izvor
Institut Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, SAD. [e-pošta zaštićena]
Sažetak
Djeca i adolescenti su sve više izloženi psihostimulansima, bilo nezakonito ili za liječenje uobičajenih neuropsihijatrijskih stanja, kao što je poremećaj deficita pažnje s i bez hiperaktivnosti. Unatoč široko rasprostranjenoj upotrebi psihomotornih stimulansa u mlađim dobnim skupinama, malo se zna o kroničnim molekularnim neuroadaptivnim odgovorima na ova sredstva u nezrelom mozgu. Ovdje ćemo pokazati da, nakon kronične primjene psihostimulansa kokain i amfetaminfaktor transkripcije DeltaFosB je reguliran u nucleus accumbens od periadolescent miševi ali ne u post-weanling ili odrasle osobe miševi, Indukcija DeltaFosB također se javlja isključivo u kaudatnom putamenu periadolescent miševi nakon amfetamin uprava. Ovi rezultati pokazuju jedinstvenu plastičnost u adolescentskom mozgu kritične molekule koja regulira psihostimulacijsko djelovanje i ukazuju na to da ove neuroadaptivne promjene mogu biti uključene u posredovanje poboljšane sklonosti ovisnosti u adolescenta u odnosu na odraslu osobu.
Uvod
Psihostimulansi se koriste u liječenju uobičajenih poremećaja u djetinjstvu, kao što je poremećaj hiperaktivnosti s nedostatkom pažnje. Osim toga, zlostavljanje stimulansa, uključujući amfetamine i kokain, uobičajeno je među adolescentima, u dobi u kojoj postoje dokazi o pojačanim sklonostima ovisnosti u odnosu na odrasle (Estroff i sur., 1989; Myers i Anderson, 1991). Usprkos podacima koji ukazuju na razvojno regulirane učinke ponašanja, malo je poznato u vezi molekularnih neuroadaptivnih odgovora u nezrelom mozgu koji se javljaju u vrijeme primjene tih sredstava. Kokain i amfetamin mogu uzrokovati dugotrajne promjene u ponašanju djelomično putem stimulacije dopamina D1receptora i povećanje razine transkripcijskih faktora, uključujući ΔFosB, u dorzalnom striatumu (tj. kaudatnom putamenu) i ventralnom striatumu (tj. nucleus accumbens) (Chen i sur., 1997). Povećanje razine ΔFosB, možda putem stabilizacije proteinskih produkata, održava se nekoliko tjedana nakon kronične izloženosti kokainu ili amfetaminu i regulirano je barem dijelom putem prijenosa dopaminskog signala (Chen i sur., 1997; Nestler et al., 2001).
Središnji dopaminergički sustav mladih životinja u velikoj se mjeri mijenja uslijed promjene razine kritičnih molekula tijekom normalnog razvoja, uključujući dopamin D1receptor DARPP-32 (dopamin i cAMP regulirani fosfoprotein; Mr 32 kDa) i cAMP (Ehrlich i dr., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano i sur., 1996; Tarazi i sur., 1999;Andersen, 2002). Izloženost psihostimulansima tijekom ovog perioda, koji pojačavaju dopaminergičku neurotransmisiju, može stoga rezultirati kvantitativnim i / ili kvalitativno različitim molekularnim odgovorima, uključujući promjene u ekspresiji ΔFosB. Da bi se testirala hipoteza da postoje neuroadaptivne reakcije ovisne o dobi tijekom kronične izloženosti psihostimulansima, tri skupine miševa analizirane su serijskim eksperimentima: odrasli (60 d stari na početku injekcija), periadolescent (33 d stari na početku injekcija), i post-weanling (24 d stari na početku injekcije). Ovo je prva izravna usporedba molekularnih neuroadaptivnih odgovora na izloženost kroničnom psihostimulansu u ove tri dobne skupine. Otkrili smo da, nakon istovjetnih paradigmi liječenja, periadolescentni miševi pokazuju pojačanu regulaciju ΔFosB kao odgovor na kokain i amfetamin.
