Cdk5 Fosforilira Dopamin D2 receptor i slabi signalizaciju nizvodno (2013)

Komentari: Čini se da pokazuje da Cdk5 uzrokuje smanjenje regulacije dopamin D2 receptora. Nevjerojatno je da faktor translacije deltafosb inducira proizvodnju Cdk5.

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, i sur. (2013) PLOS JEDAN 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Sažetak

Receptor dopamin D2 (DRD2) je ključni receptor koji posreduje funkcije mozga povezane s dopaminom, kao što su raspoloženje, nagrada i emocije. Ciklin-ovisna kinaza 5 (Cdk5) je prolin-usmjerena serin / treonin kinaza čija je funkcija uključena u sklop za nagrađivanje mozga. U ovom istraživanju otkrili smo da serinski 321 ostatak (S321) u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 (D2i3) predstavlja novo regulatorno mjesto Cdk5. Fosforilacija S5-a ovisna o Cdk321 u D2i3 opažena je u vitro i sustave stanične kulture.

Nadalje smo primijetili da je fosforilacija S321-a narušila agonist-stimuliranu površinsku ekspresiju DRD2 i smanjila spajanje G proteina na DRD2. Štoviše, nizvodni cAMP put je zahvaćen u heterolognom sustavu i u primarnim neuronskim kulturama iz p35 embrija nokautiranja vjerojatno zbog smanjene inhibitorne aktivnosti DRD2. Ovi rezultati pokazuju da fosforilacija S5-a posredovana sa Cdk321 inhibira funkciju DRD2, pružajući novi regulatorni mehanizam za signaliziranje dopamina.

Figure

Citat: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, i sur. (2013) Cdk5 Fosforilira dopamin D2 receptor i slabi signalizaciju nizvodno. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Urednik: James Porter, Sveučilište Sjeverne Dakote, Sjedinjene Američke Države

Primljeno: Svibanj 20, 2013; prihvaćeno: Studeni 14, 2013; Objavljeno: Prosinac 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong i sur. Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uvjetima Licenca za priznanje Creative Commons, koja dopušta neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju na bilo kojem mediju, pod uvjetom da se izvorni autor i izvor priznaju.

Financiranje: Ovaj rad je podržan od donacija (NRF-2012R1A2A2A01012923 i NRF-2012R1A4A1028200) korejske vlade (MSIP), a također je podržan u okviru programa međunarodne suradnje kojim upravlja NRF Koreje (2012K2A1A2033117) i Korejski institut za istraživanje mozga (KBRI) Osnovni istraživački program MSIP-a (2031-415). SKP je dobitnik nagrade 2004 i Nacionalne udruge za istraživanje o shizofreniji i depresiji (NARSAD) za mlade istraživače. Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studija, prikupljanju podataka i analizi, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Konkurentni interesi: Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi.

Uvod

Dopaminska signalizacija je uključena u različite funkcije mozga, uključujući motornu koordinaciju, kontrolu raspoloženja i mehanizme nagrađivanja [1]. Glavnu komponentu dopaminskog signaliziranja u kralježnjaka pokreću striatni srednji neuroni (MSN) koji selektivno eksprimiraju podskup dopaminskih receptora i primaju dopaminergički ulaz uglavnom iz ventralnog tegmentalnog područja (VTA) i supstance nigra (SN).) [2], Dopaminski receptori su receptori vezani za G protein (GPCR) sa sedam transmembranskih domena i sastoje se od dva podtipa, D1-slični i D2-slični receptori, koji posreduju recipročne učinke u dopaminskoj signalizaciji [1]. Na primjer, receptori slični dopamin D1 (D1, D5) aktiviraju adenilil ciklazu kroz GaS i povećavaju unutarstaničnu razinu cAMP, ali receptori slični dopamin D2 (D2, D3, D4) inhibiraju adenilil ciklazu preko Gαi i smanjenje intracelularne razine cAMP [1], [3].

Među dopaminskim receptorima, D2 receptor (DRD2) je uključen u patofiziologiju više velikih psihijatrijskih poremećaja uključujući shizofreniju i ovisnost o drogama [4]tako da mnogi antipsihotički lijekovi barem djelomično ciljaju DRD2. Također je poznato da aktivnost DRD2 dobro korelira s posljedicama zlouporabe droga u životinjskim modelima [5], Antidepresivi i djelotvornost stabilizatora raspoloženja također su povezani s promjenama ekspresije DRD2 na površini stanice ili nizvodno unutarstanične signalizacije posredovane s PKA, ERK i GSK3. [1], [4], [6], Unatoč tim kritičnim ulogama za DRD2 u mozgu, detaljni regulatorni mehanizmi koji daju heterogenost i složenost svojstvima DRD2-a nisu u potpunosti shvaćeni.

Konvergentne linije dokaza upućuju na to da su višestruke posttranslacijske modifikacije uključene u fino podešavanje aktivnosti DRD2. Opsežna glikozilacija DRD2-a otkrivena je u ranim studijama obilježavanja foto-afiniteta [7]i formiranje disulfidne veze unutar DRD2-a je također identificirano kao važna modifikacija za vezanje liganda [8], Nadalje, mjesta fosforilacije DRD2 su u početku identificirana vitro testom s radioizotopima, osiguravajući putove za različite regulatorne puteve posredovane različitim kinazama [9], Doista, proteinska kinaza C (PKC) regulira mobilizaciju intracelularnog kalcija posredovanu DRD2-om i modulira interakciju DRD2-a s citoskeletnim proteinima [10], Fosforilacija s GPCR kinazom 2 (GRK2) regulira agonist-inducirane obrasce resenzibilizacije DRD2 [11].

