PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
izvor
Laboratorij za bihevioralnu fiziologiju, Graduate School of Human Health Sciences, Sveučilište Tokyo Metropolitan, Tokio, Japan.
Sažetak
Tjelesna vježba poboljšava više aspekata funkcije hipokampa. U skladu s shvaćanjem da je aktivnost neurona ključna za promicanje neuronskih funkcija, prethodna literatura kontinuirano pokazuje da akutni napadi vježbanja izazivaju aktivaciju neurona u hipokampusu. Ponavljajući aktivirajući podražaji dovode do nakupljanja transkripcijskog faktora ΔFosB, koji posreduje u dugoročnoj neuralnoj plastičnosti.
U ovom istraživanju testirali smo hipotezu da dugotrajno dobrovoljno trčanje kotača inducira ΔFosB ekspresiju u hipokampusu, te smo ispitali sve potencijalne efekte specifične za regiju unutar hipokampalnih polja, duž dorso-ventralne osi. Muški C57BL / 6 miševi bili su smješteni sa ili bez tekućeg kotača 4 tjedana. Dugotrajno trčanje kotača značajno je povećalo FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u svim mjerenim hipokampalnim regijama (tj. u potpoljima DG, CA1 i CA3 i dorzalnog i ventralnog hipokampusa). Rezultati su potvrdili da trčanje kotača inducirano ekspresiju FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti u korteksu, sugerirajući da jednoliko povećanje FosB / ΔFosB unutar hipokampusa nije nespecifična posljedica trčanja. Podaci Western blot-a pokazali su da je povećana imunoreaktivnost hipokamp FosB / ΔFosB prvenstveno posljedica povećane ΔFosB. Ovi rezultati sugeriraju da je dugotrajno fizičko vježbanje moćan okidač za indukciju ΔFosB u cijelom hipokampusu, što bi objasnilo zašto vježbanje može poboljšati i dorzalnu i ventralnu funkciju ovisnu o hipokampusu. Zanimljivo je da smo otkrili da je ekspresija FosB / ΔFosB u DG-u bila pozitivno povezana s brojem dvokorkorin-imunoreaktivnih (tj., Nezrelih) neurona.
Iako su mehanizmi pomoću kojih ΔFosB posreduje neurogenezu izazvanu vježbanjem još uvijek neizvjesni, ovi podaci impliciraju da neurogeneza izazvana vježbanjem ovisi o aktivnosti. Uzeti zajedno, naši trenutni rezultati sugeriraju da je ΔFosB nova molekularna meta koja sudjeluje u regulaciji plastike hipokampala izazvanog vježbanjem.
Uvod
Vježba pruža različite prednosti na molekularnim, strukturnim i funkcionalnim aspektima hipokampusa kod glodavaca [1,2], od kojih su neke bile podržane ljudskim studijama [3,4]. Međutim, mehanizmi koji stoje na osnovi promjene uzrokovanih promjenama u plastičnosti hipokampa nisu dovoljno razumljivi. Dosadašnja literatura dosljedno je pokazala da vježbanje potiče aktivaciju neurona hippocampala u glodavaca. Imunohistokemijske studije koje koriste c-Fos, marker prolazne aktivacije neurona, pokazale su da i prisilno i dobrovoljno trčanje povećava ekspresiju c-Fos u dentatnom gyrusu (DG), CA1 i CA3 u poljima hipokampusa glodavaca [5-7]. Osim toga, prethodna studija koja je koristila lasersko-doplersku protočnu metriju (LDF) pokazala je da blago trčanje pločice povećava regionalni moždani krvotok (rCBF), alternativni marker aktivacije neurona, u potpolju CA1 u štakora [8]. Imunohistokemijske studije omogućuju detaljne analize specifične za regiju nakon prestanka vježbanja, dok LDF omogućuje praćenje rCBF-a u stvarnom vremenu tijekom vježbanja. Unatoč prednostima i ograničenjima svake studije, ove su studije na sličan način pokazale učinak akutne vježbe na aktivnost neurona hipokampala. Ovi rezultati sugeriraju mehanizam kojim dugotrajno redovito vježbanje promiče plastičnost hipokampala neprestano pokretanjem aktivacije neurona [9].
