A PSMC5, egy 19S proteasomális ATPáz, szabályozza a kokainhatást a Nucleus Accumbensben (2015)

PLoS One. 2015. május 11.; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Absztrakt

A ΔFosB egy stabil transzkripciós faktor, amely felhalmozódik a nucleus accumbens-ben (NAc), amely az agy jutalmazási áramkörének kulcsfontosságú része, válaszként a kokain vagy más bántalmazó szerek krónikus expozíciójára. Míg a ΔFosB köztudottan egy Jun családtaggal heterodimerizálódik, és aktív transzkripciós faktor komplexet képez, a mai napig nem folytattak nyílt végű kutatást az agyban a ΔFosB egyéb lehetséges kötőpartnereiről. Az élesztő két-hibrid vizsgálatainak felhasználásával új, a ΔFosB-vel kölcsönhatásba lépő fehérjeként azonosítjuk a PSMC5-t - más néven SUG1-t, a 19S proteazomális komplex ATPáz-tartalmú alegységét. Igazoljuk az endogén ΔFosB és a PSMC5 közötti ilyen kölcsönhatásokat az NAc-ben, és megmutatjuk, hogy mindkét fehérje komplexeket képez a génaktivációval összefüggő más kromatin-szabályozó fehérjékkel is. Bemutatjuk, hogy a krónikus kokain növeli az NAc nukleáris, de nem citoplazmatikus szintjét, és hogy a PSMC5 túlzott expressziója ebben az agyi régióban elősegíti a mozgásszervi reakciókat a kokainra. Ezek a megállapítások együttesen egy olyan új mechanizmust írnak le, amely hozzájárul a ΔFosB hatásához, és először vonja maga után a PSMC5-t a kokain által kiváltott molekuláris és viselkedési plaszticitásban.

Idézet: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O és mtsai. (2015) A PSMC5, egy 19S proteaszómális ATPáz, szabályozza a kokain hatását a nukleáris akkumulátorokban. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Tudományos szerkesztő: James Edgar McCutcheon, University of Leicester, EGYESÜLT KIRÁLYSÁG

kapott: December 10, 2014; Elfogadott: Április 7, 2015; Megjelent: May 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Attribution licenc, amely lehetővé teszi a korlátlan felhasználást, terjesztést és reprodukciót bármilyen médiumban, feltéve, hogy az eredeti szerzőt és forrást jóváírják

Adatok rendelkezésre állása: Minden releváns adat a papíron belül van.

finanszírozás: Ezt a munkát a Nemzeti Egészségügyi Intézetek, a Kábítószer-visszaélés Nemzeti Intézete, valamint az Ishibashi Alapítvány és a Japán Tudományfejlesztő Társaság támogatásával támogatták (KAKENHI számok: 24591735, 26290064, 25116010). A finanszírozóknak nem volt szerepe a tanulmánytervezésben, az adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételi döntésben és a kézirat elkészítésében.

Versenyképes érdekek: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

ΔFosB, a fosB A gén a transzkripciós faktorok Fos családjába tartozik, amelyek közé tartozik a c-Fos, a teljes hosszúságú FosB, a Fra-1 és a Fra-2. Az ΔFosB, más Fos fehérjékhez hasonlóan, heterodimerizál egy Jun család fehérjével - c-Jun, JunB vagy JunD - egy aktív AP-1 (aktivátor protein-1) transzkripciós faktor komplex kialakításához, amely indukálja vagy elnyomja a specifikus célgének expresszióját [1,2].

Kimutatták, hogy az ΔFosB kulcsszerepet játszik a kábítószer-függőségben [2]. Egyedülálló módon a Fos család fehérjéi között, az ismételt gyógyszerbeadást követően felhalmozódik a nucleus akumulének (NAc) és más, a jutalomhoz kapcsolódó agyi régiókba, magas szintű stabilitása miatt [3,4], amelyet a C-terminális degron domének hiánya és a több protein kináz foszforilációja közvetít [5-7]. Az ΔFosB ilyen indukciója a NAc-ben fokozott viselkedési reakciókat vált ki a visszaélés elleni gyógyszerekkel szemben. Így az ΔFosB túlzott expressziója a felnőtt állatok ezen agyterületén, akár vírusvektorok, akár indukálható bitransgén egerek alkalmazásával, növeli az állat érzékenységét a kokain és az opiátok mozgásszervi aktiváló és jutalmazó hatásaival szemben, valamint az állat motivációját önmagában alkalmazni. kokain [7-11]. Ezzel szemben az ΔFosB domináns negatív antagonistáinak túlexpressziója ellentétes viselkedési fenotípusokat eredményez [10-12].

Mi és mások korábban géleltolódási vizsgálatokkal megerősítettük, hogy a JunD és talán más Jun családfehérjék az ΔFosB fő kötőpartnerei az agyban in vivo [13-15]. Mindeddig azonban nem volt nyílt végű, elfogulatlan értékelés az ΔFosB kötő partnereiről az agyban. Itt arra törekedtünk, hogy az ΔFosB-hez új kötőpartnereket azonosítsunk egy élesztő kettős hibrid assay segítségével [16,17]. Adatainkból kiderült, hogy a PSMC5, más néven SUG1, az ΔFosB robusztus partnere mind in vitro, mind a NAc in vivo, ahol az ΔFosB-hez kapcsolódik egy kokain által indukált transzkripciós aktivációs komplex részeként, amely CBP-t (CREB-kötő fehérjét is tartalmaz) ) és a p300 - mindkettő hiszton-acetil-transzferáz (HAT) -, valamint a BRG1 (egy kromatint átalakító fehérje). Azt mutatjuk be, hogy a kokain krónikus expozíciója megváltoztatja a NAc PSMC5, az ATPáz-tartalmú alegység az 19S proteaszómális komplexben, nukleáris szintjét, és hogy a PSMC5 viszont a kokainnal kapcsolatos viselkedési válaszokat szabályozza.

