A FACS azonosítja az egyedi kokain által kiváltott génszabályozást a szelektíven aktivált felnőtt striatális idegsejtekben (2011) - a striatális idegsejtek kis százaléka

J Neurosci. Szerző kézirat; kapható PMC szeptember 16, 2011 formátumban.
Végleges szerkesztett formában megjelent:
PMCID: PMC3073079
NIHMSID: NIHMS279955

 

A cikk kiadójának utolsó szerkesztett változata ingyenesen elérhető a címen J Neurosci
Lásd a PMC egyéb cikkeit idéz a közzétett cikket.

Absztrakt

Számos tanulmány a Fos idegi aktivitási markerrel jelzi, hogy a kokain a ritkán eloszló striatális idegsejteknek csak kis részét aktiválja. Eddig nem álltak rendelkezésre hatékony módszerek a kifejezetten ezekben az aktivált idegsejtekben indukált neuroadaptációk értékelésére. Fluoreszcencia-aktivált sejtválogatást (FACS) használtunk a naiv és kokain-szenzibilizált kokain által kiváltott mozgás során aktivált striatális idegsejtek tisztításához. cfos-lacZ transzgénikus patkányok. Az aktivált idegsejteket a lacZ gén fehérjeterméke, β-galaktozidáz elleni antitesttel jelöltük. CAz ocaine egyedülálló gén expressziós profilt indukált szelektíven az aktivált idegsejtek kis részében, amelyet nem figyeltünk meg a neuronok nem aktivált többségében. Ezek a gének tartalmazták a közvetlen korai gének megváltozott szintjét ív, fosBés nr4a3, valamint a p38 MAPK jelátvitelben és a sejttípus-specifitásban részt vevő gének. Javasoljuk, hogy ez a FACS módszer felhasználható legyen a molekuláris neuroadaptációk tanulmányozására specifikus neuronokban, amelyek a visszaélésszerű gyógyszerek viselkedési hatásait és más tanult viselkedéseket kódolják.

Kulcsszavak: kokain-szenzibilizáció, atommagok, neuronális együttesek, fluoreszcenciával aktivált sejtek szortírozása

BEVEZETÉS

A kokain-függőséggel kapcsolatos jelenlegi neurobiológiai kutatások egyik fő hipotézise az, hogy a krónikus kokain-expozíció hosszú távú neuroadapciót okoz a striatumban és a mezolimbikus dopamin jutalmazási kör más alkotóelemeiben, ami kényszeres gyógyszerhasználathoz és hosszú távú visszaesés-kiszolgáltatottsághoz vezet (Nestler, 2001; Shaham és Hope, 2005; Kalivas, 2009; Bowers és munkatársai, 2010; Wolf és Ferrario, 2010). Ez a hipotézis azonban számos tanulmányon alapszik, amelyek a neuroadaptációk mérésére korlátozódnak az agyi régiók homogenizátumában vagy az idegsejtekben, függetlenül attól, hogy a viselkedés során aktiválódnak-e.

Fontos a különbség az aktivált és nem aktivált idegsejtekben a neuroadapciók között, mivel ezek eltérő szerepet játszhatnak a kokain fiziológiai, viselkedési és pszichológiai hatásaiban. Számos tanulmány a Fos idegi aktivitási markerrel jelzi, hogy a kokain a striatumban csak a ritkán eloszló idegsejteknek csak kis részét aktiválja. A kontextusspecifikus lokomotoros szenzibilizációt követően kimutattuk, hogy a Fos csak akkor indukálódik, amikor patkányokat injektáltak a gyógyszer-páros környezetben, és nem párosított környezetben (Mattson és munkatársai, 2008; Koya et al., 2009). A legfontosabb, hogy bebizonyítottuk, hogy ezek a szelektíven aktivált neuronok ok-okozati szerepet játszanak a kokain és a kábítószer-párosított környezet közötti megtanult összefüggésben, amely mediálja a kontextus-specifikus szenzibilizációt (Koya et al., 2009). Így a szelektíven aktivált striatális idegsejtekben a neuroadaptok egyedülálló és fontos szerepet játszhatnak a tanulásban a kontextusspecifikus szenzibilizáció és más gyógyszer-indukált viselkedés során.

A műszaki korlátok eddig megnehezítették a viselkedés során szelektíven aktivált ritkán eloszló idegsejtek kis számán belüli molekuláris változások felbecsülését. Olyan technikák, mint a lézerfogó mikrodisszisztencia (Kwon és Houpt, 2010) és kettős címkével ellátott immunhisztokémia (Berretta és munkatársai, 1992; Gerfen és munkatársai, 1995; Peters és munkatársai, 1996) képesek az aktivált neuronokban szelektíven azonosítani a molekuláris változásokat, de ezeknek a technikáknak nagyon alacsony a teljesítménye vagy nem kvantitatív. A fluoreszcencia-aktivált sejtek szortírozása (FACS) hatékony eszköz lehet felnőtt idegsejtpopulációk tisztítására molekuláris elemzés céljából (Liberles és Buck, 2006; Lobo és munkatársai, 2006). A FACS-t azonban nem használták az idegsejtek aktiválási állapotuk alapján történő tisztításához. A jelen tanulmányban a FACS-t használtuk a kokain által aktivált striatális idegsejtek transzgenikus tisztításához. cfos-lacZ patkányokat, és összehasonlította azok egyedi gén expressziós mintázatait a neuronok nem aktivált többségének mintáival.

MÓD

Állatok

nő cfos-lacZ transzgénikus patkányok (Kasof és munkatársai, 1995; Koya et al., 2009) és a nőstény Sprague-Dawley patkányokat (Charles River, Raleigh, NC, USA) egyedileg helyeztük el standard műanyag ketrecekbe egy hőmérséklet- és páratartalom által szabályozott helyiségben. Ezeket 12: 12 h hátsó lámpánál tartották: sötét cikluson (a fények bekapcsoltak 20.00 órakor), és szabad hozzáférést biztosítottak az ételhez és a vízhez. A gyógyszeres kezelés előtt legalább 7 napon keresztül hozzáigazultak ezekhez a tartási körülményekhez. A kísérleti eljárásokat a NIDA Animal Care and Use Committee hagyta jóvá.

Gyógykezelések

Az akut kokainkísérletekhez a patkányokhoz kokaint (30 mg / kg, ip; n = 8) vagy fiziológiás sóoldattal (1 ml / kg; n = 6) injektáltunk, és egy kerek plexiüveg kamrába helyeztük (38 cm átmérő). A patkányokat az injekciózás után 90 perccel feláldozták az agyszövet előállítása céljából. Ezt a kezelést háromszor megismételjük külön napokon, hogy három biológiai replikátumot kapjunk a mikrotáblák elemzéséhez. Ezenkívül három független biológiai replikátumot állítottak elő hasonlóan a kvantitatív PCR-hez (qPCR). QPCR elemzéséhez ív, pdyn, adora2a, csak ezt a három független biológiai replikátumot használtuk. QPCR elemzéséhez fosB, nr4a3, kcnc1 és map2k6, mindegyik mikroarray mintából megmaradt RNS-t is felhasználtunk.