Faktor transkripcije ΔFosB, skraćeni izoform celog FosB cijele dužine, induciran je različitim vrstama ponovljenih podražaja u specifičnim regijama mozga, gdje se postepeno nakuplja zbog svoje jedinstvene stabilnosti (poluživot tjedana) [10-12]. Sve veći broj dokaza pokazuje da povećana razina ΔFosB posreduje dugotrajnu neuralnu i bihevioralnu plastičnost povezanu s određenim podražajima [11,13]. Na primjer, kronično davanje lijekova zlouporabe poput kokaina i morfija obično povećava ekspresiju ΔFosB u jezgri jezgre, što predstavlja jedan od molekularnih mehanizama koji su temeljni na povećanoj osjetljivosti na ove lijekove [11,14,15]. Simillarno na druge podražaje na nagrade, uključujući dijetu s visokim udjelom masti i seksualno iskustvo [16,17], ldobrovoljni trčanje kotača također je povećao FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u jezgri štakora, što sugerira da je dobrovoljno trčanje prirodna nagrada za glodare [18,19]. Međutim, koliko znamo, nijedna literatura nije ispitala da li opetovano izlaganje tjelesnim vježbama izaziva ΔFosB ekspresiju u hipokampusu. Budući da vježbanje pokreće aktivaciju neurona u hipokampusu, pretpostavili smo da bi dugotrajno dobrovoljno trčanje kotača također izazvalo ekspresiju ΔFosB u hipokampusu. Iako su točni mehanizmi pomoću kojih ΔFosB regulira plastičnost hipokampa i dalje nesigurni, ispitivanja su pokazala da miševi kojima nedostaje fosB geni pokazuju oslabljenu neurogenezu hipokampala i pojačano ponašanje nalik depresiji [20,21]. jaUz to, vježbanje je poznato da pojačava neurogenezu i ima antidepresivna svojstva [22-25]. jaAko je naša hipoteza tačna, ΔFosB bi bio novi potencijalni molekularni cilj koji posreduje vježbom uzrokovanu plastičnošću hipokampala.
Hipokampus ima anatomski i funkcionalni gradijent duž svoje uzdužne (dorso – ventralne) osi [26]. Dorzalni hipokampus igra ključnu ulogu u prostornom učenju i pamćenju [27,28], budući da je ventralni hipokampus preferirano uključen u regulaciju emocionalnog ponašanja [29,30]. Nadalje, studije su pokazale da fiziološki podražaji induciraju različite obrasce ekspresije c-Fosa u dorzalnom i ventralnom dijelu hipokampusa [31-33]. Jer vježbanje poboljšava i dorzalno [34-37] i funkcije ovisne o ventralnom hipokampusu [24,25,38], važno je ispitati da li dugotrajno dobrovoljno trčanje uzrokuje ekspresiju ΔFosB u hipokampusu specifično za regiju.
Primarna hipoteza ove studije bila je da će dugotrajno dobrovoljno trčanje kotača izazvati ekspresiju ΔFosB u hipokampusu miša. Ovu hipotezu je istraživala FosB / ΔFosB imunohistokemija u dorzalnom i ventralnom hipokampalnom potpolju, DG, CA1 i CA3, s dodatnim naglaskom na prepoznavanju indukcije specifične za regiju. Rezultati su potvrđeni Western blot-om koji je korišten za identificiranje izoforme fosB genski proizvodi inducirani u hipokampusu. Ispitali smo i korteks za specifičnu indukciju FosB / ΔFosB za regiju kako bismo isključili mogućnost da dugotrajno vježbanje nespecifično povećava FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u mozgu. Konačno, korelativna povezanost između ekspresije FosB / ΔFosB i neurogeneze istražena je kao prvi korak u traženju funkcionalnih implikacija indukcije ΔFosB izazvane vježbanjem u regulaciji plastičnosti hipokampala.
Materijali i metode
1: Izjava o životinjama i etici
Dvadeset mužjaka C57BL / 6 (u dobi od 8 tjedana) kupljeno je od komercijalnog uzgajivača (SLC, Shizuoka, Japan). Deset miševa korišteno je za Experiment 1, a ostalih deset za Experiment 2. Miševi su bili smješteni u kontroliranim uvjetima temperature (22-24 ° C) i svjetlosti (12 / 12-h ciklus svjetlo / tamno, svjetlo na 0500), te im je bila osigurana hrana i voda ad libitum, Sve eksperimentalne postupke odobrilo je Povjerenstvo za eksperimentalnu etiku na životinjama Tokyo Metropolitan University.
U svakom eksperimentu, po dolasku, miševi su nasumično raspoređeni ili u kontrolnu skupinu (Control, n = 5) ili u trkačku skupinu (Runner, n = 5). Tijekom prvog tjedna, svi su miševi smješteni u standardne plastične kaveze u skupinama (5 miševi / kavez) za početnu aklimatizaciju. Zatim su Runner miševi prebačeni u kavez opremljen kotačem za trčanje (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Zato što je poznato da socijalna izolacija potiskuje neurogenezu uzrokovanu vježbanjem u hipokampusu [39], Runner miševi smješteni su kao grupa (5 miševi / kavez) dodatnih 4 tjedana. Broj rotacija kotača bilježi se svako jutro, a tjelesna masa (g) mjeri se tjedno.
