forrás
A Nathan Kline Intézet, Orangeburg, New York, 10962, USA. [e-mail védett]
Absztrakt
A gyermekeket és serdülõket egyre inkább érintik pszichostimulánsok, akár tiltottan, akár általános neuropszichiátriai állapotok kezelésére, például hiperaktivitással és anélkül fennálló figyelemhiányos rendellenességek kezelésére. Annak ellenére, hogy a pszichomotoros stimulánsok fiatalabb korcsoportokban széles körben alkalmazandók, kevés tudomásunk van ezekre a szerekre kifejtett krónikus molekuláris neuroadaptive válaszokról az éretlen agyban. Itt bemutatjuk, hogy a pszichostimulánsok krónikus beadása után kokain és a amfetamin, transzkripciós faktor DeltaFosB a géntechnológiában a génmag felhalmozódása alatt van periadolescent egerek de az elválasztás utáni vagy felnőttkorban nem egerek. Indukció DeltaFosB kizárólag a periadolescent egerek után amfetamin adminisztráció. Ezek az eredmények bizonyítják a kritikus molekula egyedülálló plaszticitását a serdülőkori agyában, amely szabályozza a pszichostimuláns hatást, és arra utalnak, hogy ezek a neuroadaptive változások részt vehetnek a fokozott addiktív tendenciák a serdülőkorban a felnőtthez viszonyítva.
Bevezetés
A pszichostimulánsokat általános gyermekkori rendellenességek, például figyelemhiányos hiperaktivitási rendellenességek kezelésére használják. Ezen túlmenően a serdülők körében gyakori az stimulánsok - köztük az amfetamin és a kokain - visszaélése, ebben a korban bizonyított a fokozott addiktív tendencia a felnőtteknél (Estroff és munkatársai, 1989; Myers és Anderson, 1991). A fejlődésben szabályozott viselkedési hatásokra utaló adatok ellenére kevés tudomásunk van az éretlen agy molekuláris neuroadaptive válaszairól, amelyek ezen ágensek beadásakor jelentkeznek. A kokain és az amfetamin részben a dopamin D stimulálása révén hathat a tartós viselkedésbeli változásokra1receptorok és a transzkripciós faktorok szintjének emelkedése, ideértve az ΔFosB-t is, a hátsó striatumban (azaz caudate putamenben) és a ventrális striatumban (azaz a nucleus carrbens-ban) (Chen és munkatársai, 1997). A ΔFosB szintjének emelkedése, talán a fehérjetermékek stabilizálása révén, néhány hétig fennmaradhat a kokain vagy amfetamin krónikus expozíciója után, és ezt legalább részben a dopamin szignál transzdukciós útja szabályozza (Chen és munkatársai, 1997; Nestler és munkatársai, 2001).
A fiatal állatok központi dopaminerg rendszere nagymértékben fluxusban van, mivel a normál fejlődés során megváltozik a kritikus molekulák szintje, ideértve a D-dopamint1DARPP-32 receptor (dopamin és cAMP által szabályozott foszfoprotein; Mr 32 kDa) és cAMP (Ehrlich és munkatársai, 1990;Teicher és munkatársai, 1993; Perrone-Capano és munkatársai, 1996; Tarazi és munkatársai, 1999;Andersen, 2002). Az ebben az időszakban a dopaminerg neurotranszmissziót fokozó pszichostimulánsoknak való kitettség tehát kvantitatív és / vagy kvalitatív módon eltérő molekuláris válaszokat eredményezhet, beleértve az ΔFosB expressziójának változásait. Annak a hipotézisnek a tesztelésére, miszerint a pszichostimulánsok krónikus expozíciójakor vannak életkorfüggő neuroadaptive válaszok, sorozatkísérletekben három egércsoportot elemeztünk: felnőtteknek (60 d az injekció beadásának kezdetén), periadolescens (33 d régi az injekciók kezdetekor), és elválasztás után (24 d éves az injekció megkezdésekor). Ez a krónikus pszichostimuláns expozíció molekuláris neuroadaptive reakcióinak első összehasonlítása ebben a három korcsoportban. Megállapítottuk, hogy azonos kezelési paradigmák után a periadolescens egerek fokozott ΔFosB-szabályozást mutatnak mind a kokain, mind az amfetamin hatására.