Ciklin-ovisna kinaza 5 (Cdk5) je prolin-usmjerena serin / treonin kinaza koja ima preferencijalno djelovanje zbog ekspresije njegovih esencijalnih aktivatora od strane mozga, p35 i p39 [12], Cdk5 je uključen u različite neuronske procese, uključujući migraciju neurona i usmjeravanje aksona, a Cdk5 i p35 null miševi pokazuju nedostatke u kortikalnom sloju [13], Nedavno je pokazano da fosforilacija WAVE1-a i ephexina pomoću Cdk5-a regulira morfogenezu dendritske kralježnice [14], Nadalje, Cdk5 također regulira razine ekspresije na površini NMDA receptora, NR2B i NR2A-posredovanih NMDA struja. [15], [16], Važno je napomenuti da više dokaza upućuje na intimnu vezu između Cdk5 i dopaminskog sustava. Cdk5 fosforilira tirozinsku hidroksilazu (TH), regulira njenu stabilnost i time održava dopaminergičku homeostazu [17], U postsinaptičkim neuronima, kada je T75 ostatak dopamina i cikličkog AMP-a reguliranog fosfoproteina-32kD (DARPP-32) fosforiliran s Cdk5, on može inhibirati PKA aktivnost i tako antagonizirati PKA signalizaciju dopaminskom DRD1-om \ t [18]. Zanimljivo, kada se kokain, indirektni agonist dopaminskih receptora, primjenjuje kronično u štakora, razine mRNA i proteina Cdk5 povećavaju se u srednjim neuronima kralježnice [19]. Čini se da je Cdk5 uključen u sinaptičke prilagodbe izazvane lijekovima. U ovoj studiji pokazali smo funkcionalnu interakciju DRD2-a i Cdk5-a koja dodatno proširuje ulogu Cdk5-a u dopaminskom signaliziranju.

Materijali i metode

antitijela

Serumi protiv kunića podignuti su protiv peptida koji sadrže fosfo-serinski 321 (pS321) treće unutarstanične petlje DRD2 (D2i3). Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), korišten je za izradu kolone za peptid-konjugaciju za afinitetno pročišćavanje (20401, PIERCE). Anti-pS321 antitijelo obogaćeno je sustavom afinitetnog pročišćavanja, slijedeći upute proizvođača. Pročišćeno fosfo-antitijelo je pohranjeno u PBS s 0.1% natrijevim azidom i 0.1% želatinom. Anti-mišje anti-Cdk5 antitijelo (sc-249) i anti-zečje anti-p35 antitijelo (sc-820) korišteni su za Western blot i imunocitokemiju Cdk5 / p35. Anti-mišje anti-GFP antitijelo (sc-9996) upotrijebljeno je za imunoprecipitaciju i Western blotiranje DRD2-GFP. Anti-zečje anti-FLAG antitijelo (sc-807), anti-zečje anti-HA antitijelo (sc-805), anti-mišje anti-GST protutijelo (sc-138) i anti-mišje anti-GAPDH antitijelo (sc- 32293) su nabavljeni od Santa Cruz Biotechnologies.

Životinje

P35 knockout miš bio je dobar dar od dr. Katsuhiko Mikoshibe u Institutu za mozak u Japanu i korišten za kulturu primarnog neurona. Primeri za genotipizaciju bili su 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC i 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT kao što je prethodno opisano [20], ICR miševi i Sprague Dawley štakori su korišteni za pripravu lizata u mozgu. Sve postupke za životinje odobrilo je Sveučilište znanosti i tehnologije Pohang, Institucionalni odbor za njegu i korištenje životinja.

Konstrukti plazmida

Korišteni su humani DRD2 dugi izoformi u EGFP-N1 plazmidnom vektoru i treća unutarstanična petlja DRD2 (212-373 aminokiselinski ostaci uključujući 29 dodatne aminokiselinske rezidue jedinstvene za DRD2 dugu izoformu) u pFLAG-CMV-2 plazmidnom vektoru. Humani Cdk5 je umetnut u pCMV-HA plazmidni vektor i humani p35 je umetnut u pcDNA 3.1 plazmidni vektor. Humani Cdk5 je umetnut pod promotor citomegalovirusa (CMV) zajedno s humanim p35 u vektoru pcDNA 3.1 da se napravi konstrukcija s dvojnom ekspresijom (Cdk5 / p35) za imunocitokemiju, test internalizacije receptora, [35S] -GTPγAnaliza vezanja S, test vezanja radioliganda i imunoanaliza cAMP enzima.

In vitro Analiza kinaze

IP-vezana vitro Ispitivanje kinaze provedeno je kako slijedi. Jedan cijeli mozak miša je liziran u puferu za lizu eritrocita 3 mL (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) 20 potezima Dounce homogenizatora radi dobivanja homogeniziranih lizata mozga , Lizati su inkubirani na ledu za 30 min, sonificirani i centrifugirani na 16,000 × g za 10 min. Supernatanti su imunoprecipitirani s anti-zečjim anti-p35 antitijelom da se dobije aktivni Cdk5 / p35 kompleks. Cdk5 / p35 kompleks i pročišćeni GST fuzijski protein pomiješan je s adenozinskim 5 tri-triposfatom, [y-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) i inkubiran u kinaznom puferu (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl)20.2 mM DTT) za 1 h na sobnoj temperaturi [18], [21], Pročišćeni Cdk5 / p25 kompleks (14 – 516, Millipore) također je korišten za vitro testa kinaze kao što je gore opisano. U reakcijsku smjesu se doda pufer za punjenje uzorka 2x i kuha se na 100 ° C. Uzorci su zatim podvrgnuti SDS-PAGE i osušeni gel je određen autoradiografijom.

Tekuća kromatografija (LC) - masena spektrometrija (MS) / MS analiza

Rekombinantni GST-D2i3 protein analiziran je pomoću LC-MS / MS nakon IP-vezanja vitro test kinaze. Proveli smo identifikaciju LC-MS / MS podataka pomoću X !! Tandema (verzija Dec-01-2008). Svaka RAW datoteka je prvo pretvorena u mzXML pomoću trans-proteomskog cjevovoda (TPP; verzija 4.3). MS / MS skenovi u konvertiranim mzXML-ovima zatim su podvrgnuti pretraživanju prema bazi podataka UniProt mišjeg slijeda proteina (oslobađanje 2010_07) uključujući GST-D2i3 sekvencu koristeći X !! Tandem. Tolerancija je postavljena na 3 Da za prekursorske ione i 2a za fragmentne ione. Upotrijebljena je specifičnost enzima za tripsin. Opcije varijabilne modifikacije korištene su za karbamidometilaciju cisteina (57.021 Da), oksidaciju metionina (15.995 Da), hidrolizu asparagina (0.987 Da) i fosforilaciju serina (79.966 Da).

Imunotaloženie

Imunoprecipitacija je provedena na staničnim lizatima u ELB liznom puferu. Anti-GFP antitijelo je dodano u lizate i inkubirano tijekom 3 h na 4 ° C. Imunokompleksi su pročišćeni upotrebom proteina-A agaroze. Precipitati su inkubirani s puferom za punjenje uzorka SDS za 30 min na 37 ° C i podvrgnuti SDS-PAGE i Western blot uzorcima.

