Za studije mikrorastanjem, životinje su svakodnevno tretirane ili „fiziološkom otopinom“ (14 tretman fiziološkom otopinom, ip), „akutnim“ kokainom (1 tretman fiziološkom otopinom + 20 tretman 7 mg / kg kokainom-HCl, ip), „ponovljenim + akutnim“ kokainom ( 8 tretmani fiziološka otopina + 20 tretmani 7 mg / kg kokain-HCl, ip) ili 'ponovljeno povlačenje + akutni' kokain (20 tretmani 7 mg / kg kokain-HCl + 1 tretmani fiziološka otopina + 20 izazovni tretman 1 mg / kg kokain-HCl, ip) i žrtvovano je 10 sat vremena nakon konačnog tretmana. U bihevioralnim eksperimentima, miševi su zasebno smješteni nakon operacije i tretirani su s 9 mg / kg kokaina-HCl, ip kao što je opisano u nastavku. Za analizu dendritične kralježnice i validaciju mikrorasta nakon HSV-GFP i HSV-G5a-GFP, miševi su tretirani s "fiziološkom otopinom" (5 tretman fiziološkom otopinom, ip) ili "ponovljenim kokainom" (20 tretmani 3 mg / kg kokain-HCl, ip ) tijekom XNUMX dana, jer je prethodno pokazalo da se ovim protokolom ubrizgavanja povećava gustoća kralježnice na neuronima coreus (NAc) unutar vremenskog okvira ekspresije transgena Herpes simplex virusa (HSV) (Dopunski ref. S1). Miševi korišćeni za analizu dendritične kralježnice žrtvovani su 4 sati nakon posljednjeg tretmana.
Da induciramo lokalno brisanje G9a transkripta ograničenog na NAc neurone, koristili smo mutirane miševe homozigotne za flox glexNUMXa alel, koji su detaljno opisani drugdje (S2). Cre-inducirana rekombinacija proizvodi egzon 22 u 25 izvan okvira okvira što dovodi do propadanja mutiranog transkripta posredovanog glupošću. Koristili smo G9a floxed miševe koji su u potpunosti retrokrosistirani na C57BL / 6J miševe. Miševima su sterotaksično ubrizgani u NAc s vektorima vezanim za adeno-virus (AAV) (serotip 2) koji eksprimiraju GFP ili Cre-GFP između dobi 7 i 10 tjedana. Imunohistokemijska analiza korištena je za provjeru učinkovitosti Cre-posredovane rekombinacije (vidjeti Dopunska slika S5). Koristili smo AAV životinjama koje su ubrizgali 21 dana nakon operacije jer je rekombinacija u miševima sa floksom G9a bila stabilna i maksimalna u ovom trenutku, u skladu s objavljenim izvještajima (S3-S4). Pokusi prekomjerne ekspresije G9a i ΔJunD slični su postupci korišteni vektori HSV virusa koji izražavaju ili GFP, divlji tip G9a-GFP, katalitički mrtvi G9aH1093K-GFP ili ΔJunD-GFP (vidi S2 za detalje u vezi s razvojem G9a konstrukata). HSV miševi koji su prekomjerno eksprimirali korišteni su 3 dana nakon operacije jer je prekomjerna ekspresija bila maksimalna u ovom trenutku, kao što je promatrano imunohistokemijom. Zbog prolazne prirode ekspresije HSV-a i znatno stabilnije prirode ekspresije AAV-a, HSV vektori su korišteni u eksperimentima koji zahtijevaju brzu, kratkoročnu ekspresiju transgena, dok su AAV vektori korišteni u eksperimentima koji zahtijevaju produžena razdoblja ekspresije transgena. Oba su vektora pokazala, u opsežnim prethodnim studijama, da inficiraju samo stanice neuronskih stanica unutar ubrizganog područja mozga, bez ikakve infekcije aferentnih ili eferentnih neurona.
Za eksperimente u ponašanju upotrebom farmakološkog inhibitora G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), miševi su sterotaksično implantirani s dvije potkožne mini pumpe, kao i dvostranim vodilicama, u NAc. Mini pumpe su se aktivirale 12 sati prije implantacije pokrećući kontinuiranu isporuku (0.25 μl / sat) bilo nosača (5 hidroksipropil β-ciklodekstrin) ili lijeka tokom 14 dana tijekom kojih su provedene procjene ponašanja.