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Állatok és gyógyszeres kezelés. Hím CD-1 egereket (Charles River Laboratories, Kingston, NY) 12 órás világos / sötét cikluson (6: 00 AM - 6: 00 PM) helyeztünk el ad libitumélelemhez és vízhez való hozzáférés. Az állatokat legalább 10 d-re hagyták az állati helyiségben elhelyezni az injekciók megkezdése előtt. Az állatokat két vizsgáló kezelte, akik az összes injekciót ugyanabban a helyiségben végezték, ahol az állatokat tartották. Az összes állatot 21 d életévkor elválasztottuk. Az injekciók 24 (elválasztás utáni), 33 (periadolescens) vagy 60 (felnőtt) életkornál kezdődtek. Az állatok 20 mg / kg kokaint (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetaminot (Sigma) vagy intraperitoneálisan egyenlő mennyiségű sóoldatot kaptak 4: 00 és 5: 00 PM között naponta az 7 d számára. Az állatokat rövid ideig CO-nak való kitettség után dekapitációval ölték meg2 10: 00 AM az utolsó injekció utáni napon. Az agyat azonnal eltávolítottuk a koponyából, és a caudates putameneket és a nucleus carrénseket gyorsan boncoltuk a jégen. Az összes boncolást koronális agyszeletekből egyetlen kutató hajtotta végre, és fehérjekivonatokat állítottak elő friss szövetekből fagyasztás nélkül. Az állatokon végzett valamennyi eljárást az Állatgondozási és Használási Intézményi Bizottság jóváhagyta és összhangban álltak a Nemzeti Egészségügyi Intézetekkel Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához.
Western blot analízis. A Western blot analízishez egyenlő mennyiségű fehérjét (40 μg a caudate putamennél és 20 μg a nucleus akumulénoknál) az egyes mintákból az 10% SDS-poliakrilamid gél mindegyik sávjába töltöttük, miután a protein koncentrációkat BCA assay-rel mérjük (Pierce, Rockford, IL). Az egyenlő fehérjeterhelést a teljes fehérje Ponceau Red általi vizualizálásával is igazoltuk, miután nitrocellulózba helyeztük és / vagy anti-aktin antitesttel blottoltuk (1: 500; Sigma). A Fos-rokon antigén (FRA) antiszérumot, amely felismeri az ΔFosB izoformákat, Dr. M. Iadarola (Országos Egészségügyi Intézet, Bethesda, MD) nagylelkűen bocsátotta rendelkezésre, és 1: 4000 koncentrációban használták. Korábbi tanulmányok (Chen és munkatársai, 1997; Hiroi és munkatársai, 1997), beleértve az FRA antiszérumnak az M-peptid immunogénnel történő preadszorpcióját, igazolta ezen antiszérum specifitását. A DARPP-32 5a monoklonális antitestet, amelyet az 1: 10,000-en alkalmaztak, Drs nagylelkûen bocsátotta rendelkezésre. Hugh Hemmings és Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). A dopamin transzporter (DAT) antitest származó volt Chemicon (Temecula, Kalifornia). A blotokat NEN-DuPont (Boston, MA) kemilumineszcens rendszerrel reagáltattuk és filmre tettük. Az ΔFosB immunreaktivitás denzitometriás értékeit a ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO) alkalmazásával kaptuk. A statisztikai szignifikancia meghatározása egyirányú ANOVA alkalmazásával történt post hoc Tukey többszörös összehasonlító tesztje vagy párosítatlan, kétfarkú Student-teszt t a teszt az ábra legenda szerint. A gyógyszeres kezelési kísérletekhez az egyes korcsoportok elemzését külön blottal végeztük, ezért minden egyes sóoldat-csoporthoz tetszőlegesen 100% értéket rendeltek az életkorcsoportok összehasonlításához. Az ongenetikai vizsgálatokhoz az összes korcsoportból vett mintákat együtt analizáltuk egyetlen blottal.
EREDMÉNYEK
Az ΔFosB indukciója kokain és amfetamin után csak periadolescens egerek magjában
Az ΔFosB expresszióját az elválasztás utáni, periadoleszcens és felnőtt egerek sejtmagjaiban és caudate putameneiben mértük az amfetamin vagy kokain 7 d dózisát követően. A nucleus carrén az agy régió, amelyről úgy gondolják, hogy a legkritikusabb a pszichostimulánsok jutalmazó hatásainak közvetítésében. Az amfetamin krónikus adagolása után az ΔFosB immunreaktivitást (35 kDa) szelektíven indukáltuk a periadolesszív állatok magfoltokjában (5. ábra). 1 A) vagy kokaint (2. ábra) 1 B). Ezzel szemben az ΔFosB (35 kDa) szintje nem változott szignifikánsan az elválasztás utáni vagy felnőtt állatok magmaggyûjtõiben (5. ábra).1 A,B). A caudate putamenben az ΔFosB szintek (35 kDa) krónikus amfetamin adagolása után is csak periadolescens állatokban szignifikánsan felújultak (2. ábra).2 A). A kokain krónikus adagolása után mindhárom korcsoport szignifikánsan növekedett az ΔFosB (35 kDa) expressziójában a caudate putamenben (5. ábra).2 B). Az indukció mértéke azonban a periadolescens állatokban volt a legnagyobb, különös tekintettel az elválasztás utáni állatokra (2. ábra). 2 B). Az egyéb FRA és Fos izoformák változatlanok voltak minden korcsoportban (az adatokat nem mutatjuk be).
