Proc Natl Acad Sci SAD A. 2005 veljača 1; 102(5): 1737-1742.
Sažetak
Kokain, droga zlostavljanja, povećava razinu sinaptičkog dopamina u striatumu blokiranjem ponovnog preuzimanja dopamina na aksonovim terminalima. Za ciklin-ovisnu kinazu 5 (Cdk5) i njegov aktivator p35, proteine uključene u fosforilaciju supstrata u postmitotičkim neuronima, pronađeno je da se nakon kronične izloženosti kokainu reguliraju gore. Kako bi se dodatno ispitali učinci indukcije Cdk5-a i p35-a na striatnu dopaminsku signalizaciju, generirali smo dvije neovisne transgene linije miša u kojima je Cdk5 ili p35 bio prekomjerno ekspresiran u neuronima. Ovdje navodimo da povećana aktivnost Cdk5, kao rezultat p35, ali ne i prekomjerne ekspresije Cdk5, dovodi do slabljenja dopaminskog signaliziranja posredovanog kokainom. Povećana Cdk5-posredovana fosforilacija dopamina i cAMP-reguliranog fosfoproteina, molekulske mase 32 kDa (DARPP-32) na Thr-75, bila je praćena smanjenom fosforilacijom DARPP-32 na Thr-34. Povećana Cdk5-posredovana fosforilacija izvanstanične signalno-regulirane kinaze kinaze 1 na Thr-286 bila je praćena smanjenom aktivacijom izvanstanične signalno-regulirane kinaze 1 / 2. Ovi učinci pridonijeli su slabljenju fosforilacije cAMP-a odgovornog za cAMP odgovor elementa-vezujućeg proteina, kao i manje indukcije c-fos u striatumu. Ovi rezultati podupiru ideju da je aktivnost Cdk5 uključena u izmijenjenu ekspresiju gena nakon kronične izloženosti kokainu i stoga utječe na dugotrajne promjene u funkciji neurona koje su u pozadini ovisnosti o kokainu.
Kokain povećava razinu sinaptičkog dopamina u striatumu i mijenja ekspresiju gena u dopaminoceptivnim neuronima aktiviranjem intracelularnih puteva koji propagiraju početni signal dopaminskog D1 receptora u jezgru (1). Kronična izloženost kokainu povećava broj transkripcijskih čimbenika, što rezultira dugotrajnim promjenama u ekspresiji gena za koje se smatra da su u osnovi neuronskih prilagodbi u ovisnosti o kokainu (2). ΔFosB, identificiran kao takav faktor transkripcije (3), pokazalo se da poboljšava reakciju životinja na kokain4, 5). Stoga se očekuje da će identifikacija ciljnih gena koji su regulirani indukcijom ΔFosB doprinijeti boljem razumijevanju molekularnog mehanizma na kojem se temelji ovisnost o kokainu. Nedavno se pokazalo da kronično liječenje životinja kokainom povećava ekspresiju ciklin-ovisne kinaze 5 (Cdk5) i njenog aktivatora p35 u striatumu kroz indukciju ΔFosB (6, 7).
Cdk5 je član Cdk porodice serin / treonin kinaza. Za razliku od drugih Cdk-a koji su glavni regulatori progresije staničnog ciklusa, Cdk5 se uglavnom bavi fosforilacijom supstrata u postmitotskim neuronima (8). Neuronska specifičnost Cdk5 aktivnosti postiže se povezivanjem s njenim aktivatorima, ili p35 ili p39, koji su pretežno eksprimirani u postmitotičkim neuronima (8). Osim bitne uloge Cdk5 u razvoju mozga (9, 10), itakođer je uključen u dopaminergičku transmisiju u postnatalnom mozgu (11, 12). Inhibicija aktivnosti Cdk5 rezultira povećanim otpuštanjem dopamina u striatumu, što ukazuje na presinaptičku funkciju Cdk5 kao negativnog regulatora otpuštanja dopamina. (11). Nadalje, Cdk5 modulira učinkovitost postsinaptičkog dopaminskog signaliziranja fosforiliranjem dopaminskog i cAMP-reguliranog fosfoproteina, molekulske mase 32 kDa (DARPP-32) na Thr-75, koji pretvara DARPP-32 u inhibitor cAMP-ovisne kinaze (PKA) (12).
