Regulacija stabilnosti DeltaFosB fosforilacijom (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

izvor

Odjel za psihijatriju, Centar za osnovnu neuroznanost, Medicinski centar Sveučilišta u Teksasu, Dallas, Texas 75390-9070, SAD.

Sažetak

Transkripcijski faktor DeltaFosB (koji se također naziva FosB2 ili FosB [kratki oblik]) je važan posrednik dugotrajne plastičnosti inducirane u mozgu kroničnim izlaganjem nekoliko tipova psihoaktivnih stimulansa, uključujući lijekove zlouporabe, stres i elektrokonvulzivne napadaje. , Posebna značajka DeltaFosB-a je da, jednom kada je inducirana, ona ostaje u mozgu relativno dugo vremena u odsutnosti daljnje stimulacije. Mehanizmi na kojima se temelji ova prividna stabilnost, međutim, ostali su nepoznati. Ovdje pokazujemo da je DeltaFosB relativno stabilan transkripcijski faktor, s poluživotom od približno 10 h u staničnoj kulturi. Nadalje, pokazali smo da je DeltaFosB fosfoprotein u mozgu i da ga fosforilacija visoko konzerviranog serinskog ostatka (Ser27) u DeltaFosB štiti od proteasomalne degradacije. Nudimo nekoliko linija dokaza koji upućuju na to da je ta fosforilacija posredovana kazein kinazom 2. Ovi nalazi su prvi dokaz da je DeltaFosB fosforiliran i pokazuju da fosforilacija pridonosi njezinoj stabilnosti, koja je u srži njezine sposobnosti da posreduje dugotrajne prilagodbe u mozgu.

Uvod

Transkripcijski faktor ΔFosB, također označen kao FosB2 ili FosB [kratki oblik], je C-terminalno skraćena varijanta spoja neposrednog ranog gena fosb (Dobrazanski i dr., 1991; Nakabeppu i Nathans, 1991; Yen i sur., 1991). Kao FosB pune duljine, ΔFosB ima osnovnu domenu koja veže DNA i leucinski zatvarač kroz koji se dimerizira s Junovim proteinima kako bi tvorili aktivatorski protein-1 (AP-1) kompleksi transkripcijskog faktora, koji reguliraju ekspresiju mnogih gena (Morgan i Curran, 1995; Rylski i Kaczmarek, 2004). Unatoč nedostatku dijela transaktivacijske domene pronađene u C-kraju FosB-a, ΔFosB funkcionira i kao snažan transkripcijski aktivator i represor u kultiviranim stanicama i mozgu (Dobrazanski i dr., 1991; Nakabeppu i Nathans, 1991; Chen i sur., 1997; McClung i Nestler, 2003; Kumar i sur., 2005).

ΔFosB se inducira do visokih razina u regiji specifičan način u mozgu nakon kroničnog, ali ne i akutnog izlaganja različitim psihoaktivnim stimulansima, uključujući stres, određene lezije, antipsihotičke i antidepresivne lijekove, zlouporabe droga i prirodne nagrade. (Hope i sur., 1994b; Hiroi i Graybiel, 1996; Moratalla i sur., 1996; Bing i sur., 1997; Mandelzys i sur., 1997; Kelz i sur., 1999; Werme i sur., 2002; Andersson i sur., 2003; Colby i sur., 2003; Peakman i sur., 2003; Perrotti i sur., 2004; Zachariou i sur., 2006). Indukcija ΔFosB izravno je povezana s funkcionalnim učincima nekoliko tih stimulusa na mozak. Perzistentnost ΔFosB čak iu odsutnosti dodatne stimulacije razlikuje je od svih drugih transkripcijskih faktora Fos obitelji, koji se brzo induciraju kao odgovor na akutne podražaje, nazaduju na bazalne razine unutar nekoliko sati i općenito pokazuju desenzibilizaciju nakon kronične stimulacije (Hope i sur., 1992; Daunais i sur., 1993; Persico i sur., 1993; Hiroi i Graybiel, 1996; Perrotti i sur., 2004). To ΔFosB čini atraktivnim kandidatom za posredovanje nekih dugotrajnih promjena u ekspresiji gena koje su temelj stabilnih neuronskih prilagodbi uzrokovanih određenim kroničnim stimulansima.

Zbog produljene prisutnosti ΔFosB u odsutnosti daljnje indukcije njegove mRNA (Chen i sur., 1995), spekulirali smo da, za razliku od FosB pune duljine i svih ostalih proteina Fos obitelji, koji su intrinzično nestabilni, ΔFosB može biti neuobičajeno stabilan faktor transkripcije (Hope i sur., 1994b; Chen i sur., 1997; Nestler et al., 2001; McClung i sur., 2004). Štoviše, imunoblotting analiza akutnog i kronično stimuliranog moždanog tkiva sugerira da se ΔFosB pomiče u M_r (molekulska masa) od N33 kDa u akutnom stanju do N35 – 37 kDa tijekom kroničnog liječenja (Hope i sur., 1994a; Chen i sur., 1995). Budući da nema dokaza za postojanje dodatnih mRNA koje bi mogle kodirati te različite izoforme, nadalje smo spekulirali da je ΔFosB posttranslacijski modificiran i da to možda pridonosi njegovoj neobičnoj stabilnosti. Do danas, međutim, nisu zabilježene biokemijske analize prometa ili posttranslacijskih modifikacija ΔFosB. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi je li ΔFosB fosfoprotein i da li fosforilacija igra ulogu u njegovoj stabilnosti.

Prethodni odjeljakSljedeći odjeljak

Materijali i metode

Stanične linije sisavaca i DNA konstrukti.

Stanice PC12-a (Clontech, Mountainview, CA) kultivirane su u DMEM-u visoke glukoze koji sadrži l-glutamin (L-Gln) i dopunjen s 5% fetalnim goveđim serumom (FBS), 10% konjskim serumom (oba od Invitrogen, Carlsbad, CA) 100 U / ml penicilina i 100 μg / ml streptomicina (oba iz Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa stanice (American Type Culture Collection, Manassas, VA) su uzgojene u DMEM-u visoke glukoze koji sadrži L-Gln i dopunjen sa 10% FBS, penicilinom i streptomicinom. Obje stanične linije su održavane na 37 ° C u vlažnom 5% CO₂ atmosfera.

Za prolazne transfekcije s DNA, PC12 ili HeLa stanice su zasijane na ploče sa šest jažica (obložene kolagenom I za PC12 stanice) kako bi se postigao 90-100% konfluencija sljedećeg dana i zatim transficirane pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen). U nekim pokusima (vidi Sl. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB je prolazno eksprimiran u PC12 stanicama putem infekcije rekombinantnim herpes simplex virusom (HSV).

ΔFosB i FosB cDNA dobiveni su iz vlastitih pTetop-konstrukata (Chen i sur., 1997), i subklonirani u pcDNA3.1 vektor (Invitrogen). Ovi pcDNA3.1-ΔFosB / FosB konstrukti su korišteni za ekspresiju u stanicama sisavaca i kao predložak za mutagenezu usmjerenu na mjesto. Rekombinantni HSV-ΔFosB je pripravljen kako je prethodno opisano (Neve i sur., 1997), a pripravak je imao titar 1 × 10⁸ pfu / ml.

Eksperimenti pulsne potjere.

Približno 24 h nakon infekcije / transfekcije, stanice (PC12 ili HeLa) u pločama sa šest jažica su isprane dva do tri puta s 2 ml PBS i inkubirane na 37 ° C za x1 h u 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) uz dodatak 5% dijaliziranog FBS (Hyclone, Logan, UT) za iscrpljivanje intracelularnih bazena Met i Cys. Na kraju ovog razdoblja "gladovanja" dodani su lijekovi (ako se stanice trebaju liječiti) i stanice su označene (pulsne) s 12-25 μCi od ³⁵S mješavina označavanja proteina (PerkinElmer, Wellesley, MA) za 1 h na 37 ° C za označavanje svih novih sintetiziranih proteina. Radioaktivni obilježivač je zatim uklonjen ispiranjem stanica dva do tri puta s 2 ml PBS-a, i ³⁵Slijedili su proteini obilježeni S (chase) zamjenom medija s "hladnim" (neradioaktivnim) medijem dopunjenim 5% FBS i sakupljanjem stanica u različitim vremenskim točkama. Tretmani stanica održavani su tijekom cijele potrage. Sve brojke ovih eksperimenata pokazuju slične početne količine različitih proteina da bi se optimizirale usporedbe njihovih brzina prometa.

Životinje i kronično liječenje elektro konvulzivnih napadaja.

Odrasli Sprague Dawley mužjaci štakora (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) tretirani su jednom dnevno elektrokonvulzivnim napadajima (ECS) za 7-9 d. ECS je proveden kao što je prethodno opisano (Hope i sur., 1994a) pomoću znaka Ugo Basile (Comerio VA, Italija) ECS jedinica sa sljedećim postavkama: frekvencija, 100 impulsi / s; puls s, 0.5 ms; trajanje šoka, 1.0 s; i struja, 75 mA. Lažne kontrolne životinje tretirane su paralelno primjenom elektroda za ušnu školjku bez električne struje.

³² P metaboličko obilježavanje.

Za obilježavanje rezova u mozgu štakori su dekapitirani, mozgovi su brzo izrezani, a 300 μm frontalni kortikalni rezovi pripremljeni su s DSK mikroslikatorom (Ted Pella, Redding, CA). Presjeci su inkubirani unutar plastičnih epruveta u 2 ml umjetnog CSF-a s nedostatkom fosfata (ACSF) i održavani na 30 ° C pod stalnim blagim mjehurićem s O₂/ CO₂ mješavina (Hemmings i sur., 1989). Rezovi (dvije kriške po epruveti) označeni su s 1.3 mCi za 8-10 h u prisutnosti ili odsutnosti okadaične kiseline (100 ng / ml). Na kraju ove inkubacije, kriške su isprane najmanje tri puta s hladnim ACSF i zatim homogenizirane ultrazvukom u 250 μl hladnog radioimunoprecipitacijskog testa (RIPA) pufera [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (w / v) natrijev deoksiholat, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] dopunjen prije uporabe s SDS do 0.6%, koktel inhibitora proteaze za stanice sisavaca (korišten u 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), koktelima inhibitora fosfataze I i II (koji se koriste na 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF i 2% glicerola. Homogeni su zatim prokuhani tijekom 15 min i očišćeni centrifugiranjem na 15,000x g za 15 min. Koncentracija proteina u dobivenim supernatantima je procijenjena pomoću BCA testa proteina (Pierce, Holmdel, NJ).

Za ³²P obilježavanje uzgojenih stanica, 24 h nakon infekcije / transfekcije, stanice su isprane dva do tri puta s medijem bez fosfata i inkubirane u ovom mediju za 1 h. Nakon tog razdoblja gladovanja, 0.2 – 0.3 mCi od ³²PH₃PO₄ (PerkinElmerdodane su u svaku jažicu i stanice su označene za 4-12 h ovisno o vrsti eksperimenta (vidi slike 1-7 za specifikacije). Stanice su zatim tri puta isprane s PBS-om i lizirane na ledu za 15 min s 50 μl dopunjenog RIPA pufera. Lizati su sakupljeni struganjem i propušteni su 10 puta kroz iglu 25 ga za smicanje DNA, prokuhani 10 min, i centrifugirani na 15,000 rpm za 15-30 min na 4 ° C. Očišćeni lizati (supernatanti) preneseni su u novu epruvetu i proveden je test BCA proteina (Pierce). Sve brojke ovih eksperimenata pokazuju slične količine ukupnog divljeg tipa (WT) i S27A ΔFosB proteina da bi se optimizirale njihove relativne razine fosforilacije.