GST Pull-down test

10 µg pročišćenog GST i GST-D2i3 su inkubirani s lizatom mozga štakora za 1.5 h na 4 ° C. Dodan je 30 µL glutation-konjugiranih sefaroznih 4B kuglica (17-0756-01, GE Healthcare) uravnotežen s puferom za lizu i inkubiran za dodatne 1 h. Kuglice su sakupljene centrifugiranjem na 2,000xg i isprani puferom za lizu 4 puta [22], [23], Precipitati su analizirani Western blot metodom upotrebom anti-Cdk5 i anti-p35 antitijela.

fosforilacija

Transfektirane HEK 293 stanice i striatalni neuroni uzgojeni na pokrovnim listovima isprani su jednom s fosfatnim puferom (PBS) i fiksirani potapanjem u hladni 4% paraformaldehid / PBS za 30 min. Primarno protutijelo razrijeđeno je u otopini za blokiranje (2% konjski serum i 1% Triton X-100 u PBS). Anti-mišje protutijelo konjugirano s Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) i anti-zečja protutijela konjugirana s Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) korištena su kao sekundarna antitijela. Hoechst je korišten za bojanje jezgre. Slike su dobivene konfokalnom mikroskopijom (Olympus, FluoView-1000).

Analiza internalizacije receptora

24 h nakon transfekcije, stanice su tretirane s 1 uM quinpirolom (Q102, Sigma) za 30 min i 90 min na 37 ° C. Stanice su ponovno suspendirane u 2 mL hladnog PBS i 200 uL alikvoti su korišteni za svaku reakciju. Tretmani lijekovima su provedeni na sobnoj temperaturi tijekom 3 h u slijedećim koncentracijama; 3 nM [3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 uM sulpirid (895, TOCRIS), 10 uM haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobni3H] -spiperon upotrijebljen je za označavanje ukupnih eksprimiranih receptora, a hidrofilni sulpirid je korišten za zamjenu membranskog receptora vezanog3H] -spiperonski signali. Signali receptora povezani s membranom izračunati su oduzimanjem vrijednosti unutarstaničnog receptora od ukupne ekspresirane vrijednosti receptora. Stanice su filtrirane na GF / B (Millipore) filter i isprane 3 puta s puferom za ispiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtri su osušeni, a preostala radioaktivnost je mjerena pomoću tekućeg scintilacijskog brojača [24].

Priprema stanične membrane

Konfluentne stanice u posudama za kulturu 100 mm nakon transfekcije isprane su ledeno hladnim PBS-om i sakupljene u puferu 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl21 mM EDTA). Homogenizirani lizati su centrifugirani s 500 x g za 15 min i supernatanti su zatim centrifugirani s 36,000 x g za 30 min. Za analizu su korištene pelete koje su ponovno suspendirane u HME puferu.

[35S] -GTPγIspitivanje vezanja

Frakcije stanične membrane su prethodno inkubirane s 1 uM quinpirolom (Q102, Sigma) u puferu za ispitivanje (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2100 mM NaCl, 1 mM EDTA i 0.01 mM GDP) za 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) dodan je konačna koncentracija 3 nM u 30 uL i dalje inkubirana tijekom 90 min. 170 uL ledeno hladnog pufera (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2i 0.1 mM GTP) da bi se zaustavila reakcija. Membrane su filtrirane na GF / B filteru (Millipore) i isprane 3 puta s puferom za ispiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtri su sušeni i radioaktivnost je mjerena scintilacijskim brojačem [25], [26].

Ispitivanje vezanja radioliganda

Pripremljene stanične membrane su inkubirane s 0.01 nM [3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer) i povećane koncentracije kvinpirola (Q102, Sigma) za 30 min u puferu za ispitivanje (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrane su filtrirane na GF / B filteru (Millipore) i isprane 3 puta s puferom za ispiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakcija je prekinuta brzom filtracijom kroz GF / C filtere. Rezidualna radioaktivnost je mjerena pomoću tekućeg scintilacijskog brojača [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Transfektirane HEK 293 stanice su prethodno obrađene s 10 uM rolipramom (R6520, Sigma) za 1 h, i zatim tretirane s 0.1 uM forskolinom (F6886, Sigma) i povećanjem koncentracija kvinpirole (Q102, Sigma) za 30 min. Primarni kulturirani striatni neuroni tretirani su 10 µM ​​rolipramom za 1 h, a zatim 1 µM ​​dopaminom za 1 h [22], Stanični lizati su pripravljeni s 0.1 M HCl i cAMP razinama su detektirane cAMP enzimskim imunoesej kitom (Sapphire Bioscience) slijedeći upute proizvođača.

Primarna kultivirana stratatalna neurona

Striatalno područje izolirano je iz mišjeg embrionalnog mozga (E15). Razdvojeno tkivo disocirano je u minimalnom esencijalnom mediju (MEM) (11095, Invitrogen) koji sadrži 0.25% tripsin (T4549-100, Sigma) i 0.1% DNaza I za 6 min na 37 ° C. Stanice su ponovno suspendirane u mediju za oblaganje (MEM s 0.01 M HEPES (pH 7.4) i 10% (vol / vol) konjski serum (16050-122, GIBCO)). Neuroni su kultivirani tijekom 7 dana vitro (DIV 7) u MEM s dodatkom B27 (17504-044, Invitrogen) prije primjene na imunoispitivanja cAMP enzima.

Rezultati

Cdk5 Fosforilira serin 321 u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 vitro

Da bismo identificirali nove supstrate Cdk5, proveli smo sustavno pretraživanje pomoću (S / T) PX (K / H / R) kao Cdk5 konsenzus sekvence [30] i identificirali DRD2 kao kandidatski supstrat. Konsenzus sekvenca, uključujući serin 321, nalazi se u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 (D2i3) gdje su različiti regulatorni mehanizmi uključeni [3], [10], [11], Slijed je evolucijski konzerviran u DRD2 u kralježnjaka, što ukazuje na funkcionalnu važnost ostatka (Slika 1A).

thumbnail

Slika 1. Cdk5 fosforilira serin 321 u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 in vitro.