2: eksperiment 1. Imunohistokemijski pregled ekspresije FosB / ΔFosB i neurogeneze hipokampala
2.1: Perfuzija i obrada tkiva
Ujutro (0900 – 1100) nakon posljednjeg dana razdoblja trčanja, miševi su bili duboko anestezirani s pentobarbital natrijem i transkardijalno prožet hladnom fiziološkom otopinom. Mozak je brzo uklonjen i naknadno fiksiran u 4% paraformaldehidu u fiziološkoj otopini 0.1 M fosfatu (PBS, pH 7.4) preko noći. Mozak je zatim krio zaštićen sa 30% saharoze u PBS i zamrznut do daljnje obrade. Koronalni odjeljci mozga (40 µm) hemisfere dobiveni su zamrzavajućim mikrotomom i prikupljeni u PBS s 0.01% natrijevim azidom.
2.2: Imunohistokemija
Jedna od šest serija sekcija nasumično je odabrana za FosB / ΔFosB imunološku boju. Susjedna serija korištena je za označavanje doublecortina (DCX), markera nezrelih neurona koji su provjereni za procjenu neurogeneze [40,41]. Nakon gašenja aktivnosti endogene peroksidaze s 1% H2O2 u PBS-u, slobodni plutajući presjeci prethodno su inkubirani sa blokirajućom otopinom koja je sadržavala 10% normalnog konjskog seruma u PBS-u tokom 2 h. Nakon ispiranja u PBS-u, odsjeci su se inkubirali zečje poliklonalno pan-FosB antitijelo (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD) razrijeđeno u PBS-u sa 0.5% Triton X-100 i 0.5% BSA (PBST -BSA) za 24 h na 4 ° C. Drugi niz presjeka inkubiran je s kozjim poliklonskim anti-DCX antitijelom (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) u PBST-BSA tijekom 48 h na 4 ° C. Odjeljci su dalje inkubirani s odgovarajućim biotiniliranim sekundarnim antitijelom (anti zečji IgG, 1: 1000, AP182B; antigatski IgG, 1: 1000, AP180B, oba antitijela iz EMD Millipore, Billerica, MA, SAD) u PBST-BSA za 2 h na sobnoj temperaturi. Odjeljci su zatim tretirani s avidin-biotin-peroksidaznim kompleksom (Vectastain ABC peroksidaza kit, Vector Laboratories Inc, Burlingame, Kalifornija, USA) 90 min u skladu s uputama proizvođača. Antigeni su konačno vizualizirani s 0.02% 3,3-diaminobenzidinom (DAB) u 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) koji sadrži 0.01% H2O2, Za imunobojanje FosB / ΔFosB, reakcija je pojačana s nikal amonij sulfatom. Za DCX bojenje, stanične jezgre su obojene Nissl bojanjem. Sekcije su postavljene na pločice presvučene želatinom i postavljeni su pokrovni listići.
2.3: Kvantifikacija imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB pomoću praga slike
Pan-FosB antitijelo koje se upotrebljava u ovom istraživanju podignuto je protiv unutarnjeg područja koje dijeli FosB i ΔFosB N-terminalna regija, tako da ne može razlikovati dvije izoforme. Stoga su imunostirane strukture opisane kao FosB / ΔFosB imunoreaktivne (FosB / ΔFosB-ir) jezgre. Za nepristranu slijepu kvantifikaciju, preparati su kodirani prije analize. Atlas mišjeg mozga42] korišten je za identifikaciju sljedećih područja interesa (ROI-a): sloj zrnatih stanica (GCL) DG (3 sekcije), piramidalni sloj stanica CA1 (3 sekcije) i CA3 (sekcije 2-3) u dorzalnom hipokampusu (zatvoreno do -2.2 mm od bregme); DG (2 sekcije), CA1 (sekcije 2) i CA3 (sekcije 2) u ventralnom hipokampusu (zatvoreno do -3.4 mm od bregme) (Slika 4, lijevo). Kaudalni dijelovi sadrže i dorzalni i ventralni dio hipokampusa, ali je trbušni dio bio ciljan. U DG, suprapiramidnim (DGsp) i infrapramidnim (DGip) oštricama analizirane su odvojeno. Motorni korteks (sekcije 2 – 3, zatvorene do -0.6 mm od bregme), somatosenzorni cortex (2 – 3 sekcije, zatvorene do -0.6 mm od bregme), vizualni korteks (3 sekcije, zatvorene do -2.9 mm od analizirana je i auditivna korteks (sekcije 3, zatvorene do -2.9 mm od bregme) i mirisna žarulja (sekcije 3, zatvorene do + 4.3 mm od bregme) (Slika 6, lijevo).