Anyag és módszer

Élesztő két hibrid szűrés

A MaV203 élesztősejteket (Invitrogen Life Technologies) együtt transzfektáltuk a PDBLeu-val, az ΔFosB fehérje különböző fragmenseit vezetve, és egy egér agyi könyvtárat szubklónoztuk a pPC86-be (Invitrogen Life Technologies). A transzformált sejteket SC táptalajon tenyésztettük, amelyekben nem volt leucin, triptofán és hisztidin, és 10 mM 3-aminotriazolt tartalmaztak. A FosB fragmensek és a jelölt partner közötti kötés három riportergént indukál (His3, Ura3és LacZ), és az indukció révén a transzformánsok képesek fennmaradni az alkalmazott tenyésztés körülményei között. A pozitív klónokat új pDBLeu-ΔFosB fragmensekkel újravizsgáltuk MaV203 sejtekben végzett transzformációs vizsgálatokkal.

Sejtvonalak

Az egér Neuro 2A neuroblastoma sejtjeit (ATCC) Eagle minimális esszenciális táptalajában (EMEM) (ATCC) tartottuk, 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) kiegészítve 37 ° C-on és 5% CO2. A patkány 1A sejtek Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japán) ajándéka voltak [18] és Dulbecco MEM-ben (DMEM) (Life Technologies) tartják fenn, kiegészítve 10% FBS-sel 37 ° C-on és 5% CO2. A sejtek plazmid-DNS-sel történő transzfekcióját Effectene (Qiagen) alkalmazásával végeztük a gyártó utasításai szerint.

PSMC5 és ΔFosB konstrukciók

A PSMC5 több mutáns formáját, mindegyik FLAG-jelöléssel az N-terminálisán, előállították immunprecipitációval vagy vírus-közvetített génátviteli kísérletekkel történő felhasználásra. Ide tartoznak: PSMC5-K196M, PSMC5-Δtekercselt domén (PSMC5-ΔCC, hiányzik az 27 – 68 aminosavak), PSMC5-NT (amely a fehérje N-terminális fragmentumából, az 1 – XMUMX – 151 aminosavakból áll, és -CT (a fehérje C-terminális fragmenséből, 5 aminosavakból áll) (lásd Ábra 1). Használtuk a vad típusú ΔFosB, valamint az ΔFosB N-terminális MYC-címkével ellátott formáit is, mutációval a leucin-cipzár doménjében (az 182 aminosavak 205-re történő mutációja, amelyről ismert, hogy elpusztítja a heterodimerizációt a Jun család proteinjével).6].

miniatűr
1 ábra. Az ΔFosB in vitro kötődik a PSMC5-hez.

 

A. Az ΔFosB, ΔFosB-LZM vázlata, amelyben a leucin cipzár domént mutálják úgy, hogy megsemmisítsék ΔFosB heterodimerizációt Jun fehérjékkel, és Δ2ΔFosB, amelyben hiányzik az ΔFosB N-terminális első 78 aminosava. B. A PSMC5, a PSMC5-NT vázlata, amely tartalmazza a PSMC151 első 5 aminosavait, a PSMC5-CT, amelyben hiányzik a PSMC235 első 5 aminosava, és a PSMC5-whichCC, amelyben nincs a becsavart tekercs domén (XNNXX-aminosavak) . Az AAA domén egy olyan motívumnak felel meg, amely számos ATPázban jelen van, különféle sejttevékenységekkel társított ATPázokhoz. C. 28 μg pcDNA68-ΔFosB-t (2.4 – 3.1 sávok) vagy ΔFosB-LZM-et (1 sáv) együtt transzfektáltunk 4 μg-vel FLAG-címkével ellátott PSMC5-sel vagy különféle deléciós mutánsokkal Neuro2.4a sejtekbe. Két nappal a transzfekció után a sejteket lizáltuk, és anti-FLAG antitesttel immunprecipitációnak vetjük alá, majd anti-AFosB vagy anti-FLAG antitestekkel Western-blottoljuk. Vegye figyelembe, hogy az ΔFosB, de nem az ΔFosB-LZM, szilárdan kötődik a PSMC5-hez vagy a PSMC2-NT-hez, de nem a PSMC5-CT vagy a PSMC5-ΔCC-hez. Az ábrán látható adatokat három példányban megismételjük három külön kísérlet mindegyikében.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

Állatok

Kilenc – 11 hetes C57BL / 6J hím egereket (The Jackson Laboratory) használtunk minden kísérlethez. Az állatokat 12-h világos-sötét cikluson helyeztük el, élelmezéshez és vízhez jutva ad libitum és a kísérlet előtt hetente szoktak 1. Két kokainkezelési rendszert alkalmaztak. A kokain biokémiai hatásainak tanulmányozása céljából az állatoknak napi 7 adagokat (20 mg / kg) vagy fiziológiás sóoldatot kaptak, és az utolsó injekció után 24 órával végzett dekappitációval ölték meg őket. Ez egy szokásos protokoll, amelyről kimutatták, hogy számos molekuláris és celluláris választ ad a gyógyszerre [7]. A PSMC5nak a nukleáris felhalmozódásban bekövetkező hatására a kokain viselkedésre adott válaszaira gyakorolt ​​hatással a gyógyszer egy alsó küszöb dózisát alkalmaztuk (7.5 mg / kg; lásd alább a Locomotor szenzibilizációt) azon hipotézis alapján, hogy a PSMC5, mint az ΔFosB, növeli az állat érzékenységét kokain [8]. Az állatokon végzett kísérleteket a Sinai-hegyi Állatgondozási és Használási Intézmény jóváhagyta.