(A) Ravnanje aminokiselinske sekvence koja prikazuje konzervirane regije DRD2 iz različitih vrsta (zasjenjene). Potencijalno mjesto fosforilacije Cdk5 označeno je zvjezdicom. (B) IP-povezan vitro testa kinaze s rekombinantnim GST-D2i3 i GST-D2i3 mutantnim proteinima. Cdk5 / p35 kompleks obogaćen iz ekstrakta mišjeg mozga pomoću imunoprecipitacije anti-p35 korišten je za reakcije kinaza. Autoradiograf fosforiliranih proteina prikazan je zajedno s Coomassie briljantnim plavim bojanjem istog gela. Arrowhead označava radioaktivni signal koji odgovara GST-D2i3s i otvorena strelica pokazuje radioaktivne signale iz p35. (C) MS / MS spektar fosforiliranog peptidnog fragmenta D2i3. Teoretski obrasci fragmentacije prikazani su ispod spektra. Među svim fragmentima iona, detektirani y- i b-ioni su označeni u spektru. Y6 i y7 Ioni snažno ukazuju na fosforilaciju serina 321. (D) In vitro testa kinaze s pročišćenim Cdk5 / GST-p25 kompleksom koristeći GST-D2i3 i GST-D2i3 mutantne proteine. Fosforilirani proteini prikazani su autoradiografom, zajedno s Coomassie briljantnim plavim bojanjem. Arrowhead označava radioaktivni signal koji odgovara GST-D2i3, a otvorena strelica pokazuje radioaktivne signale iz GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Da bismo procijenili kapacitet Cdk5 da fosforilira D2i3, izvršili smo IP-povezivanje vitro testovi kinaze upotrebom aktivnog Cdk5 / p35 kompleksa obogaćenog iz mišjeg lizata mozga imunoprecipitacijom p35 s pročišćenim rekombinantnim proteinima GST-D2i3 (aminokiselinski ostaci 212-373) kao supstrati. Uočili smo fosforilacijske signale u pročišćenim proteinima GST-D2i3 i GST-D2i3 S297A, ali je signal značajno smanjen pomoću GST-D2i3 S321A (Slika 1B). Za daljnju provjeru fosforilacije serin 321 u GST-D2i3, izvršili smo LC-MS / MS analizu uzoraka iz IP-povezane vitro ispitivanja kinaze pomoću LTQ XL masene spektrometrije. Dosljedno su dobiveni fosfo-peptidi koji odgovaraju masi fosfo-serinskih peptida 321 (Slika 1C). Uzimajući u obzir da prikupljanje podataka ovisno o podacima tijekom analize LC-MS / MS teži da detektira obilne proteine ​​u uzorku [31]ovi podaci sugeriraju da je serinski 321 ostatak dominantno mjesto fosforilacije Cdk5 u D2i3 regiji. Da bi se dokazalo izravno fosforiliranje serina 321 u GST-D2i3 pomoću Cdk5, vitro Ispitivanje kinaze provedeno je pomoću pročišćenog Cdk5 / GST-p25 kompleksa s pročišćenim rekombinantnim GST-D2i3 proteinima. Identificirali smo značajan fosforilacijski signal u GST-D2i3 koji je bio odsutan u GST-D2i3 S321A (Slika 1D). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da je D2i3 S321 ostatak preferencijalni cilj za Cdk5-posredovanu fosforilaciju.

Cdk5 Fosforilira serin 321 u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 u stanicama

Da bismo identificirali fosforilaciju serina 321, povećali smo antitijela specifična za fosfo-serin 321 (pS321). Uzorci povezani s IP-om vitro Analiza kinaze analizirana je Western blot postupkom pomoću anti-pS321 antitijela. Blotovi su pokazali različitu traku u kinaznoj reakciji koja je ovisila o GST-D2i3 (Slika 2A). Da bi se potvrdila potencijalna fosforilacija serina 321 u DRD2 pomoću Cdk5 u stanicama, anti-GFP imunoprecipitati iz HEK 293 stanica koje ekspresiraju DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP sa ili bez HA-Cdk5 i p35 su analizirane pomoću Western blot i anti-GFP i anti-pS321 antitijela. Karakteristični razmazani signali s anti-GFP antitijelima za koje se zna da su zbog prekomjerne glikozilacije DRD2 opaženi su samo u prisutnosti DRD2-GFP, a anti-pS321 antitijelo otkrilo slične DRD2 signale samo sa Cdk5 / p35 ko-ekspresijomSlika 2B) [7], Za daljnje provjeravanje fosforilacije serina 321 pomoću Cdk5, generirani su D2i3 (FLAG-D2i3) i mutantni oblik D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 i FLAG-D2i3 S321A eksprimirani sa ili bez HA-Cdk5 i p35 u HEK 293 stanicama su analizirani SDS-gel pokusom pomicanja mobilnosti. Uočen je značajan pomak kretanja ovisan o Cdk5 za FLAG-D2i3, ali ne i za FLAG-D2i3 S321A (Slika 2C). Također smo procijenili razinu fosforilacije DRD2 na Ser321 nakon stimulacije agonista. HEK 293 stanice koje eksprimiraju DRD2-GFP i Cdk5 / p35 kompleks stimulirane su kvinpirolom, a anti-GFP imunoprecipitati iz staničnih lizata analizirani su Western blot-om uz korištenje anti-GFP i anti-pS321 antitijela. Otkrili smo da fosforilacija DRD5-a posredovana Cdk2-om na Ser321 nije bila pod utjecajem agonističke stimulacije, koja se čini različitom od fosforilacija posredovanih s GRK i PKC (Slika 2D) [32], [33], Zajedno, ovi rezultati ukazuju da Cdk5 može fosforilirati serinski 321 ostatak DRD2 u staničnom okruženju.

thumbnail

Slika 2. Cdk5 fosforilira serin 321 u trećoj intracelularnoj petlji DRD2 u stanicama.

Fosforilacija serina 5 posredovana sa Cdk321 analizirana je upotrebom anti-pS321 antitijela. (A) Uzorci iz IP-povezane vitro Analiza kinaze pomoću GST-D2i3 proteina analizirana je Western blottingom (WB) s naznačenim antitijelima. Strelice prikazuju GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP je izražen sa ili bez HA-Cdk5 i p35 u HEK 293 stanicama. Anti-GFP imunoprecipitati analizirani su Western blot postupkom upotrebom anti-GFP i anti-pS321 antitijela. Zagrada ukazuje na DRD2 signale i otvorena strelica pokazuje nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitata. '% input' je% volumena ukupnog lizata za IP reakciju. Slabi endogeni signali Cdk5 označeni su zvjezdicama. (C) Analiza pomaka pokretljivosti gela. HEK 293 stanice transficirane kako je naznačeno analizirane su Western blot-om. (D) Transfektirane stanice HEK 293 tretirane su kvinpirolom i anti-GFP imunoprecipitatima su analizirane Western blot s anti-GFP i anti-pS321 antitijelima. Otvorena strelica pokazuje nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitata.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex i DRD2 su fizički povezani