Za eksperimente ΔFosB prekomjerne ekspresije [Western blotting, qPCR i ChIP], muški bitransgeni NSE-iTA × tetOP-ΔFosB korišteni su miševi (tjedni 10), pri čemu su u nedostatku doksiciklina derivata tetraciklina (8 tjedan izvan doksiciklina) životinje pokazale robustan strijatalni ograničeni konstitutivni izraz ΔFosB (S5). Prevelika ekspresija ΔFosB kod ovih miševa potvrđena je qPCR-om. Da biste potvrdili nalaze pomoću NSE-iTA × tetOP-ΔFosB miševima, muškim miševima starim 8 starim 57 / 6J sterotaksično su ubrizgani intra-NAc s AAV vektorima koji izražavaju ili GFP ili ΔFosB-GFP. U ovom su slučaju korišteni AAV vektori da se osigura maksimalna ekspresija ΔFosB tijekom 8 tjedana nakon operacije, omogućujući izravnu usporedbu između virusom zaraženih i bitransgenih ΔFosB miševa koji pretjerano eksprimiraju. Prekomjerna ekspresija virusa potvrđena je primjenom qPCR-a tijekom 8 tjedana nakon operacije (udari NAc-mjernih NAc uboda su secirani ispod mjesta ubrizgavanja). AAV-GFP i AAV-ΔFosB-GFP miševi koji su prekomjerno eksprimirali, a koji nisu korišteni za qPCR, tretirani su fiziološkom otopinom (15 tretman fiziološkom otopinom, ip) ili ponovljenim kokainom (14 tretmani 14 mg / kg kokain-HCl, ip) s početkom u 30 tjedana poslije- kirurgija. 6 dana nakon završnog liječenja, mozgovi su fiksirani 4% paraformaldehidom, odsječeni na vibratom i korišteni za dendritičku analizu kralježnice.
Western blot analiza
NAc ubodi mjerenja 14 uzeti su iz koronalnih presjeka 1 mm dobiveni korištenjem mišjeg matriksa od nehrđajućeg čelika i sonicirani su u 1 M HEPES puferu za liziranje (1% SDS) koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. 10-Uzorci ukupnog proteina 30 μg elektroforezirani su na gelovima 18% SDS. Proteini su preneseni na PVDF membrane i inkubirani bilo sa anti-H3K9me2 (mišji monoklonal, 1: 500), anti-β-tubulinom (mišji monoklonal, 1: 60,000), anti-totalnim histonom H3 (zečji poliklonal, anti-GFP (koristi se za provjeru jednake ekspresije virusa u probijenom tkivu) (zečji poliklonal, 1: 5,000), anti-H1K1000me3 (zečji poliklonal, 27: 3) ili antitijela protiv aktina (mišji monoklonal, 1: 500: 1: 60,000: 4: 5: 5: 1: 15,000: XNUMX: XNUMX XNUMX ° C (sve membrane su blokirane u mlijeku XNUMX% ili goveđem serumu albumina XNUMX%). Membrane su tada inkubirane s sekundarnim antitijelima koja su obilježena peroksidazom (XNUMX: XNUMX-1: 60,000, ovisno o primarnom korištenom antitijelu) i pojasevi su vizualizirani pomoću supstrata SuperSignal West Dura. Trake su kvantificirane NIH Image J softverom, a H3K9me2 pojasevi su normalizirani ili na aktin ili na β-tubulin i na ukupni histon H3 radi kontrole jednakog opterećenja. Ponovljeni kokain nije imao utjecaja na razinu aktina (Slika S8) ili ukupni histon 3 (Slika S1) u NAc. Nadalje, HSV-G9a-GFP i HSV-G9aH1093K-GFP infekcija nisu utjecali na ukupne razine β-tubulina u NAc (Slika S8).