Az ismételt kokainkísérletekhez a nőstény patkányokat négy napi kokainjekcióval (15 mg / kg ip.) Szenzitizálták, naponta egyszer. Injekciós napokon az egyes patkányokat 43 × 43 cm négyzet alakú Plexiglas mozgásszervi kamrába (Med Associates, St Albans, VT, USA) helyeztük, hogy 30 percig alkalmazkodhassunk. A patkányoknak kokaint injektáltunk, és a mozgásszervi aktivitást 60 perc alatt megtett távolságként rögzítettük. A negyedik ismételt kokain injekciót követően a patkányok otthoni ketrecükben maradtak 7 – 8 napokon keresztül. A teszt napján a patkányokat szokásos módon 30 percre állítottuk be a mozgásszervi aktivitás kamrákban, majd kokaint (30 mg / kg ip) vagy sóoldattal hordozóval injektáltunk. A patkányokat elpusztítottuk, és az agyat kilencven perccel az injekciózás után extraháltuk. A teljes szenzibilizációs kezelést háromszor megismételjük külön héten keresztül, hogy az egyes csoportokból három biológiai replikátumot kapjunk a qPCR elemzéshez.

Sejt disszociáció

A striatalis szövetet disszociáltuk, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk. A patkányokat lebontottuk, és a striatákat két percen belül kivontuk. Mindegyik striatumot borotvapengékkel jéghideg üveglapra darálták és 1 ml Hibernate A -ba (Cat # HALF; Brain Bits, Springfield, IL) helyezték. A sztriatákat enzimatikusan emésztettük 1 ml Accutase per striatumban (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) az 30 perc keverésével, 4 ° C hőmérsékleten, az egész végére keverve. A szövetet két percig centrifugáltuk 425 x g-vel, majd újraszuszpendáltuk 300 μl jéghideg hibernátában A. Az ezt követő centrifugálási lépéseket 4 ° C hőmérsékleten hajtottuk végre.

Az emésztett striatális szövetet eldörzsöléssel mechanikusan szétválasztottuk. Négy csíkot egyesítettünk egy Eppendorf csőbe, és tízszer trituráltuk nagy átmérőjű Pasteur-pipettával (~ 1.3mm). A csöveket röviden jégre helyeztük, hogy a nagy szövetdarabok leülepedjenek; A disszociált sejteket tartalmazó 600 μl zavaros szuszpenziót 15 ml Falcon csőbe helyeztük jégen. 600μL friss hibernátum A-t adtunk az eredeti Eppendorf-csőhöz, majd a triturálási lépéseket a fentiek szerint megismételtük közepes és kis átmérőjű csövekkel (~ 0.8mm és ~ 0.4mm). Mindegyik disszociált sejteket tartalmazó zavaros szuszpenziót az előző szuszpenzióval egyesítjük.

Az egyesített sejtszuszpenzióban maradt sejtfürtöket előre nedvesített 100 μm és 40 μm sejtszűrőkön (Falcon márka, BD Biosciences, San Jose, CA) szűréssel szűréssel eltávolítottuk. A szuszpenzióban lévő kicsi sejtes törmeléket a szűrlet 3 percenkénti centrifugálásával 430 x g centrifugálással csökkentettük, a Percoll háromlépcsős sűrűség-gradiensén keresztül (Cat # P1644; Sigma, St. Louis, MO). A törmeléket tartalmazó homályos felső réteget (körülbelül 2 ml) eldobták. A fennmaradó rétegekben lévő sejteket a fennmaradó Percoll-oldatban újraszuszpendáltuk és öt percig centrifugáltuk 550xg-en. A pelletet 1 ml Hibernát A-ban szuszpendáltuk.

Immuncímkézés és FACS

A leválasztott sejteket fixáltuk és permeabilizáltuk azonos térfogatú etanol hozzáadásával az 50% etanol végkoncentrációjához, és 15 percig jegen tartottuk, alkalmi keveréssel. A sejteket két percig centrifugáltuk 425xg nyomáson, és újraszuszpendáltuk RNáz-mentes foszfátpufferolt sóoldatban (PBS). A sejteket biotinilezett primer antitesttel inkubáltuk a NeuN ellen (1: 1000 hígítás, Cat # MAB377B, Chemicon) és a β-galaktozidáz elleni primer antitesttel ((β-gal; 1: 10000 hígítás, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Biogenesis, Biogenesis, Biogenezis) A sejteket az elsődleges antitestekben 30 percig 4 ° C-on forgatjuk, és három percig centrifugáljuk 425xg-nél. A sejteket 800 μl PBS-sel mossuk, majd 700 μl PBS-ben szuszpendáljuk. A sejteket inkubáltuk. fluoreszcensen jelölt streptavidinnel (Streptavidin-fikoeritrin, 1: 1000 hígítás, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) és szekunder antitestekkel (Alexa Fluor 488-jelölt anti-kecske IgG, 1: 1000: 11055: 15: 800) 425, Invitrogen) és a végét forgatva 1 percig. A sejteket XNUMX μl PBS-sel mossuk, három percig centrifugáljuk XNUMXx g-n, és újraszuszpendáljuk XNUMX ml PBS-ben.

Az immunrendszerrel jelölt sejteket a Johns Hopkins Bayview Campus áramlási citometriás mag létesítményében szkenneljük és válogatjuk. A FACS Aria-t (BD, Franklin Lakes, NJ) használtuk a sejtek szortírozására. A kontrollmintákat először elemezték, hogy meghatározzák az optimális kritériumokat a tesztminták válogatására. Pontosabban, antitest kezelés nélküli fixált sejteket alkalmaztunk a fényszórási kapu beállításához. A fluoreszcens másodlagos ellenanyaggal kezelt fix sejteket, de nem primer ellenanyagokat, ezután használtuk az endogén szövet fluoreszcencia és a sztreptavidin vagy szekunder antitest nem-specifikus kötődésének küszöbértékeinek meghatározására. Ezután az egyes fehérjék (NeuN vagy β-gal) primer és szekunder antitesttel egycímkézett kontrollmintáit használtuk a szomszédos csatornák fluoreszcens átfedésének kompenzálására. Végül mindkét fluoreszcens markerrel jelölt tesztmintákat elemezték és osztályozták. A válogatott sejteket alacsony kötődésű csövekbe (Cat # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) gyűjtöttük mindegyik csőben 100 μl PBS-sel.