Digitalne slike (2070 × 1548 piksela) svakog ROI-a snimljene su pomoću optičkog mikroskopa (BX-51, Olympus, Tokyo, Japan) opremljenog CCD kamerom (DP-73, Olympus) i slikovnim softverom (cellSens, Olympus). Povećanje objektiva bilo je 10 × za hipokampalni ROI i 4 × za kortikalne ROI-e. Kako bi se utvrdila umjerena do jaka FosB / ΔFosB imunoreaktivnost (Slika 1D – G), koristeći nekoliko dijelova unaprijed, i postavke snimanja slike (intenzitet svjetla, veličina zaustavljanja polja, vrijeme ekspozicije i ravnoteža bijele boje) i razine praga za svaku od RGB komponenti optimizirane su za hipokampalni i kortikalni ROI. Sljedeća analiza je tada provedena pod optimiziranim uvjetima (1). ROI su odabrani poligonom nepravilnog oblika (Slika 1A, B) (2). Slika je praćena, što jezgre FosB / ΔFosB-ir pretvara u crvenu boju (Slika 1C-G) (3). % ROI je tada automatski izračunat na sljedeći način:% ROI = (pretvoreno područje (crveno) / ukupno ROI područje) × 100.
Za potvrdu ove analize praga slike, 20 regije su nasumce odabrane iz različitih područja mozga s različitim veličinama regije. Pored kvantifikacije praga slike, broj FosB / ΔFosB-ir jezgara u odabranim područjima je ručno prebrojan i gustoća jezgara FosB / ΔFosB-ir dobivena je dijeljenjem broja FosB / ΔFosB-ir jezgara mjerenjem površina (mm2).
2.4: Kvantifikacija DCX-ir nezrelih neurona u dentatnom gyrusu
DCX-ir nezreli neuroni u DG Runner miševa bili su u izobilju i preklapali se, što je otežalo precizno brojanje diskretnog broja DCX-ir som pomoću optičkog mikroskopa. Međutim, u prethodnoj studiji, Sholl analiza za morfološku procjenu pokazala je da svaki DCX-ir neuron ima, u prosjeku, jedan dendrit mjeren unutar 40 μm soma [43]. Stoga je sljedeća originalna analiza razvijena da omogući kvantifikaciju DCX-ir neurona specifičnu za regiju.
- (1) Slika GCL-a projicirana je na zaslonu računala pomoću softvera za snimanje i objektiva 40 × (2). Na živoj slici, dio linije (150 ± 0.1 μm) je nacrtan duž sredine GCL (Slika 2) (3). Mijenjajući žarišnu dubinu, broj puta koliko su dionice linija prelazile DCX-ir dendriti bile su brojane (4). ROI (dorzalni DGsp, dDGsp; dorzalni DGip, dDGip; ventralni DGsp, vDGsp; ventralni DGip, vDGip) odgovarao je područjima gdje je analizirana FosB / ΔFosB imunoreaktivnost (5). U svakom ROI-u, segmenti linije 2 – 3 nacrtani su po odjeljku, a broj prijelaza je prosječan za sekcije 2 – 3 po mišu. Budući da je debljina GCL-a približno 60-80 μm, broj prijelaza treba odražavati broj DCX-ir neurona unutar analiziranog ograničenog područja.
Reprezentativna slika DCX-ir nezrelih neurona i linijski segment (150 ± 0.1 μm) prekriven je brojanjem broja križanja s DCX-ir dendritima.
3. Eksperiment 2. Identifikacija izoforme FosB / ΔFosB inducirane pokretanjem kotača
3.1: Perfuzija i obrada tkiva
Dodatna kohorta miševa tretirana je kao gore u eksperimentu 1. Nakon 4 tjedana intervencije u tijeku, miševi su transkardijalno perfundirani hladnom fiziološkom otopinom pod dubokom anestezijom. Hipokampus se brzo rasiječe i zamrzne s tekućim dušikom i pohrani na -80 ° C. Hipokampi svakog miša homogeniziran je u RIPA puferu (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natrijev deoksiholat, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) koji sadrži proteazu inhibitori (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Njemačka). Lizati su centrifugirani za 15 min na 5000 rpm na 4 ° C i sakupljeni su supernatanti. Koncentracije proteina izmjerene su s kompletom BCA proteina (# 23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotting
Jednake količine proteina (30 μg / lane) su podvrgnute elektroforezi na 10% poliakrilamidnom gelu, zatim prenesene na PVDF membranu (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Nespecifično vezanje je blokirano preinkubacijom membrane za 1 h u TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) koji sadrži 3% BSA. Membrana je inkubirana s pan-FosB antitijelom (1: 1000) koji je korišten gore za imunohistokemiju, otopljen u TBST koji sadrži 3% BSA. Nakon ispiranja s TBST, membrana je inkubirana s HRP-konjugiranim anti-zečjim IgG antitijelom (1: 5000 u TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) za 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s TBST, proteinske trake su vizualizirane inkubacijom s Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) i uhvaćene korištenjem Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membrana je zatim ponovno testirana s anti-gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) antitijelom (# 2275, 1: 5000 u TBS-T, Trevigen, MD, USA) kao kontrola punjenja. Optička gustoća proteinskih vrpci je kvantificirana pomoću Image-J i normalizirana na razinu GAPDH.