Kemikalije i tretmani stanične kulture.

Okadaična kiselina (OA; Sigma-Aldrich) otopljena je u etanolu i upotrijebljena pri konačnoj koncentraciji 100 ng / ml. 5,6-diklor-1-P-d-ribofuranozil-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) je otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO; Sigma-Aldrich) i korišten u kulturi stanica pri konačnoj koncentraciji 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) je otopljen u vodi i korišten pri konačnoj koncentraciji 200 μm. Kalfostin-C (Biomol) je otopljen u DMSO i korišten na 0.2 μm, dok je forbol 12-miristat 13-acetat (PMA; Promega, Madison, WI) otopljen u DMSO i korišten na 0.1 μm. inhibitorni peptid povezan s miristiliranim-autokamtid-2 (m-AIP; Biomol) je otopljen u vodi i korišten pri konačnoj koncentraciji 1 i 10 μm. Inhibitori protein-kinaze širokog spektra H-7 i H-8 (Biomol) otopljeni su u vodi i korišteni pri konačnoj koncentraciji 150 i 200 μm, respektivno. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) i epoksomicin (Peptides International, Louisville, KY) su otopljeni u DMSO i korišteni su pri konačnoj koncentraciji 12.5 i 7.5 μm, respektivno. U svim eksperimentima, dodan je DMSO (nosač) u stanice kako je potrebno da se održi konstantna količina DMSO kroz tretmane. Za ³²P eksperimenti obilježavanja, lijekovi su dodani neposredno prije etikete i zadržani tijekom preostalog razdoblja označavanja. Za eksperimente s pulsnom potezom, lijekovi su dodani u vrijeme Cys / Met "izgladnjivanja", čuvani kroz razdoblje označavanja, i zatim dodani natrag u medij za hvatanje. Inhibitori proteasoma su nagomilani za svaki 3-4 h tijekom cijele potrage kako bi se kompenzirao brzi promet tih peptida.

ΔFosB imunoprecipitacija, imunobloting i autoradiografija.

Za imunoprecipitaciju, lizati su razrijeđeni 1: 5 s običnom RIPA-om kako bi se koncentracija SDS spustila na 0.1% prije nastavljanja s imunoprecipitacijom (IP). Da bi se ograničilo nespecifično vezanje, lizati su prvo očišćeni imunoprecipitacijom s neimunim IgG i proteinom G-Sepharose (Sigma-Aldrich) najmanje 4 h. ΔFosB je zatim imunoprecipitiran iz pročišćenih lizata upotrebom kozjeg poliklonskog antitijela koje prepoznaje unutarnji epitop prisutan u oba FosB i ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) na 0.5-1 μg IgG po 10 μg lizatnog proteina (50 – 300 μg ukupnog proteina) u ukupnom volumenu 0.5 ml. IP su lagano pomiješani na 4 ° C na rotoru najmanje 8 h i zatim je dodan 15 μl proteina G-Sepharose i IP su pomiješani najmanje još s 4 h. IP-ovi su peletirani okretanjem na 3000 × g za 3-5 min na 4 ° C, ispere se tri puta s 0.5 ml hladne obične RIPA i dva puta s hladnim PBS-om koji sadrži 0.1% Tween 20. IP se zatim resuspendira u 0.5 ml hladnog PBS-a, prenese, peletira u novu epruvetu, a imunoprecipitirani proteini se zatim eluiraju dodavanjem 15-25 μl 2x reducirajućeg Laemmli pufera za uzorke proteina. Ovaj IP protokol rezultirao je specifičnim i djelotvornim taloženjem gotovo cijelog ΔFosB u lizatu. Imunoprecipitirani proteini podvrgnuti su SDS-PAGE punjenjem cijele IP na 12.5% Tris-HCl kriterijskom gelu (Bio-Rad, Hercules, CA), a zatim preneseni na PVDF ili nitrocelulozu. Nakon prijenosa, membrana je sušena na zraku i ³²P- i ³⁵S-radioaktivno obilježene proteinske trake promatrane su pomoću autoradiografije pomoću Kodak (Rochester, NY) autoradiografskog filma, kao i fosforimaging pomoću Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Ukupni (nefosforilirani i fosforilirani) ΔFosB u staničnim lizatima ili homogenatima mozga otkriveni su imunoblotiranjem bilo imunoprecipitiranog proteina (koristeći istu membranu koja se koristi za detekciju ³²P-obilježenog proteina), ili jednakih količina lizat / homogenat proteina podvrgnutog SDS-PAGE i prenesenog na PVDF ili nitrocelulozu. Membrana je prvo blokirana inkubacijom s 1% (w / v) nemasnim suhim mlijekom (Bio-Rad) u PBS-u s 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) za 1 h na 25 ° C. Membrana je zatim imunoblotirana preko noći na 4 ° C s našim vlastitim zečjim anti-FosB poliklonskim antitijelom stvorenim protiv aminokiselina 1-16 iz FosB / ΔFosB (korištenog u 1: 10,000). Nakon primarne inkubacije, membrane su isprane četiri puta za 5 min s blokirajućim puferom, a zatim inkubirane na 25 ° C za 1 h s kozjim anti-zečjim IgG konjugiranim na peroksidazu hrena (korišten na 1: 5000 u blokirajućem puferu Laboratories, Burlingame, CA). Membrane su zatim isprane tri puta za 10 min s blokirajućim puferom i jednom za 5 min s PBS. Ukupni ΔFosB proteinski trakovi su vizualizirani na Kodak MR filmu pojačanom kemiluminescencijom (Pierce) i / ili detekcijom fluorescencije korištenjem ECL-Plus reagensa (Amersham Biosciences) i Storm PhosphorImagera.

Prekomjerna ekspresija i pročišćavanje rekombinantnog ΔFosB iz stanica insekata.

ΔFosB je prekomjerno eksprimiran u Sf9 stanicama insekata kao N-terminalni heksa-His-obilježen protein (N-His (6) ΔFosB) koristeći Bac-to-Bac sistem ekspresije bakulovirusa (Invitrogen) i slijedeći upute proizvođača. Ukratko, ΔFosB cDNA (ostaci 2-237) kojoj prethodi afinitetna N-terminalna oznaka MGHHHHHHAG subklonirana je u vektor pFASTBacTM1, koji je korišten za generiranje rekombinantnog bakulovirusa. Sf9 stanice su inficirane s rekombinantnim virusom, a N-His (6) ΔFosB je pročišćen iz staničnih lizata pomoću nekoliko kromatografskih koraka uključujući afinitetnu kromatografiju koristeći kolonu nikla (Qiagen, Valencia, CA), anionsku izmjenu pomoću mono-Q stupca (Amersham). Biosciences), te isključivanjem veličine pomoću kolone za gel-filtraciju (Amersham Biosciences).

In vitro studije fosforilacije.

In vitro Reakcije fosforilacije za vremenski tijek i stehiometrijsku analizu provedene su u volumenu 30 μl koji sadrži 10 μm supstrat (N-His (6) ΔFosB ili supstrat pozitivne kontrole), 250 μm ATP i 1 μCi / μl [y-³²P] ATP, pufer dobiven od proizvođača kinaze, i jedna od sljedećih kinaza: CK2 (20 ng / μl; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) ili p70S6K (2.5 mU / μl; Upstate). Reakcije vremenskog tijeka provedene su uklanjanjem alikvota 5 μl iz reakcijske otopine u naznačenim vremenskim točkama i dodavanjem jednakog volumena 4 × reducirajućeg pufera za uzorke proteina Laemmli. Kinetički parametri Michaelis-Mentena za reakciju CK2 određeni su pod empirijski definiranim linearnim stacionarnim uvjetima. Ove reakcije provedene su za 15 min u volumenu 10 μl koji sadrži enzim 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-³²P] ATP, i N-His (6) ΔFosB koncentracije u rasponu od 2.5-30 μm. Sve reakcije su izvedene na 30 ° C u vodenoj kupelji. Nakon SDS-PAGE i bojenja gela s Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), gel je osušen, i ³²Inkorporacija P-fosfata procijenjena je analizom fosforimagingom (vidi dolje, Kvantifikacija podataka, kalkulacije i statistika).

Dvodimenzionalna mapa fosfopeptida i analiza fosfoamino kiseline.

Obje ove analize provedene su kako je opisano u Ploegh i Dunn (2000), Ukratko, suhi fragmenti gela koji sadrže ³²P-obilježeni ΔFosB (bilo od vitro reakcije ili iz imunoprecipitata metabolički obilježenih stanica), su izrezane, rehidrirane, oprane i podvrgnute probavi. Supernatant koji sadrži produkte triptične digestije je liofiliziran i liofilat je ispran nekoliko puta i resuspendiran u 10 μl elektroforeznog pufera, pH 1.9. Uzorak (3 μl) je uočen na tankoslojnoj kromatografiji (TLC) na celuloznoj ploči (Analtech, Newark, DE) i razdvojen u jednoj dimenziji elektroforezom, a druga dimenzija uzlaznom TLC. Rezultirajuće mape fosfopeptida vizualizirane su autoradiografijom i fosforiziranjem. Za analizu fosfoamino kiseline, 2 μl triptičnih digestija koji su resuspendirani u elektroforeznom puferu dalje su cijepani hidrolizom HCl na 105 ° C za 25 min u 3 m HCl pod N₂ atmosfera. Reakcija je zaustavljena sa šestostrukim razrjeđivanjem u vodi i smjesa je liofilizirana. Liofilat je resuspendiran u 5 μl pufera za elektroforezu, pH 1.9, i nanesen na TLC ploču od celuloze zajedno sa fosfo-Ser, -Thr i -Tyr standardima. Elektroforeza je izvedena preko polovine duljine TLC ploče uporabom elektroforeznog pufera, pH 1.9, i zatim je ploča prenesena u pH 3.5 pufer, te je izvršena elektroforeza do kraja. Standardi fosfoamino kiseline vizualizirani su raspršivanjem TLC ploče s otopinom 1% (v / v) ninhidrina u acetonu, i ³²P-obilježeni aminokiselinski uzorci vizualizirani su i autoradiografijom i fosforimagingom.

siRNA-inducirana CK2a srušena.

Koristili smo RNA metodu interferencije za selektivno snižavanje razina CK2 (Di Maira i sur., 2005). Stanice PC12-a zasađene su na ploče s šest jažica obložene kolagenom I do sljedećeg dana dosegle konfluenciju N70 – 80%, kada su prolazno transfektirane s 20 nm (konačna koncentracija) ili nontargetske siRNA ili siRNA usmjerene prema mRNA katalitičkog sredstva α podjedinica Rat CK2, koristeći 5 μl sredstva za transfekciju SilentFectin (Bio-Rad) i slijedeći upute proizvođača. Približno 24 h kasnije, stanice su prolazno transficirane s ΔFosB plazmidom, kao što je gore navedeno. Približno 24 h kasnije (N48 h nakon transfekcije siRNA), stanice su podvrgnute ili ³²P metaboličko obilježavanje ili puls-chase analiza kao što je gore opisano. Sljedeća četiri CK2a siRNA su korištena sa sličnim rezultatima: 5®P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 X, 5′P-UAGUCAUAUAAUCUUCCGUU3 X (Dharmacon, Lafayette, CO). Kao negativnu kontrolu koristili smo Prigušivač negativna kontrola # 3 siRNA iz tvrtke Ambion (Austin, TX). Stupanj onesposobljavanja CK2 je praćen imunoblotiranjem pomoću anti-CK2 poliklonskog antitijela (katalog # 06-873 iz Upstate) preko noći na 1: 1000 razrjeđenju. P-Tubulin je korišten kao kontrola punjenja i detektiran s monoklonskim antitijelom (katalog # 05-661 iz Upstate) preko noći na 1: 20,000 razrjeđenju.