Ova opažanja ukazuju na to da su Cdk5 i p35 nizvodni regulatori produžene aktivacije dopaminskog signaliziranja nakon kronične izloženosti kokainu, a time i ovisnosti o kokainu. Kako bi se dodatno razmotrila uloga Cdk5 na striatnom dopaminskom signaliziranju, generirali smo dvije transgene linije miša u kojima je ili Cdk5 ili p35 bio prekomjerno eksprimiran u neuronima pod kontrolom p35 promotora. Naši rezultati su pokazali da je aktivnost Cdk5-a regulirana povećanjem razine proteina p35, ali ne i proteina Cdk5, što ukazuje na to da je razina proteina p35 ograničena na brzinu za aktivnost Cdk5. Nudimo ovdje in vivo dokazi da povećana aktivnost Cdk5, kao rezultat prekomjerne ekspresije p35, dovodi do slabljenja dopaminskog signaliziranja posredovanog kokainom jezgrom putem inhibicije PKA i ekstracelularnih signalno-reguliranih kinaznih (ERK) kaskada.
Materijali i metode
Antitijela. Poliklonska antitijela na Cdk5 (C-8) i p35 (C-19) kupljena su od Santa Cruz Biotechnology. Fosforilacijska ovisna i neovisna protutijela za ERK kinazu (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 i cAMP-odgovor element-vezni protein (CREB) dobiveni su od Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antitijela na fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), ukupno DARPP-32 (12), i c-fos (14) korišteni su kako je opisano. Antitijelo za aktin je kupljeno od Sigme.
Eksperimentalne životinje. Ranije smo klonirali mišji p35 gen Cdk5r1, koji kodira p35 protein, i karakterizira njegovu genomsku strukturu (15). Da bi se generirao transgeni miš s neuronskom ekspresijom neurona p35 (Tgp35), 6-kb EkoFcsRI-EkoRI fragment koji sadrži 1.2-kb promotorsku regiju je subkloniran u pGEM9Z (-) plazmid, i 45-bp oznaka izvedena iz SV40 je umetnuta u KPNNalazi se nizvodno od poli (A+) signal (Slika 1A). Oznaka je sadržavala a SPEI mjesto za genotipizaciju životinja. 6-kb fragment je izrezan iz plazmida i pročišćen, praćeno pronuklearnom injekcijom transgena da se dobiju transgenični miševi. Ispitati profil ekspresije transgena pod regulatornom kontrolom 1.2-kb p35 promotora in vivo, dvostruki transgenični miš (Tgp35; p35 - / -) je dalje generiran pomoću strategije dvostupanjskog uzgoja pomoću kojega je Tgp35 miš regeneriran u endogenom p35-null pozadini. Ostali modeli miša koji su korišteni u ovom istraživanju uključivali su p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– i transgenični miš s neuronskom ekspresijom Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotipovi tih miševa određeni su ili pomoću Southern blot analize ili PCR na genomskoj DNA izoliranoj iz biopsija repa. Miševi su bili smješteni pod 12-h svjetlom / 12-h ciklusom mraka. Sva je skrb pružena u skladu s uputama Nacionalnog instituta za zdravlje o skrbi i korištenju laboratorijskih i pokusnih životinja.
Southern Blot analiza. Genomska DNA izvađena iz biopsija repa je probavljena EkoRI i SPE1, elektroforezom na 0.9% agaroznom gelu i prenesen na najlonsku membranu. Membrana je hibridizirana s slučajnim prajmiranjem 32P-obilježena sonda na 42 ° C preko noći. 485-bp sonda za genotipizaciju p35 knockout (p35 - / -) i Tgp35 miševa je generirana pomoću PCR korištenjem sljedećih primera: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'i 5′-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3'. Hibridizirana membrana je isprana dva puta u 2 × SSC / 0.1% SDS na 42 ° C za 10 min, i dva puta u 0.1 × SSC / 0.1% SDS na 65 ° C za 20 min, i izložena rentgenskom filmu.