4: Statistička analiza
Promjene tjelesne težine miša analizirane su dvosmjernom ANOVA-om s ponavljanim mjerama (grupa × vrijeme). Neparni t-test korišten je za određivanje statističkih razlika između skupina (Control vs Runner). Pearsonova korelacijska analiza korištena je za validaciju FosB / ΔFosB analize imunoreaktivnosti (ručno prebrojavanje u odnosu na prag slike), te za ispitivanje povezanosti između razine izraženosti FosB / ΔFosB i broja DCX prijelaza u DG. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Prag za statističku značajnost je postavljen na P <0.05.
Rezultati
1: Masa tijela i udaljenost u trčanju u eksperimentima 1 i 2
Promjene tjelesne težine kontrolnih i trkačkih miševa u eksperimentima 1 i 2 su udružene i prikazane u Slika 3, Dvosmjerna ANOVA s ponovljenim mjerama pokazala je značajnu interakciju (skupina × vrijeme, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) i glavni učinak grupe F(1, 18) = 6.07, P <0.05), što ukazuje na značajno nižu tjelesnu težinu kod miševa trkača. Udaljenost vožnje po kavezu prikazana je u Tablica 1, Iako je precizna trkačka udaljenost svakog miša bila neizvjesna jer su miševi bili smješteni zajedno, redovito promatranje potvrdilo je da su svi miševi često izvodili kotač. Runner miševi u eksperimentu 2 trčali su dulje nego oni u eksperimentu 1, ali srednja udaljenost trčanja (m / dan / kavez) bila je konzistentna tijekom svakog eksperimenta.
2: Validacija kvantifikacije imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB pomoću praga slike
Utvrđena je značajna korelacija između FosB / ΔFosB-ir područja dobivenog pragovima slike i gustoće FosB / ΔFosB-ir jezgara dobivenih ručnim brojanjem (r = 0.941, P <00001, Slika 4).
3: FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u hipokampusu
Prikazane su reprezentativne slike FosB / ΔFosB imunološkog bojenja u dorzalnim i ventralnim hipokampalnim podpoljama u Slika 5, U svim analiziranim ROI, FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u Runner miševa (Slika 5, desno) bio je kvalitativno viši nego kod kontrolnih miševa (Slika 5, centar). U Runnerovih miševa, kvantitativna analiza pokazala je značajno povećanje FosB / ΔFosB-ir područja u oba dorzalnog (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) i ventralna hipokampalna potpolja (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Slika 6).
4: FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u korteksu
Reprezentativne slike FosB / ΔFosB imunološkog bojenja u kortikalnim ROI prikazane su u Slika 7, Kvantitativna analiza pokazala je promjene u FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti u zavisnosti od regije s dugotrajnim trčanjem (Slika 8). U Runner miševa, FosB / ΔFosB-ir područje bilo je značajno više u motornom korteksu (P <0.05) i somatosenzorni korteks barela (P <0.05), ali ne u vidnom korteksu (P = 0.662) ili mirisna žarulja (P = 0.523). U slušnom korteksu, FosB / ΔFosB-ir područje je sklono povećanju Runner miševa (P = 0.105).
5: Neurogeneza
Prikazane su reprezentativne slike DCX imunološkog bojenja Slika 9, U dorzalnom hipokampusu, DCX imunoreaktivnost u Runner miševa (Slika 9, desno) bio je kvalitativno veći u usporedbi s kontrolnim miševima (Slika 9, lijevo). U usporedbi s dorzalnim hipokampusom, DCX imunoreaktivnost u ventralnom hipokampusu bila je slabija i kod Control i Runner miševa. U Runner miševima, broj prijelaza bio je značajno veći u dDGsp (P <0.01) i dDGip (P <0.01; Slika 10). U ventralnom hipokampusu, broj križanja u Runnerovim miševima je imao tendenciju povećanja, ali nije bilo značajnih razlika između skupina (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Slika 10).
6: Korelacija između ekspresije FosB / ΔFosB i neurogeneze
Izvršena je korelacijska analiza između FosB / ΔFosB-ir područja i broja DCX prijelaza (Slika 11). Budući da se svaki skup podataka (npr. Dorzalni DGsp u kontrolnim miševima) sastoji samo od parova 5, analiza je prvo provedena sa svim parovima 40. Intrigantno, postojala je značajna korelacija između FosB / ΔFosB-ir područja i broja DCX prijelaza (r = 0.885, P <0.0001). Uz to, također su utvrđene značajne korelacije kada je leđni DG (r = 0.762, P <0.05) i trbušni DG (r = 0.816, P <0.01) analizirani su odvojeno.
