(HUMAN) Ponašanje i strukturalni odgovori na kronični kokain zahtijevaju povratnu petlju koja uključuje ΔFosB i proteinu kinazu ovisnu o kalciju / kalmodulinu II u ljusci nukleusa

Transkripcijski faktor ΔFosB i proteina kinaza II (CaMKIIa) obogaćena mozgom inducirana je u nucleus accumbens (NAc) kroničnom izloženošću kokainu ili drugim psihostimulantnim lijekovima, u kojima dva proteina posreduju osjetljive lijekove , Iako ΔFosB i CaMKIIa reguliraju ekspresiju i funkciju AMPA glutamatnog receptora u NAc, formiranje dendritske kralježnice na NAc srednjim živčanim neuronima (MSNs) i lokomotornu senzibilizaciju na kokain, do danas nije istražena izravna veza između tih molekula. Ovdje pokazujemo da je ΔFosB fosforiliran CaMKIIα na Ser27 koji stabilizira protein i da je CaMKII potrebne za akumulaciju ΔFosB posredovane kokainom u NAc štakora.

Nasuprot tome, pokazali smo da je ΔFosB i neophodan i dovoljan za indukciju ekspresije CaMKIIα gena in vivo, što je selektivno za D₁-Specipe u nabornoj podregiji NAc.

Nadalje, indukcija dendritičnih bodljika na NAc MSN-ima i povećana reakcija ponašanja na kokain nakon prekomjerne ekspresije NAc ΔFosB ovisni su o CaMKII.

Važno je da prvi put demonstriramo indukciju ΔFosB i CaMKII u NAc od ovisnika o ljudskom kokainu, sugerirajući moguće ciljeve za buduću terapijsku intervenciju. Ovi podaci potvrđuju da ΔFosB i CaMKII sudjeluju u pozitivnoj feedforward petlji specifičnoj za stanični tip i mozak, kao ključni mehanizam za reguliranje kruga nagrađivanja mozga kao odgovor na kronični kokain.

Uvod

Sve više dokaza podupire mišljenje da promjene u ekspresiji gena doprinose mehanizmima ovisnosti o drogama (Robison i Nestler, 2011). Jedan od važnih posrednika ovih promjena je ΔFosB, transkripcijski faktor obitelji Fos (Nestler, 2008). Kronična primjena praktički bilo kojeg lijeka uzrokuje dugotrajnu akumulaciju ΔFosB u nucleus accumbens (NAc), limbičkoj regiji koja je bitna za nagrađivanje. Sindukcija indukcije pojavljuje se specifično za klasu NAc srednjeg živčanog neurona (MSN) koji izražava D1 dopaminske receptore. Induktivna prekomjerna ekspresija ΔFosB u ovim NAX MSN-ovima tipa D1 povećava lokomotorne i zadovoljavajuće odgovore na kokain i morfij (Kelz i sur., 1999; Zachariou i sur., 2006), uključujući povećanu samokontrolu kokaina (Colby i sur., 2003). Nadalje, genetska ili virusna blokada ΔFosB transkripcijske aktivnosti smanjuje učinak ovih lijekova (Zachariou i sur., 2006), ukazujući da je ova kontinuirana indukcija ΔFosB kritični posrednik trajnih promjena izazvanih u NAc kroničnom primjenom lijeka.

Neuobičajena stabilnost ΔFosB (u odnosu na sve ostale proteine ​​Fos obitelji) je i unutarnje svojstvo molekule, zbog skraćivanja degron domena prisutnih u FosB-u pune duljine (Carle i sur., 2007), i regulirani proces. ΔFosB je fosforiliran vitro i in vivo na Ser27, i ova reakcija dalje stabilizira ΔFosB, 10-puta, u staničnoj kulturi i NAc in vivo (Ulery-Reynolds i sur., 2009). Iako se pokazalo da je Ser27-ΔFosB supstrat za kazein-kinazu-2 vitro (Ulery i sur., 2006), njegov mehanizam in vivo fosforilacija ostaje nepoznata.

Proteinska kinaza II (CaMKII) ovisna o kalciju / kalmodulinu je visoko eksprimirana serin / treonin kinaza čije a i β izoforme tvore dodekamerne homo- i hetero-holoenzime in vivoi neophodni su za višestruke oblike neuroplastičnosti (Lisman i sur., 2002; Colbran i Brown, 2004). CaMKIIa se selektivno inducira u ljusci NAc pomoću kroničnog amfetamina (Loweth i sur., 2010), a farmakološka blokada CaMKII aktivnosti u NAc ljusci smanjuje senzibilizaciju ponašanja na amfetamin (Loweth i sur., 2008) i kokain (Pierce i sur., 1998, dok je prekomjerna ekspresija virusa CaMKIIα u ovoj NAc subregiji povećala lokomotornu senzibilizaciju i samoprimjenu amfetamina (Loweth i sur., 2010). CaMKIIa može utjecati na ponašanje nagrađivanja putem modulacije podjedinica receptora AMPA glutamata (Pierce i sur., 1998), budući da je aktivnost CaMKIIa dugo povezana s funkcijom AMPA receptora i sinaptičkim ciljanjem u nekoliko oblika neuroplastičnosti (Malinow i Malenka, 2002).

Ova literatura pokazuje nekoliko paralela između ΔFosB i CaMKII: obje su nužne i dovoljne za višestruke učinke lijekova zlostavljanja, kako upreguliraju dendritične bodlje u različitim vrstama neuronskih stanica. in vivo (Jourdain i sur., 2003; Maze i sur., 2010), i oboje vrše barem neke od svojih učinaka ponašanja kroz modulaciju AMPA receptora (Kelz i sur., 1999; Malinow i Malenka, 2002; Vialou i sur., 2010). Unatoč tim paralelama, nije poznata nikakva funkcionalna veza između ΔFosB i CaMKII. Ovdje utvrđujemo recipročnu regulaciju između ΔFosB i CaMKII, i demonstriramo da dva proteina oblikuju D1-tip MSN specifičnu petlju prema naprijed u NAc ljusci koja je inducirana kokainom i regulira niz odgovora kokaina. in vivo.

Idi na:

Materijali i metode

Eksperiment 1: iTRAQ proteomska analiza ljuske NAc i jezgre nakon tretmana kokainom (Slika 1A)

Odraslim (8 tjednima) muškim štakorima primijenjen je 20 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine IP puta jednom dnevno tijekom sedam dana. 24 h nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisekcirane (Slika 1A) i bljeskalicom. iTRAQ analize su provedene kao što je prethodno opisano (Ross i sur., 2004; Davalos i sur., 2010).

Slika 1

Shema specifična indukcija CaMKII u NAc pomoću kokaina

Eksperiment 2: kvantificiranje promjena proteina u jezgri i ljusci NAc štakora nakon tretmana kokainom (Slika 1B – D)

Odraslim (8 tjednima) muškim štakorima primijenjeno je 10 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine IP na jednom danu tijekom sedam dana u komorama za lokomotorno snimanje. Lokomotorni odgovori na jednu injekciju kokaina (5 mg / kg IP) zabilježeni su kod onih životinja koje su prethodno liječene kokainom (nazvane "kronične") i dijela onih koji su liječeni fiziološkom otopinom (nazvana "akutna"), a lokomotorni odgovori na slanu otopinu Samo su zabilježene u životinjama koje su tretirane kroničnom slanom otopinom (tzv. "slane otopine"). Ispitivanja lokomotorne aktivnosti provedena su kako je opisano (Hiroi i sur., 1997). Ukratko, odrasli mužjaci štakora smješteni su u 18 ”× 24” PAS kutije za snimanje na otvorenom polju (San Diego Instruments) za 30 min da bi se habituirali, davali su jednu IP injekciju fiziološke otopine i pratili su dodatni 30 min, te su dobili jednu IP injekciju 5 mg / kg kokaina i prati se tijekom 30 min.

24 h nakon ove posljednje injekcije, štakori su bez glave bez anestezije kako bi se izbjegli učinci anestetika na razine proteina neurona i fosfo-stanja. Mozgovi su serijski rezani u matrici 1.2 mm (Braintree Scientific), a ciljno tkivo je uklonjeno u fosfatnom puferu koji sadrži proteazu (Roche) i fosfatazu (Sigma Aldrich) inhibitorima pomoću 14 mjernog udarca za NAc jezgru i 12 mjerni udar preostalih tkivo za NAc ljusku (Vidi Slika 1A) i odmah zamrznuti na suhom ledu. Uzorci su homogenizirani laganim soniciranjem u modificiranom RIPA puferu: 10 mM Tris baza, 150 mM natrijev klorid, 1 mM EDTA, 0.1% natrijev dodecil sulfat, 1% Triton X-100, 1% natrijev deoksiholat, pH 7.4, inhibitori proteaze i fosfataze kao gore. Nakon dodavanja Laemmli pufera, proteini su razdvojeni na 4-15% poliakrilamidnim gradijentnim gelovima (Kriterijski sustav, BioRad), a Western blotting je proveden korištenjem Odyssey sustava (Li-Cor) prema proizvođačkim protokolima.