Site-usmjerena mutageneza.

Mutacija Ser27 u Ala ili Asp je postignuta korištenjem kit-a za brzo mijenjanje mutageneze (Stratagene, La Jolla, CA) i slijedeći upute proizvođača. Za uvođenje Ser27 mutacija u mišjem ΔFosB proteinu, korišteni su slijedeći prajmeri mutageneze. Ser27 do Ala: (obrnuta početnica) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27 do Asp (prednji prajmer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. Mutirane baze su podebljane, a kodon Ser27 je u kurzivu.

Bioinformatika.

Potencijalna mjesta fosforilacije i kinaze za ΔFosB pretraživane su podnošenjem proteinskog niza miša u specijalizirane baze podataka, uključujući ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost i sur., 2004) i NetPhosK (Blom i sur., 2004).

Kvantifikacija podataka, izračuni i statistika.

Količina proteina prisutna u PVDF ili nitroceluloznoj membrani kvantificirana je korištenjem Storm PhosphorImagera i pratećeg ImageQuant softvera (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). U studijama fosforilacije kultura stanica i mozga dobivene vrijednosti za ³²P-obilježeni protein zatim je podijeljen s vrijednostima dobivenim za ukupni ΔFosB i izražen kao omjer. U vitro studije fosforilacije, količina ³²P-obilježeni ΔFosB po molu ΔFosB (stehiometrija) izračunat je kako je prethodno opisano (Sahin i sur., 2004). Sva mjerenja provedena su unutar raspona linearnosti korištenog instrumenta. Kinetički parametri su izračunati pomoću Michaelis-Menten modela, pri čemu V = V_maksimum[S] / ([S]+K_M) I V_maksimum = k₂[E_ukupno]. Poluživot (t_1/2) ΔFosB i FosB procijenjeni su iz dijagrama pulsne hajke (koristeći nelinearnu regresiju koja najbolje odgovara točkama podataka) i odgovaraju vremenu u kojem je količina preostalog proteina 50% od originala. Na svim slikama, prikazani rezultati su reprezentativni za najmanje dva do tri neovisna eksperimenta. U svim grafikonima prikazani podaci su prosjeci ± SEM (3 ≤ n ≤16). Statistička značajnost razlika procijenjena je korištenjem nesparenog t test, korigiran za višestruke usporedbe, i označavaju zvjezdice p ≤ 0.05.

Prethodni odjeljakSljedeći odjeljak

Rezultati

ΔFosB je neuobičajeno stabilan faktor transkripcije

Iako smo prethodno spekulirali da je ΔFosB relativno stabilan faktor transkripcije (Nestler et al., 2001), nije provedena izravna analiza profila prometa proteina. Kako bi riješili ovo pitanje, proveli smo pokuse pulsne hajke korištenjem PC12 stanica, koje su se u velikoj mjeri koristile kao neuronska stanična linija, u kojoj je ΔFosB prolazno izražen putem infekcije rekombinantnim herpes simplex virusom (HSV-ΔFosB). Novosintetizirani proteini su metabolički obilježeni ³⁵S-Met / Cys, i obrazac degradacije ³⁵S-označeni ΔFosB (³⁵S-ΔFosB) je praćen imunoprecipitacijom iz staničnih lizata dobivenih u različitim vremenskim točkama nakon uklanjanja radio-obilježenih aminokiselina. Analiza imunoprecipitata pomoću SDS-PAGE i autoradiografije pokazala je da je poluživot ΔFosB u PC12 stanicama N10 h (Slika 1). Ovi rezultati pokazuju da je poluživot ΔFosB-a veći nego kod većine inducibilnih transkripcijskih faktora (vidi Raspravu), uključujući FosB pune duljine, za koje je zabilježeno da je vrijeme poluraspada u staničnoj kulturi N90 min (Dobrazanski i dr., 1991; Carle i sur. 2004). Osim toga, vrijedi napomenuti da degradacija ΔFosB ne odgovara eksponentnoj krivulji raspada prvoga stupnja, već je dvofazna, počevši s sporijom brzinom razgradnje. To upućuje na postojanje više od jedne ΔFosB vrste i / ili više od jednog puta razgradnje.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 1.

ΔFosB je neuobičajeno stabilan faktor transkripcije. Poluvrijeme ΔFosB je UM10 h u staničnoj kulturi. ΔFosB je eksprimiran u PC12 stanicama bilo infekcijom s HSV-ΔFosB ili prolaznom transfekcijom s ΔFosB-sadržavajućim plazmidom, a stanice su podvrgnute eksperimentima s pulsnom potezom kako je opisano u Materijali i metode. Ekvivalentni rezultati dobiveni su bez obzira na metodu za prekomjernu ekspresiju ΔFosB. Slika prikazuje vremenski tijek (i reprezentativni autoradiogram) degradacije ΔFosB. Ucrtani podaci su prosječni ± SEM najmanje pojedinačnih točaka podataka 15 dobivenih iz najmanje pet neovisnih eksperimenata. Za usporedbu, prikazan je prijavljeni poluživot FosB-a pune duljine.

ΔFosB je fosfoprotein u mozgu

Pretpostavili smo da posttranslacijska modifikacija ΔFosB može doprinijeti njegovoj prividnoj stabilnosti. Budući da se pokazalo da fosforilacija modulira aktivnost transkripcijskih faktora na mnogo načina, uključujući njihovu stabilnost (za pregled, vidi Desterro i sur., 2000; Whitmarsh i Davis, 2000), ispitali smo je li ΔFosB fosfoprotein. U tu svrhu, ekspresija ΔFosB inducirana je u mozgu štakora primjenom kronične ECS, liječenja za koju se zna da inducira visoke razine ΔFosB, osobito u frontalnom korteksu (Hope i sur., 1994a). Jedan dan nakon posljednjeg ECS ​​tretmana, kada razine ΔFosB ostaju visoke, pripravljeni su tanki frontalni kortikalni rezovi i metabolički obilježeni ³²P-ortofosfata. Paralelni skup kriški nije bio radio-obilježen, a oni su korišteni za otkrivanje ukupnih razina ΔFosB. Nakon imunoprecipitacije sa specifičnim anti-FosB / ΔFosB antitijelom i odvajanjem imunoprecipitiranih proteina pomoću SDS-PAGE, fosforilirani ³²P-obilježeni ΔFosB detektiran je autoradiografijom, dok je ukupni ΔFosB detektiran imunoblotingom. Ova analiza je pokazala da je ΔFosB fosforiliran u mozgu, što dokazuje specifično ³²P-obilježeni pojas N35 kDa prisutan u kronično tretiranim uzorcima mozga, ali je praktički neprimjetan u sham-tretiranim kontrolama (Slika 2A). To je u skladu s činjenicom da, u nedostatku kronične stimulacije, bazalne razine ΔFosB su vrlo niske. Specifičnost reakcije imunoprecipitacije je ilustrirana nedostatkom signala u neimunskom talogu IgG.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 2.

ΔFosB je fosfoprotein u mozgu. AΔFosB je fosforiliran u mozgu. Endogeni ΔFosB induciran je u mozgu štakora kroničnim ECS tretmanom kao što je opisano u Materijali i metode. Frontalni kortikalni rezovi su metabolički obilježeni ³²PH₃PO₄ nekoliko sati. Nakon homogenizacije rezova, ΔFosB je imunoprecipitiran i fosforiliran ΔFosB (³²P-ΔFosB) detektiran je autoradiografijom (gornja ploča). Ukupni ΔFosB u nonradioaktivnim imunoprecipitatima detektiran je imunoblotingom (donji panel). Kao negativne kontrole prikazani su imunoprecipitat lažno tretiranih životinja i neimunskih IgG. BMjesta kandidata za fosforilaciju i kinaze s odgovarajućim rezultatima predviđanja za sekvencu proteina mišjeg ΔFosB dobivene su bioinformatičkom analizom. Mjesta kandidata s višim rezultatima predviđanja istaknuta su u sekvenci proteina i navedena u tablici. DNA-vezna (bazična) domena i leucinski zatvarač su podebljani u proteinskoj sekvenci. C, DFosforilacija ΔFosB povećana je inhibitorom Ser / Thr fosfataze OA. C, ³²Razine P-ΔFosB u imunoprecipitatima s frontalnih kortikalnih rezova označenih u odsutnosti (Ctr) ili prisutnosti 100 ng / ml OA (graf i gornji panel) detektirane su autoradiografijom. Donja ploča prikazuje ukupni ΔFosB otkriven u imunoprecipitatima iz neobilježenih rezova imunoblotingom. D, PC12 stanice su inficirane s HSV-ΔFosB ili HSV-LacZ (vektor) i metabolički obilježene ³²PH₃PO₄ u odsutnosti (Ctr) ili prisutnosti 100 ng / ml OA. ³²Razine P-ΔFosB u imunoprecipitatima detektirane su autoradiografijom (graf, gornja ploča). Donja ploča prikazuje ukupni ΔFosB otkriven u staničnim lizatima imunoblotingom.

Kao prvi korak prema rasvjetljavanju kinaza (a) i mjesta (a) uključenih u ΔFosB fosforilaciju, podvrgnuli smo njegovoj aminokiselinskoj sekvenci nekoliko bioinformatskih analiza. Ovo je otkrilo da, iako ΔFosB ne sadrži Tyr fosforilacijska mjesta kandidata, ona sadrži nekoliko mjesta konsenzusa Ser / Thr kinaze, uključujući tri CaMKII mjesta, tri mjesta CK2 i dva mjesta PKC s vrlo visokim rezultatima predviđanja fosforilacije (Slika 2B). Ako je, kao što je predviđeno putem bioinformatike, ΔFosB samo fosforiliran na Ser ili Thr ostacima, tada bi njegova fosforilacija trebala biti značajno modulirana djelovanjem Ser / Thr fosfataza. Da bismo testirali ovu hipotezu, označili smo frontalne kortikalne rezove ³²P-ortofosfat u prisutnosti ili odsutnosti OA, inhibitora Ser / Thr proteinske fosfataze. Kao što je prikazano na Slika 2C, OA je uzrokovao veliko (∼2.5-fold) povećanje u ³²P-ΔFosB. Također je uzrokovao malo povećanje ukupnih razina ΔFosB, što je u skladu s prethodnim izvješćima koja povezuju karcinogene učinke OA s njegovom sposobnošću da inducira nekoliko neposrednih ranih gena uključujući Fos proteine ​​(Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Neto rezultat je značajno sveukupno povećanje (N60%) u razinama fosforiliranih ΔFosB.