Immunprecipitáció és Western blot

A Neuro 2A sejteket a PSMC5 vadtípusú vagy mutáns formáival transzfektáltuk. Két nappal a transzfekció után a sejteket PBS-ben mossuk, RIPA pufferben lizáljuk (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% nátrium-dezoxikolát, 10 mM nátrium-butirát) proteáz-inhibitor . A lizátumokat megosztottuk és nemimmun IgG-vel (Sigma) vagy anti-FLAG antitestekkel (Sigma) inkubáltuk 3 órán át 4 ° C-on. Az immunprecipitációt fehérje G gyöngyökkel (Invitrogen) hajtottuk végre a leírtak szerint [19]. Röviden: az immunprecipitált fehérjéket SDS-PAGE-nak vetjük alá és Western-blot-elemzéssel elemezzük anti-FosB / ΔFosB antitest (Cell Signaling Technology) felhasználásával közzétett protokollok alapján [7]. In vivo fehérjekötődési vizsgálatokhoz tisztított nukleáris frakciókat használtunk az egerek lyukasztással boncolt NAc-jéből krónikus kokainkezelés után (20 mg / kg IP naponta 7 napokon, az egereknél 24 órát használtunk az utolsó injekció után). A nukleáris frakciók együttes immunprecipitációját a Nuclear Complex Co-IP kit (Active Motif) felhasználásával hajtottuk végre, a gyártó utasításait követve. A következő antitesteket használtuk: MYC vagy ß-aktin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 és hiszton H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 és BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) és M2 FLAG, Sigma.

Immunohisztokémia

Az immunhisztokémiát a közzétett eljárások szerint hajtottuk végre [20]. Az egereket érzéstelenítettük és intrakardiálisan perfuzáltuk 4% paraformaldehiddel PBS-ben. Az agyat 30% szacharózzal védettük, majd fagyasztottuk és felhasználásig -80 ° C-on tároltuk. A koronális metszeteket (40 μm) kristályos anyagon vágtuk és immunhisztokémiai szempontból feldolgoztuk. A szabadon lebegő szakaszokat előinkubáltuk egy blokkoló pufferben, amely 0.3% Tritont és 3% normál szamár szérumot tartalmaz. Az ΔFosB-t egy kecske poliklonális antitesttel detektáltuk a protein N-terminális része ellen (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). A PSMC5-et nyúl poliklonális antitesttel detektáltuk (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). A képeket konfokális mikroszkóppal készítettük (60x nagyítás; Zeiss).

Mozdonyérzékenyítés

Valamennyi egérnek napi IP-sóoldat-injekciót kapott 3 napokon át, hogy alkalmazkodjon az injekciók stresszéhez. Másnap az egereket IP-vel injektálták sóoldattal vagy egy alsó küszöbértékű kokainnal (7.5 mg / kg; lásd fent az Állatok alatt), és azonnal új mozgásdobozokba helyezték. Az egerek mozgásszervi aktivitását foto sugaras rendszer alkalmazásával regisztráltuk, ambuláns sugárszakadásként az 30 min alatt. Ezeket a kezeléseket naponta megismételjük 3 napokon át.

Vírus-közvetített génátvitel

Széles körben publikált módszereket használtunk a vírusközvetített génátadáshoz [7,8,11,19]. Röviden: a PSMC5 vagy számos mutáns expressziós plazmidjait (lásd a fenti PSMC5 és ΔFosB konstrukciókat) subklónoztuk a GFP-t expresszáló bicistronic p1005 (+) HSV plazmidba a CMV promoter irányítása alatt, és a PSMC5-et vagy annak mutánsait a CMV-promóter irányítása alatt. IE4 / 5 promóter. Ketamin (100 mg / kg) / xilazin (10 mg / kg) érzéstelenítés alatt az egereket kisállatok sztereotaxikus eszközébe helyeztük, és a koponya felületét kitettük. Harminchárom méretű fecskendőtűt használtunk kétoldalú infúzióhoz a HSV vektor 0.5 μl-jét a NAc-ba 10 ° szögben (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) 0.1 μl / perc sebességgel. A HSV-injekciót kapott állatoknak a műtét után a kísérlet előtt 2 napokon hagyták helyreállni.

Statisztika

ANOVA-kat és hallgatói t-teszteket alkalmaztunk, több összehasonlítással korrigálva, szignifikancia értéke p <0.05.

Eredmények

PSMC5: az ΔFosB új kötőpartnere

Előzetes kísérleteket végeztünk az ΔFosB megfelelő fragmensének azonosítására, amely csalétekként szolgált élesztő kettős hibrid vizsgálatában a rendszer autoaktiválása nélkül. A Holo-ΔFosB önmagában indukálta a riporter génaktivitását, csakúgy, mint a protein N-terminális 1 – 78 aminosav-fragmentuma. Azonban egy N-terminális csonkított ΔFosB (1A), amelyet Δ2ΔFosB-nek nevezünk, amelyben hiányzik a protein első 78 aminosava, nem volt ez a hatás. Ezért Δ2ΔFosB-t használtunk csalifehérjeként.