Istražili smo potencijalnu fizičku interakciju između kompleksa Cdk5 / p35 i DRD2 jer je poznato da su mnogi Cdk5 supstrati fizički povezani s Cdk5 / p35 kompleksom [23], [34], [35], Najprije je proveden GST padajući eksperiment. Pročišćeni rekombinantni GST-D2i3 protein inkubiran je s lizatom mozga kod štakora, a GST taložnici su analizirani na Western blot. Kao što je prikazano na Slika 3A, endogeni Cdk5 i p35 identificirani su u padajućim precipitatima, što ukazuje na fizičku interakciju između DRD2 i Cdk5 / p35 kompleksa (Slika 3A). Štoviše, HA-Cdk5 i p35 su detektirani u anti-GFP imunoprecipitatima iz HEK 293 staničnih lizata koji eksprimiraju DRD2-GFP i Cdk5 / p35 (Slika 3B). Osim toga, izvršili smo imunocitokemijske analize i primijetili da DRD2-GFP, HA-Cdk5 i p35 pokazuju značajne signale ko-lokalizacije na membranskom području HEK 293 stanica (Slika 3C, gornje ploče). Također smo istražili ko-lokalizaciju DRD2 i Cdk5 / p35 u neuronskom kontekstu. Dosljedno, DRD2-GFP je također pokazao značajnu ko-lokalizaciju s endogenim Cdk5 i p35 u kultiviranim striatnim neuronima (DIV7), dodatno podupirući funkcionalne veze između DRD2 i Cdk5 / p35 (Slika 3C, donje ploče). Rezultati pokazuju da DRD2 i Cdk5 / p35 mogu tvoriti kompleks i tako podržati ideju da je DRD2 fiziološki supstrat Cdk5.

thumbnail

Slika 3. Cdk5 / p35 može formirati kompleks s DRD2.

(A) GST pull-down test upotrebom pročišćenog rekombinantnog GST-D2i3 proteina s ekstraktom mozga štakora. GST razgradni precipiti su podvrgnuti Western blot analizama. 'Kuglica' označava povlačenje taloga bez GST proteina. (B) Imunoprecipitacija kompleksa DRD2 i Cdk5 / p35. Anti-GFP IP iz lizata iz transficiranih stanica podvrgnut je Western blot analizama. Zagrada ukazuje na DRD2 signale i otvorena strelica pokazuje nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitata. Na desnoj strani prikazana je i preeksponirana mrlja za ulaze. (C) Imunocitokemijske analize DRD2 i Cdk5 / p35. HEK 293 stanice koje eksprimiraju DRD2-GFP i Cdk5 / p35 su obojene s anti-Cdk5 i anti-p35 antitijelima (gornji paneli). DRD2-GFP je eksprimiran sam u kultiviranim striatnim neuronima i obojen s anti-Cdk5 i anti-p35 antitijelima (Donji paneli). Hoechst je korišten za bojanje jezgre. Traka skale je 5 µm. Sve slike su dobivene konfokalnom mikroskopijom (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-posredovana fosforilacija DRD2 umanjuje aktivnost receptora

Prijavljeno je da fosforilacija modulira kritična svojstva GPCR-a kao što je spajanje G proteina, internalizacija receptora, intracelularna lokalizacija i povezanost s modulatorskim proteinima [9], [11], [24]. internaliziranje receptora uzrokovano gonistima je kritični regulatorni proces transdukcije signala. Istraživali smo modulaciju DRD5 internalizacije posredovanu Cdk2-om. HEK 293 stanice koje eksprimiraju DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP sa ili bez Cdk5 / p35 su inkubirane s 1 µM ​​quinpirolom kako bi se potaknula internalizacija DRD2 stimulirane agonistom (Slika 4A). [3H] -spiperonski signali stanica koje eksprimiraju DRD2-GFP bile su značajno reducirane pri 30 min kvinpirolnom tretmanu i oporavljene u 90 min. Zanimljivo, [3H] -spiperonski signali stanica koje eksprimiraju DRD2-GFP i Cdk5 / p35 također su smanjene pri 30 min kvinpirolnom tretmanu, ali nisu oporavljene u 90 min (Slika 4A, drugi dio). S druge strane, [3H] -spiperonski signali stanica koje eksprimiraju S2A-GFP smanjene su na 321 min i oporavljene u 30 min, bez obzira na ko-ekspresiju s Cdk90 / p5. Prethodne studije su pokazale da se internalizirani DRD2 reciklira natrag na plazmatsku membranu nakon produljene stimulacije agonista [11], TČini se da je fosforilacija DRD5 posredovana Cdk2-om uključena u procese resenzibilizacije nakon internalizacije DRD2 uzrokovane agonistom.

thumbnail

Slika 4. Fosforilacija posredovana Cdk5-om smanjuje ekspresiju površine DRD2 i signalizaciju nizvodno.

(A) Izraz površine DRD2 mjereno [3H] -spiperon vezujućeg testa. Transfektirane HEK293 stanice stimulirane su s 1 µM ​​quinpirolom za naznačeno vrijeme i sakupljene, a zatim 3 nM [3Liječenje H] -piperonom tijekom 3 sata. Izmjerena je radioaktivnost i izračunati površinski signali. Trake pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Jednosmjerna ANOVA s Dunnettovim post hoc testom: usporedite sve stupce u odnosu na kontrolni stupac). (B) [35S] -GTPγAnaliza vezanja S. Stanične membrane su pripremljene iz stanica transfektiranih kako je naznačeno. Membranski preparati su inkubirani s 1 uM kinpinolom, a zatim 3 nM [35S] -GTPγS tijekom 90 min. Trake pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Jednosmjerna ANOVA s Bonferroni post hoc testom: usporedite sve parove stupaca). (C) Natjecanje kvinpirola [3H] -spiperon vezujućeg testa. Membranski pripravci iz transfektiranih stanica inkubirani su s 0.01 nM [3H] -spiperon i povećanje koncentracije kvinpirola tijekom 30 minuta. Nelinearna regresija dobivena je pomoću GraphPad-a. Trake pogrešaka pokazuju srednju vrijednost ± SE (n = 3). (D) imunološki testovi cAMP enzima u transficiranim stanicama HEK 293. Transficirane stanice su prethodno obrađene s 10 uM roliprama tijekom 1 sata, a zatim su ko-obrađene s 0.1 uM forskolina i povećavanjem koncentracija kvinpirola tijekom 30 minuta. Nelinearna regresija dobivena je pomoću GraphPad-a. Trake pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± SE (n = 4; ** p <0.01; dvostrani t-tests). (E) Kultivirani striatni neuroni iz divljeg tipa i p35 embrija nokauta (DIV 7) tretirani su 10 uM rolipramom za 1 h nakon čega je slijedio 1 uM dopamin za 1 h. Stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SE (n = 4; **p<0.01; dvostrani t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Nadalje smo procijenili potencijalnu promjenu vezanja G proteina stimuliranog agonistom na DRD2 povezanu s fosforilacijom posredovanom Cdk5 upotrebom [35S] -GTPγAnaliza vezanja S [25], [26], DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP sa ili bez Cdk5 / p35 su eksprimirani u HEK 293 stanicama. Membrane su pripremljene i stimulirane s 1 µM ​​quinpirolom i dalje dopuštene [35S] -GTPγS osnivanje. Stanična membrana koja eksprimira DRD2-GFP i Cdk5 / p35 pokazala je značajno smanjenje35S] -GTPγS vezanje u usporedbi sa svim ostalim staničnim membranama (Slika 4B). Ovi rezultati ukazuju da fosforilacija posredovana Cdk5-om regulira vezanje agonist-stimuliranog G proteina na DRD2.