MATERIJALI I METODE
Životinje i davanje lijekova. Mužjaci CD-1 miševa (Charles River Laboratories, Kingston, NY) bili su smješteni na 12 hr ciklusu svjetla / mraka (6: 00 AM do 6: 00 PM) sa ad libitumpristup hrani i vodi. Životinjama je bilo dopušteno smjestiti se u sobu za životinje najmanje 10 d prije početka injekcija. Životinjama su rukovala dva istraživača koji su obavili sve injekcije u istoj prostoriji u kojoj su bile smještene životinje. Sve životinje su odbijene od starenja na 21 d. Injekcije su počele u 24 (post-weanling), 33 (periadolescent) ili 60 (odrasli) d godina. Životinje su primale 20 mg / kg kokaina (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamina (Sigma), ili jednak volumen fiziološke otopine intraperitonealno između 4: 00 i 5: 00 PM dnevno za 7 d. Životinje su ubijene dekapitacijom nakon kratkog izlaganja CO2 na 10: 00 AM na dan nakon zadnje injekcije. Mozgovi su odmah uklonjeni s lubanje, a kaudatni putamen i nucleus accumbens brzo su se secirali na ledu. Sve disekcije provedene su od koronalnih rezova mozga kod jednog istraživača, a proteinski ekstrakti su pripremljeni iz svježeg tkiva bez zamrzavanja. Sve procedure na životinjama odobrene su od strane Odbora za institucionalnu njegu i uporabu životinja i bile su u skladu s Nacionalnim institutom za zdravlje Vodič za njegu i uporabu laboratorijskih životinja.
Western blot analiza. Za Western blot analize, jednake količine proteina (40 μg za kaudatni putamen i 20 μg za nucleus accumbens) iz svakog uzorka stavljene su u svaku traku 10% SDS-poliakrilamidnog gela nakon mjerenja koncentracije proteina pomoću BCA testa (Pierce, Rockford, IL). Jednako punjenje proteina također je potvrđeno vizualizacijom ukupnog proteina Ponceau Redom nakon prijenosa na nitrocelulozu i / ili upijanje s anti-aktin antitijelom (1: 500; Sigma). Antiserum FOS-srodnog antigena (FRA), koji prepoznaje izoforme ΔFosB, velikodušno je osiguravao dr. M. Iadarola (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD) i koristio se u koncentraciji 1: 4000. Prethodne studije (Chen i sur., 1997; Hiroi i sur., 1997), uključujući preapsorpciju FRA antiseruma s imunogenom M-peptida, pokazao specifičnost ovog antiseruma. DARPP-32 5a monoklonsko antitijelo, korišteno na 1: 10,000, velikodušno je osigurano od strane Drs. Hugh Hemmings i Paul Greengard (Sveučilište Rockefeller, New York, NY). Antitijelo prijenosnika dopamina (DAT) je iz Chcmicon (Temecula, CA). Mrlje su reagirale s NEN-DuPont (Boston, MA) sustavom kemiluminescencije i izložene filmu. Denzitometrijske vrijednosti za ΔFosB imunoreaktivnost dobivene su pomoću ScanAnalysis za Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistička značajnost određena je pomoću jednosmjerne ANOVA, nakon čega slijedi post hoc Tukeyev višestruki usporedni test ili nespareni, dvostrani Studentov test t testa kako je navedeno u legendi. Za eksperimente s tretmanom lijekovima, analiza svake dobne skupine provedena je na zasebnoj mrljici, te je stoga svaka fiziološka skupina arbitrarno dodijeljena vrijednost 100% za usporedbu između dobnih skupina. Za studije ontogeneze, uzorci svih dobnih skupina analizirani su zajedno na jednom blotu.
REZULTATI
Indukcija ΔFosB nakon kokaina i amfetamina pojavljuje se u jezgri samo jednog periadolescentnog miševa
Ekspresija ΔFosB izmjerena je u jezgri accumbens i kaudate putamenima poslije odmicavanja, periadolescentnih i odraslih miševa nakon 7 d davanja amfetamina ili kokaina. Nukleus accumbens je regija mozga za koju se vjeruje da je najkritičnija za posredovanje korisnih učinaka psihostimulanata. Imunoreaktivnost ΔFosB (35 kDa) selektivno je inducirana u jezgrama periadolescentnih životinja nakon kronične primjene amfetamina (Sl. 1 A) ili kokain (Sl. 1 B). Suprotno tome, razine ΔFosB (35 kDa) nisu značajno izmijenjene u jezgrama jezgra post-odvikavanja ili odraslih životinja (Sl.1 A,B). U kaudatskim putamenima, razina ΔFosB (35 kDa) također je bila značajno regulirana nakon kronične primjene amfetamina samo kod periadolescentnih životinja (Sl.2 A). Sve tri dobne skupine pokazale su značajno povećanje ekspresije ΔFosB (35 kDa) u kaudata puta nakon kronične primjene kokaina (Sl.2 B). Jačina indukcije, međutim, bila je najveća u periadolescentnim životinjama, osobito u usporedbi s post-odijelima (Sl. 2 B). Ostali izoformi FRA i Fos ostali su nepromijenjeni u svim dobnim skupinama (podaci nisu prikazani).