Liječenje lijekom. Kokain (Sigma) je otopljen u sterilnoj fiziološkoj otopini. Životinje su ip-injektirane kokainom (15 mg / kg) ili jednakim volumenom fiziološke otopine u dobi od 3 mjeseci i ubijene dekapitacijom u različitim vremenskim točkama (15, 30, 60 i 120 min) nakon injekcije. Mozgovi su brzo uklonjeni i ohlađeni u ledeno hladnom PBS-u. Zatim su striata izrezana i podvrgnuta Northern ili Western blot analizi. Za imunohistokemijsku analizu, striatni rezovi dobiveni su od miševa 2 h nakon injekcije.
Northern Blot analiza. Ukupna RNA ekstrahirana je iz striata reagensom TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) i podvrgnuta Northern blot analizi kako je opisano (18). Za detekciju c-fos mRNA, 189-bp fragment mišje c-fos cDNA je korišten kao proba kao što je opisano (19). Razine c-fos mRNA su kvantificirane mjerenjem optičke gustoće specifične trake korištenjem sustava za analizu slike s nih slikom softvera, Verzija 1.62.
Western Blot analiza. Striatalna tkiva su sonificirana u 1% SDS i kuhana tijekom 10 min. Koncentracija proteina u svakom uzorku određena je BCA proteinskim testom (Pierce). Jednake količine proteina su odvojene pomoću SDS / PAGE prije prijenosa na nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane u 1 × PBS koje sadrže 5% obranog mlijeka i 0.05% Tween 20 i inkubirane s primarnim antitijelima preko noći na 4 ° C. Inkubacija s anti-mišjim ili zečjim IgG (Sigma) konjugiranim s peroksidazom provedena je na sobnoj temperaturi tijekom 60 min. Signal je detektiran pojačanom kemiluminescencijom (Pierce), a optičke gustoće traka su kvantificirane kao što je gore opisano.
Cdk5 test kinaze. Striatalni lizati su pripravljeni s puferom za lizu koji se sastoji od 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1 mM / ml aprotinina / 1 μg / ml ml inhibitora leupeptin / fosfataze (mješavina inhibitora fosfataze I i II, Sigma). Lizati su imunoprecipitirani bilo s anti-Cdk1 (C-1) ili anti-p5 (C-8) antitijelima. Cdk35 imunoprecipitati su pripravljeni inkubacijom 19 μl lizata (koji odgovara 5 μg proteina) s anti-Cdk300 antitijelom (300 μg) preko noći na 5 ° C nakon čega slijedi daljnja inkubacija s 3 μl zrnaca proteina A-agaroze (4) % suspenzije u puferu za lizu; Santa Cruz Biotechnology) za 25 h na 50 ° C. Za pripravu p3 imunoprecipitata, 4 μl lizata (koji odgovara 35 mg proteina) inkubiran je s anti-p500 antitijelom (1 μg) kao što je gore opisano. Imunoprecipitati su dvaput isprani puferom za lizu i dva puta s kinaznim puferom koji se sastoji od 35 mM Tris · HCl, pH 3 / 50 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendiran u 60 μl kinaznog pufera. Aktivnost kinaze mjerena je korištenjem histona H1 kao supstrata (18).
Imunohistokcmija. Miševi su anestezirani ip injekcijama avertina (250 mg / kg, Fluka) i perfundirani transkardijalno s 0.1 M natrijevim fosfatnim puferom, pH 7.4, nakon čega slijedi Fiksiranje Streck Tissue (Streck Laboratories, La Vista, NE). Razdvojeni mozgovi su dalje fiksirani u istom fiksativu preko noći na 37 ° C. Zatim su mozgovi ugrađeni u parafin, izrezani u 5-μm debele koronalne sekcije i podvrgnuti imunohistokemiji korištenjem tehnike kompleksa avidin-biotin-peroksidaza (Vector Laboratories) s diaminobenzidinom kao supstratom. Sekcije su inkubirane s afinitetno pročišćenim poliklonskim antitijelima protiv c-fos preko noći na 4 ° C. Specifičnost bojenja procijenjena je izostavljanjem primarnog antitijela.