Az ΔFosB immunreaktivitás a magban felhalmozódik krónikus pszichostimuláns alkalmazás után. CD-1 egereket naponta egyszer injektáltunk sóoldattal, amfetaminnal vagy kokainnal az 7 d kezdetére, az 24 napon kezdve (P24; az elválasztás után), az 33. nap (P33; periadolescent) vagy az 60 (Felnőtt). Az ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitási szintjét a nucleus akumulbensben a krónikus amfetamin (A) vagy kokain (B) adminisztráció. Reprezentatív immunoblotok a sóoldatból (S), amfetamin- (A) és a kokain- (C) elválasztás utáni fecskendezés (P24), periadolescens (P33) és felnőtt egerek láthatók felső panelek. Alsó panelek mutatják az ΔFosB bazális expressziójának átlagos ± SEM százalékát. n az egyes csoportok értékeit a bárok. Az ΔFosB szignifikáns emelkedését csak a periadoleszáló egerek sejtmagjaiban találták meg. *p <0.05; **p <0.01 (hallgatói t teszt; sóoldat vagy gyógyszer).
ΔFosB immunreaktivitás a caudate putamenben krónikus pszichostimuláns alkalmazás után. CD-1 egereket naponta egyszer injektáltunk sóoldattal, amfetaminnal vagy kokainnal az 7 d kezdetére, az 24 napon kezdve (P24; az elválasztás után), az 33. nap (P33; periadolescent) vagy az 60 (Felnőtt). Az ΔFosB (35 kDa) immunreaktivitás szintjét a caudate putamenben krónikus amfetamin (A) vagy kokain (B) adminisztráció. Reprezentatív immunoblotok a sóoldatból (S), amfetamin- (A) és a kokain- (C) injektált periadolescens egerek (P33) afelső panelek. Alsó panelek mutatják az ΔFosB bazális expressziójának átlagos ± SEM százalékát. n az egyes csoportok értékeit a bárok. Az ΔFosB immunreaktivitás szignifikáns amfetamin-indukált növekedését csak a periadolescens egerek caudate putamenjeiben észlelték (A). A krónikus kokainbevitel mindhárom korcsoportban növeli az ΔFosB-t (B). *p <0.05; **p <0.01 (hallgatói t teszt; sóoldat vagy gyógyszer).
A DAT és a DARPP-32 szintje nem változik a krónikus kokain vagy amfetamin után
Több kulcsfontosságú molekula, amelyeket dopaminerg és / vagy dopaminoceptive neuronok expresszálnak, ideértve a DARPP-32-et, a D1 a dopamin receptor és a DAT hozzájárul a pszichostimulánsok akut és krónikus válaszaihoz (Moratalla és munkatársai, 1996; Fienberg és munkatársai, 1998; Sora és munkatársai, 1998; Gainetdinov és munkatársai, 2001). Adatok a DARPP-32, D-től1 A receptor, valamint a DAT null és a DAT leütött egerek bonyolult összefüggést mutatnak a szintjük, a dopaminerg aktivitás szabályozása és a pszichostimulánsokra adott válaszok között. Valójában, ΔFosB indukció nem fordul elő DARPP-32 null egerekben, akik krónikus kokaint kapnak (Fienberg és munkatársai, 1998). Felnőtt egerekben azonban az 7 d expozíciója az 20 mg / kg kokainnal nem befolyásolja a DARPP-32 teljes szintet (Fienberg és munkatársai, 1998). A DAT-protein szabályozásról korábban nem számoltak be olyan egerekben, amelyek krónikusan pszichostimulánsoknak vannak kitéve, bár néhány fajban a pszichostimulánsoknak való kitettség után a dopamin transzporterhez történő kötődés radioligandumban és az oldatban bekövetkezett változásáról (Letchworth és munkatársai, 2001). Itt megmértük a DARPP-32 és a DAT fehérje szintjét annak meghatározása érdekében, hogy ezen fehérjék expressziója megváltozik-e az egerek három életkorának krónikus pszichostimuláns alkalmazása után. Megállapításaink azt mutatják, hogy a kokain vagy az amfetamin krónikus adagolása után a három korcsoport egyikében sem az egész DARPP-32, sem a DAT szintje nem változott szignifikánsan a teljes caudate putamenben vagy a nucleus carrbensben (táblázat) 1).