imunohistokemija
Miševi su sedatirani sa smrtonosnom dozom kloral hidrata i perfuzirani s 4% paraformaldehidom prije nego što su analizirani s jednom ili dvostrukom imunohistokemijom, kao što je prethodno opisano (S6). Ukratko, postfiksirani mozgovi su se inkubirali na sobnoj temperaturi preko noći u 30% saharozi prije odsječenja na 35 μm (mozgovi korišteni za dendritičku analizu kralježnice secirani su na vibratome na 100 μm presjecima u odsustvu 30% saharoze). Slobodno plutajući NAc odjeljci isprani su 1X PBS, blokirani (3% normalan magarac serum, 0.1% tritonX, 1X PBS) i kasnije inkubirani s anti-GFP (pileća poliklonalna, 1: 8000) i / ili anti-G9a (poliklonal zeca) , 1: 500) antitijela u blokirajućoj otopini. Sekcije analizirane na dendritičke bodlje su inkubirane zečje poliklonalno anti-GFP antitijelo na 1: 200. Nakon inkubacije preko noći, NAc presjeci su isprani 3 puta 10 minuta 1X PBS-om, nakon čega je slijedila inkubacija s Cy2 i / ili Cy3 fluorescentno povezanim antitijelima u 1X PBS blokirajućoj otopini 2 sati. Sekcije korištene za studije morfologije inkubirane su u sekundarnom antitijelu preko noći na sobnoj temperaturi. Nuklearno obojenje postignuto je inkubacijom presjeka u 1X PBS koji sadrži DAPI (1: 50,000) tijekom 10 minuta. Sekcije su ponovo isprane, zatim dehidracija etanolom i ugradnja DPX-om. Svi su presjeci snimljeni konfokalnom mikroskopijom.
Izolacija RNA i qPCR
Dvostrani NAc bušilice od 14 kolosijeka homogenizirani su u Trizolu i obrađeni prema uputama proizvođača. RNA je pročišćena s RNAesy Micro kolonama i spektroskopija je potvrdila da su odnosi RNA 260/280 i 260/230> 1.8. RNA je zatim obrnuto transkribirana pomoću Bio-Rad iScript Kit. cDNA je kvantificirana pomoću qPCR koristeći SYBR Green. Svaka je reakcija provedena u duplikatu ili u tri primjerka i analizirana slijedeći ΔΔCt metodu kako je prethodno opisano korištenjem gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kao normalizacijske kontrole (S7). Vidjeti dopunska tablica S5 za sekvence prajmera mRNA.
Analiza DNA mikrorasta
Četiri skupine (3 neovisne biološke replike po skupini) korištene su za istraživanje mikroraloma, ukupno 12 mikroračuni. 1 sata nakon posljednje injekcije kokaina, životinje su brzo obglavljene glave, a mozgovi su uklonjeni i stavljeni na led. Dijekcije NAc uzete su primjenom 15-mjernog igle i brzo su zamrznuti na suhom ledu dok RNA nije ekstrahirana. Bilateralni udarci su sakupljeni od četiri životinje po kopiji, ukupno 12 miševa po skupini. Izolacija RNA, obrada mikroračuna i analiza podataka provedeni su na prethodno opisani način (S8). Ukratko, RNA je izolirana i pročišćena kako je gore opisano i provjerena je kvaliteta korištenjem Agilent-ovog bioanalizatora. Obrnuta transkripcija, pojačavanje, obilježavanje i hibridizacija na nizove Illumina MouseWG-6 v2.0 izvedene su korištenjem standardnih postupaka od strane jezgre mikroreza UT Southwestern. Sirovi podaci oduzimani su u pozadini i normalizirani kvantili korištenjem softvera Beadstudio. Normalizirani podaci analizirani su pomoću softvera GeneSpring, a genelistički popisi generirani su pomoću kriterija značajnosti 1.3-kratne granične vrijednosti promjene u kombinaciji s nestrogom graničnom vrijednošću p <0.05.
U ove podatke održavamo visok stupanj povjerenja iz nekoliko razloga. Prvo, sve su životinje istodobno podnesene, tretirane i ubijane pod istim uvjetima. Isto tako, sva RNA i obrada nizova izvedena je istodobno. Drugo, izveli smo trostruke nizove i objedinili više životinja po uzorku niza, minimizirajući razlike zbog individualne varijabilnosti i povećavajući statističku snagu (S9). Treće, kriterij za analizu podataka koji se koristi za našu studiju preporučuje MicroArray projekt kontrole kvalitete, budući da su ti kriteriji validirani kako bi se osigurao visoki stupanj intersite obnovljivosti i inter- i intraplatformne obnovljivosti (S10-S11).