Eksperiment 3: Kvantificiranje promjena proteina u NAC jezgri štakora i ljusci nakon povlačenja kokaina (Slika 1E)

Odraslim (8 tjednima) muškim štakorima primijenjen je 10 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine IP puta jednom dnevno tijekom sedam dana. 14 dana nakon završne injekcije, životinje koje su liječene fiziološkom otopinom dobile su još jednu injekciju fiziološke otopine (pod nazivom "fiziološka otopina), a životinje koje su liječene kokainom dobile su još jednu injekciju fiziološke otopine (zvanu 14 dan povlačenje ili" 14d WD ") ili jednu injekciju kokaina ( pod nazivom “14d WD Chal” za izazov). Jedan sat nakon konačne injekcije, životinje su dekapitirane i Western blot izveden je kao u Eksperiment 2.

Eksperiment 4: Kvantificiranje promjena proteina u jezgri i ljusci NAc štakora nakon samo-administracije kokaina (Slika 2A – C)

Štakori su trenirani da samostalno primjenjuju 0.5 mg / kg / infuziju kokaina u jednom satu pod rasporedom 1 fiksnog omjera za devet dana. Nakon devet početnih sesija, štakori su podijeljeni u dvije skupine koje su bile uravnotežene unosom kokaina u zadnje dvije sesije. Jednoj skupini štakora bilo je dopušteno da samostalno primjenjuju kokain (0.5 mg / kg / infuzija) tijekom jednog sata (kratak pristup, ShA), dok je druga skupina štakora uzimala kokain u šest sati (dugi pristup, LgA). ) za dodatnih deset dana (sesije eskalacije).

Sekcije mozga su obrađene za imunohistokemiju kako je opisano (Perrotti i sur., 2004). Mozgovi su perfundirani 18-24 hr nakon posljednjeg izlaganja lijeku, što je rezultiralo razgradnjom bilo kojeg preostalog FosB proteina pune duljine tako da sva preostala imunoreaktivnost odražava ΔFosB. Ova degradacija je potvrđena Western blottingom, koji nije pokazao značajno bojenje s protutijelom usmjerenim protiv C terminusa FosB pune duljine koji ne prepoznaje ΔFosB (podaci nisu prikazani). Nakon rezanja u sekcije 35 um, broj ΔFosB imunopozitivnih stanica je kvantificiran od strane slijepog promatrača u dva dijela kroz NAc svakog štakora, a srednje vrijednosti za 40 × polje su zatim izračunate po regiji za svaku životinju. Svaka životinja smatrana je pojedinačnim promatranjem za statističku analizu. Regije od interesa su identificirane pomoću Paxinos i Watson (Paxinos i Watson, 2007).

Kvantifikacija imunoreaktivnosti CaMKIIa provedena je pomoću Licor sustava kao što je opisano (Covington i sur., 2009). Integrirani intenziteti CaMKII i GAPDH određeni su pomoću Odyssey softvera. Rezultati su prikazani kao integrirane vrijednosti intenziteta po mm² i prikazani su kao sredstva ± sem (n = 4 – 10 po skupini). Vrijednosti za GAPDH korištene su kao referenca za normalizaciju intenziteta CaMKII za debljinu presjeka i uvjete.

Slika 2

Indukcija CaMKII u NAc ljusci štakora i kokaina ovisnika

Eksperiment 5: Kvantificiranje razine proteina kod ljudi ovisnih o kokainu (Slika 2D)

Postupak

Postmortem tkiva ljudskog mozga dobivena su od Quebec Suicide Brain Bank (Sveučilište Douglas Mental Health University, Montreal, Quebec, Kanada). Očuvanje tkiva odvijalo se u suštini kako je opisano (Quirion i sur., 1987). Ukratko, nakon što je izvađen, mozak se stavlja na mokri led u kutiju od stiropora i odlazi u postrojenja za suicidalno mozak u Quebecu. Hemisfere se odmah razdvajaju sagitalnim rezom u sredini mozga, moždanog stabla i malog mozga. Krvne žile, pinealna žlijezda, žilski pleksus, polu mozak i pol moždanog stabla obično su izrezane iz lijeve hemisfere koje se zatim presjecaju koronalno u kriške debljine 1 cm prije zamrzavanja. Potonja polovica cerebeluma je prerezana sagitalno u kriške debljine 1cm prije zamrzavanja. Tkiva su zamrznuta u 2-metilbutanu na -40 ° C tijekom ~ 60 sek. Sva zamrznuta tkiva čuvaju se odvojeno u plastičnim vrećicama na -80 ° C za dugotrajno skladištenje. Specifična područja mozga se izrezuju iz smrznutih koronalnih rezova na ploči od nehrđajućeg čelika sa suhim ledom svuda oko sebe da bi se kontrolirala temperatura okoline. Western blot je proveden kao što je opisano u Eksperiment 2.

kohorta

Skupina je bila sastavljena od 37 muških i 3 ženskih ispitanika, u dobi između 15-66 godina. Svi su ispitanici iznenada umrli bez produljenog agonalnog stanja ili dugotrajne medicinske bolesti. U svakom slučaju, uzrok smrti utvrđen je u Quebecovom Coroner uredu, a toksikološki pregled proveden je s uzorcima tkiva kako bi se dobile informacije o lijekovima i nedopuštenoj uporabi tvari u vrijeme smrti. Skupinu ispitanika činili su pojedinci 20 koji su zadovoljili kriterije SCID-I za ovisnost o kokainu. Kontrolnu skupinu činili su ispitanici 20-a bez povijesti ovisnosti o kokainu i bez većih psihijatrijskih dijagnoza. Svi subjekti su iznenada umrli iz uzroka koji nisu imali izravan utjecaj na tkivo mozga. Grupe su bile podjednake za prosječnu starosnu dob, kašnjenje hlađenja i pH. Za sve ispitanike izvršene su psihološke obdukcije kako je prethodno opisano (Dumais i sur., 2005), omogućujući nam pristup detaljnim informacijama o psihijatrijskoj i medicinskoj povijesti, kao i drugim relevantnim kliničkim i sociodemografskim podacima. Ukratko, obučeni anketar je vodio Strukturirani klinički intervju za DSM-IV Psihijatrijski poremećaji (SCID-I) s jednim ili više doušnika pokojnika. Panel kliničara pregledao je SCID-I procjene, izvješća o slučajevima, zabilješke mrtvozornika i medicinsku dokumentaciju kako bi dobio konsenzusne psihijatrijske dijagnoze.

Eksperiment 6: Imunoprecipitacija kromatina za NAc štakora (Slika 3A – C)

Odraslim (8 tjednima) muškim štakorima primijenjen je 10 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine IP puta jednom dnevno tijekom sedam dana. 24 sati nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisktirane. Kromatin imunoprecipitacija (ChIP) je provedena objedinjavanjem bilateralnih NAc punusa ljuske ili jezgre od sedam štakora po skupini u 14 ukupnim skupinama (98 ukupno životinja, 7 kokainski bazeni, 7 slane bazene). Tkiva su umrežena, isprana i pohranjena na -80 ° C do smicanja kromatina sonikacijom. Skraćena kromatina inkubirana je preko noći s antitijelima prethodno vezanim za magnetske kuglice (Dynabeads M-280, Invitrogen). Neimunski IgG je korišten kao kontrola. Nakon povratnog umrežavanja i pročišćavanja DNA, koristi se qPCR za mjerenje razina CaMKIIa promotorske DNA. Prajmeri su dizajnirani da amplificiraju regiju koja sadrži AP-1 konsenzus sekvencu lociranu na 450 bp prije početka transkripcijske lokacije (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Revers: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Slika 3

TypeFosB indukcija CaMKIIa prema tipu stanica i regiji in vivo

Eksperiment 7: Mjerenje transkripta CaMKII i ekspresije proteina s ΔFosB prekomjernom ekspresijom specifičnom za stanični tip (Slika 3D)

Muški bitransgenični miševi izvedeni iz NSE-iTA (linija A) × TetOp-ΔfosB (linija 11) i NSE-iTA (linija B) × TetOp-FLAG-ΔfosB miševi (linija 11) (Chen i sur., 1998; Kelz i sur., 1999; Werme i sur., 2002; Zachariou i sur., 2006) su koncipirani i uzgojeni na 100 µg / ml doksiciklinu za suzbijanje ekspresije ΔFosB tijekom razvoja. Nasadnici su podijeljeni na odbiće: polovica je ostala na doksiciklinu, a polovica je prebačena u vodu, a životinje su korištene 8 do 11 tjedana kasnije kada su transkripcijski učinci ΔFosB maksimalni (Kelz i sur., 1999; McClung i Nestler, 2003). Za transkripcijske analize, miševi su brzo dekapitirani, a mozgovi su uklonjeni i stavljeni na led. Disekcije NAc su uzimane s 14-mjernim iglom i brzo smrznute na suhom ledu dok se RNA ne ekstrahira. Izolacija RNA, qPCR i analiza podataka provedeni su kako je prethodno opisano (LaPlant et al., 2009). Ukratko, RNA je izolirana s TriZol reagensom (Invitrogen), dalje pročišćena s RNAeasy mikro kitom iz Qiagena i provjerena je kvaliteta s Agilentovim Bioanalyzer. Reverzna transkripcija je izvedena korištenjem iScript (BioRad). qPCR je proveden s Applied Biosystems 7900HT RT PCR sustavom sa slijedećim parametrima ciklusa: 10 min na 95 ° C; 40 ciklusi 95 ° C za 1 min, 60 ° C za 30 s, 72 ° C za 30 s; stupnjevano zagrijavanje do 95 ° C da se dobiju krivulje disocijacije za potvrdu pojedinačnih PCR produkata. Imunohistokemijske analize ekspresije proteina ΔFosB i CaMKIIα provedene su kako je opisano u Eksperiment 4.