Zatim smo istražili je li u PC12 stanicama, koje su više podložne eksperimentalnoj manipulaciji, ΔFosB pokazao uzorak fosforilacije sličan onome koji se vidi u mozgu. Izrazili smo ΔFosB u PC12 stanicama putem infekcije s HSV-ΔFosB i metabolički obilježili stanice s ³²P-ortofosfat u prisutnosti ili odsutnosti OA. Uspješna ekspresija i imunoprecipitacija proteina iz stanica zaraženih HSV-ΔFosB prikazana je prisutnošću i u imunoblotu (Slika 2Dna donjoj ploči) i autoradiograf (gornji panel) 35 kDa trake, odsutne u stanicama inficiranim vektorom. Kao što je primijećeno u mozgu, OA je uzrokovala malo povećanje ukupnih razina ΔFosB, ali mnogo veći (približno dvostruki) porast ³²P-ΔFosB, što rezultira značajnim (N50%) neto povećanjem ΔFosB fosforilacije. Nadalje, u skladu s bioinformatičkim predviđanjima, liječenje stanica PC12 s inhibitorom Tyr fosfataze nije rezultiralo značajnim promjenama u ³²Razine P-ΔFosB (podaci nisu prikazani). Zajedno, ovi rezultati su otkrili da je ΔFosB fosforiliran na Ser i / ili Thr ostacima u mozgu iu PC12 stanicama i potvrdio je da je ovo dobar sustav stanične kulture u kojem se mogu dalje proučavati profili fosforilacije i degradacije ΔFosB.

CK2, ali ne i PKC ili CaMKII, fosforilira ΔFosB vitro

Kako je gore opisano, analiza aminokiselinske sekvence ΔFosB otkrila je visoke rezultate predviđanja za mjesta fosforilacije CK2, PKC i CaMKII. Da bismo odredili koja od ovih kinaza može fosforirati ΔFosB, proveli smo niz vitro reakcije fosforilacije upotrebom pročišćenih kinaza i pročišćenog rekombinantnog ΔFosB. Kao što je prikazano na Slika 3Aod tri kandidatne kinaze, samo CK2 značajno fosforilira ΔFosB. Dodatno, nekoliko drugih kinaza je testirano (npr. GSK3 i p70S6K), ali nisu uspjele značajno fosforilirati ΔFosB (podaci nisu prikazani). Dodatna karakterizacija reakcije CK2 prema vremenskom tijeku pokazala je da ova kinaza može katalizirati ugradnju N0.5 mol fosfata po molu ΔFosB (Slika 3B). Činjenica da CK2 može fosforirati ΔFosB vitro do znatne stehiometrije (N50%) ukazuje na fiziološki relevantnu reakciju. Zatim smo proučavali kinetiku ove reakcije inkubiranjem CK2 u prisustvu povećanih količina pročišćenog ΔFosB, i utvrdili smo da CK2 fosforilira ΔFosB s V_max 5.8 pmol · min^-1 · Μg^-1 enzima, a K_M 18.4 μm, i a k_kako od 0.2 / s (Slika 3C). Vrijednosti dobivene za te kinetičke parametre dodatno podupiru fiziološki značaj ove reakcije. Na primjer, K_M CK2 za DARPP32, jedan od njegovih najpoznatijih supstrata, je 3.4 μm, a k_kako je N0.3 / s (Girault i sur., 1989); K_M za ATP raspone od N10 – 40 μm (Cochet i sur., 1983; Silva-Neto i sur., 2002), a za kazein u rasponu od N10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Zajedno, ovi podaci ukazuju da je ΔFosB bona fide supstrat za CK2 vitro.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 3.

CK2, ali ne i PKC ili CaMKII, fosforilira ΔFosB vitro, Autoradiograf (gornja ploča) prikazuje fosforilirani produkt, a Coomassie-obojeni gel (donji panel) prikazuje ukupni ΔFosB prisutan u reakciji. APročišćeni rekombinantni ΔFosB je podvrgnut vitro fosforilacija s različitim kandidatskim kinazama (od kojih su tri prikazane). B, Vremenski tijek i stehiometrijske analize pokazuju da CK2 može fosforirati ΔFosB vitro sa stehiometrijom od x50%. C, Kinetička analiza reakcije CK2 pokazala je da je ΔFosB vjerodostojna vitro supstrat. Linearizacija reakcije prikazana je u dvostruko-recipročnom dijagramu (dno), ali su kinetički parametri izvedeni iz Michaelis-Mentenove krivulje (gore).

CK2 modulira fosforilaciju i stabilnost ΔFosB u intaktnim stanicama

Da bismo procijenili fiziološku važnost fosforilacije ΔFosB posredovane CK2-om, proveli smo usporedno mapiranje fosfopeptida pomoću vitro fosforilirani i PC12-stanično-fosforilirani ΔFosB. Nakon SDS-PAGE i gel eluiranja ³²P-ΔFosB (od vitro ili iz imunoprecipitata ³²P-obilježene stanice), protein je digestiran s tripsinom, a rezultirajući fosfopeptidi bili podvrgnuti dvodimenzionalnoj separaciji. Ova analiza je otkrila da je glavni fosfopeptid iz reakcije CK2 kombinirao s jednim od dva glavna fosfopeptida iz ΔFosB fosforiliranog u PC12 stanicama (Slika 4Afosfopeptidi koji su rezultat PKC ili CaMKII (podaci nisu prikazani) reakcija nije. Postoji drugi ΔFosB fosfopeptid prisutan na karti iz PC12 stanica, ali zbog nemogućnosti bilo koje od kinaza koje smo testirali da bi se proizveo sličan fosfopeptid vitrotrenutno ne znamo da li ovaj drugi fosfopeptid sadrži mjesto fosforilacije koje se razlikuje od drugog fosfopeptida ili da li predstavlja poseban triptički peptid koji sadrži isto mjesto fosforilacije.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 4.

CK2 modulira fosforilaciju i stabilnost ΔFosB u intaktnim stanicama. AČini se da CK2, ali ne i PKC, fosforilira ΔFosB u stanicama. Dvodimenzionalne fosfopeptidne mape ΔFosB fosforilirane sa CK2 ili PKC vitro ili s intaktnim PC12 stanicama. Strelice pokazuju kombinaciju CK2-fosforiliranog peptida, ali ne i PKC-fosforiliranog s jednim od ΔFosB fosfopeptida dobivenim iz PC12 stanica. BΔFosB fosforilacija u PC12 stanicama se povećava tretiranjem stanica s aktivnim aktivatorom CK2 spermina (SP) i smanjuje se tretmanom s CK2 inhibitorom DRB. Nasuprot tome, ΔFosB fosforilacija u PC12 stanicama nije bila pod utjecajem tretmana bilo s PKC aktivatorom (PMA) ili PKC-specifičnim inhibitorom calphostin-C (Calph). Prikazani su reprezentativni autoradiogram (gornja ploča) i imunoblot (donji panel). C-F, Utjecaj aktivnosti CK2 na stabilnost ΔFosB. Slike prikazuju vremenski tijek (i reprezentativni autoradiogram) degradacije ΔFosB. PC12 stanice koje su prolazno eksprimirale ΔFosB podvrgnute su pokusima pulsne potjere provedenim u odsutnosti ili prisutnosti inhibitora CK2 DRB (C), aktivator CK2 spermin (D), ili inhibitor kinaze širokog spektra H-8 (E), koji je korišten za kontrolu nespecifičnih učinaka sliva rijeke Save. F, Učinak srušavanja katalitičke podjedinice CK2 na stabilnost ΔFosB. Stanice PC12-a su transfektirane bilo s ne-ciljnim siRNA (Ctr) ili siRNA ciljanim štakorskim CK2a i 24 h kasnije transficiranim s ΔFosB plazmidom. Gornja ploča prikazuje imunoblote cijelih staničnih lizata koji pokazuju učinak CK2 siRNA na CK2 i ΔFosB razinu proteina. Odgovarajući imunoblot za P-tubulin prikazan je kao kontrola punjenja.

Kako bi se dalje obradila fiziološka važnost CK2 kao ΔFosB kinaze, tretirali smo ΔFosB-eksprimirajuće PC12 stanice s dva lijeka koji moduliraju aktivnost CK2. Kao što je prikazano na Slika 4BΔFosB fosforilacija je smanjena tretiranjem PC12 stanica s CK2 inhibitorom DRB (koji je propustan za stanice) (Meggio et al., 1990; Szyszka i sur., 1995), i povećan tretmanom s poliamin sperminom, poznatim kao snažan CK2 aktivator (Cochet i Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Nasuprot tome, liječenje PC12 stanica s PKC inhibitorom kalfostinom-C (Kobayashi i sur., 1989; Tamaoki i sur., 1990) ili PKC aktivator PMA (Schmidt i Hecker, 1975; Beh i sur., 1989) nije rezultiralo značajnim promjenama ΔFosB fosforilacije. U slučaju PMA, neznatno (i ne značajno) povećanje ³²P-ΔFosB može se objasniti povećanjem ukupnih razina ΔFosB uzrokovanih ovim lijekom; u stvari, objavljeno je da phorbol esteri induciraju ekspresiju nekoliko proteina Fos obitelji, uključujući FosB (Yoza i sur., 1992; Suh et al., 2004). Nadalje, tretiranje stanica specifičnim CaMKII inhibitorom m-AIP koji propušta stanice (Ishida i Fujisawa, 1995; Stevens i sur., 1999) također nije rezultiralo smanjenjem fosforilacije ΔFosB (podaci nisu prikazani). Zajedno, ovi rezultati su u skladu s našim vitro Nalazi i ukazuju da je u intaktnim stanicama ΔFosB vjerojatno fosforiliran sa CK2, ali ne i PKC ili CaMKII. Činjenica da CK2 inhibicija u potpunosti ne sprečava ΔFosB fosforilaciju ukazuje na postojanje dodatnih mjesta fosforilacije u proteinu.

Zatim smo ispitali ima li CK2 ulogu u prometu ΔFosB i time u njegovoj stabilnosti. U tu svrhu, proveli smo pokuse puls-chase koristeći ΔFosB-eksprimirajuće PC12 stanice tretirane s CK2 inhibitorom ili aktivatorom CK2 korištenim u studiji fosforilacije. Kao što je prikazano na Slika 4C, tretiranje stanica s inhibitorom CK2 DRB imalo je značajan utjecaj na brzinu obrtanja ΔFosB, što se očituje promjenom oblika njegove krivulje degradacije, od bifazne do krivulje koja je bliža krivulji eksponencijalnog raspada. Nasuprot tome, prisutnost aktivatora CK2 spermina uzrokovala je značajno smanjenje brzine razgradnje ΔFosB, što je dovelo do akumulacije proteina tijekom prvih sati hvatanja (Slika 4D).