Izgradnja virusnih vektora
Zbog virusnih vektora insercije ograničenom području, kodirajuće sekvence za bilo divljeg tipa G9a (G9a) ili katalitički mrtvo G9a (G9aH1093K) su subklonirani u bicistroničku p1005 + HSV plazmida koji eksprimiraju GFP pod kontrolom humanog najbližeg početnog citomegalovirusnog promotora (CMV) (u G9a veličina umetanja bila je ~ 3.96 kb, što premašuje maksimalnu veličinu umetanja za AAV-2 vektore). IE4 / 5 promotor pokreće G9a izraz. Fragmenti su subklonirani u bicistronički p1005 + HSV plazmid tupim krajnjim ligacijama s Klenowom tretiranim PmeI i EcoRI digestiranim G9a (iz pcDNA3.1) i CX tretiranim p1005 + nakon EcoRI digestije. Za proizvodnju HSV-AJunD-GFP, kodirajuća sekvenca ΔJunD obrubljena s EcoRI restrikcijskim mjestima nastala je PCR primjenom oligonukleotida koji sadrže EcoRI mjesto. PCR produkt zatim je ligiran na EcoRI mjesto p1005 + vektora. Lokalna ekspresija Cre rekombinaze u NAc neuronima postignuta je virusno posredovanom isporukom gena koristeći AAV vektor kako je opisano (S12). GFP ili N-terminalna fuzija GFP-a s Cre-om subklonirana je u rekombinantni AAV-2 vektor koji sadrži CMV promotor s akcepcijskim nizom spojeva davalaca i signalom poliadenilacije. Svi vektorski umetci su potvrđeni dideoksi sekvenciranjem. Virusni vektori proizvedeni su trostrukom transfekcijom bez ikakvih pomagala, kao što je prethodno opisano (S13). Pročišćeni virus pohranjen je na -80 ° C. Kvalitet virusa procijenjen je infektivnim titrom koji je procijenjen u stanicama HEK293. AAV-ΔFosB-GFP virusi bili su na sličan način pripremljeni. Za HSV-Cre, Cre ekspresiju je pokretao IRES promotor, za razliku od IE4 / 5 promotora, kako bi se minimiziralo Cre ekspresija i spriječila toksičnost neurona (vidi S14 za izgradnju virusa). U svim je slučajevima virusna prekomjerna ekspresija potvrđena, i jedno i drugo vitro i in vivo, putem qPCR-a, a virusi su imunohistokemijski potvrđeni da pokazuju NAc-ograničenu ekspresiju nakon operacije.
Stereotaksijska kirurgija
Pod anestezijom ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (10 mg / kg), miševi su bili smješteni u stereotaksičnom instrumentu za male životinje, a površina kranija bila je izložena. Trideset tri igle špriceva korištene su za bilateralnu infuziju 0.5 μl virusa u NAc pod kutom 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) brzinom 0.1 μl / min. Životinjama koje su primile HSV injekcije je dopušteno da se oporave tokom 2 dana nakon operacije, dok su miševi korišteni za testiranje ponašanja primajući AAV vektore oporavljeni za 20 dana prije nego što su bili podvrgnuti kondicioniranju. Ova vremena su u skladu s periodima maksimalne virusne ekspresije transgena za dva vektora. Za infuzije BIX01294, svaka od dvije mini pumpe postavljena je supkutano na leđima miša. Položaji kanile postignuti su bušenjem dvije male kranijalne rupe iznad NAc i isporukom kanile iz bregme (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Miševima je omogućeno da se oporave od operacije tijekom 4 do 5 dana prije početka postupka kondicioniranja kokaina, kako je opisano u nastavku.
Uvjetovana preferencija mjesta
Postupak kondicioniranja mjesta proveden je kao što je ranije opisano, uz sljedeće modifikacije (S7). Ukratko, tri dana nakon intra-NAc infuzija HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP ili HSV-GFP, miševi su smješteni u komore za kondicioniranje, koje se sastoje od tri različita okruženja. Miševi koji su pokazali značajnu sklonost bilo kojoj od dvije kondicione komore izuzeti su iz studije (<1093% svih životinja). Grupe za kondicioniranje tada su uravnotežene kako bi se prilagodile bilo kakvim pristranostima komore koje još uvijek mogu postojati. Sljedećih dana životinjama je ubrizgana fiziološka otopina i zatvorena u jednu komoru popodne na 10 minuta, a zatim je ubrizgana kokain (30 mg / kg, ip) i zatvorena 10 minuta u drugu komoru navečer tijekom 30 dana (dva fiziološka otopina i dva uparivanja kokaina). Na dan testa, miševi su vraćeni u aparat bez obrade tijekom 2 minuta i testirani kako bi procijenili koju stranu preferiraju. Lokomotorni odgovori na kokain procjenjivali su se pomoću prekida zraka u komorama uparenim s kokainom kako bi se osigurala učinkovitost liječenja lijekovima. Za eksperimente AAV i BIX20 CPP primijenjen je malo modificirani protokol. Životinjama je ponovno ubrizgana fiziološka otopina ili kokain (01294 mg / kg, ip) i zatvorene u određene komore tijekom 10-minutnih sesija, ali umjesto toga bile su uvjetovane samo jednom dnevno tijekom 30 dana, nakon čega je uslijedio test 4. dana (životinje su bile kondicionirane navečer su se izmjenjivali tretmani za kondicioniranje). Za sve skupine procijenjena je osnovna lokomocija kao odgovor na fiziološku otopinu kako bi se osiguralo da liječenje virusima ili inhibitorima ne utječe na kretanje.