7: Identifikacija izoforme FosB / ΔFosB inducirane dugotrajnim trčanjem
Konačno, identificirati izoforme fosB genski proizvodi inducirani u hipokampusu kao odgovor na dugotrajno trčanje, hipokampi iz dodatne kohorte miševa podvrgnut je Western blotingu uz korištenje istog pan-FosB antitijela. Višestruki opsezi 35-37 kDa, koji predstavljaju modificirane izoforme ΔFosB [44], značajno su se povećale kod miša Runner nasuprot kontrolnimSlika 12, P <0.01). S druge strane, izoforma FosB od 48 kDa nije bila otkrivena ni u jednoj skupini. Još jedan pojas slabo vidljiv iznad 25 kDa vjerojatno predstavlja izoformu Δ2ΔFosB (27 kDa). Postojala su još dva opsega, iznad 50 kDa i 37 kDa, koji su bili najvjerojatnije zbog nespecifičnog vezanja. Kada se kvantificiraju, nisu pronađene razlike u ovim ne-ΔFosB opsezima između skupina (podaci nisu prikazani).
Rasprava
U sažetku, ova studija je najprije izvršila imunohistokemijsku analizu za ispitivanje 1-a da li dugoročno volontiranje kotača inducira ekspresiju FosB / ΔFosB u hipokampusu; i 2) postoji li odgovor specifičan za regiju duž njezine dorso-ventralne osi.
Četiri tjedna dobrovoljnog pokretanja kotača izazvali su značajno povećanje imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB u svim analiziranim regijama hipokampusa (tj., DG, CA1 i CA3 podpolja dorzalnih i ventralnih dijelova hipokampusa). Potvrdili smo da je izoforma 35 – 37kDa ΔFosB glavna fosB genski proizvod koji se akumulira kao odgovor na dugotrajno trčanje. Ovi rezultati jasno podupiru hipotezu da je dugotrajno redovito vježbanje snažan okidač za indukciju ΔFosB kroz hipokampus, te da bi njegova indukcija mogla biti novi molekularni mehanizam pomoću kojeg vježbanje utječe na različite vrste dorzalnih i / ili ventralnih funkcija ovisnih o hipokampusu.
1: Validacija i ograničenja kvantificiranja FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti pomoću praga slike
Tehnika praćenja slike, široko korištena u imunohistokemijskim istraživanjima za brojanje ciljnih stanica i za ocjenu morfologije stanica, usvojena je u ovom istraživanju za kvantifikaciju FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti prema regiji15,45,46]. Pokazana je značajna korelacija između razina imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB kvantificiranih pragovima slike i ručnim prebrojavanjem (Slika 4). Međutim, budući da su gustoća i preklapanje spriječili brojanje broja jezgri FosB / ΔFosB-ir u visoko gustim područjima, prikazana korelacija podrazumijeva samo točnost metode praga slike kada područja FosB / ΔFosB-ir predstavljaju <~ 40% ukupnog ROI područje. Stoga je potrebna pažljiva interpretacija za područja FosB / ΔFosB-ir> 40% ukupne površine ROI-a.
Osobito u miševima DG-a (Slika 4), Ekspresija FosB / ΔFosB uvelike je inducirana pokretanjem kotača, a većina jezgara FosB / ΔFosB-ir preklapala se. U tim područjima povećana indukcija ekspresije FosB / ΔFosB dovodi do većeg podcjenjivanja razine ekspresije, bez obzira na korištenu metodu kvantifikacije (određivanje praga slike ili ručno brojanje). Međutim, unatoč riziku od podcjenjivanja, važno je napomenuti da je ova studija uspješno pokazala značajna povećanja u FosB / ΔFosB-ir području u DG od Runner miševa. To sugerira da metodološka ograničenja ne ugrožavaju naše nalaze. Umjesto toga, potencijalno podcjenjivanje povećava pouzdanost otkrića da dugotrajno povećanje povećane FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti u hipokampusu.