A potenciális kötőpartnerek kiszűrésére egér agyi könyvtárat használtunk, amelyet a pPC86-ben szubklónoztunk. Azonosítottuk az 11 jelölteket a kötelező partnerek számára. Bár ezek a fehérjék tartalmazták az ΔFosB ismert heterodimerizációs partnereit, a c-Jun és a JunD (Táblázat 1), a messze a legelterjedtebb jelölt a PSMC5 volt. Bár meglepő, ez érdekes megállapítás volt, mivel a PSMC5-et egy évvel ezelőtt egyetlen jelentésben kimutatták, hogy in vitro kötődik a c-Fos-hoz [21]. Korábban azonban nem érkezett jelentés a PSMC5 kokainban való részvételéről. Ennek ellenére, mivel a PSMC5 szignál erőteljes az élesztő két-hibrid vizsgálatában, megvizsgáltuk a lehetséges ΔFosB-PSMC5 kölcsönhatások további vizsgálatát.

miniatűr
1 táblázat. Az élesztő két hibrid szűrésének eredményei Δ2ΔFosB-vel.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Először az ΔFosB és a PSMC5 közötti fizikai kölcsönhatás megerősítésére in vitro együtt immunprecipitációs kísérleteket végeztünk. Azt találtuk, hogy a FLAG-címkével ellátott PSMC5 (1B), transzfektálva Neuro 2A sejtekbe, hatékonyan lebontja az ΔFosB-t (1C). Másodszor, hogy meghatározzuk azt a régiót a PSMC5-ben, amely felelős az ΔFosB-hez való kötéséért, több FLAG-címkével ellátott PSMC5-mutánst (1B) és megismételjük a ko-immunprecipitációs kísérletet. Az ΔFosB hatékonyan lecsökkent a PSMC151 (PSMC5-NT) N-terminális 5 aminosavaival, de nem a fehérje C-terminális 172 aminosav fragmentumával (PSMC5-CT) (1C). A PSMC5, amelyben hiányzik a tekercselt tekercsdoménje (PSMC5-ΔCC), szintén hatástalan volt ΔFosB kicsapására. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a PSMC5 az ΔFosB-t kötötte-tekercs doménjével (27 – 68 aminosavak) köti. Ezen túlmenően, a FLAG-címkével ellátott PSMC5 nem kicsapta az ΔFosB mutáns formáját mutáns leucin cipzár doménnel (ΔFosB-LZM) (1C), jelezve, hogy ΔFosB vagy ezen a doménen keresztül köti a PSMC5-et, vagy valószínűbb, hogy ΔFosB heterodimerizációra van szükség a PSMC5 kötéshez.

A PSMC5-ΔFosB kötés NAc-ban krónikus kokain beadása után

Ezen in vitro megállapítások alapján megvizsgáltuk, hogy a NAM PSMC5 szintje megváltozik-e a krónikus kokain beadására adott válaszként. Szubcelluláris frakcionálás és Western blot módszerrel azt találtuk, hogy a krónikus kokain növeli a PSMC5 nukleáris szintjét ezen agyi régióban anélkül, hogy a citoplazmatikus szint megváltozik (2A). Ezt a hatást a kokain egyszeri adagja után nem figyelték meg (az adatokat nem mutatjuk be). Ezt követően megvizsgáltuk a PSMC5 és az ΔFosB NAc-ban való elhelyezkedését konfokális immunfluoreszcencia mikroszkóp segítségével. Elemeztük az 24 egereket óránként a kokain utolsó ismételt adagja után, amikor az ΔFosB az egyetlen kimutatható fosB géntermék (lásd Nestler 2008). Erős PSMC5 immunreaktivitást találtunk a NAc-ben, ideértve az erős nukleáris szignált is. ~ Az ΔFosB + magok 85% -a együtt festett a PSMC5 esetében (2B). Ezenkívül ko-immunprecipitációs kísérleteket végeztünk NAc kivonatokkal és megállapítottuk, hogy krónikus kokainkezelés után az ΔFosB hatékonyan lecsökkent egy anti-PSMC5 antitest (2C). Ezzel szemben a gyógyszeres kezelésben nem részesített NAc elemzése (ismételt sóoldat-injekciók után) nem mutatott kimutatható ΔFosB-lehúzódást (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az adatok összhangban állnak a sejttenyészetben tett megállapításainkkal és megerősítik, hogy az ΔFosB és a PSMC5 kölcsönhatásba lépnek a NAc-vel in vivo.

miniatűr
2 ábra. PSMC5 szabályozás egér NAc-ben.