Eksperiment 8: Učinci antagonista dopaminskih receptora D-NUMX i D1 Intra-NAc na promjene proteina posredovanih kokainom (Slika 3H)

Odraslim (8 tjednima) mužjacima štakora primijenjen je 10 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine ("vehikl" grupa) IP jednom dnevno tijekom sedam dana. 30 min prije svake injekcije kokaina, štakorima je IP primijenjen antagonist D1 receptora SCH 23390 (0.5 mg / kg, "D1 Ant" grupa) ili antagonist D2 receptora etikloprid (0.5 mg / kg, "D2 Ant" grupa). ili kontrolnom injekcijom s fiziološkom otopinom (skupina "kokain"). 24 sati nakon završne injekcije, životinje su dekapitirane i proteini su kvantificirani pomoću Western blot-a kao u Eksperiment 2.

Eksperiment 9: Učinci AAV-posredovane ΔFosB prekomjerne ekspresije na ekspresiju proteina (Slika 4 A – C)

Stereotaksijska kirurgija provedena je na odraslim mužjacima štakora (8 tjedana) za ubrizgavanje AAV-GFP (zeleni fluorescentni protein) ili AAV-GFP-ΔFosB (Maze i sur., 2010). 33 igle za mjerenje (Hamilton) korištene su za sve operacije, tijekom kojih je 0.5 µl pročišćenog virusa visokog titra bilateralno infundiran tijekom vremenskog perioda od 5 min, nakon čega je uslijedio dodatni 5 min post-infuzijski period odmora. Sve udaljenosti se mjere u odnosu na Bregmu: 10 ° kut, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dana nakon operacije, životinjama je dana jedna IP injekcija 10 mg / kg kokaina u komorama za lokomotorno praćenje kako bi se procijenili učinci ponašanja prekomjerne ekspresije ΔFosB. 24 sati nakon ove završne injekcije, štakori su dekapitirani prema per Eksperiment 2i mikrodisekcija tkiva je provedena pod fluorescentnim mikroskopskim vodstvom kako bi se dobilo GFP-pozitivno NAc tkivo. Zatim je izvršeno Western blotting kao po Eksperiment 2.

Slika 4

ΔFosB je i nužan i dovoljan za indukciju CaMKIIα-ovisne D1 receptora posredovane kokainom u NAc ljusci

Eksperiment 10: Učinci AAV-posredovane ΔJunD prekomjerne ekspresije na ekspresiju proteina ovisne o kokainu (Slika 4 D – F)

Stereotaksijska injekcija AAV-GFP ili AAV-GFP-ΔJunD provedena je prema Eksperiment 8. 14 dana nakon kirurškog zahvata, životinjama je primijenjeno 10 mg / kg kokaina ili fiziološke otopine IP-a jednom dnevno tijekom sedam dana u komorama za lokomotorno snimanje. Zabilježeni su lokomotorni odgovori na jednu injekciju kokaina (5 mg / kg IP) ili fiziološke otopine. 24 sati nakon ove završne injekcije, štakori su odrubljeni glave, tkivo sakupljeno, i Western blot izvedeni kao u Eksperiment 9.

Eksperiment 11: In vitro Analize proteinske kinaze (Slika 5A – D)

Rekombinantni CaMKIIa i ΔFosB su pročišćeni iz stanica insekata (Brickey i sur., 1990; Jorissen i sur., 2007) i testovi kinaze proteina (Colbran, 1993), kao što je prethodno opisano. Ukratko, CaMKII je prethodno inkubiran na ledu s 2.5 uM (ili naznačenom koncentracijom) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺40 mM Mg²⁺15 uM kalmodulina i 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilacija je započeta dodavanjem 200 µM ​​ATP sa ili bez [y-³²P] ATP i ostavljeno da nastavi tijekom 10 min na sobnoj temperaturi (Slika 5A i B) ili 2 min na ledu (Slika 5C & D). Proizvodi su riješeni Western blottingom (Slika 5A i B) ili pomoću autoradiograma i scintilacijskog brojanja (Slika B-D).

Slika 5

ΔFosB je snažan supstrat za CaMKIIa

Eksperiment 12: Identifikacija fosforilacije Ser27 ΔFosB (Slika 5E)

In vitro Ispitivanja kinaze provedena su prema Eksperiment 11, proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE, a trake koje odgovaraju ΔFosB izrezane su i podvrgnute tandemskoj masenoj spektrometriji. M / z dodjeli odgovarajućih ionskih fragmenata u svim pločama označeni su na vrhu vršnih iona. Nisu svi fragmenti ioni označeni zbog ograničenja prostora. Općenito, tekst za oznake ionskih fragmenata obojene su u crnoj boji, osim kada izravno potvrđuju ili dodaju dokaz prisutnosti mjesta fosforilacije od interesa, u kojem slučaju su označene crvenom bojom. Dokazi o produktima fragmentacije kralježnice prikazani su u redoslijedu očitavanja fosfopeptida s detektiranim mjestom ostatka fosforilacije označenim crvenom bojom s oznakom pojedinačne aminokiseline. Numerički opis promatranih fragmenta iona također je označen na peptidnoj sekvenci kao b i y ioni. Faktori zumiranja za dijelove m / z osi kako bi se pokazali fragmenti iona nižeg intenziteta označeni su na vrhu svakog masenog spektra fragmenta. Frakcijski ioni prikazani na ploči H potvrđuju prisutnost Ser27 fosforilirane izoforme, međutim, unutar smjese drugih fosforiliranih izoformi na mjestima Ser28, Ser31, Ser34 i Thr37. Prisustvo pa5, pa5-P, pb5 i pb5-P jona jedinstveno potvrđuje fosforilaciju Ser27 ostatka.

Eksperiment 13: kvantifikacija fosforilacije Ser27 (Slika 5F)

Standardni peptidi su dizajnirani tako da oponašaju fosfo i nefosfo oblike Ser27AFosB. Nakon sinteze i pročišćavanja, svaki "teški" idiotipski peptid je otopljen u puferu 50 / 50 acetonitril / voda i poslan na analizu amino kiselina kako bi se odredila apsolutna koncentracija na sintetičkoj osnovnoj otopini peptida. Svaki "teški" peptid je zatim izravno infundiran u 4000 QTRAP maseni spektrometar (MS) kako bi se odredila najbolja energija sudara za MS / MS fragmentaciju i dvije do četiri MRM prijelaze. Zatim, čisti "teški" peptidi su podvrgnuti LCMS na 4000 QTRAP kako bi se osiguralo odvajanje peptida. Instrument je pokrenut u trostrukom kvadrupolnom načinu, s Q1 postavljenim na specifičnu vrijednost prekursora m / z (Q1 nije skeniranje), a Q3 postavljen na specifičnu vrijednost m / z koja odgovara specifičnom fragmentu tog peptida. U MRM modu, serija pojedinačnih reakcija (prijelazni / fragmentni ionski prijelazi u kojima je energija sudara podešena da optimizira intenzitet fragmentiranih iona) mjereni su sekvencijalno, a ciklus (tipično 1 – 2 sec) je bio petlja cijelo vrijeme HPLC razdvajanja. MRM prijelazi su određeni iz MS / MS spektara postojećih peptida. Potom su odabrane dvije tranzicije po peptidu, koje odgovaraju fragmentima iona visokog intenziteta, a energija sudara optimizirana je da maksimizira jačinu signala MRM prijelaza upotrebom softvera za automatizaciju. Maksimumi koji su rezultat standardnih peptida i ΔFosB uzoraka koji su izloženi CaMKII ili kontroli su zatim uspoređeni kako bi se odredilo apsolutno obilje svake peptidne forme u reakciji. Analiza podataka na LC-MRM podacima vrši se pomoću softvera AB Multiquant 1.1.

Eksperiment 14: Indukcija ΔFosB u CaMKII prekomjerno ekspresirajućim miševima (Slika 5G & H)

Transgenični miševi koji prekomjerno eksprimiraju T286D CaMKII (Mayford i sur., 1996; Kourrich i sur., 2012) i divljeg tipa littermates su uzgojeni u odsutnosti doksiciklina kako bi se omogućila ekspresija transgena. Odraslim miševima je dan 20 mg / kg kokaina ili fiziološka otopina IP jednom dnevno tijekom 14 dana. 24 h nakon završne injekcije, životinje su dekapitirane i imunohistokemija i kvantifikacija ΔFosB ekspresije je izvedena kao u Eksperiment 4.

Eksperiment 15: Učinci HSV-posredovane ΔFosB prekomjerne ekspresije i inhibicije CaMKII na NAc dendritične bodlje (Slika 6A – E)

Odrasli mužjaci miševa (8 tjedana) su stereotaksijski injektirani u NAc s HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson i sur., 2006HSV-GFPAC3I, ili HSV-GFPAC3I-ΔFosB. U tim konstruktima, AC3I, inhibitor CaMKII na bazi peptida, spojen je na C-kraj GFP. GFPAC3I je kloniran PCR-om koristeći pMM400-vektor koji sadrži GFPAC3I kao predložak sa slijedećim primerima: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (stezaljka) GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Rezultirajući PCR produkt umetnut je u p1005 + i p1005 + -Δ FosB vektore koristeći Nhel i BspEI mjesta. Konstrukt je potvrđen sekvenciranjem. Stereotaksične koordinate bile su: 10 ° kut, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfuzija i presjeci mozga izvedeni su prema per Eksperiment 4.