A DARPP-32 és a DAT relatív denzitometriás értékei amfetaminnal és kokainnal kezelt P24, P33 és felnőtt egerekben a kontroll, a fiziológiás só értékhez viszonyítva, önkényesen 100% -ra beállítva
Az ΔFosB kiindulási szintjét fejlõdésben szabályozják
Megvizsgáltuk az ΔFosB ontogenezisét, mivel a felnőtt egereknek, akiknek géntechnológiával megnövelt expressziója van az ΔFosB számára a striatumban, fokozott viselkedésbeli reakciójuk van a pszichostimulánsokra (Kelz és munkatársai, 1999). Megállapítottuk, hogy az ΔFosB kiindulási szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a fiatalabb állatokban, mint a felnőttkorban, mind a caudate putamenben, mind a nucleus activumbensben (5. ábra).3 A). A dopamin rendszer funkcionális markereinek szintje, beleértve a DARPP-32-t (Ehrlich és munkatársai, 1990), DAT (Perrone-Capano és munkatársai, 1996) és a dopamin receptorok (Teicher és munkatársai, 1993; Tarazi és munkatársai, 1999) fejlesztési szempontból is szabályozottak. A CD-1 egerekkel kapcsolatos korábbi beszámolók a DARPP-32 striatális csúcsának az 28 utáni születésnapján (P28) mutattak (Ehrlich és munkatársai, 1990). Patkány caudate putamenben és nucleus activumban, D1A receptor szintje a P28-től a P40-ig (Teicher és munkatársai, 1993; Tarazi és munkatársai, 1999), de hasonló vizsgálatokat az egérrel nem végeztek el. Ezzel szemben itt azt találtuk, hogy a caudate putamenben és a nucleus akuménben a DAT fehérje szintje állandó volt a szülés utáni 24 nap és a felnőttkor között (2. ábra). 3 B). Így a D közötti relatív arányok1 receptorok, a DAT, a DARPP-32 és az ΔFosB különböznek korcsoportok között, potenciálisan eltéréseket mutatva a D1 receptor aktivitás, amely befolyásolhatja az ΔFosB indukció mértékét.
ΔFosB és DAT fejlődési expressziója. A, ΔFosB (35 – 37 kDa) immunreaktivitás naiv CD-1 egerek caudate putameneiben és atommagjaiban az életkor függvényében. A reprezentatív immunoblotok a felső panelek.Alsó panelek csoportonként három egér ± SEM átlagát mutatják. *p <0.05, felnőtt versus P24; #p <0.05, felnőtt és P36 (Tukey többszörös összehasonlító tesztje ANOVA után). B, A DAT immunreaktivitás denzitometriás értékei a caudate putamenben és a nucleus akumbensben naiv CD-1 egereknél kor függvényében. A DAT szintje nem különbözött a három korcsoportban.
VITA
A pszichomotoros stimulánsok viselkedésbeli hatása korfüggő. Az addiktív tendencia a serdülőkorban a legmagasabb, amikor a tiltott anyagok használata fokozódik (Estroff és munkatársai, 1989; Myers és Anderson, 1991). Valójában a fiatalabb gyermekek gyakran pszichostimulánsoknak való kitettséggel diszforikusak, míg a serdülők és felnőttek eufóriát tapasztalnak (Rapoport és munkatársai, 1980). Rágcsáló modellekben néhány tanulmány azt sugallja, hogy a periadolescens állatok magasabb aktivitási kiindulási szinttel rendelkeznek (Lándzsa és fék, 1983) és a fiatalabb és idősebb állatokhoz viszonyított megváltozott válaszok a pszichostimulánsokra. Így kevesebb mozgásszervi stimulációt és újdonságot mutatnak a pszichostimulánsok akut alacsony dózisú adagolására az elválasztáshoz és felnőtt állatokhoz képest, de megnövekedett hiperaktivitás a nagy dózisú kezelés után. Krónikus alkalmazás esetén a perifériás patkányokban a kokain-indukált mozgatás iránti szenzibilizáció nagyobb, mint a felnőtteknél, míg a sztereotípia iránti érzékenység alacsonyabb. A mikrodialízis adatai rávilágítottak arra is, hogy az amfetamin által kiváltott dopamin felszabadulásra való szenzibilizáció szempontjából különbségek vannak a periadolescens és felnőtt patkányok között (Laviola és munkatársai, 1995; Adriani és munkatársai, 1998; Adriani és Laviola, 2000;Laviola és munkatársai, 2001). Ellentmondásos tanulmányok vannak a serkentő patkányok metil-fenidát beadását követően a kokainnal való hosszú távú reakcióképességéről (Brandon és munkatársai, 2001; Andersen és munkatársai, 2002). Ez utóbbi két jelentés kiemeli a tanulmányok összehasonlításának nehézségét, amikor különféle kísérleti paradigmákat alkalmaznak. A fiatalabb állatok viselkedésbeli tanulmányainak összehasonlítására tett kísérleteket tovább zavarja különféle fajok és törzsek használata.