 

A. A sóoldattal vagy kokainnal (20 mg / kg) kezelt egerek NAc nukleáris és citoszolos frakcióinak Western-blot-vizsgálata 7 napig, állatokkal az utolsó injekció után 24 órával elemeztük. A kokain növeli a PSMC5 nukleáris, de nem citoszolszintjét. A kokain által nem befolyásolt hiszton H3 és ß-aktint használtuk terhelés kontrollként. Az adatok átlag ± SEM (n = 8–10 / csoport, * p <0.05). B. Az endogén PSMC5 (zöld) és ΔFosB (kék) együttes lokalizálása kokainnal krónikusan kezelt egerek NAc-jében, mint AC krónikus kokainkezelés után az egér NAc nukleáris lizátumaiban immunprecipitációt végeztünk anti-PSMC5 antitesttel vagy egér IgG-vel kontrollként majd Western-blottot anti-FosB / AFosB antitesttel. Az ábra PSMC5-ΔFosB kölcsönhatásokat mutat be az NAc-ben in vivo. A B és C adatok három példányban ismétlődtek mindhárom különálló kísérletben.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

A PSMC5 fokozza az ΔFosB expressziót in vitro

Mivel a PSMC5 a proteaszóma komplex ismert tagja, megvizsgáltuk, hogy a Rat 1A sejtek segítségével szabályozza-e az ΔFosB szinteket. A PSMC5 túlzott mértékű expressziója nem volt hatással az ΔFosB alapszintjére, ám a sejtek szérumstimulálásakor az ΔFosB indukciójának kis, de szignifikáns fokozódását okozta (3A). Hasonló tendencia figyelhető meg a teljes hosszúságú FosB esetében, de a hatás nem érte el statisztikai jelentőségét. Ezzel szemben az endogén PSMC5 expresszió visszaszorítása patkány 1A sejtekben, amelyet a PSMC5-et megcélzó siRNS-ek alkalmazásával valósítottak meg, nem befolyásolta a bazális ΔFosB szintet, de erősen gátolta a ΔFosB indukciót a szérumstimuláció révén (3B). Hasonló hatásokat tapasztaltunk a teljes hosszúságú FosB-re is. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a PSMC5 nem segíti elő az ΔFosB proteaszómális lebomlását, amint az elvárható a proteaszóma mag alegységében, hanem ehhez szükséges a fosB géntermékek in vitro, valószínűleg a fehérjék stabilizálása révén.

miniatűr
3 ábra. A FosB / ΔFosB expresszió PSMC5 szabályozása patkány 1A sejtekben.

 

A. Az 1A patkány sejteket 4 μg PSMC5 vagy kontroll DNS-sel transzfektáltuk. A PSMC5 túlexpresszió nem volt hatással a FosB vagy ΔFosB fehérje bazális expressziós szintjére, amelyet Western-blot-módszerrel határoztak meg, de kismértékű, de jelentős növekedést okozott a ΔFosB indukciójában szérumstimulációval (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Az 1A patkány sejteket 5 pmol két siRNS-ből vagy összekevert RNS-ből transzfektáltuk (kontroll). Mindkét siRNS hatékonyan csökkentette a PSMC5 fehérje szintjét a kontroll körülményekhez képest (siRNS # 1, a kontroll 23 ± 5% -a; siRNS # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). A PSMC5 leütésnek nem volt hatása a FosB vagy ΔFosB bazális szintjére, de szérumstimulációval enyhítette mind a FosB, mind a ΔFosB indukcióját (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

Az ΔFosB és PSMC5 komplexeket képez a NAP-vel, CBP, p300 és BRG1.

Annak érdekében, hogy jobban megértsük azokat a transzkripciós mechanizmusokat, amelyek révén a PSMC5 befolyásolhatja az ΔFosB funkciót, megvizsgáltuk a NAc két fehérjének lehetséges további kötőpartnereit krónikus kokainnal kezelt körülmények között. Van egy jelentés, hogy a PSMC5 kötődik a CBP-hez - egy HAT-hoz - és növeli a hiszton H3 acetilációját az MHC-II proximális promoterénél a HeLa sejtekben [22]. Ezen túlmenően azokban az egerekben, amelyek hiányosak a CBP-ben, csökkent kokain-viselkedési érzékenységük, valamint csökkent hiszton-acetilezés a fosB promóter [23]. Ezért teszteltük, hogy a PSMC5 kötődhet-e az ΔFosB-hez olyan komplexek részeként, amelyek CBP-t és esetleg más transzkripciós aktivátorokat is tartalmaznak.

Először bebizonyítottuk, hogy az ΔFosB hatékonyan lehúzza mind a CBP-t, mind a hasonló HAT-t, a P300-t a Neuro2A sejtekben (4A). Ezzel szemben az ΔFosB leucin cipzáras mutáns formája - a várakozásoknak megfelelően - nem mutatta ezt az aktivitást. Hasonlóképpen, a PSMC5 hatékonyan lehúzta a CBP-t és a p300-et (4B). Érdekes, hogy ezt a hatást a PSMC5-ΔCC-re is megfigyelték, amely nem vonta le az AFosB-t, jelezve, hogy a PSMC5 kölcsönhatásba lép a CBP-vel és a p300-rel a fehérje más doménjein keresztül, függetlenül annak ΔFosB-hez való kötődésétől.

miniatűr
4 ábra. Az ΔFosB és a PSMC5 kölcsönhatásba lép a CBP-vel, a p300-kel és a BRG1-kel in vitro és in vivo.