Intravenska samouprava kokaina
Na početku pokusa dobiveni su mužjaci dugogodišnjih štakora Long-Evansa, mase 230-250 g. Bili su smješteni u okruženju s vlagom i temperaturom u obrnutom ciklusu svjetla / mraka u satu 12 (svjetla ugašena u 9: 00 ujutro) s ad libitum pristup hrani i vodi. Štakorima je bilo dopušteno da se aklimatiziraju u njihovom novom okruženju i njima se svakodnevno upravljalo 1 tjedan prije početka eksperimenta. Svi postupci provedeni su u skladu s Vodičem za njegu i uporabu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravstvo, a odobrio ih je Odbor za njegu i upotrebu životinja Mount Sinai. Oprema za samoupravljanje bila je opremljena infracrvenim zracima za mjerenje ponašanja lokomotora. Samo-primjena je provedena kao što je prethodno opisano (S15-S16) s kateterima ugrađenim u desnu vratnu venu pod anestezijom izofluranom (2.4–2.7%). Kateteri su isprani s 0.1 ml fiziološke otopine koja sadrži 10 U heparina i ampicilina (50 mg / kg). Nakon tjedan dana oporavka od operacije, započeo je trening samoupravljanja tijekom tamne faze ciklusa svjetlost / mrak. Životinjama je omogućen trosatni dnevni pristup kokainu (3 mg / kg / infuzija) prema rasporedu pojačanja s fiksnim omjerom-0.75 (FR1), gdje je 1 aktivna preša poluge rezultirala jednom infuzijom lijeka. Štakori su stabilizirali unos kokaina nakon 1 dana (<6% varijacija u stopi odgovora tijekom 15 uzastopna dana, s najmanje 3% koji su reagirali na ojačanu polugu). 75 sata nakon završne sesije samo-administracije, štakori su brzo obezglavljeni, mozgovi su brzo uklonjeni i obrađeni za izolaciju RNA i qPCR.
Kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)
Svježi udarci NAc bili su formaldehidski umreženi i pripremljeni za ChIP kao što je prethodno opisano (S17-S18) s manjim izmjenama. Ukratko, sakupljeni su NAc ubodi 4 kalibracije po životinji (životinje 14 skupljene po uzorku), umreženi s 5% formaldehidom i ugašeni 1 M glicinom prije zamrzavanja na -2 ° C. Dan 80 prije ultrazvuka uzorka, ovčje anti-zečeve / miša (ovisno o oborinskom antitijelu) pripremljene su magnetske kuglice IgG inkubacijom odgovarajućih magnetskih zrnaca bilo s anti-G1a (zečji poliklonalni stupanj ChIP) ili anti-H9K3me9 (mišji monoklonski stupanj ChIP) antitijela preko noći na 2 ° C pod stalnom rotacijom u blok otopini. Sonifikacija tkiva i šišanje kromatina provedeni su kako je ranije opisano (S17). Nakon ultrazvuka jednake koncentracije kromatina prenesene su u nove epruvete i ~ 5% konačnih proizvoda je spremljeno da posluže kao "ulazni" nadzor. Nakon temeljitog ispiranja i resuspendiranja konjugirane smjese perla / antitijela, svakom uzorku kromatina dodane su jednake količine smjesa antitijelo / zrno (~ 7.5 μg protutijelo / uzorak) i inkubirano ~ 16 sati pod stalnom rotacijom na 4 ° C. Uzorci su dalje isprani i obrnuti umreženi na 65 ° C preko noći prije pročišćavanja DNA upotrebom kompleta za pročišćavanje PCR. Nakon pročišćavanja DNA, uzorci su podvrgnuti qPCR-u i normalizirani na odgovarajuće 'ulazne' kontrole kao što je prethodno opisano (S17). Normalne imunoprecipitacije mišjeg IgG koristeći mišje poliklonalno anti-IgG antitijelo također su provedene radi kontrole odgovarajućeg obogaćivanja pojačanja signala. Adeninska fosforibosiltransferaza (APRT) korištena je kao negativna kontrola za eksperimente prekomjerne ekspresije s kokainom i ΔFosB. Vidjeti Dopunska tablica S5 za sekvence promotorskih primera.