Kao što je slučaj s mnogim aktivatorima i inhibitorima kinaze, spermin i DRB mogu imati metaboličke učinke izvan modulacije aktivnosti CK2. Pokazalo se da DRB inhibira transkripcijski faktor IIH (TFIIH) povezan s kinazom (Yankulov i sur., 1995), što rezultira inhibicijom transkripcije posredovane RNA polimerazom II. Budući da bi ovaj učinak mogao utjecati na stabilnost ΔFosB, analizirali smo učinak inhibitora kinaze širokog spektra H-8 (Hidaka i Kobayashi, 1992) na prometu ΔFosB u koncentraciji (200 μm) za koju se zna da inhibira kinazu povezanu s TFIIH, ali ne i CK2 (Yankulov i sur., 1995). Kao što je prikazano na Slika 4E, tretman s H-8 nije utjecao na brzinu obrtanja ΔFosB. Slični rezultati dobiveni su s H-7, drugim inhibitorom kinaze širokog spektra, korištenim u koncentraciji koja inhibira TFIIH-povezanu kinazu, ali ne i CK2 (podaci nisu prikazani). Ovi podaci dalje podupiru tumačenje da se smanjenje stabilnosti ΔFosB uzrokovano DRB-om najvjerojatnije može pripisati inhibiciji CK2-a.

Da bi se dodatno utvrdila uloga CK2-a u prometu ΔFosB, istražili smo posljedice obaranja CK2-a putem siRNA. Izvršili smo ove pokuse koristeći PC12 stanice koje su prvo transfektirane sa kontrolnom (nontargetskom) siRNA ili siRNK koja cilja na mRNA katalitičke podjedinice štakora CK2 (CK2α) i 24 h kasnije transficirane s ΔFosB. Kao što je prikazano na Slika 4F, transfekcija s CK2a siRNA učinkovito i specifično srušila razine CK2α proteina bez utjecaja na ΔFosB razine (gornji panel). Pulse-chase analiza je pokazala da je obaranje CK2-a rezultiralo značajnim povećanjem brzine fluktuacije ΔFosB, što je dokazano bržom razgradnjom proteina. Činjenica da inhibiranje aktivnosti CK2 (bilo putem DRB tretmana ili siRNA) povećava promet ΔFosB i rezultira nestankom sporih komponenti dvofazne krivulje, dok aktivacija CK2-a pojačava sporu fazu krivulje, pruža snažnu podršku za ideju da CK2 igra ulogu u reguliranju stabilnosti ΔFosB.

CK2 fosforilira ΔFosB na Ser27

Da bismo počeli identificirati mjesto (a) na ΔFosB fosforilirajućem CK2, proveli smo analizu fosfo-amino kiselina rekombinantnog ΔFosB fosforiliranog CK2 vitro i ΔFosB fosforiliran u PC12 stanicama. Ovi pokusi su otkrili da je u oba slučaja jedina otkrivena fosfo-aminokiselina bila fosfo-ser (Slika 5A). Ovaj nalaz, zajedno sa stehiometrijom dobivenom za CK2 vitro reakcija fosforilacije (N50%) (Slika 3B) i prisutnost samo jednog značajnog mjesta na CK2 karti fosfopeptida (Slika 4A), sugerira da je CK2 fosforilacija ΔFosB vjerojatno ograničena na jedan serinski ostatak. Ovaj zaključak je u skladu s konsenzusnom analizom fosforilacije (Slika 2B), koji predviđa samo jedan kandidat za serin, tj. Ser27, za CK2. Taksonomska analiza pokazala je da je Ser27 visoko očuvan kroz evoluciju među članovima obitelji Fos (Slika 5B), sugerirajući da može imati važnu fiziološku funkciju.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 5.

CK2 Fosforiliraju ΔFosB na Ser27. A, Analiza fosforaminske kiseline fosforiliranog CK2 (vitro) i PC12 stanično fosforilirani ΔFosB koji pokazuje da je u oba slučaja glavni ostatak fosforiliran serin. B, Analiza među vrstama FosB / ΔFosB sekvence aminokiselina otkrila je visoku očuvanost Ser27-a među članovima obitelji Fos od čovjeka do zebrice (tamna boja). Međutim, kiselinski ostatak na položaju + 3, koji je potreban za CK2 konsenzus mjesto, nije konzerviran (svjetlost). CHeLa stanice su prolazno transfektirane s divljim tipom ΔFosB (WT) ili ΔFosB koje sadrže točkastu mutaciju da zamijene Ser27 s Ala (S27A). Stanice su metabolički obilježene ³²PH₃PO₄ i tretirane nosačem ili sperminom (SP) za aktiviranje CK2. Prikazani su reprezentativni autoradiogram (gornja ploča) i imunoblot (donja ploča) dobivenih ΔFosB imunoprecipitata. Prikazan je imunoprecipitat lažno-transfektiranih stanica (vektor).

Da bismo utvrdili je li Ser27 fosforiliran u ΔFosB, mutirali smo ovaj ostatak u Ala i analizirali posljedice na status fosforilacije proteina. U tu svrhu koristili smo HeLa stanice (koje se mogu transfektirati s većom učinkovitošću) kako bi privremeno eksprimirale ili WT ili S27A mutant ΔFosB. Približno 24 h nakon transfekcije, stanice su metabolički obilježene ³²Pripremljeni su P-ortofosfat i lizati cijelih stanica. Nakon imunoprecipitacije i SDS-PAGE, ³²P-ΔFosB detektiran je autoradiografijom i ukupnim ΔFosB imunoblotingom. Kao što je prikazano na Slika 5C (donji panel), ΔFosB nije detektiran u stanicama transfektiranim vektorima, dok su stanice transfektirane bilo s WT ili S27A mutantom ΔFosB uspješno eksprimirale protein. Otkrili smo da je mutacija S27A uzrokovala značajno (∼30%) smanjenje u ³²Razine P-ΔFosB (Slika 5C, gornji panel i grafikon), što ukazuje da je ΔFosB u živim stanicama fosforiliran na Ser27. U nastojanju da se ustanovi je li u stanicama Ser27 doista fosforiliran sa CK2, uspoređivali smo sposobnost spermina aktivatora CK2 da modulira fosforilaciju WT i S27A ΔFosB. Kao što smo ranije primijetili u stanicama PC12 (Slika 4B), liječenje HeLa stanica s sperminom značajno je povećalo fosforilaciju WT proteina. Činjenica da je taj učinak značajno smanjen mutacijom S27A (Slika 5C) podržava tumačenje da je Ser27 u ΔFosB fiziološki supstrat za CK2.

Fosforilacija Ser27 regulira stabilnost ΔFosB

Nakon što je utvrđeno da se stabilnost ΔFosB smanjuje kada je CK2 inhibiran i pojačan kada je aktiviran CK2 (Slika 4), te da CK2 fosforilira ΔFosB na Ser27 (Slika 5), predviđali smo da bi sprečavanje fosforilacije ovog mjesta trebalo destabilizirati protein. Eksperimenti s pulsnom potezom provedeni s HeLa stanicama koje su privremeno eksprimirale bilo WT ili S27A mutant ΔFosB pokazale su da, kao što je predviđeno, mutacija S27A rezultirala je značajnim povećanjem brzine razgradnje ΔFosB i istodobnim smanjenjem poluživota proteina (Slika 6A). Zatim smo istražili da li se taj regulatorni mehanizam također pojavljuje u više neuronskih staničnih linija PC12. Ovi eksperimenti su otkrili da, kao što smo primijetili u HeLa stanicama, točkasta mutacija S27A uzrokuje dramatično smanjenje poluživota ΔFosB u PC12 stanicama (od N11 do N4 h) (Slika 6B). Činjenica da je ta destabilizacija slična onoj koju uzrokuje inhibicija CK2-a ili obaranje (Slika 4) daje daljnju potporu ideji da fosforilacija Ser2 posredovana sa CK27 regulira stabilnost ΔFosB. Dodatni dokazi za regulatornu ulogu fosforilacije Ser27 na prometu ΔFosB proteina dobiveni su upotrebom fosfomimetičke Ser27 do Asp mutacije (S27D). MX mutacija S27D smatra se fosfomimetičkom, jer smješta veliku negativno nabijenu (karboksilnu) skupinu na amino kiselinu 27 i time djelomično oponaša fosforilaciju Ser27. Kao što je prikazano na Slika 6C, mutacija S27D uzrokovala je suprotan učinak mutacije S27A i rezultirala je značajno većom stabilnošću proteina od proteina WT. Slično učinku dobivenom nakon aktivacije CK2-a (Slika 4D), mutacija S27D rezultirala je akumulacijom i time povećala razine ΔFosB tijekom prvih sati hvatanja.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 6.

Fosforilacija Ser27-a regulira stabilnost ΔFosB. A, C, Puls-chase analiza koja pokazuje učinak fosforilacije Ser27 na brzinu fluktuacije ΔFosB. Prikazan je profil razgradnje i procijenjeni poluživot divljeg tipa ΔFosB (WT), mutanta Ser27 do Ala (S27A) i fosfomimetičkog Ser27 do mutanta Asp (S27D). Isti rezultati dobiveni su u HeLa stanicama (A) i PC12 ćelije (B, C).

Ser27 fosforilacija stabilizira ΔFosB sprečavanjem njegove proteasomalne degradacije

Da bismo počeli razjašnjavati mehanizam kojim fosforilacija Ser27-a stabilizira ΔFosB, ispitali smo sposobnost proteazomskih inhibitora MG132 (Palombella i sur., 1994; Tsubuki i sur., 1996) i epoksomicin (Hanada i sur., 1992; Kim i sur., 1999) modulirati brzinu razgradnje WT i S27A mutanta ΔFosB. Eksperimenti s pulsnom potezom provedeni su korištenjem PC12 stanica inficiranih s rekombinantnim HSV koji eksprimira ili WT ili S27A ΔFosB i tretirane bilo s DMSO ili s jednim od dva inhibitora proteasoma. Ovi eksperimenti su otkrili da, iako je brzina razgradnje WT proteina relativno neosjetljiva na prisutnost jednog od dva inhibitora proteasoma (Slika 7A), da je mutant S27A osjetljiv na ove lijekove (Slika 7B). To pokazuje da, za razliku od WT proteina, S27A mutant je meta proteasomalne degradacije. Zaista, liječenje stanica bilo MG132 ili epoksomicina u potpunosti je promijenilo učinak S27A mutacije na brzinu degradacije ΔFosB, što se dokazuje povećanjem poluživota S27A mutanta od N4 do N9 h za MG132 i do ∼ 12 h za epoksomicin (Slika 7B). Zajedno, ovi rezultati ukazuju da fosforilacija ΔFosB na Ser27 štiti protein od proteasomalne degradacije i stoga je bitan za njegovu neuobičajenu stabilnost.

Prikaži veću verziju:

• Na ovoj stranici
• U novom prozoru

• Preuzmite kao PowerPoint slajd

Slika 7.

Fosforilacija Ser27-a stabilizira ΔFosB sprečavanjem njegove proteasomalne degradacije. A, B, Puls-chase analiza s HSV-inficiranim PC12 stanicama koje pokazuju profil razgradnje i procijenjene poluživote divljeg tipa ΔFosB (A) ili S27A ΔFosB (Bu odsutnosti ili prisutnosti bilo kojeg od dva inhibitora proteasoma [MG132 i epoksomicin (Epoxo)]. Zabilježite činjenicu da niti jedan lijek nema značajan učinak na promet divljeg tipa ΔFosB, dok je liječenje stanica bilo s inhibitorom proteasoma rezultiralo stabilizacijom S27A ΔFosB. C, Model za ulogu Ser27 fosforilacije u sposobnosti ΔFosB da posreduje u dugotrajnoj plastičnosti mozga. Jednom kada je induciran, dio ΔFosB stabiliziran je u mozgu fosforilacijom S2 posredovanom s CK27. To rezultira njegovom akumulacijom, što rezultira dugotrajnim promjenama u ekspresiji gena. Ove stabilne promjene u ekspresiji gena doprinose stabilnim prilagodbama ponašanja. Nasuprot tome, defosforilacija S27-a pomoću Ser / Thr fosfataza PP1 i / ili PP2A rezultira destabilizacijom proteina i njegovom obradom proteasomalnim strojevima.