RNS extrakció

A szortírozás után a mintákat, amelyek βgal-pozitív vagy β-negatív sejteket tartalmaztak kokain-injekcióval beadott patkányokból, vagy az összes NeuN-pozitív sejtet a sóoldat-injekcióval beadott patkányokból, 8 percig centrifugáltuk 2650 × g-nél 18 ° C-on. Sós oldattal injektált patkányok neuN-negatív sejtjeit 8 percig centrifugáltuk 6000 ×g 18 ° C-on. A mikrotáblás kísérletekhez az RNS-t extraháltuk Trizol reagenssel (Cat # 15596-026, Invitrogen) a gyártó utasításai szerint. Az RNS minőségét és mennyiségét a Bioanalyzer Picochip (Cat # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) felhasználásával értékeltük. A qPCR kísérletekhez az RNS-t RNEasy Micro készlettel (Cat # 74004; Qiagen, Valencia, CA) extraháltuk, a gyártó utasításai szerint, DNase kezeléssel. Az RNS mennyiségét és tisztaságát Nanodrop spektrofotométerrel (Thermo Scientific, Wilmington, DE) határoztuk meg.

Microarray kísérletek

A mikrorétegeket a fiziológiás sóoldatba injektált patkányok NeuN-pozitív és NeuN-negatív sejtjeinek, valamint a kokainnal injektált patkányok βgal-pozitív és βgal-negatív idegsejtjeinek RNS-ének elemzésére használták. Ahogyan azt a gyógyszerkezelési szakaszban fentebb leírtuk, a mikrotáblák három biológiai replikátumot tartalmaztak mind a négy mintatípushoz. Az egyes mintákból öt μl teljes RNS-t jelöltünk az Illumina TotalPrep RNS amplifikációs készlettel (Cat # IL1791; Ambion, Austin, TX) a cDNS szintézis kétlépéses folyamatában, majd in vitro RNS transzkripció biotin-16-UTP-vel. 0.75 μg biotinnal jelölt cRNS-t hibridizáltunk 16 órákon keresztül az Illumina Sentrix patkány Ref12_v1 BeadChips-hez (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). A chiphez hibridizált biotinilezett cRNS-t Cy3-jelölt streptavidinnel detektáltuk, és az Illumina BeadStation 500GX genetikai elemző rendszerek szkennerével számszerűsítettük. Az összes címkézést és elemzést a Johns Hopkins Bayview Medical Campus Lowe Family Genomics Központjában végezték.

Valós idejű kvantitatív PCR

Valós idejű kvantitatív PCR-t használtunk a FACS és a mikroarray eredmények validálására. Az RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-ként a RETROscript kit (Cat # AM1710, Ambion) segítségével oligo (dT) primerrel használtuk. Minden 25 μl PCR reakció tartalmazott 12.5 μl Taqman Gene Expression Master Mix-et (Cat #4369514; Applied Biosystems, Foster City, CA), 1.1 μl mindegyik 20 μM előre- és fordított primert, 0.25 μl 100 μM FAM-jelölt próbát, μl víz és 5 μl 5 ng / μl cDNS. Alapozó és szonda kombinációkTáblázat 1] a Roche Universal Probe Library Assay Design Center alkalmazásával készültek, hogy behatolásukra szolgáljanak. A PCR reakciókat az Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD) alkalmazásával figyeltük. A program azzal indult, hogy az 20 lemezt leolvastuk 50 ° C-on a fényfehérítéshez, majd 5 min 95 ° C-on, majd 40 ciklus 20 mp-t 94 ° C-on, 1 min 60 ° C-on, és a lemezt leolvastuk.

Táblázat 1 

A qPCR-hez használt alapozók és szondák

Az amplifikáció hatékonyságának meghatározása céljából először minden génhez standard görbereakciókat hajtottunk végre [Táblázat 1]. Az amplifikált gének expressziós szintjét kiszámítottuk ^ ΔC hatékonysággalq ahol ΔCq = Cq(kísérleti gén) - Cq(referenciagén) minden biológiai replikátumhoz. Gorasp2 Azért választottuk referenciagénnek, mert a neuronok és a glia között nem volt eltérő expresszió a mikroarray analízis során. Ezenkívül referenciagénként validáltuk az azonos mintájú sablon betöltésekor az összes minta egyenlő qPCR amplifikációja miatt. C műszaki vizsgálat három példányaq Az ΔC kiszámítása előtt átlagoltuk az értékeketq a mintában szereplő minden génre. A qPCR-ben mért minden mRNS-re a génexpressziós értékeket átlagoltuk a biológiai replikációk között. Ezután, hogy tükrözzük a hajtás-változási értékeket, ezt az átlagot felosztottuk a sóoldattal injektált patkányok NeuN-pozitív sejtjeinek átlagos génexpressziós értékeivel. Ezeket az értékeket átlag és standard hibákként tüntettük fel a grafikonokban és táblázatokban.

Immunohisztokémia

Az agyszövet vad típusú nőstény Spraque-Dawley patkányokból nyertük ugyanazt az akut és ismételt kokainkezelést, amelyet a fentiekben a mikroarray- és qPCR-kísérletekben leírtunk. Azonban 90 perccel a tesztnapi injekciók után a patkányokat mélyen érzéstelenítettük izofluránnal, és perfuzáltuk 100 ml PBS-sel, majd 400 ml 4% paraformaldehiddel (PFA). Az agyokat utólag rögzítettük PFA-ban 2 órákra, majd 30% szacharóz oldatba vittük át 4 ° C-on 2 – 3 napon át. Az agyokat porított szárazjégen fagyasztottuk és –80 ° C-on tartottuk a szétválasztásig. A koronális metszeteket 40 μm vastagra vágtuk a Bregma 2.5 és −0.5 között (Paxinos és Watson, 1998).

A metszeteket Fos és Arc immunjelzéssel jelöltük. Röviden, a metszeteket háromszor mossuk Tris-pufferolt sóoldatban (TBS), és 30 percig permeabilizáljuk TBS-ben 0.2% Triton X-100-dal. A metszeteket ismét mostuk TBS-ben és inkubáltuk primer antitestekben, amelyeket PBS-sel hígítottuk 0.3% Triton X-100-rel 24 órán át rázógépen, 4 ° C-on. Nyulakat poliklonálisan használtunk c-Fos ellenanyagok ellen (1: 500 hígítás, Cat # sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia) és egér monoklonális ív antitesteket (1: 100 hígítás, Cat # sc-17839, Santa) Cruz Biotechnológia). A metszeteket háromszor mostuk TBS-ben, és PBS-ben hígított szekunder antitestekben inkubáltuk 1.5 órán át rázógépen szobahőmérsékleten. Alexa Fluor 488-sel jelölt szamár anti-nyúl antitestet használtunk (1: 200 hígítás, Cat # A21206, Invitrogen) és Alexa Fluor 568-lel jelölt kecske anti-egér antitest (1: 200 hígítás, Cat. Szám A11004, Invitrogen). A metszeteket TBS-ben mossuk, krómmalummal bevont tárgylemezekre szereljük, és VectaShield keményen rögzített szerelőközeggel fedjük le.