Analiza kralježnice provedena je kako je opisano (Christoffel i sur., 2011). Ukratko, dendritički segmenti 50-150 µm udaljeni od soma slučajno su odabrani iz HSV-inficiranih stanica koje izražavaju GFP. Slike su dobivene na konfokalnom LSM 710 (Carl Zeiss) za morfološku analizu korištenjem NeuronStudio s rayburst algoritmom. NeuronStudio klasificira bodlje kao tanke, gljive ili stubby na temelju sljedećih vrijednosti: (1) omjer širine i visine, (2) omjer glave i vrata i (3) promjer glave. Kičme s vratom mogu se klasificirati kao tanke ili gljive, a one bez značajnog vrata klasificiraju se kao tvrdoglavi. Kičme s vratom označene su kao tanke ili gljive na temelju promjera glave.

Slika 6

Blokada djelovanja CaMKII sprječava morfološke i bihevioralne učinke ΔFosB u NAc

Eksperiment 16: Učinci HSV-posredovane ΔFosB prekomjerne ekspresije i inhibicije CaMKII na odgovore na kokain (Slika 6F)

Odraslim mužjacima miševa injicirani su virusi prema izumu Eksperiment 15, a lokomotorni odgovori na jednu 5 mg / kg injekciju kokaina izmjereni su prema per Eksperiment 9. Podaci o lokomotoru izraženi su kao ukupni prekidi snopa tijekom 30 min nakon injekcije kokaina.

dodatne informacije

Kućište životinja

Mužjaci štakora Sprague Dawley (250-275 g; Charles River Laboratories) bili su smješteni u paru. Muški miševi C57BL / 6J starih osam tjedana (Jackson Laboratory) bili su smješteni u skupinu s najviše pet životinja po kavezu. Sve životinje su naviknute na životinjski objekt za ≥1 tjedan prije eksperimentalnih manipulacija i smještene u klimatiziranim sobama (23 – 25 ° C) na 12 hr ciklusu svjetla / mraka (svjetla u 7: 00 AM) s pristupom hrani i vode ad libitum, Eksperimenti su provedeni u skladu sa smjernicama Društva za neuroznanost i institucionalnog odbora za njegu i korištenje životinja (IACUC) na brdu Sinai.

Droge

Lijekovi su primijenjeni IP i otopljeni u sterilnoj fiziološkoj otopini, uključujući kokain (5-20 mg / kg po 10 µl za miševe, po 1 ml za štakore, NIDA) i SCH 23390 ili etikloprid hidroklorid (0.5 mg / kg po 1 ml, Tocris) , Za stereotaksijsku kirurgiju, miševi su anestezirani s "koktelom" ketamina (100 mg / kg) i ksilazinom (10 mg / kg) (Henry Schein) u sterilnoj fiziološkoj otopini.

antitijela

CaMKIIα (ukupno): upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (ukupno): Signalizacija ćelija 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: fosforna otopina, 1: 500

GluA1 (ukupno): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Milipore Ab1557P, 1: 1,000

Statističke analize

Sve statističke analize provedene su pomoću programskog paketa Prism 6 (GraphPad). Studentski t-testovi korišteni su za sve parne usporedbe (navedene u Rezultati gdje je dana vrijednost t), i za jednosmjerne ANOVA-e korištene su sve višestruke usporedbe (naznačeno u dijelu rezultata gdje je zadana vrijednost F).

Idi na:

Rezultati

Kronični kokain izaziva CaMKII u NAc Shell

Mnoge studije su pokazale da MSN u ljusci i jezgri NAc-a imaju različite biokemijske i fiziološke odgovore na kroničnu izloženost drogama (Kourrich i Thomas, 2009; Loweth i sur., 2010) i da dvije podregije različito reguliraju ponašanje koje traži droga (Ito i sur., 2004). Odrediti diferencijalne učinke kokaina na sastojke proteina NAc ljuske vs jezgre, koristili smo multipleksirano izobarično označavanje (iTRAQ) i tandemsku masenu spektroskopiju (MS / MS). Odraslim mužjacima štakora injiciran je IP s kokainom (20 mg / kg) ili fiziološkom otopinom dnevno tijekom 7 dana; 24 h nakon zadnje injekcije, NAc ljuska i jezgra su mikrodisekcirane (Slika 1A) i bljeskalicom. Proteini u tim uzorcima su zatim kvantificirani pomoću iTRAQ. Sva četiri izoforma CaMKII pokazala su veliko povećanje ekspresije nakon tretmana kokainom koji su bili specifični za NAc ljusku u usporedbi s jezgrom. Nekoliko proteinskih fosfataza, uključujući PP1 katalitičke i regulatorne podjedinice i PP2A, koje su prethodno bile povezane s različitim CaMKII supstratima u drugim sustavima (Colbran, 2004), slijedio je sličan uzorak. Ovi su nalazi pružili nove, nepristrane dokaze da je signalni put CaMKII na vidljiv način reguliran kokainom u NAc-u.

Da bismo potvrdili ovaj nalaz više kvantitativno, liječili smo štakore kao gore s kokainom (u različitim dozama) ili fiziološkom otopinom i mjerili smo lokomotorne odgovore na kokain (5 mg / kg) ili dozirnu dozu fiziološke otopine. Ponovljena izloženost 10 mg / kg kokaina rezultirala je tipičnim obrascem lokomotorne senzibilizacije (Slika 1B). Daljnje studije s ovim režimom doziranja otkrile su, pomoću Western blotinga, da ponovljeni kokain inducira CaMKIIa selektivno u NAc ljusci 24 h nakon konačne injekcije kokaina (Slika 1C i D; p = 0.0019; F = 7.943; DF = 29). Osim toga, fosforilacija kanonskog CaMKII supstrata Ser831 podjedinice GluA1 receptora AMPA značajno je povećana u NAc ljusci, a ne u jezgri (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), dok je autofosforilacija CaMKIIa Thr286 imala jaku ali ne značajan trend prema indukciji samo u ljusci (Slika 1D). Nekoliko drugih receptora glutamata nije bilo zahvaćeno. Za razliku od ovih mjera CaMKII, isti uzorci tkiva prikazali su indukciju ΔFosB u obje ljuske (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) i jezgru (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) NAc (Slika 1C i D), u skladu s prethodnim nalazima (Perrotti i sur., 2008).

Budući da je nekoliko prethodnih studija kokainske regulacije AMPA receptora analiziralo životinje nakon of 14 dana odustajanja od kroničnog kokaina (vidi raspravu), ponovili smo ove biokemijske analize u ovom trenutku. Otkrili smo da 14 dana nakon konačne injekcije kokaina, ΔFosB ostaje povišen u NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), dok ni CaMKII ni fosforilacija GluA1 Ser831 ostaje povećana (Slika 1E). Međutim, 1 hr nakon jedne 10 mg / kg izazovne doze kokaina, razine ukupnog CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) i GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) i fosforilacija su povišene do stupnja sličnog onom koji se pronađe nakon početnog kroničnog izlaganjaSlika 1E). Ovi podaci ukazuju da su neuroni NAc ljuski pripremljeni za indukciju CaMKII tijekom produženih razdoblja apstinencije, možda putem izravnog primiranja promotora CaMKII gena (vidi raspravu). Štoviše, činjenica da je indukcija ΔFosB perzistentnija od indukcije CaMKII ukazuje na postojanje dodatnih mehanizama, bilo na osnovi kromatina ili na drugi način, koji vrše "kočnicu" na regulaciju CaMKII, kao što je opisano u raspravi.

Kako bismo dodatno ojačali ova opažanja, istražili smo modele samoupravljanja kokainom, koji uključuju voljni unos droge. Odraslim mužjacima štakora dan je ili kratak ili dugačak pristup kokainu; kako se i očekivalo (Ahmed i Koob, 1998), samo dugi uvjeti pristupa doveli su do eskalacije samouprave lijeka (Slika 2A). ΔFosB je induciran u većoj mjeri dugotrajno vs kratak pristup kokainu u obje NAc ljuske (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) i jezgra (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Nasuprot tome, CaMKIIa je induciran u NAc ljusci samo dugim pristupom kokainu (Slika 2B i C; p = 0.0236; F = 4.957; DF = 16). Zanimljivo je usporediti prosječni dnevni unos kokaina kod životinja kratkog pristupa (12 mg / kg IV), životinja s dugim pristupom (70 mg / kg IV) i životinja koje su primile eksperimente (10 mg / kg), i pitati zašto potonji izaziva snažnu indukciju ΔFosB i CaMKII, dok kratki pristup ne. Razlika je vjerojatno posljedica razlika u vršnim razinama kokaina (kokain koji se primjenjuje na eksperimentu daje se kao jedan bolus IP, dok se kokain koji se primjenjuje samostalno daje putem višestrukih IV doza) ili razlikama u dužini izloženosti lijeku (7 dana za eksperimentatora) davanja, 19 dana za samoupravu).