 

A. A Neuro2A sejteket 2.4 μg MYC-jelölt ΔFosB-vel vagy MYC-címkével ellátott ΔFosB-LZM-tel transzfektáltuk. A sejtkivonatokat anti-CBP vagy anti-p300 antitestekkel immunprecipitáltuk, és a csapadékokat Western-blottoltuk ugyanazzal az ellenanyaggal vagy anti-MYC ellenanyaggal. Mind a CBP, mind a p300 kölcsönhatásba lép ΔFosB-vel, és az ilyen kölcsönhatásokhoz ép leucin cipzár szükséges. B. A Neuro2A sejteket 2.4 μg FLAG-címkével ellátott PSMC5 vagy FLAG-címkével ellátott PSMC5-CC-vel transzfektáltuk. A sejtkivonatokat anti-CBP vagy anti-p300 antitestekkel immunprecipitáltuk, és a csapadékokat Western-blottel azonos azonosítóval vagy anti-FLAG ellenanyaggal elválasztottuk. Mind a CBP, mind a p300 kölcsönhatásba lép a PSMC5-rel, és az ilyen interakciókhoz nincs szükség a CC tartományra. C. Az egér NAc nukleáris lizátumait krónikus kokainkezelés után immunprecipitációnak vetettük alá anti-CBP vagy anti-p300 ellenanyaggal. A kapott csapadékok anti-FosB / ΔFosB antitesttel végzett későbbi Western-blot-analízisével az AFosB és a CBP / p300 között endogén kölcsönhatásokat mutattak. D. Ugyanazon nukleáris lizátumok aliquot részeit immunprecipitációnak vetettük alá anti-BRG1 vagy anti-PSMC5 antitesttel, majd a csapadékok anti-FosB / ΔFosB vagy anti-BRG1 antitestekkel végzett Western blottolását végeztük. Az eredmények endogén kölcsönhatásokat mutatnak ΔFosB és BRG1, valamint BRG1 és PSMC5 között. E. A ΔFosB: JunD heterodimerekből álló, transzkripciós aktivációs komplex sematikus ábrázolása, amelyek kölcsönhatásba lépnek a CBP / p300, BRG1 és PSMC5 vegyületekkel.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Annak igazolására, hogy ezek az interakciók in vivo is előfordulnak, krónikusan adtunk kokaint ΔFosB és nukleáris PSMC5 szintek indukálásához, majd immunprecipitált NAc kivonatokat anti-CBP vagy anti-p300 antitestekkel. Sejttenyésztési adatainkkal összhangban a CBP vagy a p300 immunprecipitációja hatékonyan csökkentette ΔFosB-t (4C). Vizsgáltuk, hogy a BRG1, az SWI-SNF kromatin-átalakító komplex mag alegysége is kötődhet-e az ΔFosB-hez és a PSMC5-hez, korábbi megállapításunk alapján, hogy a BRG1 bizonyos ΔFosB célgénekbe toborozódik, a krónikus kokain utáni NAc-ban történő aktiválásukkal együtt [24]. Megállapítottuk, hogy a BRG1 immunprecipitációja lecsökkentette az ΔFosB-t NAc kivonatokban, és hogy a PSMC5 immunprecipitációja hasonló módon együttesen kicsapódott endogén BRG1 (4D). Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ΔFosB-PSMC5 komplexeket képez NAc-ben, amelyek magukban foglalják a CBP / p300-t és a BRG1-t (4E).

A PSMC5 túlzott expressziója növeli a kokain lokomotoros válaszát

A PSMC5 és az ΔFosB közötti NAc-ban való kiemelkedő kötődése arra késztett minket, hogy vizsgáljuk meg, vajon a PSMC5 szint növelése ezen agyi régióban szabályozza-e a kokain viselkedésbeli reakcióit. Készítettünk egy Herpes Simplex Virus (HSV) vektort, amely vagy a vad típusú PSMC5-et, vagy annak egyik mutánsát túlzottan expresszálja, és a vektorokat NAc-ben in vivo validálta (5A). A PSMC5 vírusközvetített expressziója dominál a sejtmagban (5B). A vad típusú PSMC5-et túlzottan expresszáló egerek nem mutattak megváltozott választ a kokain kezdeti dózisaira, de megnövekedett lokomotoros aktivációt mutattak az ismételt kokain dózisok hatására a GFP-t expresszáló kontroll egerekhez képest. Ezzel szemben az olyan egerek, amelyek a PSMC5 mutáns formáját túlzottan expresszálják, amelyben nincs a tekercselt tekercs doménje (PSMC5-ΔCC), nem mutatták ezt a hatást (5B). Érdekes módon a PSMC5-K196M túlexpressziója, amelyben nincs a vadtípusú protein ATPáz aktivitása, szintén fokozta a kokain lokomotoros válaszát.

miniatűr
5 ábra. A NAc PSMC5 túlzott expressziója növeli a kokain lokomotoros válaszát.

 

A. Reprezentatív HSV-közvetített transzgén expresszió mediális NAc-ben. AC, elülső kompresszor. NAc mag és héj kistérségek vannak feltüntetve az ábrán. B. A PSMC60 immunhisztokémiai festésének reprezentatív nagyobb (5x) nagyítása NAc neuronokban a HSV-PSMC5 injekció után, amely azt mutatja, hogy a fehérje túlnyomórészt nukleáris, amint azt a DAPI festés jelzi. C. Az egerek kétoldalú HSV injekciókat kaptak NAc-be, majd napi IP injekciókat kaptak a kokain küszöb alatti dózisaiból (7.5 mg / kg). A mozgásszervi válaszok a gyógyszer 3 napi dózisának első és utolsó adagjára adott válaszként jelennek meg. A PSMC5 vagy a PSMC5-K196M túlzott mértékű expressziója növeli a mozgásszervi válaszokat az ismételt kokainra, ez a hatás a PSMC5-ΔCC esetében nem látható. A transzgéneknek nem volt szignifikáns hatása a mozgásszervi válaszokra a kezdeti kokain adagokra. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 Dunnett posthoc tesztjével.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Megbeszélés