A Fos és az Arc immunreaktivitás fluoreszcens képeit caudate-putamenben és NAc-ben (körülbelül 2.0 mm-rel a Bregma előtt) egy CCD kamerával (Coolsnap Photometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) rögzítettük egy Zeiss Axioskop 2 mikroszkóphoz. A jelölt sejtek számlálására szolgáló képeket 200x nagyítással készítettük; a Fos és az Arc colocalization meghatározására szolgáló képeket az 400x nagyításnál készítettük. Patkányonként négy féltekén címkézett sejteket automatikusan megszámlálunk a Macintosh IPLab szoftverével, az 3.9.4 r5 verzióval (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). A négy félgömb számát átlagoltuk, hogy minden patkányhoz egyetlen értéket kapjunk.

Az adatok elemzése

A mozgásszenzibilizációs adatokat egyirányú ANOVA alkalmazásával elemeztük, ismételve az idő fő hatását 4 injekciós napon keresztül. A statisztikai szignifikanciát p <0.05 értékre állítottuk be. A mikroszkóp adatait a DIANE 6.0 alkalmazásával elemeztük, egy táblázatkezelő alapú mikroarray elemző programmal, amely a SAS JMP 7.0-n alapult, a korábban leírtak szerint (Garg és munkatársai, 2009). A mikroarray-k fluoreszcencia-intenzitásának adatait detektálással szűrtük p-értékek és Z normalizálás. A minta minőségét scatterlot-okkal, a fő komponensek elemzésével és a génmintával elemeztük Z- pontszám alapú hierarchikus klaszterezés a lehetséges kiugró értékek kizárása érdekében. Ezután ANOVA teszteket alkalmaztak az egyes összehasonlító csoportokon belül nagyobb eltérésekkel rendelkező gének kiküszöbölésére. A géneket differenciálisan expresszáltuk, ha p <0.01, abszolút érték Z-arány ≥ 1.5, és hamis felfedezési arány (fdr) <0.07. A qPCR adatokhoz egyirányú ANOVA-t használtunk az egyes gének adatainak összehasonlításához. A statisztikai szignifikanciát p <0.05 értékre állítottuk be. A Fos és Arc immunhisztokémia esetében t-tesztet alkalmaztunk, amely egyenlőtlen varianciát feltételezett, a statisztikai szignifikancia kiszámításához, p <0.05 értékre állítva.

EREDMÉNYEK

cfos-lacZ transzgenikus patkányok

A cfos-lacZ ezekben a patkányokban a transzgént a c-fos az endogénnél hasonló promoter c-fos gén, és így hasonló módon az idegsejtekben aktiválódik a magas szintű ingerlő szinaptikus bemenet (Shin és munkatársai, 1990; Labiner és munkatársai, 1993; Sgambato és munkatársai, 1997). A fehérjetermék cfos-lacZ A transzgént, a β-galaktozidázt (βgal), c-Fos-nal együtt expresszálják erősen aktivált neuronokban (Koya et al., 2009) és az aktivált striatális idegsejtek jelölésére használják a következő FACS tisztítási eljárás során.

Az aktivált striatális neuronok FACS tisztítása egyszeri akut kokain injekciók után

Az egész striatát a következőktől nyerték: cfos-lacZ patkányok 90 perccel az 30 mg / kg kokain vagy sóoldat akut injekcióját követően otthoni ketrecükön kívül. A hasonló módon kezelt patkányokból disszociált striatális sejteket egyesítjük a FACS tisztítás előtt az egyes biológiai replikátumokhoz a következő mikrotípusos és kvantitatív PCR (qPCR) elemzések során. A szétválasztott striatális sejteket kezdetben elemezték előre és oldalsó fényszóródási jellemzőik alapján [1a]. A NeuN-jelöléssel ellátott idegsejtek többségét a cselekmény alsó része mentén lévő eseménysávon találták meg. Így az összes későbbi elemzést csak az ezen a szalagon talált események bevonásával továbbítottuk.

ábra 1 

Egyetlen kokain injekcióval kezelt patkányok βgal-jelölt neuronjainak fluoreszcencia-aktivált sejtválogatása

Az ebben a kapun belüli sejteket elválasztottuk az immunjelölés fokának függvényében a NeuN neuronális markerrel és a βgal idegi aktivációs markerrel. A kokainnal injektált patkányokból nyert szövetekben a NeuN-jelölt neuronok körülbelül 15% -ában volt magas βgalszint [1b], amely patkányonként körülbelül 100,000 βgal-jelölt neuronoknak felel meg. Az összes βgal-jelölt sejt együtt expresszálta a NeuN-et, jelezve, hogy csak a neuronok expresszálták a βgal-t. Ezzel szemben nagyon kevés NeuN-jelölt neuron, amelyet sóoldattal injektált patkányokból nyertek, expresszálta a βgal vagy Fos aktivációs markereket, amelyek a βgal és Fos immunreaktivitást támasztják alá, mint a neurális aktiválás markerei a kokainnal injektált patkányokban. A sóoldattal injektált patkányok alacsony βgal-expresszáló idegsejtjei nem szolgáltattak elegendő sejtet a későbbi molekuláris elemzésekhez. Így kizárólag a NeuN-jelölést használtuk az idegsejtek és a nem-neuronális sejtek elválasztására az összes későbbi, sóoldatban injektált patkányokból származó striatális szövettel végzett kísérlet során. Összességében az összes striatális sejttest körülbelül 30% -a volt NeuN-pozitív, ami patkányonként körülbelül 600,000 striatális neuronoknak felel meg. Amikor a FACS-tisztított sejteket fluoreszcencia mikroszkóppal vizsgáltuk, az összes sejt kerek volt, és nem volt folyamatban [ábra 2]. A mikroszkópos megfigyelés megerősítette, hogy a FACS-válogatott sejteket megfelelően jelölték a NeuN- és a βgal-immunreaktivitás szempontjából. Megállapítottuk, hogy a FACS-tisztított sejtek mintái> 90% -os tisztaságúak, ha egy második áramlási citometriás fordulóval értékeljük (az adatokat nem mutatjuk be).