Unatoč velikoj literaturi o ΔFosB i CaMKII u djelovanju kokaina, nema istraživanja tih proteina kod korisnika kokaina. Ovdje predstavljamo prvi dokaz da su razine i ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) i CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) povećane u NAc ljudi koji ovise o kokainu (Slika 2D, Tablica 1). Ovi podaci pokazuju da je naše ispitivanje indukcije ΔFosB i CaMKII kokainom u NAc glodavaca klinički relevantno za ovisnost o kokainu.

Tablica 1

Karakterizacija uzoraka od ovisnika o ljudskom kokainu i odgovarajuće kontrolne skupine

ΔFosB selektivno regulira transkripciju CaMKII u MSN-ovima tipa D1 u NAc Shell-u

Nalaz da su i CaMKII i ΔFosB regulirani kokainom u NAc glodavaca, doveli su nas do toga da odredimo može li ΔFosB regulirati transkripciju gena CaMKII. Prethodno smo izvijestili CaMKIIα kao moguću metu za ΔFosB u nepristranoj analizi mikrorazreda NAc (McClung i Nestler, 2003), ali ovaj nalaz nije dalje potvrđen u toj studiji. Najprije smo upotrijebili kvantitativni ChIP (qChIP — ChIP nakon kojeg slijedi kvantitativna PCR) kako bismo utvrdili da li se ΔFosB veže za promotor gena CaMKIIα u NAc odraslih mužjaka štakora, i utvrdili da je ovo vezanje značajno povećano kod kronične primjene kokaina u ljusci ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ali ne i jezgru, podregiju (Slika 3A). Da bi se dalje razumjeli mehanizmi povezani s ovom subregion-specifičnom razlikom u vezanju ΔFosB na CaMKIIα promotor, koristili smo qChIP da karakteriziramo stanje modifikacija histona u ovoj genomskoj regiji. Prethodne studije pokazale su indukciju kokaina acetilacijom H3 na promotoru CaMKIIα u ukupnom NAc miša (Wang et al., 2010). Nasuprot tome, otkrili smo da kokain smanjuje acetilaciju H3 na promotoru CaMKIIα selektivno u NAc jezgri (Slika 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), bez promjene vidljive u ljusci, u skladu s promjenama kromatina specifičnim za subregion izvan ΔFosB vezanja. qCHIP za represivni znak, dimetilirani H3 lizin 9 (H3K9me2), otkrio je trendove smanjenja u obje podvrste ljuske i jezgre (Sl. 3C).

Da bi se odredilo da li ΔFosB regulira transkripciju CaMKIIa in vivo, koristili smo dvije bitransgenične linije miša koje inducibno prekomjerno eksprimiraju ΔFosB posebno u D1 vs MSN-ovi tipa D2 na način kontroliran davanjem doksiciklina u vodi za piće (Chen i sur., 1998; Kelz i sur., 1999; Werme i sur., 2002). Odrasli mužjaci miševa koji su prekomjerno eksprimirali ΔFosB isključivo u MSN-ovima tipa D1 imali su značajno povišene razine CaMKIIa mRNA u NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), efekt koji se ne vidi kod miševa koji prekomjerno eksprimiraju ΔFosB pretežno u MSN-ovima tipa D2 (Slika 3D). Povećanje CaMKIIa mRNA, inducirano ekspresijom ΔFosB u MSN-ovima tipa D1, popraćeno je istodobnim povećanjem CaMKIIα proteina u obje NAc ljuske (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) i jezgra (p = 0.0392; t Df = 2.275; Slike 3E i F). Ovi podaci pokazuju da je ΔFosB sposoban za ekspresiju CaMKIIα gena u MSN-ovima tipa D1 u obje podregije, iako Slika 3B sugerira da se promjene kromatina uzrokovane kokainom na CaMKIIa promotoru (npr. smanjenoj acetilaciji) sprječavaju da ΔFosB regulira CaMKII u središnjoj podregiji nakon kokaina.

Budući da su naši podaci o transgenim mišima pokazali da je ΔFosB indukcija ekspresije gena CaMKII specifična za MSN tipa D1 u NAc, dalje smo pokušali utvrditi zahtijeva li koprena regulacija CaMKII ovisna o kokainu aktivaciju D1 dopaminskog receptora. Odraslim muškim štakorima davani su kronični kokain ili fiziološka otopina kao i prije, ali 30 minuta prije svake injekcije, štakorima iz skupine kokaina davana je IP injekcija fiziološke otopine, D1 antagonist SCH 23390 (0.5 mg / kg) ili antagonist D2 receptora etikloprid (0.5 mg / kg). Životinje su analizirane 24 sata nakon posljednje injekcije kokaina. Western blotting otkrio je da je antagonist D1, ali ne i D2, u potpunosti blokirao porast ΔFosB posredovanog kokainom (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kako je prethodno navedeno (Nye i sur., 1995), kao iu CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Slika 3G i H). Ovi podaci podupiru hipotezu da kokain uključuje povećanje ekspresije CaMKII gena posredovanog ΔFosB specifično u MSN-ovima tipa D1 NAc ljuske. Bilo bi važno u budućim istraživanjima izravno prikazati učinak kokaina specifičnog tipa stanica na ekspresiju CaMKII unutar ovog područja mozga.

ΔFosB je potreban i dovoljan za indukciju CaMKII u NAc ljusci

Kako bi upotpunili upotrebu bitransgeničnih miševa, zatim smo proučavali ulogu ΔFosB u posredovanju indukcije CaMKIIa kokaina korištenjem virusnog prijenosa gena kod štakora. Dvostrano smo ubrizgali adeno-povezane virusne (AAV) čestice u NAc ljusku odraslih mužjaka štakora (gdje se ljuska može selektivno ciljati) da prekomjerno eksprimiraju ΔFosB plus GFP ili GFP sam. Životinje su zatim primile jednu IP injekciju 10 mg / kg kokaina. Životinje koje su prekomjerno eksprimirale ΔFosB / GFP pokazale su povećani lokomotorni odgovor u usporedbi sa životinjama koje su prekomjerno eksprimirale sam GFP (Slika 4A). 24 h nakon jedne injekcije kokaina, GFP-pozitivno NAc tkivo je izrezano iz tih životinja disekcijom pod fluorescentnim izvorom svjetlosti. Western bloting ovog tkiva (Slika 4B i C) otkrila je snažnu prekomjernu ekspresiju ΔFosB, kao i značajno povećanje ukupnog CaMKIIα proteina u usporedbi s GFP životinjama (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), slično indukciji koja se vidi kod kronične primjene kokaina. Dodatno, CaMKIIa autofosforilacija na Thr286 (što ukazuje na aktivaciju enzima) povećana je prekomjernom ekspresijom ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), kao i fosforilacija CaMKII supstrata, Ser831 od GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012; df = 28), opet oponašajući djelovanje kroničnog kokaina (Slika 1C i D). TZajedno, ovi podaci pružaju dodatne dokaze da je ekspresija ΔFosB u ljusci NAc dovoljna za senzitivizaciju lokomotora na kokain i za indukciju i aktivaciju CaMKII u ovom podregiju.

Koristili smo sličan pristup kako bismo utvrdili je li ΔFosB također nužan za indukciju CaMKIIα posredstvom kokaina u NAc ljusci. AAV je korišten za prekomjernu ekspresiju skraćenog JunD proteina, nazvanog ΔJunD, koji je negativni regulator ΔFosB transkripcijske aktivacije (Winstanley i sur., 2007) plus GFP ili GFP sam. Dva tjedna kasnije, kada je ekspresija transgena maksimalna, životinjama je dan kokain (10 mg / kg) ili fiziološka otopina dnevno tijekom 7 dana, i testirano na lokomotorne odgovore na izazivanje kokaina (5 mg / kg) 24 h nakon posljednje kronične injekcije (Slika 4D). Prekomjerna ekspresija ΔJunD spriječila je lokomotornu senzibilizaciju prema kokainu, a također je spriječila indukciju i aktivaciju CaMKIIα u ljusci NAc (Slika 4E i F; p = 0.0437; F = 2.997; ukupno df = 38), što ukazuje da je ΔFosB transkripcijska aktivnost neophodna za indukciju CaMKIIa posredovanu kokainom u ovoj subregiji. Zanimljivo je da smo otkrili da ΔJunD smanjuje razine ΔFosB u uvjetima koji su tretirani fiziološkom otopinom i kokainom (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), povećavajući novu mogućnost da ΔFosB ovisi o aktivnosti AP-1 za vlastite razine ekspresije.

CaMKII Fosforilira ΔFosB na Ser27

Korištenje vitro Pokusi kinaze proteina, utvrdili smo da je pročišćeni ΔFosB robustan supstrat za CaMKIIa. Njegova inkubacija₆-AFosB s CaMKIIα i ATP uzrokovali su pomak prema gore u elektroforetskoj pokretljivosti ΔFosB (Slika 5A); nekoliko rezultirajućih traka ukazalo je na više mjesta fosforilacije. Sličan vitro analize kinaza pomoću [γ-³²P] ATP pokazao je ugradnju radioaktivno obilježenog fosfata u pomaknute ΔFosB vrpce (Slika 5B), pokazujući direktnu fosforilaciju proteina. Stvorili smo fosfo-specifično antitijelo za prethodno okarakterizirani Ser27 ΔFosB (Ulery i sur., 2006). Dok ovo antitijelo ne proizvodi signal protiv ekstrakta mozga koji sadrže Ser27-fosforilirani ΔFosB (podaci nisu prikazani), mogli smo otkriti fosforilaciju Ser27 u vitro analiza kinaze pomoću CaMKII (Slika 5B). Kinetička analiza CaMKII fosforilacije ΔFosB ukazuje da je ona snažan supstrat za kinazu (Sl. 5C), s prividnim K_M 5.7 ± 2.0µM i K_MAČKA 2.3 ± 0.3min^-1, Ovi rezultati su usporedivi s mnogim dobro opisanim in vivo supstrati CaMKII (Colbran i Brown, 2004). Osim toga, utvrdili smo da CaMKII fosforilira ΔFosB sa stehiometrijom 2.27 ± 0.07 mol / mol (Slika 5D), što pokazuje da postoje najmanje tri mjesta fosforilacije CaMKII unutar His₆-AFosB protein, u skladu s Slika 5A.