Rezultati
Generacija transgenih miševa s neuroksualnom ekspresijom p35. Transgen koji se koristi za postizanje povećane neuronske ekspresije p35 sastojao se od 6-kb fragmenta kloniranog gena p35 miša koji sadrži 1.2-kb promotor i cijelu kodirajuću sekvencu p35 (Slika 1 A). Genotipovi miševa određeni su Southern blot analizom uporabom sonde koja je dizajnirana za razlikovanje p35 - / - i Tgp35 miševa od miševa divljeg tipa (Slika 1 A i B), Da bi se ispitala ekspresija transgena pod kontrolom 1.2-kb p35 promotora, generirali smo dvostruke transgenične miševe (Tgp35; p35 - / -) u kojima je ekspresija p35 bila potaknuta samo iz transgena. Ekspresija p35 u Tgp35; p35 - / - miševa je promatrana samo u mozgu (Slika 1C), gdje je uzorak prostorne ekspresije sličan onom kod miševa divljeg tipa (Slika 1D). Pokazalo se da nedostatak p35-a rezultira abnormalnom strukturom slojeva u moždanoj kori i hipokampusu miševa (10). Međutim, Tgp35; p35 - / - miševi pokazali su potpuno spašavanje p35 - / - fenotipa mozga (Slika 1E). Ovi podaci ukazuju da promotor 1.2-kb p35 kontrolira ekspresiju transgena sa sličnim profilom ekspresije s p35 iz endogenog p35 gena.
Razina proteina p35-a ograničava brzinu za regulaciju aktivnosti Cdk5. Ispitali smo učinke genskog doziranja gena koji kodiraju p35 i Cdk5 na ekspresiju proteina u striatalnim ekstraktima iz miševa p35 - / -, p35 +/-, divljeg tipa, Tgp35, Cdk5 +/- i TgCdk5 u dobi od 3 mjeseci. Razine proteina p35 i Cdk5 dobro su korelirale s dozama gena, respektivno (Slika 2 A i B). Tgp35 miševi su pokazali ≈1.6-puta povećanje razine p35 proteina u usporedbi s divljim tipom miševa, dok su razine Cdk5 proteina nisu bile pod utjecajem različitih razina p35 proteina. TgCdk5 miševi su pokazali ≈1.9-puta povećanje razine proteina Cdk5 u usporedbi s divljim tipom miševa, dok su razine p35 proteina nisu bile pod utjecajem različitih razina Cdk5 proteina. Da bi se ispitalo djelovanje različitih količina proteina p35 na aktivnost Cdk5, Cdk5 je bio imunoprecipitiran iz striatalnih ekstrakata s mjerenjem anti-Cdk5 antitijela i aktivnosti kinaze. Isto tako, da bi se ispitali učinci različitih količina Cdk5 proteina na aktivnost kinaze, p35 je imunoprecipitiran iz striatalnih ekstrakata s anti-p35 antitijelom, te je mjerena aktivnost kinaze. Aktivnost Cdk5 dobro korelira s razinom p35 proteina, ali ne s razinom Cdk5 proteina (Slika 2 C i D). Ovi rezultati ukazuju da je količina proteina p35 ograničavajući faktor za aktivnost Cdk5. Stoga smo koristili Tgp35 miševe da istražimo učinke povećane aktivnosti Cdk5 na striatno dopaminsko signaliziranje.