ábra 2 

Mikroszkópfotók a FACS-tisztított sejtekről és törmelékről

Meghatároztuk a FACS tisztítási eljárás szelektivitását mikrotáblával, hogy elemezzük a FACS-tisztított sejtek génexpressziós mintáit. Össze hasonlítottuk a kokain-injekcióval kezelt patkányok βgal-pozitív és βgal-negatív idegsejtjeinek génexpresszióját, valamint a sóoldattal injektált patkányok NeuN-pozitív és NeuN-negatív sejtjeit. A főkomponens- és klaszteranalízis azt mutatta, hogy az elsődleges megkülönböztető tényező az volt, hogy a sejtek neuronok vagy glia volt-e [3a]. A második megkülönböztető tényező az βgal expresszió volt, amelyet az aktivált és az aktiválatlan idegsejtek elválasztására használtak. A géneket differenciálisan expresszáltuk, ha p <0.01, abszolút érték Z-arány ≥ 1.5, és hamis felfedezési arány (fdr) <0.07. Megállapítottuk, hogy a βgal-pozitív idegsejtekben 125 gén növekedett és 467 gén csökkent, összehasonlítva a kokain-injektált patkányok ugyanazon sztriatális szövetéből nyert βgal-negatív idegsejtekkel [3b]. Amikor kokainnal injektált patkányokból származó ugyanazokat a βgal-pozitív idegsejteket összehasonlítottuk sóoldattal injektált patkányok összes NeuN-jelölt neuronjának kontrollmintáival, a βgal-pozitív idegsejtekben 133 gén növekedett és 890 gén csökkent. Nevezetesen a két kontrollcsoport - kokain-injektált patkányok βgal-negatív neuronjai és sóoldattal injektált patkányok összes NeuN-jelölt neuronja - nagyon hasonló génexpressziós mintákat produkáltak; a génexpresszió nem különbözött szignifikánsan e kontrollcsoportok között [3b].

ábra 3 

Patkány striatákból válogatott sejtek mikroarray analízise egy kokain vagy sóoldat egyszeri beadása után

A különböző mintacsoportokban található specifikus gének megerősítették az aktivált és nem aktivált neuronok, valamint az idegsejtek és a nem neuronális sejtek elválasztását FACS segítségével [Táblázat 2]. Kokainnal injektált patkányok βgal-pozitív idegsejtjei több neurális aktivációs marker gént expresszáltak magasabb szinten, mint ugyanazon kokain-injekcióval beadott patkányok βgal-negatív neuronjaihoz képest, vagy fiziológiásán sós injekcióval injektált patkányok összes NeuN-jelölt neuronjához [3c]. Ezek az aktivitásjelző gének tartalmazzák c-fos, JunB, ív, EGR család (1, 2, 4) és nr4a3 (Guzowski és munkatársai, 2005). Érdekes, hogy ezek a βgal-pozitív neuronok a D1 dopamin receptor sejt-típusú specifikus marker prodynorphin gén szintjét is szignifikánsan magasabban fejezték ki, és a D2 dopamin receptor gén szignifikánsan alacsonyabb szintjét fejezték ki.

Táblázat 2 

Az akut kokain-kísérlet mikrotáblájának és qPCR-adatainak összefoglalása.

A mikroarray génexpressziós adatokat qPCR alkalmazásával validáltuk. Az aktivitásjelző gének fosB, ívés nr4a3 magasabb szinten fejeződtek ki kokain injekcióval beadott patkányok βgal-pozitív idegsejtjeiben, mind ugyanazon kokain injektált patkányok βgal negatív idegsejtjeiben, mind pedig sóoldatban injektált patkányok összes idegében kifejezve [4a; adatok és statisztikai információk Táblázat 2]. A βgal-pozitív neuronok szintén a prodynorphin gén magasabb szintjét fejezték ki [4b]. Míg a βgal-pozitív neuronok nyilvánvalóan alacsonyabb expressziós szintet mutattak több gén esetében, beleértve az A2A adenozin-receptort, a Kv3.1 káliumcsatornát és a map2k6 / MEKK6 géneket, csak a Kv3.1 és a map2k6 / MEKK6 expressziós szintek voltak statisztikailag eltérőek4c]. Összességében a qPCR-rel kiértékelt gén expressziós változások majdnem azonosak voltak a mikrotípusos kísérletekkel becsült gén expressziós változásokkal.

ábra 4 

A kvantitatív PCR eltérő génexpressziós profilt mutat a βgal-pozitív neuronok számára akut kokainjekciók után, összehasonlítva ugyanazon patkányok βgal-negatív idegsejteivel, vagy a sóoldattal injektált patkányok összes neuronjával

Annak meghatározására, hogy az aktivált idegsejtek mRNS-változásai tükröződnek-e a fehérje szintjén, kokain- és sóoldat-injekcióval beadott vad típusú nőstény patkányok koronális agyszakaszának immunhisztokémiai elemzésével [ábra 5]. Ezekben a metszetekben nem ment keresztül disszociáció vagy FACS, ezért az immunhisztokémiai elemzést nem befolyásolta a FACS eljárás során észlelt sejt disszociáció. Kokainnal injektált patkányok ventrális striatumában [5a], a Fos és az Arc idegi aktivitási markereket ugyanazon sejtekben expresszálták együtt: az összes Fos-pozitív sejt 85 ± 4% -a volt Arc-pozitív, míg az 82 ± 3% az összes Arc-pozitív sejt Fos-pozitív. A kokain injekciók 2.7-szeres növekedést okoztak a Fos-jelölt neuronokban és 2.7-szeres növekedést az Arc-jelölt neuronokban. Kokainnal injektált patkányok háti striatumában [5b], Az összes Fos-pozitív sejt 80 ± 2% -a volt Arc-pozitív, míg az 86 ± 3% az összes Arc-pozitív sejt Fos-pozitív volt. A kokain injekciók 4.4-szeres növekedést okoztak a Fos-jelölt neuronokban és 3.8-szeres növekedést az Arc-jelölt neuronokban.

ábra 5 

A Fos és az Arc együttesen expresszálódik a) ventrális striatumban és (b) dorsalis striatumban kokain egyetlen injekciója után

A kokain-szenzibilizált patkányok aktivált striatális idegsejtjeinek FACS tisztítása

A második FACS kísérletben az összes patkányt szenzibilizálták ismételt kokain injekciókkal. Az ismételt kokain adagolás a mozgásszervi dobozban fokozta a kokain által kiváltott mozgást: a 7 napon a 180 ± 18% -ának mozgása 1% volt (az 4 ismételt injekciókhoz kapcsolódó idő fő hatása, F)3, 363 = 24.9, p <0.001), ami szignifikáns pszichomotoros szenzibilizációt jelzett. Hét nappal később, a teszt napján, kokaint vagy sóoldatot adtak patkányoknak ugyanabban a mozgásszekrényben. Kilencven perccel később a sztriatális szövetet, beleértve az NAc-t is, kivontuk, és a sejteket FACS-tisztítottuk a fent leírt eljárással.

A sejteket ugyanolyan, könnyű, szétszórtan rendezett eseménycsíkban, mint az előző kísérletben elválasztottuk, a neuron jelölőképességük és a NeuN neuronális marker és a βgal idegi aktivációs marker jelzésének mértéke alapján. A kokainnal injektált patkányokból nyert szövetekben a NeuN-jelölt neuronok körülbelül 10% -ában volt magas βgalszint [ábra 6], amely patkányonként körülbelül 60,000 βgal-jelölt neuronoknak felel meg. Az összes βgal-jelölt sejt együtt expresszálta a NeuN-et, jelezve, hogy csak a neuronok expresszálták a βgal-t. Ismét a vizsgálati napon sóoldattal injektált patkányokból nyert szövet nagyon kevés βgal- vagy Fos-expresszáló neuront hozott létre, és így nem volt elegendő sejt a későbbi molekuláris elemzésekhez. Ezért csak a NeuN-jelölést használtuk az idegsejtek és a nem-neuronális sejtek elválasztására, amelyeket sóoldattal injektált patkányokból nyertünk. A sóoldattal injektált patkányokban az összes sejttest körülbelül 30% -a volt NeuN-pozitív, amely ebben a kísérletben patkányonként körülbelül 400,000 striatális idegsejteknek felel meg.