Da bismo istražili pojedina mjesta fosforilacije, koristili smo MS analize uzoraka iz naše vitro ispitivanja kinaza. Slika 5E pokazuje ΔFosB fosforilaciju na prethodno karakteriziranom Ser27 i na nekoliko dodatnih mjesta (podaci nisu prikazani). S obzirom na prethodnu funkcionalnu karakterizaciju Ser27-a, usredotočili smo se na ovo mjesto generiranjem obilježenih sintetskih peptida koji oponašaju fosfo- i nefosfo-stanja Ser27-a, a zatim koristili poznate količine tih peptida kao standarde u MRM analizama ΔFosB prije i poslije vitro fosforilacija pomoću CaMKII. Naknadna kvantifikacija (Slika 5F) potvrđuje da je Ser27 snažan supstrat za CaMKII. Ovi rezultati ukazuju na to da je, između više fosforiliranih ostataka unutar ΔFosB, Ser27 posebno učinkovit supstrat za CaMKII.

CaMKII posreduje u akumulaciji ΔFosB kokaina u ljusci NAc

Budući da CaMKII može fosforirati ΔFosB vitro na mjestu koje dramatično povećava njegovu stabilnost vitro i in vivo (Ulery i sur., 2006; Ulery-Reynolds i sur., 2009), utvrdili smo da li aktivnost CaMKII kontrolira razine ΔFosB u NAc in vivo, Da bismo odgovorili na ovo pitanje, najprije smo koristili liniju miša koja je prekomjerno eksprimirala mutaciju CaMKIIa (T286D) neovisnu o kalciju u više područja mozga, uključujući NAc (Mayford i sur., 1996; Kourrich i sur., 2012). Mužjacima i divljim tipovima koji su se podjednako podudarali u dobi, koji su odgovarali uzrastu, injicirali smo 20 mg / kg kokaina ili fiziološku otopinu jednom dnevno tijekom 14 dana, a zatim smo analizirali životinje dan nakon završne injekcije. Otkrili smo da su bazalne razine ΔFosB povećane kod mutantnih životinja u NAc ljusci (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ali ne i jezgre (Slika 5G i H). Iznenađujuće, indukcija ΔFosB ovisna o kokainu blokirana je u mutantnim životinjama u ljusci i jezgri, što ukazuje na to da, iako CaMKII može izravno regulirati stabilnost ΔFosB u NAc ljusci, ona također može ležati uzvodno od ΔFosB u putovima aktiviranim kokainom u obje NAc subregije ,

Aktivnost CaMKII potrebna je za strukturiranu i ponašajnu plastičnost ΔFosB

Indukcija kokaina dendritičkim bodljama na NAc MSN-u jedna je od najbolje uspostavljenih prilagodbi uzrokovanih lijekovima u ovom području mozga, a takva indukcija kralježnice korelirana je s osjetljivim odgovorima na ponašanje lijeka (Robinson i Kolb, 2004; Russo i sur., 2010) i prijavljeno da je selektivno za MSN-ove tipa D1 (Lee i sur., 2006). Nedavno smo pokazali da je indukcija kokaina dendritičnih bodlji u NAc ovisna o ΔFosB i njenom nizvodnom transkripcijskom programu (Maze i sur., 2010). Iako postoji opsežna literatura o uključenosti CaMKII u morfologiju dendritske kralježnice i indukciju u drugim regijama mozga i eksperimentalnim sustavima (Jourdain i sur., 2003; Penzes i sur., 2008; Okamoto i sur., 2009), njegova uloga u NAc MSN formaciji kralježnice nije istražena. Stoga smo odredili da li je CaMKII aktivnost potrebna za ΔFosB-posredovanu indukciju MSN dendritičnih bodljika pomoću HSV-posredovane prekomjerne ekspresije CaMKII inhibitora peptida AC3I spojenog na GFP, konstrukt koji je ranije pokazao da inhibira aktivnost CaMKII. in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Virusna prekomjerna ekspresija ΔFosB u NAc ljusci odraslih miševa inducirala je značajan porast MSN dendritične gustoće kralježnice (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Slika 6A i B) kako je prethodno prijavljeno (Maze i sur., 2010), a to povećanje je prvenstveno potaknuto tankim (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) vrstama kralježnice (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) (obje smatrane nezrelim bodljama) (Slika 6C – E). Nije bilo učinka na zrelijim grebenastim bodljama. Međutim, kada je GFP-AC3I koeksprimiran, indukcija ΔFosB bodljama je potpuno ukinuta (Slika 6A – E), što pokazuje da je aktivnost CaMKII potrebna za indukciju ΔFosB dendritičnih bodlji u ljusci NAc.

Zatim smo koristili iste viralne alate da utvrdimo je li aktivnost CaMKII potrebna za djelovanje ΔFosB-a na osjetljivost na kokain. 72 h nakon injekcije virusa u NAc ljusku, životinjama je dana jedna injekcija 5 mg / kg kokaina i zabilježena je njihova lokomotorna aktivnost. Kao što je prethodno prikazano s više proširene AAV prekomjerne ekspresije ΔFosB (Slika 4A), HSV posredovana prekomjerna ekspresija ΔFosB povećala je lokomotornu osjetljivost na kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Slika 6F). Kao i kod indukcije dendritičnih bodova, inhibicija aktivnosti CaMKII koekspresijom GFP-AC3I potpuno je blokirala ΔFosB-posredovano povećanje osjetljivosti kokaina, ukazujući da je aktivnost CaMKII potrebna za promjene u ponašanju kokaina uzrokovane ΔFosB-om.

Idi na:

Rasprava

Ova studija opisuje novi mehanizam prijenosa napitka u kojem kokain inducira ΔFosB u NAc, koji selektivno prepravlja transkripciju gena CaMKIIα u NAc ljusci. CaMKIIα zatim fosforilira i stabilizira ΔFosB što dovodi do veće akumulacije ΔFosB i daljnje indukcije CaMKIIα (Slika 6G). Ko-eskalirajući nivoi dvaju proteina tijekom kronične izloženosti kokainu doprinose na bitan način senzibiliziranim reakcijama ponašanja na lijek. Ovo je osobito privlačna hipoteza jer su i ΔFosB i CaMKII prethodno pokazali da su potrebni za povećane reakcije na kokain (Pierce i sur., 1998; Peakman i sur., 2003), i taj nalaz nalazimo za ΔFosB u NAc školjci, specifično koristeći virusni pristup (Slike 4 i and66).

Premda transgena ΔFosB prekomjerna ekspresija u MSN-ovima tipa D1 može potaknuti CaMKII indukciju i u NAc ljusci i jezgri životinja koje nisu na kokainu, u kontekstu kokaina, nakupljanje endogenog ΔFosB, koje se događa u obje podregije, potiče indukciju CaMKII specifično u NAc ljusci , Ova razlika može se odnositi na više razine ΔFosB inducirane u našem bitransgeničkom modelu, međutim, može također odražavati sposobnost kokaina da diferencijalno promijeni CaMKIIα promotor u ljusci vs jezgre MSN-a ili promicati ΔFosB vezanje u bivšoj ili ga isključiti u potonjoj podregiji. Zapravo, naši ChIP podaci, koji otkrivaju kokainom posredovanu deacetilaciju histona na CaMKIIα promotoru gena samo u NAc jezgri, podupiru moguće sudjelovanje mehanizma kromatina. U skladu s ovom hipotezom, prekomjerna ekspresija ΔFosB u MSN-ovima tipa D1 uspjela je inducirati CaMKIIα indukciju u NAc jezgri u odsutnosti kokaina (Slika 3F), što sugerira da postoje aktivne modifikacije CaMKIIa promotora koje sprječavaju ovu indukciju tijekom kronične izloženosti kokainu. Regulacija krajolika kromatina na promotoru CaMKII može također objasniti zašto se CaMKII inducira izazovnom dozom kokaina u NAc ljusci kroničnih štakora koji se povlače iz kokaina (Slika 1E), ali ne i životinja koje nisu bile liječneSlika 1D). To bi moglo predstavljati epigenetski efekt ΔFosB-a na primarnu gensku aktivnostRobison i Nestler, 2011), te bi stoga mogao biti jedan molekularni mehanizam inkubacije žudnje za kokainom (Pickens et al., 2011). Međutim, da bi se ta kromatinska promjena uzročno povezala s inkubacijom žudnje, ona bi se s vremenom trebala povećavati. Bit će zanimljivo utvrditi je li to slučaj, i istražiti jesu li drugi geni pokazali ΔFosB-ovisnu, subregionsku specifičnu regulaciju kokainom. Također je važno napomenuti da napojna petlja koju opisujemo ne dovodi do beskrajne akumulacije CaMKII ili ΔFosB (Slika 1E); otkrivanje molekularne "kočnice" odgovorne za to važan je cilj budućih studija.