Osim toga, quinpirole-competing [3H] -spiperonski testovi vezanja provedeni su kako bi se istražila svaka potencijalna promjena u afinitetu agonista kod DRD2-a pomoću fosforilacije posredovane Cdk5. Konkurentno obvezivanje za [3H] -spiperona je izmjeren nakon tretiranja povećanih koncentracija quinpirole na pripravak membrane iz transfektirane. Konkurentno vezanje quinpirole i [3H] -spiperon na DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP napravio sličan logKi vrijednosti (-9.789 za DRD2-GFP; -9.691 za DRD2 S321A-GFP), što ukazuje da afinitet liganda prema DRD2 nije značajno pogođen fosforilacijom posredovanom Cdk5 na DRD2 (Slika 4C).

Fosforilacija posredovana Cdk5-om regulira signalni put DRD2-cAMP

Zatim smo istražili utječe li modifikacija DRD2-a na Cdk5 nizvodne signalne puteve. Pratili smo DRD2-posredovanu inhibiciju forskolin-stimulirane proizvodnje cAMP adenilil-ciklazom u stanicama koje eksprimiraju DRD2-GFP i DRD2 S321A-GFP koristeći cAMP enzimski imunotest. Stanice koje eksprimiraju DRD2 pokazale su smanjene razine cAMP kao odgovor na kininol na način ovisan o dozi. Značajno je da koekspresija Cdk5 / p35 značajno smanjuje maksimalnu inhibiciju nastanka cAMP (Slika 4D, lijeva ploča). S druge strane, u stanicama koje eksprimiraju DRD2 S321A-GFP, cAMP formacije su učinkovito inhibirane u odgovoru na tretman quinpirolom bez obzira na ekspresiju Cdk5 / p35 (Slika 4D, desna ploča). Ovi rezultati pokazuju da fosforilacija DRD5 posredovana sa Cdk2 smanjuje inhibitornu aktivnost DRD2 na nizu cAMP signalizacijskog puta. Kako bi dodatno potvrdili fenomen u fiziološki relevantnijem okruženju, koristili smo primarne kultivirane neurone iz embrija nokauta s manjkom p35a, esencijalnog Cdk5 aktivatora. Primarni kulturirani striatni neuroni tretirani su 1 uM dopaminom i analizirani imunoanalizom cAMP enzima. Neuroni iz p35 nokautiranih miševa pokazali su smanjene razine cAMP u usporedbi s neuronima divljeg tipa kada su stimulirani dopaminom (Slika 4E). Tzajedno, zaključili smo da fosforilacija DRD5-a posredovana sa Cdk2 rezultira smanjenjem inhibitornog tona na cAMP putu koji vrši DRD2.

Rasprava

Identificirali smo DRD2 kao novi supstrat Cdk5. Čini se da fosforilacija smanjuje površinsku ekspresiju DRD2-a utječući na sudbinu DRD2-a nakon internalizacije receptora čime se smanjuje DRD2 Gipovezivanje i nizvodni cAMP put. Budući da ostatak fosforilacije S321 postoji u DRD2 dugim i kratkim izoformama, mehanizam predložen u ovoj studiji može biti opći način regulacije u signalizaciji posredovanom DRD2-om..

DRD2 u srednjim neuronima kralježnice nije samo smatran glavnim podtipom receptora dopamina, već je također prepoznatljiv po svojoj osjetljivosti na promjene u dostupnosti kao odgovor na podražaje iz okoline. Agonistom inducirana desenzibilizacija i resenzibilizacija DRD2-a su opsežno proučavani [11], [24]. Posebno, brojna su istraživanja pokazala da učinci kronične izloženosti psihostimulansima, kao što su kokain i amfetamin, koji povećavaju izvanstaničnu razinu dopamina u striatalnoj sinapsi, praćeni su dinamičkim promjenama DRD2 postsinaptički [36]. Za kronične korisnike kokaina poznato je da imaju smanjenu razinu DRD2-a u području strijatala, a dostupnost DRD2-a u nucleus accumbens (NAcc) pokazuje negativnu korelaciju s traženjem lijekova i ponašanjem pojačanja kod miševa i primata. [37]-[39]. Ovi nalazi ukazuju da je funkcionalnost DRD2-a vrlo osjetljiva na adaptivnu ili kompenzacijsku regulaciju kao odgovor na različite stimulanse, uključujući kroničnu izloženost lijeku. Naši rezultati pokazuju da ostatak S321 u trećoj intracelularnoj petlji DRD2-a može biti fosforiliran s Cdk5, što rezultira smanjenjem inhibitornog utjecaja DRD2 na cAMP putu. Ova interakcija predlaže novi regulatorni mehanizam povezan s Cdk5 u dopaminoceptivnim neuronima koji bi mogli biti povezani s dinamičkom prirodom raspoloživosti površine DRD2.