2: Jedinstvena indukcija ΔFosB unutar hipokampusa dugotrajnim trčanjem
Hipokampus ima anatomske i funkcionalne gradijente duž svoje uzdužne osi [26], tako da je za ovu studiju FosB / ΔFosB imunoreaktivnost u dorzalnim i ventralnim dijelovima hipokampusa analizirana odvojeno. Podaci su pokazali da se dugotrajno izjednačeno povećava ekspresija FosB / ΔFosB u svim ROI-ima hipokampusa. Ta ujednačena indukcija FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti može biti nespecifično uzrokovana sistemskim metaboličkim promjenama koje su povezane s dugotrajnim trčanjem. Međutim, važno je napomenuti da je došlo do specifičnih povećanja imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB u korteksu. Ovaj rezultat je potvrđen nedavnim nalazima koji pokazuju da je akutni napad treadmilla povećao regionalni cerebralni protok krvi u hipokampusu, ali ne u mirisnoj žarulji.8]. Nadalje, Rhodes et al. (2003) pokazali su da 7 dana dobrovoljnog rada kotača izazivaju ekspresiju c-Fos u DG i CA2 / 3 hipokampusa (CA1 nije mjeren) iu osjetilnom korteksu, ali ne u vizualnom korteksu [47]. Uzete zajedno, ove studije upućuju na to da ujednačena indukcija ekspresije FosB / ΔFosB u hipokampusu nije nespecifična posljedica dugotrajnog trčanja. Zanimljivo, Hawley i sur. nedavno je izvijestio da je kronični nepredvidljivi stres povećao ekspresiju FosB / ΔFosB u dorzalnom, ali ne iu ventralnom, DG u hipokampusu štakora [48]. Daljnjim istraživanjem, različiti obrasci indukcije FosB / ΔFosB, kao što su oni izazvani vježbanjem ili stresom, omogućit će kontinuirani uvid u utjecaje na hipokampus ovisne o stimulusu.
Poznato je da primarno pan-FosB antitijelo koje se koristi u ovoj studiji prepoznaje sve izoforme FosB proteina. Nakon Western blotting analize, otkrili smo da su samo izoforme koje su se povećale u hipokampusu nakon dugotrajnog trčanja bile modificirane izoforme ΔFosB (35-37 kDa), jedine stabilne izoforme među Fosovim proteinima obitelji [11]. Ovaj nalaz je u skladu s prethodnim radom pomoću pan-Fos antitijela kako bi se pokazalo da je 35-37 kDa ΔFosB dominantni protein Fos obitelji induciran u frontalnom korteksu zbog kroničnog stresa [44]. Dakle, povećanje hipokampalne FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti inducirane ovdje dugotrajnim trčanjem najvjerojatnije odražava razinu ΔFosB.
Manje se zna o učincima vježbanja specifičnih za regiju na molekularne i strukturne aspekte hipokampusa. Međutim, brojne bihevioralne studije ukazuju na veliki potencijal za poboljšanja izazvana vježbom u dorzalnim i ventralnim funkcijama hipokampusa. Pokazano je da vježbanje poboljšava prostorno učenje i pamćenje.34-38] i prostorna i kontekstualna obrada uglavnom ovisi o dorzalnom hipokampusu [27,28]. Nasuprot tome, poznato je da vježbanje pokazuje i anksiolitička i antidepresivna svojstva.24,25,38i ti emocionalni odgovori su uglavnom regulirani ventralnim hipokampusom [29,30]. Ujednačena indukcija ΔFosB dugotrajnim trčanjem u ovoj studiji ukazuje na to da se tijekom cijelog hipokampusa pojavio neki oblik neuroplastičnih promjena. To bi objasnilo zašto vježbanje može utjecati na dorzalne i ventralne funkcije ovisne o hipokampusu.
3: Regionalno-specifična analiza neurogeneze izazvane vježbom
Funkcionalna disocijacija neurogeneze između dorzalnog i ventralnog hipokampusa također dobiva sve veću pozornost49]. U ovom istraživanju, iskorištavanje morfoloških karakteristika DCX-ir nezrelih neurona [43], izbrojali smo broj sjecišta između DCX-ir dendrita i segmenta crte duž sredine GCL-a. Ovo mjerenje nije dalo ukupan broj DCX-ir neurona u DG, ali je omogućilo kvantifikaciju specifičnu za regiju koja je potrebna za provođenje korelacijske analize s podacima ekspresije FosB / ΔFosB (vidi dolje). Nakon dugotrajnog trčanja, broj DCX-ir neurona se značajno povećao u dorzalnom, ali ne i ventralnom, DG. To sugerira da vježbanje može stimulirati neurogenezu još izraženije u dorzalnom odnosu u odnosu na ventralni dio DG. Međutim, prethodne studije izvijestile su o sukobljenim rezultatima u kojima je točak povećao neurogenezu u dorzalnoj i ventralnoj DG.50,51]. U ovoj studiji, broj DCX-ir prijelaza u ventralnoj DG povećavao se s trčanjem, iako je mala veličina uzorka (5 miševi po skupini) mogla ograničiti mogućnost otkrivanja statistički značajne razlike između skupina. Stoga je vjerojatno preuranjeno isključiti mogućnost da dobrovoljno trčanje kotača može stimulirati ventralnu hipokampalnu neurogenezu. Potrebne su daljnje detaljne studije kako bi se razumjelo specifičnost regije za neurogenezu uzrokovanu vježbanjem s obzirom na njegov višestepeni proces (stanična proliferacija, diferencijacija, migracija i preživljavanje).