Poznate funkcije ΔFosB i CaMKII u nekoliko eksperimentalnih sustava i regija mozga konvergiraju se na mnogim razinama (Slika 6F). Obje molekule su blisko povezane s dendritičkim rastom kralježnice: CaMKII interagira s aktinskim citoskeletom (Okamoto i sur., 2009), regulira veličinu glave kralježnice (Matsuzaki i sur., 2004), i oboje je nužno i dostatno za plastično inducirano povećanje filopodije i broja sinapsi u hipokampalnim organotipskim kulturama kriške (Jourdain i sur., 2003), while ΔFosB je i neophodan i dovoljan za dendritičko stvaranje kralježnice uzrokovano kokainom u NAc MSN-ovima (Maze i sur., 2010). Osim toga, obje molekule su povezane s regulacijom AMPA receptora glutamata. CaMKII ne regulira ukupne razine podjedinica AMPA receptora, ali pokreće umetanje AMPA receptora u sinapse i povećava provodljivost AMPA kanala fosforilacijom GluA1 na Ser831 u hipokampalnim piramidnim neuronima u kulturi i in vivo (pregledano u (Malinow i Malenka, 2002; Colbran i Brown, 2004)). Takva povećana trgovina GluA1-om sinapsi je također uključena u kronično djelovanje kokaina (Boudreau i Wolf, 2005). Štoviše, reakcije ponašanja na aktivaciju AMPA receptora u NAc pojačane su prekomjernom ekspresijom CaMKIIa na način ovisan o D1 dopaminskom receptoru (Singer i sur., 2010). Pokazalo se da dugotrajna D1-specifična prekomjerna ekspresija ΔFosB inducira GluA2 transkripciju u NAc (Kelz i sur., 1999), što smanjuje AMPA odgovore posredovane putem GluA1-a, dok ovdje pokazujemo da kratkoročna ΔFosB prekomjerna ekspresija - kao i kraća izloženost kokainu - nemaju učinka na ovu podjedinicu (Slika 1). Ipak, nedavno smo otkrili da kratkotrajna prekomjerna ekspresija ΔFosB ipak smanjuje AMPA odgovore u MSN-ovima tipa D1 u NAc-u (Grueter i dr., 2013). Ovi podaci sugeriraju vremenski različite mehanizme koji bi mogli predstavljati seriju neuroadaptacija ovisnih o kokainu ovisno o vremenu koje su temelj različitih aspekata napredovanja ovisnosti koji još nisu dobro shvaćeni. Na razini ponašanja potrebni su i CaMKII i ΔFosB za lokomotornu senzibilizaciju prema kokainu (vidi gore), a oba su potrebna za kontinuiranu kokainsku samoupravu kod glodavaca (Colby i sur., 2003; Wang et al., 2010), sugerirajući da su ta dva proteina važna i za kratkoročne i za dugoročne prilagodbe ponašanja izloženosti lijekovima, iako putem djelomično različitih mehanizama. Pretpostavlja se da ΔFosB i CaMKII reguliraju takve složene prilagodbe ponašanja kroz promjene u sinaptičkoj funkciji NAc, iako je potreban daljnji rad kako bi se sinaptičke pojave izravno povezale s promjenom ponašanja.

CaMKII holoenzim istodobno stupa u interakciju s različitim proteinima povezanim sa sinapsom (Robison i sur., 2005) za koje se smatra da reguliraju njegovo ciljanje na postsinaptičnu gustoću (PSD), što je fenomen koji se smatra važnim za sinaptičku plastičnost. Naročito je nedavno pokazano da interakcija CaMKII s podjedinicom GluN2B glutamatnog receptora tipa NMDA regulira i sinaptičku plastičnost i učenje (Halt et al., 2012). Dok AC3I peptid oponaša autoinhibitornu domenu CaMKII, i time inhibira katalitičku aktivnost enzima, ona također blokira višestruke interakcije proteina i proteina (Strack i sur., 2000; Robison i sur., 2005). Dakle, bihevioralni i morfološki učinci HSV-GFP-AC3I koji su ovdje opisani mogu se pojaviti kroz smanjenu fosforilaciju CaMKII ciljnih proteina, promjene u CaMKII ciljanju, ili promjenu u predloženoj strukturnoj ulozi CaMKII na sinapsama (Lisman i sur., 2002).

Ograničenje predložene ΔFosB-CaMKII petlje na NAc ljusci je od posebne važnosti, budući da su nedavni radovi pokazali nekoliko fizioloških razlika između NAc ljuske i jezgre kao odgovor na administraciju kokaina, što je potvrđeno našim nepristranim iTRAQ podacima (Tablica S1). , MSN-ovci u NAc ljusci pokazuju depresiju u kapacitetu pečenja nakon kroničnog kokaina koji se održava tjednima, dok osnovne MSN poruke istih životinja pokazuju prolazno (1 – 3 dan) povećanje kapaciteta paljenja koje se vraća na bazalne razine u 2 tjedana (Kourrich i Thomas, 2009). Osim toga, brojni sinaptički proteini su različito regulirani u NAc ljusci vs jezgra životinja izloženih kroničnom kokainu, uključujući GluA2 (Knackstedt i sur., 2010). Kako kronični amfetamin inducira CaMKIIa posebno u NAc ljusci (Loweth i sur., 2010), nije iznenađujuće da sličan učinak nalazimo kod kokaina. Međutim, kako se ΔFosB inducira i u NAc ljusci i jezgri od strane kroničnog kokaina (Perrotti i sur., 2008), a budući da smo pokazali da je CaMKIIα indukcija u ljusci ovisna o ΔFosB, naši rezultati pružaju nove dokaze za različite transkripcijske mehanizme na CaMKIIα promotoru između ove dvije podregije, koje su odgovorne za selektivnu indukciju CaMKIIa u ljusci.

Veliki dio nedavnih radova usredotočen je na ocrtavanje razlika između NAX MSN-a tipa D1 i D2. Iako su i receptori D1 i D2 uključeni u nagrađivanje kokaina (Self, 2010), nedavni rad pokazuje da optogenetska aktivacija MSN-ova tipa D1 povećava reakcije ponašanja na kokain, dok aktivacija MSN-a tipa D2 ima suprotan učinak (Lobo i sur., 2010). U skladu s tim nalazima, miševi koji nokautiraju D1-receptor su deficitarni u stjecanju kokainske samouprave (Caine i sur., 2007), dok D2 nokauti nisu (Caine i sur., 2002). Primjena D1 agonista izravno u NAc aktivira ponašanje koje traži kokain u paradigmama za ponovnu uspostavu (Self, 2010). Zanimljivo, ovaj učinak zahtijeva povećanje zavisnosti CaMKII-aktivnosti u D-NUMX-receptoru u NAc ljusci, ali ne i jezgru (Anderson i sur., 2008), rezultat koji se lijepo slaže s D1- i specifičnom -FosB-CaMKII petljom predloženom ovdje.

Prethodno smo izvijestili da se Ser27 u ΔFosB može fosforilirati kazein kinazom-2 (Ulery i sur., 2006), međutim, ovdje utvrđujemo da CaMKII fosforilira ΔFosB na ovom i drugim mjestima s daleko većom kinetikom i stehiometrijom i može replicirati višu očitu M_r uočeno za ΔFosB (Slika 5A) s izlaganjem kokainu in vivo (Nestler, 2008). Već znamo da fosforilacija Ser27 povećava stabilnost ΔFosB i aktivnost transkripcije (Ulery i sur., 2006; Ulery i Nestler, 2007; Ulery-Reynolds i sur., 2009). Budući rad će se sada usredotočiti na identifikaciju i funkcionalne posljedice novih mjesta fosforilacije ΔFosB koja je naznačena u ovoj studiji.

Opisana petlja naprijed-natrag pruža uvjerljiv novi mehanizam pomoću kojeg ponovna primjena kokaina pokreće progresivne abnormalnosti u NAc. Kao takav, ovaj biokemijski put može pružiti važan cilj za buduće terapeutske intervencije u poremećajima ovisnosti. Budući da je CaMKII sveprisutan i potreban za mnoge bazalne neuronske i bihevioralne funkcije, izravna upotreba CaMKII inhibitora je izbjegnuta kao liječenje ovisnosti. Naši podaci upućuju na to da suptilnije ciljanje mehanizma CaMKII indukcije, koje je specifično za pojedini tip stanice i subregiju mozga, može pružiti terapeutski cilj koji će izbjeći komplikacije sistemske inhibicije CaMKII.

Idi na:

Zahvale

Ovaj rad podržali su stipendije Nacionalnog instituta za zlouporabu opojnih droga (EJN), NIDA-jevskog centra za proteomiku DA018343 (AJR i EJN) i Hartwell Foundation (AJR). Autori žele zahvaliti Gabby Rundenko za velikodušni dar pročišćenog ΔFosB i Rogera Colbrana za velikodušni dar pročišćenog CaMKIIa.