Prethodni odjeljakSljedeći odjeljak

Rasprava

U ovom istraživanju pokazali smo da ΔFosB ima poluvijek N10 h u staničnoj kulturi, što ga čini stabilnim u usporedbi s FosB-om pune duljine i većinom drugih inducibilnih transkripcijskih faktora, čiji poluvijek u kulturi stanica može biti kratak nekoliko minuta i rijetko premašuje 3 h (Hann i Eisenman, 1984; Dobrazanski i dr., 1991; Roberts i Whitelaw, 1999; Ferrara i sur., 2003; Hirata i sur., 2004). Osim toga, nalazimo da je ΔFosB fosforiliran u mozgu i da je njegova fosforilacija osjetljiva na inhibitor PP1 / PP2A okadaičnu kiselinu. Naše studije stanične kulture pokazuju da je stabilnost ΔFosB modulirana pomoću CK2, s višom aktivnošću CK2 koja stabilizira protein. Konačno, naši rezultati sugeriraju da CK2 fosforilira ΔFosB na visoko konzerviranom N terminalnom serinu (S27) i pokazuju da fosforilacija S27-a štiti ΔFosB od proteasomalne degradacije. Stoga predlažemo model u kojem je fosforilacija ΔFosB na S27 od strane CK2-a kritični regulatorni mehanizam prometa ΔFosB (Slika 7C). Takva stabilizacija ΔFosB-a posredovana fosforilacijom je funkcionalno važna, jer je pokazano da povišene razine ΔFosB u određenim područjima mozga izravno reguliraju brojne neuronske gene in vivo i pokazati snažne učinke ponašanja na životinjskim modelima nekoliko neuropsihijatrijskih poremećaja (vidi Uvod).

Iako je fosforilacija brz i reverzibilan način reguliranja transkripcijske aktivnosti određenih transkripcijskih faktora, kao što je CREB (vezni protein cAMP odgovora) (Bohmann, 1990), moduliranje degradacije transkripcijskih faktora pruža još snažniji (manje lako reverzibilni) oblik regulacije (Desterro i sur., 2000). Transkripcijski faktori čija je funkcionalna aktivnost regulirana na razini njihove degradacije uključuju NFkB (Desterro i sur., 2000), c-Myc (Sears i sur., 1999) i c-Fos (Ferrara i sur., 2003), između ostalih. U mnogim slučajevima, fosforilacija je ključni regulator stabilnosti transkripcijskog faktora, kao što je pokazano za c-Fos (Okazaki i Sagata, 1995; Tsurumi i sur., 1995, Fos-srodni antigen-1 (Fra-1) (Vial i Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe i sur., 2001), c-Jun (Fuchs i sur., 1996), JunB (Fuchs i sur., 1997), ATF2 (Fuchs i sur., 2000) i p53 (Buschmann i sur., 2001). Naše studije tako dodaju ΔFosB ovom popisu transkripcijskih čimbenika čija je funkcionalna aktivnost regulirana stabilnošću koja ovisi o fosforilaciji.

CK2 je sveprisutna i konstitutivno aktivna Ser / Thr kinaza koja ima> 300 navodnih supstrata do sada identificiranih i uključena je u više bioloških procesa, uključujući staničnu smrt i preživljavanje (Litchfield, 2003; Unger i sur., 2004), odgovor na stanični stres (Yanagawa i sur., 1997; Kato i sur., 2003), te popravak DNA i remodeliranje kromatina (Barz i sur., 2003; Krohn i sur., 2003). Više od jedne trećine pretpostavljenih supstrata CK2-a su proteini uključeni u regulaciju ekspresije gena (Meggio i Pinna, 2003). U stvari, pokazalo se da je CK2 istaknuta nuklearna kinaza (Krek et al., 1992) (za pregled pogledajte Yu i sur., 2001) i interakciju s bZIP domenama nekoliko transkripcijskih faktora (Yamaguchi et al., 1998). Pokazalo se da fosforilacija posredovana CK2-om modulira razgradnju (bilo povećanje ili smanjivanje) mnogih proteina, uključujući IkB (Schwarz i sur., 1996), PTEN (Torres i Pulido, 2001), leća Connexin (Yin i sur., 2000, protein HMG1 povezan s kromatinom (Wisniewski i sur., 1999), i nekoliko faktora transkripcije kao što je HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter i sur., 1997), i c-Myc (Channavajhala i Seldin, 2002). CK2 je najzastupljeniji u mozgu (Alcazar i sur., 1988; Girault i sur., 1990), a njegova aktivnost uključena je u mnoge aspekte funkcije mozga, uključujući preživljavanje neurona (Boehning i sur., 2003), diferencijacija (Nuthall i sur., 2004), funkcija ionskog kanala (Jones i Yakel, 2003; Bildl i sur., 2004), te dugotrajno pojačavanje i plastičnost neurona (Diaz-Nido i sur., 1992; Lieberman i Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Usprkos sve većem dokazu za ulogu CK2-a u regulaciji neuronske funkcije, malo se zna što kontrolira njegovu aktivnost. Smatra se da je CK2 konstitutivno aktivan, s regulacijom njegove sposobnosti da fosforilira specifične supstrate oslanjajući se uglavnom na promjene u njegovoj intracelularnoj lokalizaciji (npr. Citosol vs jezgra) (Ahmed i Tawfic, 1994; Yu i sur., 1999). Ova informacija postavlja važno pitanje o tome koji su signali potrebni za indukciju akumulacije ΔFosB u mozgu nakon kronične stimulacije (Slika 7C). Jedan od uvjeta je ponovna aktivacija fosB gen i indukcija ΔFosB mRNA (Chen i sur., 1995). Naši podaci pokazuju da je CK2 fosforilacija ΔFosB kritična za njegovu stabilnost, što sugerira da drugi signal može biti potreban za dugoročne učinke ΔFosB na ekspresiju gena, naime, signal koji stimulira fosforilaciju proteina pomoću CK2. To može uključivati ​​aktivaciju CK2-a nekim nepoznatim mehanizmom ili njegovu translokaciju u jezgru. Alternativno, CK2 fosforilacija ΔFosB može biti konstitutivna, tako da se ΔFosB protein prevodi kao odgovor na svaki stimulus, dio se dobiva fosforiliran i time stabiliziran, tako da se uz ponovljenu stimulaciju akumulira na visoke razine u zahvaćenim neuronima.

Naši rezultati pokazuju da CK2 i S27 vjerojatno nisu jedina kinaza i mjesto odgovorno za ΔFosB fosforilaciju, jer niti inhibicija CK2-a niti S27A mutacija nisu u potpunosti spriječili ΔFosB fosforilaciju. Isto tako, činjenica da mutacija S27A rezultira redukcijom 30% fosfo-ΔFosB dokazuje da je S27 glavno mjesto fosforilacije na proteinu. Mi smo, ipak, istražujemo druge navodne kinaze i mjesta fosforilacije na ΔFosB. Na kraju, bit će također važno analizirati fosforilaciju S27-a i bilo kojeg drugog mjesta fosforilacije u ΔFosB u mozgu in vivo nakon različitih tipova kronične stimulacije, na primjer, upotrebom masene spektrometrije ili fosfospecifičnih antitijela.

Kao što je gore spomenuto, S27 u ΔFosB je visoko konzerviran tijekom evolucije i među drugim proteinima obitelji Fos. Međutim, stranica konsenzusa za CK2 nije: kako je prikazano u Slika 5B, samo FosB / ΔFosB (i xenolog zebrafish), ali ne i c-Fos ili Fra-2, posjeduju kiseli ostatak na + 3, ključnu odrednicu fosforilacije CK2 (Marin i sur., 1986; Meggio et al., 1994). Dakle, nedostatak CK2 fosforilacije na S27 može objasniti zašto drugi proteini Fos obitelji nisu tako stabilni kao ΔFosB. Međutim, to ne objašnjava zašto FosB cijele dužine, koji ima isto mjesto CK2 konsenzusa kao ΔFosB, nije slično stabiliziran. Ne znamo je li FosB pune duljine fosforiliran s CK2 na ovom konzerviranom ostatku. Jedina izvješća FosB-a (Skinner i sur., 1997) i c-Fos (Okazaki i Sagata, 1995; Chen i sur., 1996) fosforilacija opisuje mjesta u C-terminalnom području ovih proteina, koja je odsutna u ΔFosB. Potencijalna fosforilacija FosB pune duljine i drugih proteina Fos obitelji CK2 zahtijeva izravno istraživanje. Međutim, čak i ako su fosforilirani, poznato je da drugi proteini obitelji Fos sadrže motive na njihovim C-terminalima koji ciljaju na proteine ​​za brzu degradaciju (Papavassiliou i sur., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva i sur., 2002). Primjerice, pokazano je da dio ∼21 ostataka prisutnih u C kraju svih proteina iz porodice Fos, ali izostaje u ΔFosB, djeluje kao destabilizirajući domen za c-Fos (Acquaviva i sur., 2001). Otkrili smo da iako ovaj slijed slično destabilizira FosB u punoj dužini (Carle i sur., 2004), izostanak ove domene u ΔFosB ne odražava u potpunosti njegovu stabilizaciju. Umjesto toga, čini se da kombinacija odsutnosti ove domene C termusa i fosforilacije Ser27 u potpunosti odražava približno peterostruku razliku u stabilnosti između ΔFosB i FosB.

Iako je razgradnja proteina iz porodice Fos složeno i nije u potpunosti razumljivo, čini se da je proteasomalna degradacija glavni put koji je uključen (Salvat i dr., 1999; Acquaviva i sur., 2002; Ferrara i sur., 2003). Ovdje prikazani podaci, u kojima proteasomalni inhibitori ne mijenjaju značajno brzinu razgradnje ΔFosB, tvrde da, za razliku od ostalih proteina iz Fos porodice, ΔFosB izmiče 26S proteasomu, a to igra središnju ulogu u njegovoj stabilizaciji. Stoga predlažemo shemu prema kojoj se povećana stabilnost ΔFosB može pripisati kombinaciji dva glavna faktora: (1) odsutnosti C-terminalne destabilizirajući domene i (2) fosforilaciji S27 od strane CK2.

Ukratko, ova studija daje mehanički uvid zašto je ΔFosB, proizvod neposrednog ranog gena fosB, je, za razliku od svih ostalih članova obitelji Fos, relativno dugovječan protein. Smatra se da za ostale proteine ​​obitelji Fos posreduju brzo, ali prolazno spajanje podloga za transkripciju (Morgan i Curran, 1995), relativna stabilnost ΔFosB daje mu mogućnost posredovanja dugotrajnih transkripcijskih promjena izazvanih kroničnom stimulacijom. Ovo podupire stajalište da ΔFosB djeluje kao kontinuirani molekulski prekidač u mozgu, postupno pretvarajući akutne odgovore u kronične prilagodbe. Identifikacija fosforilacije Ser27 kao središnjeg mehanizma za stabilnost ΔFosB otvara nove putove za razvoj sredstava za regulaciju funkcije ΔFosB i na taj način modulira njegove dugoročne učinke na neuralnu i bihevioralnu plastičnost.