Dendritična analiza kralježnice
Da bismo istražili ulogu G9a u regulaciji neuronske morfologije in vivo, koristili smo ranije opisane metode sa sljedećim modifikacijama (S1). Tri dana nakon injekcije HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (svi virusi korišteni su u miševima Wild C57Bl / 6J) ili HSV-Cre-GFP (koristi se u G9afl / fl miševi), kada je virusna ekspresija bila maksimalna, miševi su perfuzirani, mozgovi su krio zaštićeni i kasnije su odsječeni na 100 μm na vibratome. Sekcije su zatim imuno obojene koristeći antitijelo protiv GFP-a kako je gore opisano (vidjeti Imunohistohemiju). Za procjenu učinaka G9a prekomjerne ekspresije i udara na brojeve kralježnice, kao i učinka prekomjerne ekspresije ΔJunD, izmjerili smo broj bodljika na približno 1 – 2 neurita po neuronu koji je jednak najmanje 299 μm sekundarnih dendrita iz NAc medija koji iskazuje GFP špijunski neuroni (MSN). S obzirom da se MSN razlikuju morfološki od ostalih neuronskih populacija u NAc, kao i prijašnja izvješća koja ukazuju da HSV primarno inficira DARPP-32 ekspresionirajuće neurone u ovoj moždanoj regiji (S19), uvjereni smo da su MSN-i bili isključivo ocijenjeni u ovim studijama. Za svaku životinju ispitivali smo ~ 6 – 8 neurone u životinjama 3 – 4 po skupini (7 grupe), nakon čega je dobivena prosječna vrijednost za svaku životinju za statističku analizu. Eksperimenti osmišljeni za ispitivanje učinaka prekomjerne ekspresije ΔFosB na gustoću kralježnice NAc izvedeni su slično kao što je gore opisano, s izuzetkom što su AAV vektori korišteni za izražavanje GFP-a ili ΔFosB-GFP u dužem vremenskom razdoblju (8 tjedana). Sve slike HSV-a snimljene su pomoću konfokalnog mikroskopa s 100X uljnim ciljem uranjanja (AAV slike snimljene su s 63X ciljem uranjanja uljom). Slike su dobivene pomoću otvora postavljenog na proizvoljnoj jedinici 1 i veličine okvira 1024 × 1024. Dendritička duljina mjerena je korištenjem softvera NIH Image J, a primarni eksperimentator je brojao kralježnicu slijepo, budući da su slajdovi kodirani prije eksperimentalnog skeniranja. Izračunan je prosječni broj bodlji po 10 μm dendrita.
Statistička analiza
Izvršene su jednosmjerne i ANOVA za određivanje važnosti za sklonost kondicioniranom mjestu i dendritičku analizu kralježnice s više od dvije skupine. Studentovi t testovi korišteni su za druge usporedbe, uključujući qPCR, Western blotning, dendritičku analizu kralježnice uspoređujući HSV-GFP s HSV-Cre u G9afl / fl miševi, analize mikrorazreda (vidi gore) i eksperimenti imunoprecipitacije kromatina. Planirani studentski t-testovi korišteni su nakon dvosmjerne ANOVA analize gustoće dendritične kralježnice nakon prekomjerne ekspresije ΔFosB s potvrdom značajnih glavnih učinaka liječenja lijekovima i virusa. Sve vrijednosti uključene u legende slika predstavljaju srednju vrijednost ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Detaljne statističke analize za Sl. 1-3 u glavnom su tekstu date u: Detaljane legende slika uključujući statistiku.
fusnote
Potvrđujem da nijedan materijal uključen u rukopis nema pravo Bitna uloga histon metiltransferaze G9a u plastičnosti izazvanoj kokainom prethodno su objavljeni ili se razmatraju na drugom mjestu, uključujući na Internetu.
Sav rad koji uključuje upotrebu životinja proveden je u skladu s institucionalnim i IACUC smjernicama na Medicinskom centru Sveučilišta u Teksasu i jugozapadu te Medicinskom fakultetu Mount Sinai.
Reference i bilješke
;