Idi na:

Reference

1. Ahmed SH, Koob GF. Prijelaz s umjerenog na prekomjerni unos lijeka: promjena u hedoničnoj točki. Znanost. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Famous KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biokemijski most koji povezuje sustave dopamina i glutamata u traženju kokaina. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Bihevioralna senzibilizacija na kokain povezana je s povećanom površinskom ekspresijom AMPA receptora u nucleus accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ekspresija i karakterizacija alfa-podjedinice proteinske kinaze II ovisne o Ca2 + / kalmodulinu pomoću sustava ekspresije bakulovirusa. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Uloga receptora sličnih dopaminskim D2 u kokainskom samo-upravljanju: studije s mutantnim miševima receptora D2 i novim D2 receptorom antagonisti. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Nedostatak samoprimjene kokaina u dopaminskim D1 receptorima nokautnih miševa. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [PMC slobodan članak] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasom-ovisni i neovisni mehanizmi za destabilizaciju FosB-a: identifikacija FosB-degron domena i implikacije za stabilnost DeltaFosB-a. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene životinje s inducibilnom ciljanom ekspresijom gena u mozgu. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinaza regulira društveni poremećaj sinaptičke i bihevioralne plastičnosti izazvane stresom. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [PMC slobodan članak] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivacija proteinske kinaze II ovisne o Ca2 + / kalmodulinu bazalnom autofosforilacijom. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteinska fosfataze i sinaptička plastičnost proteina ovisna o proteinu kinaze II i kalcij / kalmodulin. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Protein kinaza II ovisna o kalciju / kalmodulinu i sinaptička plastičnost. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Striatalna tipična prekomjerna ekspresija DeltaFosB-a povećava poticaj za kokain. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepresivno djelovanje inhibitora histon deacetilaze. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [PMC slobodan članak] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativna proteomika proteina reguliranih caveolin-1-om: karakterizacija polimeraze i i faktora oslobađanja transkripta / CAVIN-1 IN endotelnih stanica. Molekularna proteomika. 2010; 9: 2109-2124. [PMC slobodan članak] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Faktori rizika za završetak samoubojstva u velikoj depresiji: studija slučaja kontrole impulzivnog i agresivnog ponašanja u muškarci. Am J Psihijatrija. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB diferencijalno modulira nukleus accumbens izravnu i neizravnu funkciju puta. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 u tisku. [PMC slobodan članak] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Vezanje CaMKII za GluN2B je kritično tijekom konsolidacije memorije. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [PMC slobodan članak] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Mutirani miševi FosB: gubitak kronične indukcije kokaina proteina povezanih s Fosom i povećana osjetljivost na psihomotorne i korisne učinke kokaina. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC slobodan članak] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Nuklearna akumbensova jezgra i ljuska diferencijalna kontrola ponašanja koje traži kokain. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizacija i svojstva vezanja DNA faktora transkripcije DeltaFosB. Biokemija. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Protein kinaza II ovisna o kalciju / kalmodulinu doprinosi rastu filopodije ovisnoj o aktivnosti i formiranju kralježnice. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresija transkripcijskog faktora deltaFosB u mozgu kontrolira osjetljivost na kokain. Priroda. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetska inhibicija CaMKII u dorzalnom striatalnom mediju Spiny Neurons smanjuje funkcionalne ekscitacijske sinapse i povećava unutarnju ekscitabilnost. PLoS One. 2012; 7: e45323. [PMC slobodan članak] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Trening izumiranja nakon kokainske samouprave uzrokuje glutamatergičnu plastičnost da spriječi traženje kokaina. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [PMC slobodan članak] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Slični neuroni, suprotne prilagodbe: iskustvo psihostimulanta diferencijalno mijenja svojstva paljenja u akumbens jezgri nasuprot ljuske. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [PMC slobodan članak] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-neovisni učinak Striatal alphaCaMKII potiče senzibilizaciju nagrade za kokain. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [PMC slobodan članak] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ , Uloga nuklearnog faktora kappaB u stresnoj hipersenzitivnosti stresnog hormona kod ženki miševa. Biol Psychiatry. 2009; 65: 874-880. [PMC slobodan članak] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Stvaranje dendritičkih kralježnica uzrokovanih kokainom u D1 i D2 dopaminskim receptorima koji sadrže srednje štitne neurone u nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399-3404. [PMC slobodan članak] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekularna osnova CaMKII funkcionira u sinaptičkoj i bihevioralnoj memoriji. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Specifični gubitak BDNF signalizacije ovisi o optogenetskoj kontroli nagrade za kokain. Znanost. 2010; 330: 385-390. [PMC slobodan članak] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibicija CaMKII u ljusci nucleus accumbens smanjuje povećani unos amfetamina u osjetljive štakore. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [PMC slobodan članak] [PubMed]
33. Loweth JA, pjevačica BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Prolazna prekomjerna ekspresija alfa-Ca2 + / kalmodulina ovisne protein kinaze II u ljusci nucleus accumbens pojačava ponašanje u ponašanju na amfetamine. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [PMC slobodan članak] [PubMed]
34. Malinow R, RC Malenka. Trgovina AMPA receptorima i sinaptička plastičnost. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturna osnova dugoročnog potenciranja u pojedinačnim dendritskim bodljama. Priroda. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Kontrola stvaranja memorije putem regulirane ekspresije transgena CaMKII. Znanost. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schafer Y, Nestler EJ. Bitna uloga histonske metiltransferaze G9a u plastičnosti izazvanoj kokainom. Znanost. 2010; 327: 213-216. [PMC slobodan članak] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Pregled. Transkripcijski mehanizmi ovisnosti: uloga DeltaFosB-a. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [PMC slobodan članak] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakološka ispitivanja regulacije kronične indukcije antigena antigena s FOS kokainom u striatumu i nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Uloge CaMKII i F-aktina u strukturalnoj plastičnosti dendritičnih bodova: potencijalni molekularni identitet sinaptičke oznake? Fiziologija (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB u nucleus accumbens regulira instrumentalno ponašanje i motivaciju pojačanu hranom. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Mozak štakora u stereotaksičnim koordinatama. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilna ekspresija dominantnog negativnog mutanta c-Jun-a u transgenim miševima na području mozga smanjuje osjetljivost na kokain. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergentni CaMK i RacGEF signali kontroliraju dendritičku strukturu i funkciju. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukcija deltaFosB u moždanim strukturama povezanim s nagrađivanjem nakon kroničnog stresa. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različiti obrasci indukcije DeltaFosB u mozgu pomoću droga zlostavljanja. Sinapsa. 2008; 62: 358-369. [PMC slobodan članak] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologija inkubacije žudnje za drogom. Trendovi Neurosci. 2011; 34: 411-420. [PMC slobodan članak] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Drugi glasnici posredovani kalcijem moduliraju ekspresiju senzibilizacije ponašanja na kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografija receptora za ljudski mozak pomoću dijelova cijele hemisfere: opća metoda koja minimalizira artefakte tkiva. Sinapsa. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturna plastičnost povezana s izlaganjem drogama zlostavljanja. Neurofarmakologija. 2004 (47) (1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripcijski i epigenetski mehanizmi ovisnosti. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [PMC slobodan članak] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentne interakcije proteina kinaze II ovisne o kalciju / kalmodulinu s proteinima postsinaptičke gustoće NR2B, densin-180 i alfa-aktinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Multipleksirana kvantifikacija proteina u Saccharomyces cerevisiae korištenjem amina-reaktivnih izobaričnih reagensa za obilježavanje. Molekularna proteomika. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Ovisni sinapsi: mehanizmi sinaptičke i strukturne plastičnosti u nucleus accumbens. Trendovi Neurosci. 2010; 33: 267-276. [PMC slobodan članak] [PubMed]
56. Self DW. U: Dopamin receptori. Neve KA, urednik. New York: Humana Press; 2010. 479-524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Prelazna virusna prekomjerna ekspresija protein-kinaze II ovisne o alfa-kalciju / kalmodulinu u ljusci nucleus accumbens dovodi do dugotrajne funkcionalne regulacije alfa-amino-3-hidroksil-5 Receptori -metil-4-izoksazol-propionata: receptor dopaminskog tipa-1 i ovisnost protein-kinaze A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [PMC slobodan članak] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mehanizam i regulacija ciljane protein kinaze II ovisne o kalciju / kalmodulinu na podjedinicu NR2B receptora N-metil-D-aspartata. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilacija DeltaFosB posreduje njenu stabilnost in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [PMC slobodan članak] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulacija transkripcijske aktivnosti DeltaFosB fosforilacijom Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224â € „230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulacija stabilnosti DeltaFosB fosforilacijom. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB u krugovima nagrađivanja mozga posreduje otpornost na stres i antidepresivne odgovore. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [PMC slobodan članak] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Hronična kokainom izazvana H3 acetilacija i transkripcijska aktivacija CaMKIIalpha u nucleus accumbens kritična je za motivaciju za pojačanje droge. Neuropsvchopharmacologv. 2010; 35: 913-928. [PMC slobodan članak] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB regulira rad kotača. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Indukcija DeltaFosB u orbitofrontalnom korteksu posreduje u toleranciji kognitivne disfunkcije izazvane kokainom. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Bitna uloga za DeltaFosB u nucleus accumbens u djelovanju morfija. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, cijena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibicija kalmodulin kinaze II štiti od strukturnih bolesti srca. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]