4: Funkcionalne implikacije indukcije ΔFosB izazvane vježbom za regulaciju plastičnosti hipokampa
Konačno, kao prvi korak u prepoznavanju funkcionalnih implikacija ΔFosB indukcije izazvane vježbom u hipokampusu, ispitali smo odnos imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB na DCX-ir križanja u dorzalnoj i ventralnoj DG i pronašli značajnu, pozitivnu korelaciju između dvije varijable. Iako su točni mehanizmi pomoću kojih ΔFosB regulira neurogenezu uzrokovanu vježbanjem, ostaju neizvjesni, pokazalo je to nedavno istraživanje fosBnula miševa, kojima nedostaje FosB, ΔFosB i Δ2ΔFosB (sve fosB proizvoda), pokazali su nedostatke u bazalnoj hipokampalnoj neurogenezi, uključujući smanjenu proliferaciju neuronskih progenitorskih stanica, povećanu ektopičnu migraciju novorođenih neurona i abnormalne DG strukture [20]. Međutim, te promjene nisu uočene u fosB(dd) miševa, kojima nedostaje FosB, ali ne i ΔFosB / Δ2ΔFosB. Zanimljivo, u fosBnula miševa, uključujući ekspresiju nekih gena povezanih s neurogenezom, uključujući vgf (Inducirajući faktor rasta VGF-a) i žena za sve (Galanin prepropeptid) su regulirani na dolje20]. Budući da su VGF i GAL sekretorne molekule, jedan prijedlog koji obećava smatra da neuroni koji eksprimiraju ΔFosB mogu regulirati neurogenezu putem autokrine / parakrine aktivnosti.20].
Osim toga, treba napomenuti da se područje gdje je ΔFosB inducirano prostornim preklapanjem s područjem gdje je neurogena aktivnost visoka. Ovo otkriće sugerira da je neurogeneza izazvana vježbom na minimalnoj razini ovisna o aktivnosti. Aktivacija neurona ključna je za održavanje i poboljšanje funkcije središnjeg živčanog sustava.9], putem mehanizama koji uključuju ekspresiju i oslobađanje neurotrofnog faktora iz mozga (BDNF) [52,53], unos serumskog inzulinu sličnog faktora rasta 1 (IGF-1) kroz krvno-moždanu barijeru54,55], supresija apoptoze [56i regulacija mitohondrijske pokretljivosti [57]. Stoga, ova studija sugerira da dugotrajno vježbanje pokreće ponovljenu aktivaciju neurona, što je vidljivo u povećanoj ekspresiji ΔFosB, koja doprinosi povećanju plastičnosti hipokampusa, potencijalno kroz gore opisane višestruke mehanizme.
Ova studija samo je procijenila neurogenezu izazvanu vježbom i njezinu povezanost s ekspresijom FosB / ΔFosB u DG. Međutim, FosB / ΔFosB imunoreaktivnost je također inducirana u CA1 i CA3 podpoljima. Iako su potrebne daljnje studije kako bi se bolje razumjele funkcionalne uloge ΔFosB ekspresije uzrokovane vježbanjem unutar ovih potpodručja, prethodna literatura nudi obećavajuću mogućnost. Guan i sur. (2011) pokazali su da specifična ablacija kinaze ovisne o ciklinu 5 (Cdk5) u CA1 ili CA3 piramidalnim neuronima umanjuje konsolidaciju memorije ili pronalaženje, respektivno [58]. Zanimljivo, Cdk5 je nizvodni cilj ΔFosB [59] i uključen je u reguliranje sinaptičke plastičnosti [60]. Stoga, ekspresija ΔFosB izazvana vježbanjem može biti uključena u reguliranje sinaptičke plastičnosti putem Cdk5 aktivacije u CA1 i CA3 podpoljima.
Zaključak
Dok je poznato da akutni napadi vježbanja induciraju ekspresiju neposrednih ranih proteina gena u hipokampusu, ova studija daje prvi dokaz da dugotrajna redovita tjelovježba značajno inducira ekspresiju ΔFosB u cijelom hipokampusu. thUjednačena indukcija ΔFosB podržava trenutno shvaćanje da je vježba učinkovita nefarmakološka intervencija koja može poboljšati višestruke funkcije hipokampusa. Zajedno sa značajnom korelacijom između ekspresije FosB / ΔFosB i neurogeneze, ovi podaci su provokativni i ukazuju na potrebu za daljnjim istraživanjima koja definiraju ulogu ΔFosB u posredovanju učinaka vježbanja na funkciju hipokampusa, uključujući neurogenezu.
Izjava o financiranju
Reference
;