ábra 6 

A szenzibilizált patkányok βgal-jelölt neuronok fluoreszcencia-aktivált sejtválogatása kokainnal fertőzött 7 nappal az ismételt kokainkezelés után

QPCR-t használtunk a kokainszenzitású patkányok βgal-pozitív és βgal-negatív neuronjainak, valamint a kokain-szenzibilizációt követően a sóoldattal injektált patkányok összes NeuN-pozitív neuronjának összehasonlítására. Kokain-injektált patkányok βgal-pozitív neuronjai három idegi aktivitás marker gén magasabb szintjét fejezték ki - fosB, ívés nr4a3–Azonos kokain-injektált patkányok βgal-negatív idegsejtjeihez és sóoldattal injektált patkányok összes neuronjához [7a; adatok és statisztikai információk Táblázat 3]. A βgal-pozitív idegsejtek szintén a prodynorphin gén magasabb szintjét fejezték ki, hasonlóan az egyetlen kokain injekciós kísérlethez [7b]. Ezzel szemben a βgal-pozitív neuronok alacsonyabb expressziós szintet mutattak több gén esetében [7c], beleértve Drd2 - a D2 dopamin receptort kódolja, és - Térkép2k6 a p38 MAPK-t aktiváló kinázt kódolja, hasonlóan az egyetlen akut kokain injekciós kísérlethez. Végül, a βgal-pozitív idegsejtek fokozottan expresszáltak dusp1, más néven mkp1 [7c], amely a foszfatázt kódolja, amely inaktiválja a p38 MAPK-t (Sgambato és munkatársai, 1998).

ábra 7 

A kvantitatív PCR eltérő génexpressziós profilt mutat a szenzitizált kokainval fertőzött patkányok βgal-pozitív idegsejtjeiben, összehasonlítva ugyanazon patkányok βgal-negatív idegsejteivel vagy sóoldatot fertőzött patkányok összes neuronjával.
Táblázat 3 

Az ismételt kokain-kísérlet qPCR adatainak összefoglalása.

Annak meghatározására, hogy az aktivált idegsejtek mRNS-változásai tükröződnek-e a fehérje szintjén, a vad típusú kokain-szenzibilizált nőstény patkányok koronális agyszekcióinak immunhisztokémiai elemzését használtuk a teszt napján végzett kokain- vagy sóoldat-injekciókat követően. A kokainnal injektált patkányok ventrális striatumában a Fos és Arc idegi aktivitási markereket ugyanazokban a sejtekben expresszálták: 90 ± 2% az összes Fos-pozitív sejtből Arc-pozitív, és 83 ± 2% az összes Arc-pozitívból a sejtek Fos-pozitívak voltak. A kokain tesztinjekciók 2.3-szeres növekedést mutattak a Fos-jelölt neuronok és 2.2-szeres növekedést az Arc-jelölt neuronoknál. A kokainnal injektált patkányok dorsalis striatumában az összes Fos-pozitív sejt 93 ± 2% -a volt Arc-pozitív, az 90 ± 3% az összes Arc-pozitív sejt Fos-pozitív. A kokain tesztinjekciók 4.4-szeres növekedést mutattak a Fos-jelölt neuronok és 4.5-szeres növekedést az Arc-jelölt neuronoknál. Így nagyon kevés nem Fos-jelölt sejt expresszált ívet, és nagyon kevés nem-Arc-jelölt sejt expresszált Fos-t, ami alátámasztja a válogatott sejtekből származó megállapításainkat.

VITA

Kidolgoztunk egy eljárást az idegsejtek molekuláris változásainak tisztítására és értékelésére, amelyeket csak a korábbi aktiválási állapotuk határoz meg a kokain által kiváltott mozgásszervi aktivitás során. A mikrotípus, a qPCR és az immunhisztokémiai kísérletekből származó adatok függetlenül megerősítették, hogy a FACS eljárásunk az aktivált idegsejtekben egyedi molekuláris változásokat azonosított, amelyeket a c-fos a βgal expresszió promoter indukciója. Ennek az eljárásnak a fő biológiai megállapítása az volt, hogy az azonnali korai géneket (IEG) csak aktivált neuronokban indukálják, míg az IEG expresszió változatlan, vagy akár csökkent az idegsejtek nem aktivált többségében. Mivel ezeknek az IEG idegi aktivitási markereknek szintén transzkripciós tényezői vannak, valószínű, hogy ezekben az aktivált idegsejtekben ezután nagyon különböző gén expressziós mintákat indukálnak, amelyek hozzájárulhatnak a kokain élettani és viselkedési hatásaihoz (lásd például (Curran és Franza, 1988; Nestler és munkatársai, 1993; McClung és munkatársai, 2004; Loebrich és Nedivi, 2009).

Az aktivált és nem aktivált neuronok közötti differenciális IEG indukció alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a kokain által kiváltott mozgás során csak az idegsejtek kisebb része aktiválódik erősen, míg az idegsejtek többsége jóval kisebb mértékben vagy egyáltalán nem aktiválódik. Elektrofiziológiai kísérletek vad típusú patkányokon azt mutatják, hogy a Fos fehérje expressziója korrelál az izgató szinaptikus bevitel magas szintjével (Shin és munkatársai, 1990; Labiner és munkatársai, 1993; Sgambato és munkatársai, 1997). Tudjuk, hogy a Fos és a βgal expresszió hasonlóan szabályozott ugyanazon neuronokban cfos-lacZ patkányok (Koya et al., 2009). Megállapítottuk tehát, hogy a megnövekedett βgal és IEG expresszió csak kis számban található a striatális idegsejtekben, és ez azt jelzi, hogy a striatális neuronoknak csak kis része kap magas szintű izgató szinaptikus bemenetet válaszként a kokain beadására.