Az egér egyre fontosabb állatmodellré válik a pszichostimulánsok használatának és visszaélésének tanulmányozása során, és ez az első szisztematikus elemzése a molekuláris neuroadaptive válaszoknak három különböző fejlődési korban egérben vagy bármely más fajban. A korábbi tanulmányok, amelyekből a kezelési paradigmáinkat derítettük ki, kimutatták az ΔFosB növekedését vad típusú felnőtt patkányok izolált dorsalis és ventrális striatumában krónikus kokain és amfetamin adagolása után (Hope és munkatársai, 1994; Nye et al., 1995; Turgeon és munkatársai, 1997), de csak vad típusú felnőtt egerek kombinált dorsalis és ventrális striatumában vagy izolált dorsalis striatumában krónikus kokain után (Fienberg és munkatársai, 1998; Zachariou és munkatársai, 2001).
Most megmutatjuk a pszichostimulánsok által indukált ΔFosB térbeli és mennyiségi különbségét elválasztás utáni, periadolescens és felnőtt egerekben. A fokozott válasz észlelését a periadolesszív állatokban a felnőttekkel és az elválasztás utáni időszakkal összehasonlítva megerősíti az a tény, hogy a válasz hasonló a kokainnal és amfetaminnal kezelt egereknél. A pszichostimulánsok a kokain és az amfetamin egyaránt növelik a szinaptikus dopamint, valamint a szerotonint és a norepinefrint, de eltérő mechanizmusok révén. A kokain a plazmakémiai transzporterekhez kötődik a dopamin, szerotonin és norepinefrin számára, és gátolja ezek újbóli felvételét az presiszinaptikus terminálokba. Ezzel szemben az amfetamin elősegíti ezen adóegységek felszabadulását. Az ΔFosB szelektív indukciója csak a periadolescens korcsoportban lévő stimulánsok 7 d dózisának felhalmozódásában és az ΔFosB viszonylag fokozott indukciója a caudate putamenben neurobiológiai reprezentációt vagy okot jelenthet a korábban megfigyelt fokozott tendenciára a pszichostimulánsok visszaélésében. korcsoport (Estroff és munkatársai, 1989; Myers és Anderson, 1991) és a génkifejezés egyéb hosszú távú változásai, amelyek korcsoportok között különböznek (Andersen és munkatársai, 2002). Ezen túlmenően ezeket a különbségeket a kulcsmolekulák szintjének fejlõdésbeli változásai, köztük maga az AFosB is, belsőleg szabályozhatják. A korcsoportok közötti ΔFosB kiindulási szintbeli különbségek lehetséges következményei hasonlóak a patkány törzsek közötti különbségekre javasolt hatásokhoz (Haile és munkatársai, 2001). Valójában arra számítunk, hogy hasonló törzsbeli különbségeket fognak találni a beltenyésztett egerek között. Lehetséges az is, hogy különböző korú egerek eltérő molekuláris adaptációt mutatnak az agy más területein, a magvakon kívül. További elemzés periadolescens egerek felhasználásával, a kulcsmolekulák szintjének géntechnológiával módosított változataival és egyidejű viselkedési megfigyelésekkel tovább vizsgálja ezeket a hipotéziseket.
Lábjegyzetek
- Fogadott Április 8, 2002.
- A módosítás beérkezett Augusztus 6, 2002.
- Elfogadva Augusztus 8, 2002.
Ezt a munkát a Nemzeti Egészségügyi Intézetek / Nemzeti Neurológiai rendellenességek Intézete és az Stroke Grant NS41871 (MEE és EMU), valamint a Kábítószer-visszaélések Nemzeti Intézete támogatta a P30-DA13429 (EMU).
A levelezést Dr. Michelle E. Ehrlich, a Thomas Jefferson Egyetem, a Curtis 310, az 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107 címre kell címezni. Email: [e-mail védett].
- Copyright © 2002 Neurotudományi Társaság
;