Valja napomenuti da je poznato da je Cdk5 ključna komponenta u posredovanju adaptivnih promjena neuronskog okoliša. Primjerice, strukturne i funkcionalne promjene dendritičnih kralježnica u neuronima limbičkog kruga jedna su od posljedica ponovljene izloženosti psihostimulansima [40]. Te su promjene popraćene različitim molekularnim promjenama, uključujući indukciju veznog proteina cAMP odgovora (CREB) i ΔFosB, transkripcijskih faktora koji pokazuju trajnu regulaciju kao odgovor na kroničnu primjenu kokaina [41], [42]. Važno je da je Cdk5 meta ΔFosB [19], i mnoge kritične komponente uključene u dendritičnu dinamiku kralježnice, kao što su PSD-95, p21-aktivirana kinaza (PAK), β-katenin i spinofilin, zabilježene su kao supstrati Cdk5 [43]-[46]. Dosljedno, genetske ili farmakološke manipulacije aktivnostima Cdk5 izazivaju promjene morfologije dendritske kralježnice i reakcija na ponašanje kokaina, što implicira kritične uloge Cdk5 u molekularnim i morfološkim promjenama mezolimbičkih krugova dopamina [47], [48]. Naši rezultati koji pokazuju da je DRD2 nova meta Cdk5 daje dodatni uvid u adaptivne promjene dopaminskog sustava kao odgovor na kroničnu izloženost lijeku zbog naknadne regulacije Cdk5-a posredovane ΔFosB može izazvati toničko povećanje fosforilacije DRD2 , Osim toga, poznato je da DRD2 utječe na brojne stanične procese, uključujući regulaciju cAMP i MAP kinaznih puteva te nizvodne transkripcijske događaje. [42], [49]. Prema tome, nalazi u ovoj studiji ne samo da mogu prikazati izravnu regulaciju DRD2-a pomoću Cdk5-a, već također pružaju novi uvid u adaptivne odgovore dopaminskog sustava na kroničnu izloženost lijeku.

Doprinosi autora

Zamislio i osmislio eksperimente: JJ YUP DH SKP. Izvršio je pokuse: JJ YUP DKK YK. Analizirani su podaci: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Priloženi reagensi / materijali / alati za analizu: YHS. Napisao je rad: JJ SKP.