A striatális idegsejtek diszkrét aktiválása összhangban van az upstate-downstate hipotézissel, amely leírja a dopamin ellentétes hatásait a striatalis neuronális aktivitására. A kokain által indukált dopaminról úgy gondolják, hogy fokozza a különbségeket a nagy aktivitású és az alacsony aktivitású neuronok között azáltal, hogy fokozza a már magas aktivitású neuronok folyamatos elektrofiziológiai aktivitását, miközben enyhíti az alacsony aktivitású neuronok többségének folyamatos aktivitását (Wilson és Kawaguchi, 1996; Hernandez-Lopez és munkatársai, 1997; Nicola és munkatársai, 2000; O'Donnell, 2003; Nicola és munkatársai, 2004). A jel-zaj arány növekedéséből adódóan nemcsak fokozza a szelektivitást az akut jelzés során, hanem - amint azt kutatásunkban is javasoljuk - hozzájárulhat az egyedi molekuláris neuroadaptációk indukciójához is csak a nagy aktivitású idegsejtekben. Eközben a géta-expresszió a βgal-negatív idegsejtekben, amelyek a kokain-injekcióval beadott patkányok striatális idegsejtjeinek többségét alkotják, nem különbözik a sóoldattal injektált patkányok striatális idegsejtjeiben alkalmazott génexpressziótól; Ez alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a striatális idegsejtek többsége az alsó állapotban marad a kokain expozíció során.

A p38 MAP kináz jelátviteli út összetevői szintén megváltoztak az aktivált és nem aktivált neuronok között. A Map2k6 / MEKK6, a p38-et aktiváló kináz gén expressziója csökkent, míg az Mkp1 / Dusp1, a p38-et inaktiváló foszfatáz gén expressziója (Sgambato és munkatársai, 1998), az aktivált idegsejtekben megnőtt, de az nem aktivált neuronokban nem. Így a p38 MAPK átfogó jelátvitelének, amelyről kimutatták, szerepet játszik a szinaptikus plaszticitásban (Bolshakov és munkatársai, 2000; Izumi és munkatársai, 2008) csökkenthető az aktivált idegsejtekben, a neuronok nem aktivált többségéhez viszonyítva.

A FACS segíthet azonosítani azokat az idegtípusokat is, amelyek akut vagy ismételt kokain expozíció után aktiválódnak. Az aktivált idegsejtekben a D1 neuronális markergén prodynorphin magasabb expresszióját, a D2 neuronális markergének D2 dopamin receptor és A2A adenozin receptor alacsonyabb expresszióját találtuk aktivált neuronokban. Ez arra utal, hogy a Fos elsősorban a D1 striatális idegsejtekben indukálódott. Bár ez egyetért számos immunhisztokémiai tanulmánnyal, amelyek a Fos indukcióról számolnak be elsősorban a D1 neuronokban, pszichostimuláns injekciókat követően a otthoni ketrec (Berretta és munkatársai, 1992; Cenci és munkatársai, 1992), ellentmond a D1 és a D2 idegsejtek azonos pszichostimuláns injekciókat követő azonos aktiválásának új környezet a patkány otthoni ketrecén kívül (Jaber és munkatársai, 1995; Badiani és munkatársai, 1999; Hope és munkatársai, 2006).

Mivel ugyanazt a Pgal markert használtuk az aktivált idegsejtek azonosítására a FACS során, mint a korábban leírt Daun02 inaktivációs eljárásunkhoz (Koya et al., 2009), valószínű, hogy az idegrendszeri egységekben egyedülálló molekuláris változásokat figyelünk meg, amelyek szükségesek a kokain által kiváltott mozgás kontextus-specifikus szenzibilizációjának megtanult komponenseihez. Korábban azt találtuk, hogy csak egy kis számú, ritkán eloszló neuron inaktiválása egy feltételezett együtten belül elegendő a kontextusspecifikus kokain pszichomotoros szenzibilizáció megszakításához (Koya et al., 2009). Ezt a megállapítást ugyanazon nőstény mintával megismételjük cfos-lacZ patkányok és az ebben a vizsgálatban alkalmazott szenzibilizációs rend [http://irp.drugabuse.gov]. Ezek az idegsejtek természetüknél fogva nem érzékenyebbek az összes stimulusra, mivel a környezet vagy a környezet megváltoztatásakor, amikor a gyógyszert beadták, a kokain-injekciók után a striatális idegsejtek más csoportja aktiválódott (Mattson és munkatársai, 2008; Koya et al., 2009). Egy adott striatális neuronális együttes kiválasztása elsősorban a kortikális és szubkortikális glutamatergikus afferensek aktivitásának mintájától függ (Pennartz és munkatársai, 1994; O'Donnell, 2003), és ezeket a bemeneteket maga a viselkedés során jelenlévő speciális környezeti és interoceptive ingerek határozzák meg. Ebből a korábbi munkából és a jelenlegi adatainkból feltételezzük, hogy a kokain és a környezeti ingerek ismételt párosítása szenzibilizációs programunk során egyedi molekuláris változásokat idéz elő az ismételten aktivált neuron együttesekben, amelyek hozzájárulhatnak a kontextusspecifikus szenzibilizáció alapjául szolgáló megtanult társulásokhoz.

Összességében bemutattuk a FACS új alkalmazását felnőtt idegsejtek izolálására, amelyeket szelektíven aktiváltak az akut kokain-indukált lokomotoros aktivitás és az ismételt kokain-indukált lokomotoros szenzibilizáció során. Javasoljuk, hogy ez a megközelítés felhasználható legyen az egyedi molekuláris neuroadaptációk azonosítására is a neuronális együttesekben, amelyek a visszaélésszerű gyógyszerek viselkedési hatásait és más tanult viselkedéseket kódolják. Ezen egyedüli molekuláris neuroadaptációk ok-okozati szerepe a neurális plaszticitásban és viselkedésben végül meg kell vizsgálni a génexpresszió manipulálásával csak aktivált neuronokban; ezt a technikát azonban még nem fejlesztették ki.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a Nemzeti Kábítószer-visszaélés Intézet Intramurális Kutatási Programja támogatta. D. Guez-Barber-t az NIH MSTP TG 5T32GM07205, a Kábítószer-visszaélés Nemzeti Intézetének F30DA024931 díjszáma és a Charles BG Murphy pszichiátriai elnöke támogatta a Yale Egyetemen. Köszönjük Joe Chrestnek a FACS-val való kiváló technikai segítségét, valamint Chris Cheadle-t, Tonya Watkins-ot és Alan Berger-t a mikrotáblán végzett munkájáért. Köszönjük Yavin Shahamnek a kézirattal kapcsolatos hasznos észrevételeit.

Lábjegyzetek

 

A kézirat egyetlen szerzőjével sem áll fenn összeférhetetlenség.