Imunoreaktivnost ΔFosB u jezgri smanjuje se nakon primjene kroničnih psihostimulanata. CD-1 miševima ubrizgavani su jednom dnevno fiziološkom otopinom, amfetaminom ili kokainom za 7 d, počevši od dana 24 (P24; post-weanling), dan 33 (P33; periadolescentno) ili 60 dan (Odrasla osoba). Razine imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) u jezgri jezgre prikazane su nakon kroničnog amfetamina (A) ili kokain (B) uprava. Reprezentativni imunobloti iz fiziološke otopine (S), amfetamin- (A) i kokain- (C) ubrizgano nakon umiranja (P24), periadolescentno (P33), a odrasli miševi prikazani su u prozoru gornje ploče. Donji paneli pokazuju srednju vrijednost ± SEM postotak bazne ΔFosB ekspresije. n vrijednosti za svaku skupinu prikazane su u prozoru barovi, Pronađeno je značajno povećanje ΔFosB u jezgri jezgre samo periadolescentnih miševa. *p <0.05; **p <0.01 (studentska t test; fiziološka otopina vs lijek).
ΔFosB imunoreaktivnost u kaudata puta nakon kronične primjene psihostimulanata. CD-1 miševima ubrizgavani su jednom dnevno fiziološkom otopinom, amfetaminom ili kokainom za 7 d, počevši od dana 24 (P24; post-weanling), dan 33 (P33; periadolescentno) ili 60 dan (Odrasla osoba). Razine imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) kod kaudata pokazane su nakon kroničnog amfetamina (A) ili kokain (B) uprava. Reprezentativni imunobloti iz fiziološke otopine (S), amfetamin- (A) i kokain- (C) ubrizgavaju periadolescentne miševe (P33) prikazani su ugornje ploče. Donji paneli pokazuju srednju vrijednost ± SEM postotak bazne ΔFosB ekspresije. n vrijednosti za svaku skupinu prikazane su u prozoru barovi, Pronađeno je značajno povećanje imunoreaktivnosti ΔFosB uzrokovano amfetaminom kod kaudata samo kod periadolescentnih miševa (A). Hronično uzimanje kokaina povećalo je ΔFosB u sve tri dobne skupine (B). *p <0.05; **p <0.01 (studentska t test; fiziološka otopina vs lijek).
Razina DAT i DARPP-32 se ne mijenja nakon kroničnog kokaina ili amfetamina
Nekoliko ključnih molekula eksprimiranih dopaminergičkim i / ili dopaminoceptivnim neuronima, uključujući DARPP-32, D1 dopaminski receptor i DAT doprinose akutnim i kroničnim odgovorima na psihostimulanse (Moratalla i sur., 1996; Fienberg i dr., 1998; Sora i sur., 1998; Gainetdinov i sur., 2001). Podaci iz DARPP-32, D1 receptora i DAT null i DAT oboreni miševi ukazuju na kompliciran odnos između njihovih razina, regulaciju dopaminergičke aktivnosti i reakcije na psihostimulans. U stvari, indukcija ΔFosB ne javlja se kod nula miševa DARPP-32 koji primaju kronični kokain (Fienberg i dr., 1998). U odraslih miševa, međutim, izloženost 7 d 20 mg / kg kokaina ne mijenja ukupne razine DARPP-32 (Fienberg i dr., 1998). Regulacija DAT proteina ranije nije zabilježena kod miševa koji su kronično izloženi psihostimulansima, mada su u nekim vrstama zabilježene promjene u vezivanju radioliganda na transporter dopamina nakon izlaganja psihostimulansima (Letchworth i sur., 2001). Ovdje smo izmjerili razine DARPP-32 i DAT proteina kako bismo utvrdili je li ekspresija ovih proteina promijenjena nakon kronične primjene psihostimulanata u bilo kojem od tri uzrasta miševa. Naši nalazi pokazuju da nije bilo značajnih promjena u razinama ukupnog DARPP-32 ili DAT u cijelom uzročniku kaudata ili jezgri, nakon kronične primjene kokaina ili amfetamina u bilo kojoj od tri dobne skupine (Tablica 1).