Reference

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Dopamin receptori: od strukture do funkcije. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Mudri RA (2002) Struktura za nagrađivanje mozga: uvidi iz neosjetljivih poticaja. Neuron 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Pogledajte članak
  4. PubMed / NCBI
  5. Google znalca
  6. Pogledajte članak
  7. PubMed / NCBI
  8. Google znalca
  9. Pogledajte članak
  10. PubMed / NCBI
  11. Google znalca
  12. Pogledajte članak
  13. PubMed / NCBI
  14. Google znalca
  15. Pogledajte članak
  16. PubMed / NCBI
  17. Google znalca
  18. Pogledajte članak
  19. PubMed / NCBI
  20. Google znalca
  21. Pogledajte članak
  22. PubMed / NCBI
  23. Google znalca
  24. Pogledajte članak
  25. PubMed / NCBI
  26. Google znalca
  27. Pogledajte članak
  28. PubMed / NCBI
  29. Google znalca
  30. Pogledajte članak
  31. PubMed / NCBI
  32. Google znalca
  33. Pogledajte članak
  34. PubMed / NCBI
  35. Google znalca
  36. Pogledajte članak
  37. PubMed / NCBI
  38. Google znalca
  39. Pogledajte članak
  40. PubMed / NCBI
  41. Google znalca
  42. Pogledajte članak
  43. PubMed / NCBI
  44. Google znalca
  45. Pogledajte članak
  46. PubMed / NCBI
  47. Google znalca
  48. Pogledajte članak
  49. PubMed / NCBI
  50. Google znalca
  51. Pogledajte članak
  52. PubMed / NCBI
  53. Google znalca
  54. Pogledajte članak
  55. PubMed / NCBI
  56. Google znalca
  57. Pogledajte članak
  58. PubMed / NCBI
  59. Google znalca
  60. Pogledajte članak
  61. PubMed / NCBI
  62. Google znalca
  63. Pogledajte članak
  64. PubMed / NCBI
  65. Google znalca
  66. Pogledajte članak
  67. PubMed / NCBI
  68. Google znalca
  69. Pogledajte članak
  70. PubMed / NCBI
  71. Google znalca
  72. Pogledajte članak
  73. PubMed / NCBI
  74. Google znalca
  75. Pogledajte članak
  76. PubMed / NCBI
  77. Google znalca
  78. Pogledajte članak
  79. PubMed / NCBI
  80. Google znalca
  81. Pogledajte članak
  82. PubMed / NCBI
  83. Google znalca
  84. Pogledajte članak
  85. PubMed / NCBI
  86. Google znalca
  87. Pogledajte članak
  88. PubMed / NCBI
  89. Google znalca
  90. Pogledajte članak
  91. PubMed / NCBI
  92. Google znalca
  93. Pogledajte članak
  94. PubMed / NCBI
  95. Google znalca
  96. Pogledajte članak
  97. PubMed / NCBI
  98. Google znalca
  99. Pogledajte članak
  100. PubMed / NCBI
  101. Google znalca
  102. Pogledajte članak
  103. PubMed / NCBI
  104. Google znalca
  105. Pogledajte članak
  106. PubMed / NCBI
  107. Google znalca
  108. Pogledajte članak
  109. PubMed / NCBI
  110. Google znalca
  111. Pogledajte članak
  112. PubMed / NCBI
  113. Google znalca
  114. Pogledajte članak
  115. PubMed / NCBI
  116. Google znalca
  117. Pogledajte članak
  118. PubMed / NCBI
  119. Google znalca
  120. Pogledajte članak
  121. PubMed / NCBI
  122. Google znalca
  123. Pogledajte članak
  124. PubMed / NCBI
  125. Google znalca
  126. Pogledajte članak
  127. PubMed / NCBI
  128. Google znalca
  129. Pogledajte članak
  130. PubMed / NCBI
  131. Google znalca
  132. Pogledajte članak
  133. PubMed / NCBI
  134. Google znalca
  135. Pogledajte članak
  136. PubMed / NCBI
  137. Google znalca
  138. Pogledajte članak
  139. PubMed / NCBI
  140. Google znalca
  141. Pogledajte članak
  142. PubMed / NCBI
  143. Google znalca
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, signaliziranje dopaminskih receptora H (2004) Trantham-Davidsona. J Prijem signala prijenosa 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Moguće sudjelovanje signalnih komponenti D2 receptora nakon dopamina u patofiziologiji shizofrenije. Int J Neuropsihofarmakol 11: 197 – 205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Uloga receptora sličnih dopaminskim D2 u kokainskoj samoupravi: studije s mutantnim miševima receptora D2 i novim antagonistima D2 receptora. J Neurosci 22: 2977-2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, i sur. (2012) Valproat mijenja dopaminsku signalizaciju zajedno s indukcijom ekspresije proteina Par-4. PLoS Jedan 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Diferencijalna glikozilacija i intracelularna trgovina za duge i kratke izoforme D2 dopaminskog receptora. J Biol Chem 270: 29819-29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Čitatelj TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Specifični [3H] raclopride koji se veže na neostriatalne receptore dopamin D2: uloga disulfidnih i sulfhidrilnih skupina. Neurochem Res 17: 749 – 759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, i sur. (1994) Fosforilacija i palmitoilacija humanog D2L dopaminskog receptora u Sf9 stanicama. J Neurochem 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulacija signaliziranja dopamin D (2) receptora aktivin-vezujućim proteinom (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Agonistom inducirana endocitoza i receptorska fosforilacija posreduju u resenzibilizaciji receptora dopamina D (2). Mol Endocrinol 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 je neuronski specifična regulatorna podjedinica ciklin-ovisne kinaze 5. Priroda 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Desetljeće CDK5-a. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749 – 759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Ciklin-ovisna kinaza 5 povezuje izvanstanične znakove s aktinim citoskeletom tijekom razvoja dendritske kralježnice. Cell Adh Migr 1: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Aktivacija Cdk5 inducira hipokampalnu smrt CA1 stanica izravnim fosforiliranjem NMDA receptora. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 regulira fosforilaciju tirozina 1472 NR2B i površinsku ekspresiju NMDA receptora. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Ciklin-ovisna kinaza 5 fosforilira serin 31 tirozinske hidroksilaze i regulira njegovu stabilnost. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Fosforilacija DARPP-32-a pomoću Cdk5 modulira dopaminsku signalizaciju u neuronima. Priroda 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, i sur. (2001) Učinci kronične izloženosti kokainu regulirani su proteinom neurona Cdk5. Priroda 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Sinergijski doprinosi ciklin-ovisne kinaze 5 / p35 i Reelin / Dab1 na pozicioniranje kortikalnih neurona u mozgu miša u razvoju. Proc Natl Acad Sci SAD 98: 2764 – 2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Ciklin-ovisna kinaza 5 fosforilira N-terminalnu domenu proteina PSD-95 postsinaptičke gustoće u neuronima. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 povezuje dopaminsku signalizaciju i depresiju. Ćelija 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL je novi Cdk5 supstrat koji se veže uz LIS1 i citoplazmatski dynein. Neuron 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS i sur. (2001) Diferencijalna regulacija receptora dopamina D2 i D3 pomoću kinaza receptora vezanih za G protein i beta-uhićenja. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Diferencijalno razdvajanje A1 adenozinskih i D2 dopaminskih receptora pomoću suramina i didemetiliranog suramina (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, i sur. (2000) Vezanje kalmodulina na D2-dopaminski receptor smanjuje signalizaciju receptora zaustavljanjem prekidača aktivacije G proteina. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Popis SJ, Seeman P (1981) Rezolucija komponenti dopaminskog i serotoninskog receptora [3H] spiperona koji se vežu na područja mozga štakora. Proc Natl Acad Sci SAD 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Djelovanje čudnih PG (1998) agonista na D2 (duge) dopaminske receptore: vezivanje liganda i funkcionalni testovi. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamin zamjenjuje [3H] domperidon iz visoko afinitetnih mjesta dopaminskog D2 receptora, ali ne i [3H] raclopride ili [3H] spiperone u izotoničnom mediju: Posljedice za humanu pozitronsku emisijsku tomografiju. Synapse 49: 209 – 215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: predviđanje interakcija stanične signalizacije na razini čitavog prostora pomoću motiva kratkog slijeda. Nukleinske kiseline Res 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Model za nasumično uzorkovanje i procjenu relativne količine bjelančevina u proteomici sačmarice. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Sekvestracija dopaminskih D2 receptora ovisi o koekspresiji G-protein-vezanih receptorskih kinaza 2 ili 5. Eur J Biochem 260: 112-119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namikung Y, Sibley DR (2004) Proteinska kinaza C posreduje u fosforilaciji, desenzibilizaciji i trgovini D2 dopaminskim receptorom. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Za induciranu autofagiju u modelima Parkinsonove bolesti potrebna je fosforilacija endofilina B5 posredovana Cdk1. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 veže i fosforilira beta-katenin i regulira interakciju beta-katenin / presenilin-1. Eur J Neurosci 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Dopaminska hipoteza o pojačavajućim svojstvima kokaina. Trendovi Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, i sur. (1990) Učinci kroničnog zlouporabe kokaina na postsinaptičke dopaminske receptore. Am J Psihijatrija 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE i sur. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 receptori predviđaju impulzivnost svojstava i pojačanje kokaina. Znanost 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) PET snimanje receptora dopamina D2 tijekom kronične samouprave kokaina kod majmuna. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Perzistentne strukturne promjene u nukleusnim akumbensima i prefrontalnim neuronima korteksa proizvedene prethodnim iskustvom s amfetaminom. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Promjene u morfologiji dendrita i dendritičnih bodlji u nucleus accumbens i prefrontalnom korteksu nakon ponovljenog liječenja amfetaminom ili kokainom. Eur J Neurosci 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacija ekspresije gena i nagrade kokaina od strane CREB i DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, i sur. (2000) Spinophilin regulira formiranje i funkciju dendritskih bodlji. Proc Natl Acad Sci SAD 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modularni transport postsinaptičkih gustoća 95 klastera i povezanost sa stabilnim prekursorima kralježnice tijekom ranog razvoja kortikalnih neurona. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarizacija pokreće beta-katenin u neuronskim bodljama promičući promjene u sinaptičkoj strukturi i funkciji. Neuron 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, i sur. (2004) Promijenjena morfologija kortikalnog sinaptičkog sustava i umanjena memorijska konsolidacija u dominantno negativnim PAK transgenim miševima specifičnim za prednji mozak. Neuron 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 modulira nagrađivanje kokaina, motivaciju i razdražljivost strija. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, bogatiji E, Benković SA, Hayashi K, Kansy JW, i sur. Striatalna disregulacija Cdk2008 mijenja lokomotorni odgovor na kokain, motoričko učenje i dendritičku morfologiju. Proc Natl Acad Sci SAD 5: 105 – 18561. doi: 18566 / pnas.10.1073
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Olujna DR (1999) Stvaranje novih veza: uloga ERK / MAP kinaze signaliziranja u neuronskoj plastičnosti. Neuron 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3