A tanulmány eredményei egy új mechanizmust tárnak fel, amellyel az ΔFosB közvetíti az agyára gyakorolt ​​hatásait, valamint egy új mechanizmust, amely a kokain hatásában rejlik. Egy elfogulatlan megközelítés, az élesztő kettős hibrid assay alkalmazásával azonosítottuk a PSMC5 mint új ΔFosB kötőpartnert. Ezt a megállapítást mind in vitro tenyésztett sejtekben, mind in vivo NAc-ben validáltuk robusztus PSMC5-ΔFosB kötés kimutatásával. Fontos szempont, hogy a PSMC5 nukleáris szintjét NAc-ban idézik elő krónikus kokain adagolás. Megmutattuk továbbá, hogy a PSMC5-ΔFosB kötés számos más transzkripciós aktivátor fehérjével, nevezetesen a CBP-vel és a p300-vel (két HAT) és a BRG1-vel (az SWI-SNF kromatin-átalakító komplexek kulcsfontosságú alkotóelemeivel) együttesen történik. Eredményeink együttesen alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a PSMC5 a transzkripciós aktivációs komplex része, amelyet legalább bizonyos ΔFosB-indukált génekhez toboroznak krónikus kokain-beadás során (4E). Ezzel a hipotézissel összhangban van az a további megállapítás, hogy a PSMC5 túlzott expressziója a NAc-ban, mint maga az ΔFosB túlzott kifejezése, elősegíti a kokain viselkedésbeli reakcióit. A jövőbeni vizsgálatokban érdekes lenne ezeket az in vivo megfigyeléseket nyomon követni a PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 kölcsönhatások jellemzésével in vitro riporter vizsgálatok alkalmazásával.

A PSMC5 kokainban való részvétele teljesen újszerű. A PSMC5-et, amely kezdetben a proteaszómát magában foglaló nagy ATPáz-család tagjaként azonosították, az évek során bebizonyosodott, hogy kölcsönhatásba lép számos transzkripciós faktorral, beleértve a c-Fos-t, a p53-et, a nukleáris hormon receptorokat és az alaptranszkripciós komplex alkotóelemeit [25], azonban az évek során kevés funkcionális vizsgálatot végeztek [26]. Legjobban megalapozott tevékenysége az MYC transzkripciós faktorok aktivitásának elősegítése a tenyésztett sejtekben27]. A PSMC5 transzkripciós mechanizmusokba való bevonása felvette az ubiquitination-proteasomális aktivitás potenciális szerepét a gén transzkripció szabályozásában, ám a PSMC5 ebben a szabályozásban való részvétele gyakorlatilag nem tesztelt [28,29].

Nagyon keveset tudunk a PSMC5 agy működéséről. Egy korábbi tanulmány kimutatta a PSMC5 mRNS széles körű expresszióját az agyban [30], de funkcionális aktivitása tanulmányozott maradt. Megállapításaink most felkutatják ezen érdekes fehérje további kutatásait, hogy jobban megértsék annak szerepét a gén transzkripció szabályozásában és az ubiquitination-proteasomális funkcióval való kapcsolatát az agyban. A PSMC5 ΔFosB-hez való kötődését a PSMC5 tekercselt tekercs doménje közvetíti. Ezenkívül a PSMC5 azon képessége, hogy elősegítse a kokain lokomotoros reakcióit, miközben megköveteli a tekercselt tekercs domént, nem követeli meg az ATPáz aktivitást, amely a proteinre jellemző. Ezek az eredmények felveti annak a lehetőségét, hogy legalább a rendszerünkben a PSMC5 fő aktivitása az ΔFosB-hez és más transzkripciós szabályozó fehérjékhez történő kötődése révén közvetíthető, és nem a proteaszómához kapcsolódó aktivitás önmagában. További munkára van szükség ezen és az alternatív lehetőségek közvetlen teszteléséhez. Az a hipotézis, miszerint a PSMC5 vírusközvetített túlzott expressziója fokozta a kokain lokomotoros válaszát az ΔFosB-rel való kölcsönhatás révén, annak ellenére, hogy az 3 napi kokainkezelési rendszert alkalmazták, mivel ismert, hogy ebben az időtartamban az ΔFosB érzékelhető szintje felhalmozódik az agyban [3].

A jelen eredmények tovább igazolják az elfogulatlan, nyílt végű kísérleti megközelítések alkalmazhatóságát az agyszabályozás molekuláris alapjának tanulmányozásában. A PSMC5 iránti kezdeti figyelmünk kizárólag az ΔFosB-hez való erőteljes kötődésén alapszik egy élesztő kettős hibrid assay-ben, bár úgy tűnik, hogy fontos eleme a transzkripciós változásoknak, amelyeket NAc-ban toboroznak az ismételt kokain adagolás. A jelenlegi vizsgálatok középpontjában a PSMC5 nukleáris szintjeinek a kokain által kiváltott részletes mechanizmusainak jobb megértése áll, és amelyek révén a PSMC5 hozzájárul a kokain által indukált transzkripciós aktivációs komplexekhez. Eközben az élesztővel végzett két-hibrid vizsgálatunk számos további feltételezett kötőpartnert mutatott az ΔFosB (Táblázat 1), amelyek most a közvetlen vizsgálatot indokolják a kokainmodellekben is. Ez a munka együttesen hozzájárul a komplex molekuláris mechanizmusok megértéséhez, amelyek révén a kokain megváltoztatja a NAc funkciót.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Nemzeti Kábítószer-visszaélés Intézet, valamint az Ishibashi Alapítvány és a Japán Tudományfejlesztő Társaság támogatásával támogatták (KAKENHI számok: 24591735, 26290064, 25116010).