Fosforilacija izazvana kokainom DARPP-32 na Thr-34 umanjena je u Tgp35 miševima. Funkcija DARPP-32 ovisi o fosforilacijskom stanju na više mjesta (20). PKA fosforilira DARPP-32 na Thr-34, dok Cdk5 fosforilira DARPP-32 na Thr-75. Stoga smo ispitali stanje fosforilacije DARPP-32 u striatalnim ekstraktima divljeg tipa i Tgp35 miševa. Razina fosfo-Thr-75 DARPP-32 bila je viša u Tgp35 miševa (Slika 3A; 1.6 ± 0.2-puta iznad vrijednosti miševa divljeg tipa). Zatim smo procijenili učinke povećane aktivnosti Cdk5-a na striaminsku dopaminsku signalizaciju. Ispitali smo PKA aktivaciju kokaina kod Tgp35 miševa analizirajući fosforilacijsko stanje DARPP-32 na Thr-34. Razina fosfo-Thr-34 DARPP-32 povećana je kod miševa divljeg tipa 15 min nakon injekcije kokaina (Slika 3B; 1.8 ± 0.2-puta iznad bazalne razine). Međutim, učinak kokaina na Thr-34 fosforilaciju DARPP-32 je smanjen kod Tgp35 miševa (1.2 ± 0.3-puta iznad bazalne razine). Ovi rezultati ukazuju da povećanje aktivnosti Cdk5 oslabljuje aktivaciju PKA izazvanu kokainom vjerojatno kroz fosforilaciju DARPP-32 na Thr-75 (6, 12). Također je moguće da povećanje presinaptičke aktivnosti Cdk5 dovodi do smanjenja oslobađanja dopamina i da to pridonosi smanjenom učinku kokaina. Značajno, jedna injekcija kokaina nije utjecala na razinu proteina p35 i Cdk5, kao i na aktivnost kinaze (Slika 3 C i D). To je u suprotnosti s prethodnom studijom u kojoj je pokazano da kronična izloženost kokainu povećava ekspresiju p35 i Cdk5 (6).
Reguliranje aktivnosti Cdk5-a umanjuje aktivaciju kokaina ERK1 / 2. Nedavni dokazi pokazuju da aktivacija dopaminskog receptora u striatumu također aktivira i druge signalne kaskade, uključujući ERK put (21, 22), koja ima važnu ulogu u odgovoru na ponašanje kokaina (23). Stoga smo ispitali može li aktivnost Cdk5-a utjecati na aktivaciju ERK puta izazvanog kokainom. Aktivacija puta ERK opažena je nakon injekcije kokaina u striatalnim ekstraktima miševa divljeg tipa, što je vidljivo povećanom fosforilacijom MEK1 / 2 na Ser-217 i Ser-221 (1.5 ± 0.2-puta iznad bazalne razine) i ERK1 / 2 na Thr-202 i Tyr-204 (ERK2 fosforilacija: 1.5 ± 0.2-puta iznad bazalne razine) (Slika 4 A i B). Međutim, kokainom potaknuta aktivacija MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-puta iznad bazalne razine) i ERK1 / 2 (ERK2 fosforilacija: 1.2 ± 0.2-puta iznad bazalne razine) je smanjena kod Tgp35 miševa (Slika 4 A i B). Štoviše, bazalne razine fosfo-ERK1 / 2 bile su niže kod Tgp35 miševa (0.8 ± 0.2-puta ispod vrijednosti divljeg tipa miševa), dok ovaj trend nije bio statistički značajan. Ovaj posljednji rezultat može se pripisati Cdk5-ovisnoj fosforilaciji MEK1-a na Thr-286, što dovodi do smanjenja katalitičke aktivnosti (24). Da bismo procijenili tu mogućnost, ispitali smo fosforilacijsko stanje MEK1-a na Thr-286 i utvrdili da su viši nivoi fosfo-Thr-286 MEK1-a prisutni u strijatalnim ekstraktima Tgp35 miševa (Slika 4C; 1.3 ± 0.1-puta iznad vrijednosti miševa divljeg tipa). Nadalje, fosforilacijsko stanje MEK1-a na Thr-286 nije bilo promijenjeno jednom injekcijom kokaina, što je u skladu s nalazom da tretman Cdk5-om nije bio pod utjecajem liječenja (Slika 3D).