Referenciák

  1. Badiani A, Oates MM, HE nap, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Az amfetamin által kiváltott c-fos expresszió környezeti modulációja a D1-ben a D2 striatális idegsejtekkel szemben. Behav Brain Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
  2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. A dopamin és a glutamát agonisták stimulálják a Fos-szerű protein neuron-specifikus expresszióját a striatumban. J Neurophysiol. 1992; 68: 767-777. [PubMed]
  3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. A kettős MAP kináz utak közvetítik a hosszú távú plaszticitás ellentétes formáit a CA3-CA1 szinapszisokban. Nat Neurosci. 2000; 3: 1107-1112. [PubMed]
  4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. Pszichostimulánsok által indukált AMPA receptor szinaptikus plaszticitás: a múlt, a jelen és a terápiás jövő. Idegsejt. 2010; 67: 11-24. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. A striatalis c-fos indukció kokain vagy apomorphine által indukálható preferenciálisan patkányok Substantia Nigra kimeneti idegsejtjeiben. Eur J Neurosci. 1992; 4: 376-380. [PubMed]
  6. Curran T, Franza BR., Jr Fos és Jun: az AP-1 kapcsolat. Sejt. 1988; 55: 395-397. [PubMed]
  7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. A központi idegrendszerben rezidens sejtek által végzett MyD88 expresszió kulcsfontosságú az agyi tályogok védő immunitásának kiváltásában. ASN Neuro. 2009: 1. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. A D1 és a D2 dopamin receptor funkciója a striatumban: A D1 és D2 dopamin receptorok együttes aktiválása külön neuronpopulációkon a D1-tartalmú idegsejtek azonnali korai génválaszának fokozását eredményezi. J Neurosci. 1995; 15: 8167-8176. [PubMed]
  9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. A viselkedés szempontjából releváns idegi áramkörök feltérképezése azonnali-korai gén expresszióval. Curr Opin Neurobiol. 2005; 15: 599-606. [PubMed]
  10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. A D1 receptor aktiválása az L-típusú Ca2 + vezetőképesség modulálásával fokozza az idült kisülés a neostriatális közepes tüskés idegsejtekben. J Neurosci. 1997; 17: 3334-3342. [PubMed]
  11. B remény, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. A kokain által kiváltott mozgásszervi aktivitás és a Fos expressziója a nucleus carrbens-ben az 6 hónapokra érzékenyül, miután az otthoni ketrecben ismételt kokaint adagoltak. Eur J Neurosci. 2006; 24: 867-875. [PubMed]
  12. Izumi Y, Tokuda K, Zorumski CF. Az alacsony szintű N-metil-D-aszpartát receptor aktiválással történő hosszú távú potencírozás gátlása kalcineurint, nitrogén-monoxidot és p38 mitogén-aktivált protein-kinázt foglal magában. Hippocampus. 2008; 18: 258-265. [PubMed]
  13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Az akut és krónikus amfetamin kezelések eltérően szabályozzák a neuropeptid hírvivő RNS szintjét és a Fos immunreaktivitást patkányok striatális idegsejtjeiben. Neuroscience. 1995; 65: 1041-1050. [PubMed]
  14. Kalivas PW. A függőség glutamát homeosztázisának hipotézise. Nat Rev Neurosci. 2009; 10: 561-572. [PubMed]
  15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. A spontán és kiváltott glutamát jelátvitel befolyásolja a Fos-lacZ expressziót és a piramissejt pusztulását transzgenikus patkányok hippokampuszos szeletek tenyészeteiben. Brain Res Mol Brain Res. 1995; 34: 197-208. [PubMed]
  16. Koya E, Golden S, Harvey B, Guez-Barber D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Hope B. Célzott zavar a kokain-aktivált nucleus activum neuronok megakadályozzák a környezet-specifikus szenzibilizációt. Nat Neurosci. 2009; 12: 1069-U1152. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  17. Kwon B, Houpt TA. A lézermegfogó mikrodisszekció és az X-Gal szövettan kombinált módszere a gén expressziójának elemzésére c-Fos-specifikus neuronokban. J Neurosci Methods. 2010; 186: 155-164. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  18. Labiner DM, Butler LS, Cao Z, Hosford DA, Shin C, McNamara JO. C-fos mRNS indukálása meggyújtott rohamokkal: komplex kapcsolat a neuronális robbantással. J Neurosci. 1993; 13: 744-751. [PubMed]
  19. Liberles SD, Buck LB. A szaglóhámban lévő kemoszenzoros receptorok második osztálya. Természet. 2006; 442: 645-650. [PubMed]
  20. Lobo MK, Karsten SL, Grey M, Geschwind DH, Yang XW. A striatális projekciós neuron altípusok FACS-tömb profilozása juvenilis és felnőtt egér agyban. Nat Neurosci. 2006; 9: 443-452. [PubMed]
  21. Loebrich S, Nedivi E. Az aktivitással szabályozott gének működése az idegrendszerben. Physiol rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [PMC ingyenes cikk] [PubMed]
  22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Hope B. A kokain-indukálta lokomotoros aktivitás és a kapcsolódó neuron együttesek kontekst-specifikus szenzibilizálása patkánymag-akumulációkban. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202-212. [PubMed]
  23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekuláris kapcsoló az agy hosszú távú alkalmazkodásához. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
  24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Kábítószer-függőség - az idegi plaszticitás molekuláris alapjának modellje. Idegsejt. 1993; 11: 995–1006. [PubMed]
  25. Nestler EJ. A függőségen alapuló hosszú távú plaszticitás molekuláris alapja. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
  26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Az idegsejt ingerlékenységének dopaminerg modulációja a striatumban és a nucleus activbensben. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185-215. [PubMed]
  27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Kontrasztjavítás: a striatális dopamin fiziológiai hatása? Cell Tissue Res. 2004; 318: 93-106. [PubMed]
  28. O'Donnell P. Az agy idegi együtteseinek dopamin gátlása. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429-435. [PubMed]
  29. Paxinos G, Watson C. A patkány agya sztereotaxikus koordinátákkal. 4. San Diego: Academic Press; 1998.
  30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. A sejtmag felhalmozódik funkcionálisan megkülönböztetett neuron együttesként: a viselkedési, elektrofiziológiai és anatómiai adatok integrációja. Prog Neurobiol. 1994; 42: 719-761. [PubMed]
  31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-Fos expresszió a patkányok közötti intergenulátum-szórólapban: fotoreguláció, Fos-B-vel való együttes lokalizáció és a sejtek azonosítása. Brain Res. 1996; 728: 231-241. [PubMed]
  32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Az agykéreg elektromos stimulációjának hatása a Fos fehérje expressziójára a bazális ganglionokban. Neurosci. 1997; 81: 93-112. [PubMed]
  33. Sgambato V, C. oldal, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) az azonnali korai gén indukciót vezérli a kortikosztriatális stimulációval. J Neurosci. 1998; 18: 8814-8825. [PubMed]
  34. Shaham Y, Hope BT. A neuroadaptációk szerepe a visszaesésben a drogkeresésnél. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437-1439. [PubMed]
  35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. A c-fos mRNS expresszió indukciója utólagos kisüléssel naiv és meggyújtott patkányok hippokampuszában. J Neurochem. 1990; 55: 1050-1055. [PubMed]
  36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. A neostriatális tüskés idegsejtek kétállapotú spontán membránpotenciál-ingadozásának eredete. J Neurosci. 1996; 16: 2397-2410. [PubMed]
  37. Wolf ME, Ferrario CR. Az AMPA receptor plaszticitása a magban felhalmozódik a kokain ismételt expozíciója után. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC ingyenes cikk] [PubMed]