Relativne vrijednosti denzitometrije za DARPP-32 i DAT kod miševa tretiranih amfetaminom i kokainom P24, P33 i odraslih miševa u odnosu na kontrolne, fiziološke vrijednosti, proizvoljno postavljene na 100%
Osnovne razine ΔFosB razvojno su regulirane
Ispitali smo ontogeniju ΔFosB, jer odrasli miševi s genetski inženjeriziranim povećanim izražajem ΔFosB u striatumu imaju pojačani bihevioralni odgovor na psihostimulansi (Kelz i sur., 1999). Otkrili smo da su polazne razine ΔFosB bile znatno niže u mlađih životinja u usporedbi s odraslom osobom kako u kaudata putamen tako i u jezgri jezgre (Sl.3 A). Razine funkcionalnih markera dopaminskog sustava, uključujući DARPP-32 (Ehrlich i dr., 1990), DAT (Perrone-Capano i sur., 1996) i dopaminske receptore (Teicher et al., 1993; Tarazi i sur., 1999) također su regulirani razvojno. Prethodni izvještaji u CD-1 miševa ukazuju na vrhunac u striatnom DARPP-32 u postnatalnom danu 28 (P28) (Ehrlich i dr., 1990). U štakorskim patenatima i nucleus accumbens, D1razine receptora od P28 do P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi i sur., 1999), ali slične studije nisu provedene na mišu. Nasuprot tome, ovdje smo otkrili da su razine proteina DAT u kaudatnom putamenu i nucleus accumbens bile konstantne između postnatalnog dana 24 i odrasle dobi (sl. 3 B). Dakle, relativni omjeri između D1 receptori, DAT, DARPP-32 i ΔFosB razlikuju se između dobnih skupina, što potencijalno rezultira razlikama u D1 Aktivnost receptora može utjecati na stupanj indukcije ΔFosB.
Razvojna ekspresija ΔFosB i DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) imunoreaktivnost u kaudatnom putamenu i nukleusu akumbensa naivnih CD-1 miševa kao funkcija dobi. Reprezentativni imunoblotovi prikazani su u gornje ploče.Donji paneli prikazano znači ± SEM od tri miševa po skupini. *p <0.05, odrasla osoba u odnosu na P24; #p <0.05, odrasla osoba u odnosu na P36 (Tukeyev test višestruke usporedbe nakon ANOVA). B, Denzitometrijske vrijednosti imunoreaktivnosti DAT u kaudatnom putamenu i nucleus accumbens za naivne CD-1 miševe kao funkciju dobi. Razine DAT nisu se razlikovale u tri dobne skupine.
RASPRAVA
Bihevioralni učinci psihomotornih stimulansa ovise o dobi. Sklonosti ovisnosti najviše su u adolescenciji, kada se upotreba nedopuštenih tvari eskalira (Estroff i sur., 1989; Myers i Anderson, 1991). U stvari, mlađa djeca često postaju disforična kada su izložena psihostimulansima, dok adolescenti i odrasli doživljavaju euforiju (Rapoport i dr., 1980). Kod modela glodavaca, neke studije upućuju na to da periadolescentne životinje imaju više osnovne razine aktivnosti (Koplje i kočnica, 1983) i izmijenjeni odgovori na psihostimulanse u odnosu na mlađe i starije životinje. Prema tome, oni pokazuju manju stimulaciju lokomotora i traženje novosti kao odgovor na akutnu primjenu niskih doza psihostimulansa u odnosu na dojenje i odrasle životinje, ali povećanu hiperaktivnost nakon tretmana visokom dozom. Kod kronične primjene, senzibilizacija na kokainom uzrokovanu lokomociju je veća u periadolescentnih štakora u usporedbi s odraslim osobama, dok je senzibilizacija na stereotipnost niža. Također, podaci mikrodijalize otkrili su razlike između periadolescentnih i odraslih štakora u odnosu na senzibilizaciju na oslobađanje dopamina uzrokovano amfetaminom (Laviola i sur., 1995; Adriani i sur., 1998; Adriani i Laviola, 2000;Laviola i sur., 2001). Međutim, postoje sukobljene studije o dugotrajnoj reaktivnosti na kokain nakon primjene metilfenidata u adolescentnih štakora (Brandon i sur., 2001; Andersen i sur., 2002). Ova posljednja dva izvješća ističu poteškoće u usporedbi studija kada se koriste različite eksperimentalne paradigme. Pokušaji uspoređivanja studija ponašanja kod mlađih životinja dodatno su zbunjeni uporabom različitih vrsta i sojeva.