Szerzői hozzájárulások

A kísérletek megtervezése és megtervezése: YHO YNO EJN. Kísérleteket hajtott végre: YHO YNO PJK RN. Elemeztem az adatokat: YHO YNO EJN. Hozzáadott reagensek / anyagok / elemző eszközök: TN MO OY AN RN TT. Írta a papírt: YHO EJN.

Referenciák

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Azonnali-korai gének: tíz év. Trends Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) A függőség transzkripciós mechanizmusai: a deltaFosB szerepe. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Cikk megtekintése
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Cikk megtekintése
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Cikk megtekintése
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Cikk megtekintése
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Cikk megtekintése
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Cikk megtekintése
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Cikk megtekintése
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Cikk megtekintése
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Cikk megtekintése
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Cikk megtekintése
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Cikk megtekintése
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Cikk megtekintése
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Cikk megtekintése
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Cikk megtekintése
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Cikk megtekintése
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Cikk megtekintése
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Cikk megtekintése
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Cikk megtekintése
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Cikk megtekintése
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Cikk megtekintése
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Cikk megtekintése
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Cikk megtekintése
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Cikk megtekintése
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Cikk megtekintése
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Cikk megtekintése
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Cikk megtekintése
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Cikk megtekintése
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Cikk megtekintése
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Cikk megtekintése
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Az agyban megváltozott Fos-szerű fehérjékből álló tartós AP-1 komplex indukciója krónikus kokain és más krónikus kezelésekkel. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutáns egerek: Fos-kapcsolódó fehérjék krónikus kokainindukciójának elvesztése és fokozott érzékenység a kokain pszichomotoros és jutalmazó hatásaival szemben. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) ΔFosB stabilitásának szabályozása foszforilezéssel. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A és mtsai. (2007) A konzervált C-terminális degron domén hiánya hozzájárul az ΔFosB egyedülálló stabilitásához. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V., Mazei-Robison M., Feng J., Kourrich S., Collins M, et al. (2013) A krónikus kokainnal kapcsolatos viselkedési és strukturális válaszokhoz előmenetel-hurok szükséges, amelybe beletartozik az ΔFosB és a CaMKII az atommagban. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM és társai. (1999) Az ΔFosB transzkripciós faktor expressziója az agyban szabályozza a kokainnal szembeni érzékenységet. Természet 401: 272 – 276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB fokozza a kokain ösztönzését. J Neurosci 23: 2488 – 2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) A gén expressziójának és a kokain-jutalomnak a szabályozása a CREB és a DFosB által. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D., Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Az ΔFosB alapvető szerepe a sejtmagban felhalmozódó morfin hatásában. Természet Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P és munkatársai. (2003) A transzgenikus egerekben a domináns negatív c-Jun mutáns indukálható, agyi régióra jellemző expressziója csökkenti a kokain iránti érzékenységet. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) A delta FosB és a FosB-szerű fehérjék szabályozása elektrokonvulsó roham és kokainkezeléssel. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J., Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) A fosB gén alapvető szerepe az elektrokonvulív rohamok molekuláris, celluláris és viselkedési fellépéseiben. J Neurosci 18: 6952 – 6962. PMID: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP parkinsonizmust egy D-FosB-szerű protein tartós expressziója kíséri a dopaminerg utakon. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Az eukarióta transzkripciós inhibitor átalakítása aktivátorré. 55 cella: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, S mezők (1991). A két hibrid rendszer: módszer olyan fehérjék gének azonosítására és klónozására, amelyek kölcsönhatásba lépnek egy érdekes fehérjével. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) A nyugalmi Rat-1A sejtek proliferatív aktiválása FosB delta által. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH és munkatársai. (2014) A poli (ADP-ribozil) -tionok alapvető szerepe a kokain hatásában. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I., Yazdani S és mtsai. (2008) Az αFosB indukciójának különféle mintái az agyban a visszaélés elleni gyógyszerekkel. 62 szinapszis: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Sug1 emlős és c-Fos a nukleáris 26S proteaszómában. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D., Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Az acetiláció szabályozása a fő hisztokompatibilitási komplex II. Osztályú proximális promóteren az 19S proteaszómális ATPáz Sug1 segítségével. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, XuS, Kandel ER, Schwartz JH (2005) A CREB-kötő protein szabályozza a kokainre adott válaszokat hisztonok acetilezésével az egér striatumában lévő fosB promoternél. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT és munkatársai. (2005) A kromatin átalakítása kulcsfontosságú mechanizmus a kokain által kiváltott plaszticitás alapjául a striatumban. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Kettős funkciók a transzkripciós szabályozók számára: mítosz vagy valóság. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Az 26S proteaszóma szabályozó alegység interakciói, összetett probléma. Trends Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Az ubiquitin / proteaszóma rendszer szerepe a myc-szabályozott transzkripcióban. 2 – 5 cellaciklus: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin és proteaszómák transzkripcióban. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) A proteaszóma: hasznos eszköz az átíráshoz? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Az egér idegrendszerében differenciáltan expresszálódó filogenetikailag konzervált Sug1 CAD családtag azonosítása. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5