Širenje signala dopamina na nukleus umanjuje se povećanom aktivnošću Cdk5. Kokainom izazvana aktivacija višestrukih signalnih kaskada koje uključuju PKA i ERK dovodi do naknadne aktivacije transkripcijskog faktora CREB u jezgri kroz njegovu fosforilaciju na Ser-133 (22, 25). Da bismo istražili može li se Cdk5-posredovan inhibitorni učinak na PKA i ERK aktivacijske kaskade konvergirati na CREB fosforilaciji u jezgri, ispitali smo fosforilacijsko stanje CREB na Ser-133 u striatalnim ekstraktima divljeg tipa i Tgp35 miševa. Bazalna razina fosfo-CREB bila je niža kod Tgp35 miševa (0.7 ± 0.1-puta vrijednost miševa divljeg tipa) (Slika 5). U odgovoru na injekciju kokaina, razina fosfo-CREB-a povećana je u striatumu miševa divljeg tipa (1.5 ± 0.1-puta iznad bazalne razine), ali je taj odgovor na kokain smanjen kod Tgp35 miševa (1.2 ± 0.1- prekoračenje bazalne razine) (Slika 5).
Fosforilacija CREB na Ser-133 povećava njegovu transkripcijsku aktivnost putem elementa odgovora cAMP u promotorskoj regiji određenih gena, uključujući gen c-fos (26). Stoga smo ispitali indukciju c-fos u striatumu divljeg tipa i Tgp35 miševa nakon injekcije kokaina. U miševa divljeg tipa, razina c-fos mRNA se povećala do vršne vrijednosti (1.8 ± 0.2-puta iznad bazalne razine) 30 min nakon injekcije kokaina, a nakon toga se vratila na bazalnu razinu do 120 min nakon injekcije (Slika 6 A i B). Međutim, razine c-fos mRNA bile su ≈30% niže u Tgp35 miševa nego u divljem tipu miševa do 30 min nakon injekcije (Slika 6 A i B). Manja indukcija c-fos u Tgp35 miševima dodatno je potvrđena imunohistokemijom (Slika 6 C-F). Primjena kokaina povećala je imunoreaktivnost c-fos, snažno u dorsomedijalno-dorsocentralnim dijelovima striatuma i slabo u lateralnim dijelovima, i kod divljeg tipa i kod Tgp35 miševa. Međutim, povećanje broja c-fos-imunopozitivnih stanica izazvano kokainom značajno je smanjeno u striatumu Tgp35 miševa (Slika 6G). Zajedno, ovi rezultati ukazuju da je kokainom posredovano pojačavanje striatnog dopaminskog signala u jezgru inhibirano kod Tgp35 miševa, što je vjerojatno posljedica povećane aktivnosti Cdk5.
Rasprava
Cdk5 i njegov aktivator p35 identificirani su kao ciljni geni koji su gore regulirani kroničnom izloženošću kokainu (6). Ovdje navodimo dokaze da povećana aktivnost Cdk5-a, kao posljedica p35 up-regulacije, a ne Cdk5 up-regulacije, dovodi do slabljenja dopaminskog signaliziranja posredovanog kokainom u striatalnim neuronima. Da bi se ispitale posljedice povećane ekspresije bilo Cdk5 ili p35 na striatnom dopaminskom signaliziranju, analizirane su dvije transgene linije miša, TgCdk5 i Tgp35 miševi. Otkrili smo da je aktivnost Cdk5-a bila regulirana u omjeru s povećanom razinom p35 proteina, ali nije bila pod utjecajem povećane razine Cdk5 proteina. Naše prethodno izvješće također je pokazalo da je aktivnost Cdk5 u mozgu miša TgCdk5 bila niža nego u mozgu miša divljeg tipa kada je aktivnost mjerena pomoću Cdk5 imunoprecipitata (17), sugerirajući da prekomjerna ekspresija Cdk5-a rezultira povećanom razinom monomernog Cdk5 ako se razina p35-a ne poveća. Ovi rezultati ukazuju da je razina proteina p35 ograničavajući faktor za aktivnost Cdk5.