Miš postaje sve važniji životinjski model u proučavanju uporabe i zlouporabe psihostimulansa, a to je prva sustavna analiza molekularnih neuroadaptivnih odgovora u tri različite razvojne dobi kod miša ili bilo koje druge pojedinačne vrste. Dosadašnje studije iz kojih smo izveli naše terapijske paradigme pokazale su povećanje ΔFosB u izoliranom dorzalnom i ventralnom striatumu odraslih štakora divljeg tipa nakon kronične primjene kokaina i amfetamina (Hope i sur., 1994; Nye i sur., 1995; Turgeon i sur., 1997) ali samo u kombiniranom dorzalnom i ventralnom striatumu ili izoliranom dorzalnom striatumu divljih tipova odraslih miševa nakon kroničnog kokaina (Fienberg i dr., 1998; Zachariou i sur., 2001).
Sada demonstriramo prostornu i kvantitativnu razliku u ΔFosB induciranoj psihostimulansom u miševima nakon dojenja, periadolescenata i odraslih. Promatranje povišenog odgovora kod periadolescentnih životinja u usporedbi s odraslima i post-weanlingom ojačano je činjenicom da je odgovor sličan kod miševa liječenih kokainom i amfetaminom. Psihostimulansi kokain i amfetamin povećavaju sinaptički dopamin, kao i serotonin i norepinefrin, ali različitim mehanizmima. Kokain se veže za prijenosnike plazmaleme za dopamin, serotonin i norepinefrin i inhibira njihovo vraćanje u presinaptičke terminale. Nasuprot tome, amfetamin potiče oslobađanje tih odašiljača. Selektivna indukcija ΔFosB u nukleusu accumbens samo periadolescentne dobne skupine nakon primjene stimulansa 7 d i relativno povišena indukcija ΔFosB u kaudatnom putamenu može biti neurobiološka reprezentacija ili uzrok ranije zabilježene povećane sklonosti zlouporabi psihostimulansa u ovoj dobna skupina (Estroff i sur., 1989; Myers i Anderson, 1991) i druge dugoročne promjene u ekspresiji gena, koje se razlikuju među dobnim skupinama (Andersen i sur., 2002). Štoviše, te razlike mogu biti suštinski regulirane razvojnim promjenama u razinama ključnih molekula, uključujući i sam ΔFosB. Potencijalne implikacije razlika u osnovnim razinama ΔFosB između dobnih skupina analogne su onima predloženim za razlike između sojeva štakora (Haile i sur., 2001). Zapravo, očekujemo da će se slične razlike u soju naći među inbred miševima. Također je moguće da će miševi različite dobi pokazati različite molekularne prilagodbe u područjima mozga osim nukleusa accumbens. Dodatna analiza korištenjem periadolescentnih miševa s genetski modificiranim promjenama u razinama ključnih molekula i istodobnim promatranjima ponašanja dodatno će ispitati te hipoteze.
fusnote
- Primljeni Travanj 8, 2002.
- Primljena je revizija Kolovoz 6, 2002.
- prihvaćeno Kolovoz 8, 2002.
Ovaj rad podržali su Nacionalni instituti za zdravlje / Nacionalni institut za neurološke poremećaje i poticaj za moždani udar NS41871 (MEE i EMU) i Nacionalni institut za zlouporabu droga P30-DA13429 (EMU).
Korespondenciju treba uputiti dr. Michelle E. Ehrlich, Sveučilište Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [e-pošta zaštićena].
- Copyright © Društvo za neuroznanost 2002
;