Prethodni odjeljakSljedeći odjeljak

fusnote

• Primljeno 21, 2005.
• Revizija je primljena u veljači 21, 2006.
• Prihvaćeno u travnju 2, 2006.

• Ovaj je rad podržan od Nacionalnog saveza za istraživanje shizofrenije i depresije Mladi istraživač PGU, Nacionalnog instituta za zlouporabu droga (NIDA), Nacionalne istraživačke službe PGU-a, i bespovratnih sredstava Nacionalnog instituta za mentalno zdravlje i NIDA EJN-u hvala dr. James Bibb na pomoći u vezi s vitro ispitivanja fosforilacije, dr. Ming-Hu Han za pomoć u pripremi moždanih kriški koji se koriste za metaboličko označavanje, a dr. Rachael Neve za pomoć u pakiranju rekombinantnih HSV-a.
• Sadašnja adresa G. Rudenka: Institut za znanosti o životu i Odjel za farmakologiju Sveučilišta Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
• Dopisništvo treba uputiti Ericu J. Nestleru, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-mail: [e-pošta zaštićena]

Prethodni odjeljak

Reference

1. ↵

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikacija C-terminalnog tripeptidnog motiva uključenog u kontrolu brze proteasomske razgradnje c-Fos proto-onkoproteina tijekom G (0) -to-S faznog prijelaza. onkogena 20:7563-7572.

CrossRefMedline

2. ↵

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Višestruki put razgradnje za proteine ​​iz porodice Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medline

3. ↵

Ahmed K, Tawfic S (1994) Mehanizam unutarćelijske regulacije proteinske kinaze CK2: uloga stimulacije posredovane podražajem. Cell Mol Bio Res 40:539-545.

Medline

4. ↵

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Poboljšani postupak pročišćavanja i svojstva kazein kinaze II iz mozga. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedline

5. ↵

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Vremenski tijek strijatalne imunoreaktivnosti slične DeltaFosB i razina mRNA prodinnorfina nakon prekida kroničnog dopaminomimetrijskog liječenja. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedline

6. ↵

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W. (2003) Ekrani za ekspresiju širom genoma ukazuju na globalnu ulogu CK2 proteinske kinaze u pregradnja kromatina. J Cell Sci 116:1563-1577.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

7. ↵

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dva izozima PKC-a koji se nalaze u stanicama HL-60 pokazuju razliku u aktivaciji Thor-fobol estera. FEBS Lett 249:264-266.

Medline

8. ↵

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteinska kinaza CK2 kombinirana je s malim provodnim Ca (2 +) aktiviranim K + kanalima i regulira kanalizaciju. Neuron 43:847-858.

CrossRefMedline

9. ↵

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Dugotrajna ekspresija antigena vezanog za Fos i prolazna ekspresija delte FosB povezana s napadima u hipokampusu i striatumu štakora. J Neurochem 68:272-279.

Medline

10. ↵

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Predviđanje posttralacijske glikozilacije i fosforilacije proteina iz aminokiselinskog niza. proteomika 4:1633-1649.

CrossRefMedline

11. ↵

Boehning D, Mjesec C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmisija ugljičnog monoksida aktivirana CK2 fosforilacijom heme oksigenaze-2. Neuron 40:129-137.

CrossRefMedline

12. ↵

Bohmann D (1990) Fosforilacija faktora transkripcije: veza između transdukcije signala i regulacije ekspresije gena. Stanice raka 2:337-344.

Medline

13. ↵

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Lipanj fosforilacija p2 na krajnjoj kinazi NH53 na Thr-81 važna je za stabilizaciju i transkripcijske aktivnosti p53 kao odgovor na stres. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

14. ↵

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Odsutnost konzervirane C-terminalne domene obitelji Fos doprinosi jedinstvenoj stabilnosti deltaFosB-a. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

15. ↵

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkcionalna interakcija protein kinaze CK2 i c-Myc u limfomagenezi. onkogena 21:5280-5288.

CrossRefMedline

16. ↵

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulacija delta FosB i FosB-sličnih proteina elektrokonvulzivnim napadima i liječenjem kokainom. Mol Pharmacol 48:880-889.

Sažetak

17. ↵

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kronični Fos-povezani antigeni: stabilne varijante ΔFosB inducirane u mozgu kroničnim tretmanima. J Neurosci 17:4933-4941.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

18. ↵

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilacija c-Fos na C-terminusu povećava njegovu transformacijsku aktivnost. onkogena 12:1493-1502.

Medline

19. ↵

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Okadaična kiselina inhibitora protein fosfataze 1 / 2A povećava CREB i Elk-1 fosforilaciju i c-fos ekspresiju u striatumu štakora in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedline

20. ↵

Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliaminom posredovane proteinske fosforilacije: moguća meta za unutarstanično djelovanje poliamina. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMedline

21. ↵

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalitička i molekularna svojstva visoko pročišćene kazein kinaze G iz goveđeg plućnog tkiva. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medline

22. ↵

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Striatalna tipična prekomjerna ekspresija DeltaFosB-a povećava poticaj za kokain. J Neurosci 23:2488-2493.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

23. ↵

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Samoprimjena kokaina povećava preprodinorfin, ali ne i c-fos, mRNA u striatumu štakora. NeuroReport 4:543-546.

Medline

24. ↵

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulacija transkripcijskih faktora razgradnjom proteina. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedline

25. ↵

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Povećanje aktivnosti citoplazmatske kazein kinaze II prati izrastanje neurita nakon inhibicije sinteze DNA u NIA-103 stanicama neuroblastoma. J Neurochem 58:1820-1828.

Medline

26. ↵

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteinska kinaza CK2 fosforilira i pojačava Akt / PKB. Smrt stanica razlikuje se 12:668-677.

CrossRefMedline

27. ↵

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Oba produkta fosB gena, FosB i njegov kratki oblik, FosB / SF, su transkripcijski aktivatori u fibroblastima. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

28. ↵

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Strukturne determinante odgovorne za proteasomalnu degradaciju c-Fos proteina razlikuju se prema uvjetima izražavanja. onkogena 22:1461-1474.

CrossRefMedline

29. ↵

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforilacijsko ovisno ciljanje cb Jun ubikvitinacije Jun N-kinazom. onkogena 13:1531-1535.

Medline

30. ↵

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminalne kinaze ciljaju na ubikvitinaciju njihovih povezanih transkripcijskih faktora. J Biol Chem 272:32163-32168.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

31. ↵

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabilnost ATF2 transkripcijskog faktora regulirana je fosforilacijom i defosforilacijom. J Biol Chem 275:12560-12564.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

32. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr., Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilacija DARPP-32, fosfoproteina reguliranog dopaminom i cAMP-om, kazein kinazom II. J Biol Chem 264:21748-21759.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

33. ↵

Girault JA, Hemmings HC Jr., Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterizacija u mozgu sisavaca DARPP-32 serin kinaze identična kazein kinazi II. J Neurochem 55:1772-1783.

Medline

34. ↵

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomicin, novo antitumorsko sredstvo mikrobnog porijekla. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.

Medline

35. ↵

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteini kodirani humanim c-myc onkogenom: diferencijalna ekspresija u neoplastičnim stanicama. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

36. ↵

Hemmings HC Jr., Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, ciklički AMP-regulirani fosfoprotein (Mr = 21,000) obogaćen dopaminima inerviranim područjima mozga. Aminokiselinska sekvenca fosforiliranog s cikličkim AMP-om u intaktnim stanicama i kinetičke studije njegove fosforilacije in vitro. J Biol Chem 264:7726-7733.

37. ↵

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakologija inhibitora protein kinaze. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedline

38. ↵

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Nestabilnost Hes7 proteina je ključna za sat segmentacije somita. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedline

39. ↵

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atipični i tipični neuroleptički tretmani induciraju različite programe ekspresije transkripcijskog faktora u striatumu. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMedline

40. ↵

Nada B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulacija neposredne rane ekspresije gena i vezanja AP-1-a u nukleusu štakora accumbens pomoću kroničnog kokaina. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

41. ↵

Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Tretman kroničnim elektrokonvulzivnim napadajima (ECS) rezultira ekspresijom dugotrajnog kompleksa AP-1 u mozgu s izmijenjenim sastavom i karakteristikama. J Neurosci 14:4318-4328.

Sažetak

42. ↵

Nada BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Indukcija dugotrajnog AP-1 kompleksa sastavljenog od izmijenjenih Fos-sličnih proteina u mozgu kroničnim kokainom i drugim kroničnim tretmanima. Neuron 13:1235-1244.

CrossRefMedline

43. ↵

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilizacija protein kinaze II ovisne o kalmodulinu preko autoinhibitorne domene. J Biol Chem 270:2163-2170.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

44. ↵

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Kompleksni mehanizmi za degradaciju c-fos i c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedline

45. ↵

Jones S, Yakel JL (2003) Kazein kinaza ii (protein kinaza ck2) regulira funkciju kanala serotoninskog 5-ht (3) receptora u ng108-15 stanicama. Neuroznanost 119:629-634.

CrossRefMedline

46. ↵

Kato T Jr., Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 je C-terminalna IkappaB kinaza odgovorna za aktivaciju NF-kappaB tijekom UV odgovora. Mol Cell 12:829-839.

CrossRefMedline

47. ↵

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ekspresija transkripcijskog faktora deltaFosB u mozgu kontrolira osjetljivost na kokain. Priroda 401:272-276.

CrossRefMedline

48. ↵

Kim KB, Myung J, Sin N, posade CM (1999) Proteazomska inhibicija prirodnim produktima epoksomicina i dihidroeponemicina: uvid u specifičnost i potenciju. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedline

49. ↵

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Kalfostin C (UCN-1028C), novi mikrobni spoj, vrlo je snažan i specifičan inhibitor protein kinaze C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.

CrossRefMedline

50. ↵

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazein kinaza II je pretežno nuklearni enzim. J Cell Biol 116:43-55.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

51. ↵

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteinska kinaza CK2 fosforilira protein domene visoke pokretljivosti SSRP1, inducirajući prepoznavanje UV-oštećene DNA. J Biol Chem 278:12710-12715.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

52. ↵

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Remodeliranje kromatina je ključni mehanizam koji podupire plastičnost kokaina u striatumu. Neuron 48:303-314.

CrossRefMedline

53. ↵

Lieberman DN, Mody I (1999) Kazein kinaza-II regulira funkciju NMDA kanala u hipokampalnim neuronima. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedline

54. ↵

Litchfield DW (2003) Proteinska kinaza CK2: struktura, regulacija i uloga u staničnim odlukama života i smrti. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedline

55. ↵

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Razgradnja c-Fos proteina izražena s N-metil-d-aspartinska kiselina u nuklearnim frakcijama mišjeg hipokampusa. Brain Res 905:34-43.

Medline

56. ↵

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Odsustvo trajno povišene antigena i aktivnosti vezanja DNA vezanog na 37 kDa fos u mozgovima fosB miševa tretiranih fosB kainičnom kiselinom. J Neurosci 17:5407-5415.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

57. ↵

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Specifičnost mjesta kazeina kinaze-2 (TS) iz citosola jetre štakora. Studija s modelnim peptidnim supstratima. Eur J Biochem 160:239-244.