Tgp35 miševi su pokazali manju indukciju i CREB fosforilacije i c-fos u striatumu nakon akutne injekcije kokaina, što ukazuje da je striatalni odgovor na kokain inhibiran povećanom aktivnošću Cdk5. Smanjenje dopaminskog signaliziranja kokainom kod Tgp35 miševa je vjerojatno postignuto pomoću Cdk5-posredovane inhibicije višestrukih signalnih kaskada koje uključuju DARPP-32, PKA i ERK. Primjena kokaina povećala je fosforilaciju PKA DARPP-32 na Thr-34 u miševa divljeg tipa, dok je taj odgovor oslabljen kod Tgp35 miševa. Pokazalo se da PKA fosforilacija DARPP-32 na Thr-34 inhibira aktivnost proteinske fosfataze 1 (PP1), enzima odgovornog za defosforilaciju Ser-133 iz CREB (27). Dakle, aktivnost PP1 se ne bi antagonizirala putem DARPP-32 / PP1 putanje u Tgp35 miševima.
Kokain-inducirana aktivacija ERK1 / 2 također je prigušena kod Tgp35 miševa. Postoji nekoliko različitih mehanizama pomoću kojih Cdk5 može inhibirati kokain izazvanu aktivaciju ERK1 / 2. Prvo, fosforilacija DARPP-5 ovisna o Cdk32 na Thr-75 može inhibirati PKA, što dovodi do naknadne inhibicije bilo koje aktivirane MEK1 / 2 posredovane PKA koja je potrebna za aktiviranje ERK1 / 2. Nedavno istraživanje je također otkrilo da je fosforilacija DARPP-32 na Thr-34 potrebna za kokain posredovanu aktivaciju ERK1 / 2 više puta koji uključuju indirektnu regulaciju aktivacije MEK kao i uključivanje regulacije strijatalno obogaćene fosfataze, tirozina fosfataza koja djeluje izravno na ERK1 / 2 (28). Podršku ovoj mogućnosti sugerira nalaz da je fosforilacija MEK1 / 2 izazvana kokainom kod Ser-217 i Ser-221 ukinuta kod Tgp35 miševa. Drugi vjerojatni put je preko fosforilacije MEK5 ovisnog o Cdk1 na Thr-286, što bi rezultiralo smanjenjem njegove katalitičke aktivnosti i dovodi do inhibicije aktivnosti ERK1 / 2 (24).
Pokazalo se da inhibicija aktivnosti Cdk5 u striatumu potencira efekte ponašanja kroničnog liječenja kokainom kod životinja (6). U skladu s hipotezom da povećana regulacija aktivnosti Cdk5 može pridonijeti adaptaciji neurona za suzbijanje učinaka opetovane primjene kokaina (6), otkrili smo da fosforilacija DARPP-5 i MEK32 posredovana Cdk1 doprinosi slabljenju aktiviranja ERK1 / 2 izazvanog kokainom, što rezultira manjom indukcijom fosforilacije CREB i c-fos u striatumu. Naši nalazi podržavaju ideju da povećana aktivnost Cdk5, kao rezultat regulacije p35, može promijeniti ekspresiju gena u striatumu nakon kronične izloženosti kokainu. To se može dogoditi kroz promjene u aktivnostima faktora transkripcije, kao što su CREB i c-fos. Stoga, Cdk5 aktivator p35, zahvaljujući utjecaju koji ograničava brzinu na aktivnost Cdk5, može pridonijeti dugotrajnim promjenama u funkciji neurona u osnovi ovisnosti o kokainu.
Zahvale
Zahvaljujemo dr. Mary Jo Danton, Philip Grant i Sashi Kesavapany za kritičko čitanje rukopisa. Ovaj rad podržali su Nacionalni institut za zdravstvo Z01DE00664-05 (do ABK), Grantovi američkog javnog zdravstva DA10044, a stipendije Zaklade Simons, Zaklade Peter J. Sharp i Fondacije Picower (PG).
Bilješke
Kratice: Cdk5, ciklin-ovisna kinaza 5; ERK, izvanćelijska signalno regulirana kinaza; DARPP-32, fosfoprotein reguliran dopaminom i cAMP, molekulska masa 32 kDa; PKA, kinaza ovisna o cAMP; MEK, ERK kinaza; CREB, protein koji veže element cAMP.
Reference
;