58. ↵

McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedline

59. ↵

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekularni prekidač za dugotrajnu adaptaciju u mozgu. Brain Res Mol Mozak Res 132:146-154.

Medline

60. ↵

Meggio F, Pinna LA (2003) Tisuću i tisuću supstrata protein kinaze CK2? FASEB J 17:349-368.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

61. ↵

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilacija frakcija kazeina pomoću fosvitin kinaze jetre štakora. FEBS Lett 75:192-196.

Medline

62. ↵

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforilacija tipa 2 kazein kinaze TS na obje alfa- i beta podjedinice. Utjecaj različitih efektora. FEBS Lett 160:203-208.

CrossRefMedline

63. ↵

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Derivati ​​ribofuranozil-benzimidazola kao inhibitora kazein kinaze-2 i kazein kinaze-1. Eur J Biochem 187:89-94.

Medline

64. ↵

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Specifičnost supstrata protein kinaze CK2. Cell Mol Bio Res 40:401-409.

Medline

65. ↵

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripciona indukcija gena za ciklooksigenazu-2 inhibicijom aktivnosti fosfataze u ljudskim hondrocitima okadaičnom kiselinom: ko-stimulacija AP-1 i CRE nuklearnih veziva proteina. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedline

66. ↵

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Promjene na razini mreže u ekspresiji inducibilnih Fos-Jun proteina u striatumu tijekom kroničnog liječenja kokainom i povlačenja. Neuron 17:147-156.

CrossRefMedline

67. ↵

Morgan JI, Curran T (1995) Geni neposredno u ranoj fazi: deset godina nadalje. Trendovi Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedline

68. ↵

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Prirodno oblikovani oblik FosB-a koji inhibira aktivnost Fos / Jun transkripcije. Ćelija 64:751-759.

CrossRefMedline

69. ↵

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: neprekidni molekularni prekidač za ovisnost. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

70. ↵

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Uvođenje podjedinice receptora za glutamat 1 u motorne neurone in vitro i in vivo primjenom rekombinantnog virusa herpes simpleksa. Neuroznanost 79:435-447.

CrossRefMedline

71. ↵

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilacija serina 239 od Groucho / TLE1 proteinskom kinazom CK2 važno je za inhibiciju diferencijacije neurona. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

72. ↵

Okazaki K, Sagata N (1995) Put Mos / MAP kinaze stabilizira c-Fos fosforilacijom i pojačava njegovu transformatorsku aktivnost u NIH 3T3 stanicama. EMBO J 14:5048-5059.

Medline

73. ↵

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Put ubikvitin-proteasoma potreban je za obradu proteina prekidača NF-kappa B1 i aktivaciju NF-kappa B. Ćelija 78:773-785.

CrossRefMedline

74. ↵

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Ciljana degradacija c-Fos, ali ne v-Fos, signalom ovisnim o fosforilaciji c-lipnja. Znanost 258:1941-1944.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

75. ↵

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducibilna ekspresija dominantnog negativnog mutanta c-Juna kod transgenih miševa specifičnog za regiju mozga smanjuje osjetljivost na kokain. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedline

76. ↵

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Uvođenje DeltaFosB u moždane strukture mozga nakon kroničnog stresa. J Neurosci 24:10594-10602.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

77. ↵

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Ekspresija faktora transkripcije mozga: učinci akutnog i kroničnog amfetamina i stres zbog injekcije. Brain Res Mol Mozak Res 20:91-100.

Medline

78. ↵

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Posttranslacijska modifikacija: fosforilacija i fosfataze. U: Trenutni protokoli u znanosti o proteinima (Dunn BM, ur.) Str. 13.01-13.02. New York: Wiley i sinovi.

79. ↵

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalitička i molekularna svojstva visoko pročišćene fosvitin / kazein kinazu tip II iz humanih epitelijskih stanica u kulturi (HeLa) i odnos prema proteinu kinazi ecto. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

Medline

80. ↵

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status sustava "protein kinaza CK2-HMG14" u amneziji povezanoj s godinama kod štakora. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medline

81. ↵

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradacija bazičnog heksi-petlje-heliksa / Per-ARNT-Sim homologne domene dioksin receptora preko ubikvitin / proteasomskog puta. J Biol Chem 274:36351-36356.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

82. ↵

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Poslužitelj PredictProtein. Nucleic Acids Res 32:W321-W326.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

83. ↵

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 mete u mozgu. Front Biosci 9:8-23.

CrossRefMedline

84. ↵

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekularna karakterizacija rekombinantne mišje adenozin kinaze i evaluacija kao cilj za fosforilaciju proteina. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medline

85. ↵

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Postoje li višestruki proteolitički putovi koji doprinose razgradnji proteina c-Fos, c-Jun i p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedline

86. ↵

Schmidt R, Hecker E (1975) Autoksidacija forbol estera pod normalnim uvjetima čuvanja. Cancer Res 35:1375-1377.

SLOBODAN Cijeli tekst

87. ↵

Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstitutivna fosforilacija IkappaBalfa kazein kinazom II pojavljuje se ponajprije u serinu 293: zahtjev za razgradnju slobodnog IkappaBalfe. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

88. ↵

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras pojačava stabilnost Myc proteina. Mol Cell 3:169-179.

CrossRefMedline

89. ↵

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Ciklička fosforilacija vitelina neovisna o nukleotidima kazein kinazom II pročišćena iz ohodnih stanica Rhodnius prolixus. Insekt Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedline

90. ↵

Skinner M, Qu S, Moore C, Wisdom R (1997) Transkripcijska aktivacija i transformacija FosB proteinom zahtijevaju fosforilaciju karboksil-terminalne aktivacijske domene. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

91. ↵

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteinska kinaza CK2 diferencijalno fosforilira proteine ​​kromosomske skupine s visokom mobilnošću B (HMGB) kukuruza, modulirajući njihovu stabilnost i interakcije DNA. J Biol Chem 277:1092-1098.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

92. ↵

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikacija cyk, ciklin B2 kinaze, kao nove proteinske kinaze II ovisne o kalciju / kalmodulinu i njenoj ulozi tijekom sazrijevanja oocita Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.

CrossRefMedline

93. ↵

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulacija ekspresije c-fos i c-jun gena lipopolisaharidima i citokinima u primarno uzgojenim astrocitima: učinak PKA i PKC putova. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medline

94. ↵

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferencijalna fosforilacija ribosomalnih kiselih proteina iz stanice kvasca s dvije endogene protein kinaze: kazein kinaza-2 i kinaza 60S. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medline

95. ↵

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) i spojevi povezani s kalfostinom, nova klasa specifičnih i potentnih inhibitora protein kinaze C. Adv Second Messenger Fosfoproteinska rez 24:497-501.

Medline

96. ↵

Torres J, Pulido R (2001) Tumor supresor PTEN je fosforiliran protein kinazom CK2 na svom C-kraju. Implikacije za stabilnost PTEN-a na degradaciju posredovanu proteasomom. J Biol Chem 276:993-998.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

97. ↵

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Diferencijalna inhibicija aktivnosti kalpaina i proteasoma peptidil aldehidima di-leucina i tri-leucina. J Biochem (Tokio) 119:572-576.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

98. ↵

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradacija c-Fos proteazomom 26S se ubrzava pomoću c-Jun i više proteinskih kinaza. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

99. ↵

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteinska kinaza CK2 kao regulator staničnog preživljavanja: implikacije za terapiju raka. Curr Ciljevi lijekova za rak 4:77-84.

CrossRefMedline

100. ↵

Vial E, Marshall CJ (2003) Povišena aktivnost ERK-MAP kinaze štiti člana FOS obitelji FRA-1 od proteasomalne degradacije u stanicama karcinoma kolona. J Cell Sci 116:4957-4963.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

101. ↵

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB regulira rad kotača. J Neurosci 22:8133-8138.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

102. ↵

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulacija funkcije faktora transkripcije fosforilacijom. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedline

103. ↵

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Dva mjesta fosforilacije protein kinaze CK2 su važna za Myf-5 aktivnost. Biol Chem 378:1445-1456.

Medline

104. ↵

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitutivna fosforilacija kiselih repova proteina 1 grupe visoke pokretljivosti kazein kinazom II mijenja njihovu konformaciju, stabilnost i specifičnost vezanja DNA. J Biol Chem 274:20116-20122.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

105. ↵

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazein kinaza II stupa u interakciju s bZIP domenama nekoliko transkripcijskih faktora. Nucleic Acids Res 26:3854-3861.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

106. ↵

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilacija A170 stresnog proteina aktivnostima sličnim kazein kinazi II u makrofagima. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.

CrossRefMedline

107. ↵

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibitor transkripcijske elongacije 5,6-dikloro-1-beta-d-ribofuranozilbenzimidazol inhibira protein kinazu povezanu s transkripcijskim faktorom IIH. J Biol Chem 270:23922-23925.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

108. ↵

Yen J, Mudrost RM, Tratner I, Verma IM (1991) Alternativni spojeni oblik FosB je negativni regulator transkripcijske aktivacije i transformacije Fos proteina. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

109. ↵

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazein kinaza II fosforilira koneksin leće 45.6 i uključena je u njegovu razgradnju. J Biol Chem 275:6850-6856.

Sažetak / FREE Cijeli tekst

110. ↵

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indukcija komponenti transkripcijskog faktora AP-1 tijekom aktivacije T-stanica pomoću interleukina 1 i estera forbola. Razlika u rastu stanica 3:677-684.

Sažetak

111. ↵

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Posljedice CK2 signalizacije na nuklearnu matricu. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedline

112. ↵

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Diferencijalno ciljanje protein kinaze CK2 na nuklearnu matricu nakon prolazne prekomjerne ekspresije njegovih podjedinica. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedline

113. ↵

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: bitna uloga ΔFosB u nucleus accumbens u djelovanju morfina. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedline

Članci navode ovaj članak

• Bihevioralni i strukturalni odgovori na kronični kokain zahtijevaju povratnu petlju koja uključuje {Delta} FosB i proteinu ovisnu o proteinu kinazu II u ljusci Journal of Neuroscience, 6 ožujak 2013, 33(10):4295-4307
  • Sažetak
  • Cijeli tekst
  • Cijeli tekst (PDF)
• Striatalna prekomjerna ekspresija {Delta} FosB reproducira neproduktivne pokrete uzrokovane kroničnom levodopom Journal of Neuroscience, 26 svibanj 2010, 30(21):7335-7343
• Sažetak
• Cijeli tekst
• Cijeli tekst (PDF)
• Sažetak
• Cijeli tekst
• Cijeli tekst (PDF)
• Sažetak
• Cijeli tekst
• Cijeli tekst (PDF)
• Sažetak
• Cijeli tekst
• Cijeli tekst (PDF)
• Transkripcijski mehanizmi ovisnosti: uloga {Delta} FosB Filozofske transakcije Kraljevskog društva B: Biološke znanosti, 12 listopad 2008, 363(1507):3245-3255
• Trajna ranjivost na ponovno uspostavljanje ponašanja koje traži metamfetamin u mutantnim miševima mutanata dobivenih iz glijalnih stanica Časopis FASEB, 1 srpanj 2007, 21(9):1994-2004
• Aktivacijski protein-1 transkripcijski faktor u karcinogenezi respiratornog epitela Istraživanje molekularnog raka, 1 veljača 2007, 5(2):109-120